ES2563737T3 - Composiciones de IFN-beta, métodos de preparación y usos de las mismas - Google Patents

Composiciones de IFN-beta, métodos de preparación y usos de las mismas Download PDF

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ES2563737T3 ES12721844.4T ES12721844T ES2563737T3 ES 2563737 T3 ES2563737 T3 ES 2563737T3 ES 12721844 T ES12721844 T ES 12721844T ES 2563737 T3 ES2563737 T3 ES 2563737T3
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Helen Gabriela Baldascini
Joel Richard
Frédéric CHÉCOT
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Abstract

Una composición farmacéutica sólida que comprende: - interferón beta (IFN-beta) y - un polímero de poli(ácido glutámico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo el índice de injerto molar medio de 4,5-5,5 % en moles, en la que la relación en peso/peso entre dicho polímero de poli(ácido glutámico) injertado e IFN-beta está entre 24 y 125.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones de IFN-beta, metodos de preparacion y usos de las mismas CAMPO DE LA INVENClON
La presente invencion se refiere a composiciones de interferon beta (IFN-beta), a sus metodos de preparacion y a la aplicacion de estos para obtener composiciones terapeuticas en forma de unidad de dosificacion que suministren iFN-beta durante un periodo de tiempo prolongado.
Antecedentes de interferones y su estabilizacion
Los interferones son citocinas, es decir, protemas solubles que transmiten mensajes entre las celulas y desempenan un papel esencial en el sistema inmunitario al ayudar a destruir microorganismos que causan infecciones y reparar cualquier dano resultante. Los interferones se secretan naturalmente por celulas infectadas y se identificaron por primera vez en 1957. Su nombre deriva del hecho de que "interfieren" con la replicacion y produccion vmcas.
Los interferones exhiben actividad tanto antivmca como antiproliferativa. En base a las propiedades bioqmmicas e inmunologicas, los interferones humanos de origen natural se agrupan en tres clases principales: interferon alfa, interferon beta e interferon gamma. Ademas, los interferones (IFN) son glucoprotemas producidas por el cuerpo en respuesta a una infeccion vmca. Inhiben la multiplicacion de virus en celulas protegidas. Los IFN, que consisten en una protema de bajo peso molecular, son notablemente no espedficos en su accion, es decir, el IFN inducido por un virus es eficaz contra un amplio intervalo de otros virus. Son, sin embargo, espedficos de especie, es decir, el IFN producido por una especie estimulara solo la actividad antivmca en celulas de la misma o una especie estrechamente relacionada. Los IFN fueron el primer grupo de citocinas que se explotaron por sus potenciales actividades antitumorales y antivmcas.
Los tres IFN principales se denominan IFN-a, IFN-p e IFN-y. Dichos tipos principales de IFN se clasificaron inicialmente segun sus celulas de origen (leucocitos, fibroblastos o linfocitos T). Sin embargo, resulto evidente que varios tipos podrian ser producidos por una celula. De aid que el IFN de leucocitos se llame ahora IFN-a, el IFN de fibroblastos es IFN-p y el IFN de linfocitos T es IFN-y. Hay tambien un cuarto tipo de IFN, el IFN de linfoblastoides, producido en la estirpe celular "Namalwa" (derivada de linfoma de Burkitt), que parece que produce una mezcla de ambos IFN de leucocitos y fibroblastos.
Cada clase de IFN contiene varios tipos distintos. Los IFN-p e IFN-y son cada uno el producto de un solo gen.
El interferon de fibroblastos humanos (IFN-p o IFN-beta) tiene actividad antivmca y puede estimular tambien los linfocitos citotoxicos naturales contra celulas neoplasicas. Es un polipeptido de aproximadamente 20.000 Da inducido por virus y ARN bicatenarios. A partir de la secuencia nucleoddica del gen del interferon de fibroblastos, clonado por tecnologfa de ADN recombinante, (Derynk et al., 1980) dedujeron la secuencia aminoaddica completa de la protema. Es de 166 aminoacidos de largo.
Shepard et al. 1981 describieron una mutacion en la base 842 (Cys ^ Tyr en la posicion 141) que anulaba su actividad antivmca, y una variante del clon con una delecion de los nucleotidos 1119-1121.
Mark et al. 1984 insertaron una mutacion artificial sustituyendo la base 469 (T) por (A), causando un cambio de aminoacidos de Cys ^ Ser en la posicion 17. Se ha resenado que el IFN-beta resultante era tan activo como el IFN- beta 'nativo' y estable durante almacenamiento a largo plazo (-70 °C).
Rebif® (Merck Serono) es interferon beta-1a, producido por estirpes celulares de mairnfero. Su denominacion comun internacional (DCI) recomendada es "interferon beta-1a".
La unidad de interferon o unidad internacional de interferon (U o UI) se define como la cantidad necesaria para proteger al 50 % de las celulas ante el dano vdico; el ensayo que puede usarse para medir la bioactividad es el ensayo de inhibicion del efecto citopatico, como se describio por primera vez por Rubinstein, et al., 1981 y Familletti, P. C., et al., 1981. En este ensayo antivdico de interferon, aproximadamente 1 unidad/ml de interferon es la concentracion necesaria para producir una inhibicion del efecto citopatico del 50 %. Las unidades de IFN-beta se determinan con respecto al patron de referencia internacional para Hu-IFN-beta proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (Pestka, S. 1986).
La unidad de interferon o unidad internacional de interferon (U o UI) se define como la cantidad necesaria para proteger al 50 % de las celulas ante el dano vdico; el ensayo que puede usarse para medir la bioactividad es el ensayo de inhibicion del efecto citopatico, como se describio por primera vez por Rubinstein, et al., 1981 y Familletti, P. C., et al., 1981. En este ensayo antivdico de interferon, aproximadamente 1 unidad/ml de interferon es la concentracion necesaria para producir un efecto citopatico del 50 %. Las unidades de IFN-beta se determinan con respecto al patron de referencia internacional para Hu-IFN-beta proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (Pestka, S. 1986).
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Como con todos los productos farmaceuticos basados en protemas, es un obstaculo importante que debe superarse en el uso de IFN-beta como agente terapeutico la perdida de utilidad farmaceutica que puede ser el resultado de su inestabilidad en composiciones farmaceuticas.
Las inestabilidades ffsicas que amenazan la actividad y eficacia proteicas en las composiciones farmaceuticas incluyen la desnaturalizacion y formacion de agregados solubles e insolubles, mientras que las inestabilidades qmmicas incluyen hidrolisis, formacion de imida, oxidacion, racemizacion y desamidacion. Algunos de estos cambios son conocidos por conducir a la perdida o reduccion de la actividad farmaceutica de la protema de interes. En otros casos, los efectos precisos de estos cambios son desconocidos, pero los productos degradativos resultantes siguen siendo considerados farmaceuticamente inaceptables debido al potencial de efectos secundarios indeseables.
La estabilizacion de protemas en composiciones farmaceuticas sigue siendo un campo en que el ensayo y error desempena el papel principal (revisado por Wang (1999) Int. J. Pharm. 185: 129-188; Wang y Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42: S3-S26). Los excipientes que se anaden a las composiciones farmaceuticas proteicas para aumentar su estabilidad incluyen tampones, azucares, tensioactivos, aminoacidos, polietilenglicoles y polfmeros, pero los efectos estabilizantes de estos aditivos qmmicos vanan dependiendo de la protema.
Existe la necesidad de composiciones farmaceuticas de IFN-beta mejoradas que comprendan estabilizantes fisiologicamente compatibles que mejoren la solubilidad de esta protema y estabilicen la protema ante la formacion de agregados, potenciando asf su utilidad farmaceutica.
A pesar de los importantes esfuerzos que se han aplicado al problema, no se han producido todavfa composiciones farmaceuticas de IFN-beta completamente satisfactorias.
Se han descubierto ahora formas de unidad de dosificacion terapeutica que son faciles de preparar, proporcionan una liberacion prolongada de IFN-beta y estan disponibles en forma solida o lfquida.
La invencion
Es un objeto de la presente invencion proporcionar una composicion de liberacion prolongada de interferon beta adecuada para administracion una vez por semana.
Es otro objeto de la presente invencion proporcionar una composicion de liberacion prolongada de IFN-beta que libere un 60 % del IFN-beta durante mas de 120 min, preferiblemente mas de 180 min, usando una prueba in vitro T1 o un 60 % del IFN-beta durante mas de 60 min, preferiblemente mas de 90 min, usando una prueba in vitro T2, descritas a continuacion.
Es otro objeto de la presente invencion proporcionar una composicion solida que sea estable frente a la agregacion de IFN-beta, como que el porcentaje de agregados sea menor del 20 %, preferiblemente menor del 10 % y mas preferiblemente menor del 5 % de la cantidad total de IFN-beta despues de 2 anos de almacenamiento a 5 °C y despues de 6 meses a 25 °C.
Es otro objeto de la presente invencion proporcionar una composicion lfquida lista para inyectar que tenga una viscosidad menor de 1.000 mPa.s, medida a 20 °C y con un mdice de cizallamiento de 10 s, usando un reometro AR1000 (TA Instruments) o un aparato equivalente con una geometna de cono-placa y un cono de 4 cm y un angulo de 2°.
Se ha observado sorprendente e inesperadamente que la combinacion de IFN-beta con polfmeros de poli(acido glutamico) injertados espedficos permite proporcionar composiciones de liberacion prolongada de IFN-beta faciles de inyectar con estabilidad mejorada, evidenciada por la baja cantidad de agregados formados.
La presente invencion se refiere por tanto a una composicion farmaceutica solida que comprende:
- interferon beta (IFN-beta) y
- un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000
g/mol, en particular entre 28.000 y 38.000 g/mol, y mas particularmente de aproximadamente 33.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles, en la que la
relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
La presente invencion se refiere adicionalmente a una composicion lfquida acuosa que comprende:
- IFN-beta y
- un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000
g/mol, en particular entre 28.000 y 38.000 g/mol, y mas particularmente de aproximadamente 33.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles, en la que la
relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
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La presente invencion se refiere tambien a un metodo para preparar una composicion solida que comprende IFN- beta y un polfmero de poli(acido glutamico) injertado segun la invencion.
La invencion se refiere tambien a las composiciones Kquidas o solidas anteriores para uso en un metodo para el tratamiento terapeutico del cuerpo humano o animal, particularmente para uso en un metodo de tratamiento terapeutico de enfermedades autoinmunitarias cronicas del sistema nervioso central o de enfermedades neurodegenerativas, particularmente de esclerosis multiple o de smdrome clmico aislado.
La invencion se refiere tambien al uso de composiciones para la fabricacion de un farmaco para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias del sistema nervioso central o de enfermedades neurodegenerativas, particularmente de esclerosis multiple o smdrome clmico aislado.
Definicion del termino interferon beta
La expresion "interferon-beta (IFN-beta o IFN-p)", como se usa en la presente memoria, pretende incluir el interferon de fibroblastos, en particular de origen humano, obtenido mediante aislamiento a partir de fluidos biologicos u obtenido mediante tecnicas de ADN recombinante a partir de celulas hospedadoras procarioticas o eucarioticas, asf como sus mutemas, sales, derivados funcionales, variantes, analogos y fragmentos activos.
Como se usa en la presente memoria, el termino "mutemas" hace referencia a analogos de IFN-beta en que uno o mas residuos aminoaddicos de un IFN-beta natural se reemplazan por diferentes residuos aminoaddicos, o se eliminan, o se anaden uno o mas residuos aminoaddicos a la secuencia natural de IFN-beta, sin cambiar sustancialmente la actividad de los productos resultantes en comparacion con el IFN-beta de tipo silvestre. Estas mutemas se preparan mediante smtesis conocidas y/o mediante tecnicas de mutagenesis dirigida a sitio, o mediante cualquier otra tecnica conocida adecuada para ello. Las mutemas preferidas incluyen, p.ej., aquellas descritas por Shepard et al. (1981) o Mark et al. (1984).
Cualquiera de dichas mutemas tiene preferiblemente una secuencia aminoaddica suficientemente similar a la secuencia de IFN-beta para tener una actividad sustancialmente similar o incluso mejor que el IFN-beta. La funcion biologica del interferon es bien conocida para el experto en la tecnica, y estan establecidos y disponibles patrones biologicos, p.ej., en el Instituto Nacional de Patrones y Controles Biologicos (
http://immunology.org/links/NIBSc).
Se han descrito bioensayos para la determinacion de la actividad de IFN. Un ensayo de IFN puede llevarse a cabo, por ejemplo, como se describe por Rubinstein et al., 1981. Por tanto, puede determinarse si cualquier mutema dada tiene una actividad sustancialmente similar, o incluso mejor, que el IFN mediante experimentacion rutinaria.
Las mutemas de IFN-beta que pueden usarse de acuerdo con la presente invencion, o acido nucleico que codifica las mismas, incluyen una serie finita de secuencias sustancialmente correspondientes como peptidos o polinucleotidos de sustitucion que un experto en la tecnica puede obtener rutinariamente, sin experimentacion indebida, sobre la base de las ensenanzas y la grna presentadas en la presente memoria.
Los cambios preferidos para mutemas de acuerdo con la presente invencion se denominan asf sustituciones "conservativas". Las sustituciones conservativas de aminoacidos de polipeptidos o protemas de la invencion pueden incluir aminoacidos sinonimos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoqmmicas suficientemente similares para que la sustitucion entre miembros del grupo conserve la funcion biologica de la molecula. Esta claro que tambien pueden realizarse inserciones y deleciones de aminoacidos en las secuencias definidas anteriormente sin alterar su funcion, en particular si las inserciones o deleciones implican solo unos pocos aminoacidos, p.ej., menos de treinta, y preferiblemente menos de diez, y no eliminan o desplazan a los aminoacidos que son cnticos para una conformacion funcional, p.ej., los residuos de cistema. Las protemas y las mutemas producidas mediante dichas deleciones y/o inserciones entran dentro del ambito de la presente invencion.
Preferiblemente, son grupos de aminoacidos sinonimos aquellos definidos en la Tabla I a continuacion. Mas preferiblemente, son grupos de aminoacidos sinonimos aquellos definidos en la Tabla II, y lo mas preferiblemente son grupos de aminoacidos sinonimos aquellos definidos en la Tabla III.
TABLAI
Grupos preferidos de aminoacidos sinonimos
Aminoacido
Grupo sinonimo
Ser
Ser, Thr, Gly, Asn
Arg
Arg, Gln, Lys, Glu, His
Grupos preferidos de aminoacidos sinonimos
Aminoacido
Grupo sinonimo
Leu
Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro
Gly, Ala, Thr, Pro
Thr
Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala
Gly, Thr, Pro, Ala
Val
Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly
Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile
Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe
Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr
Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys
Ser, Thr, Cys
His
Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln
Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn
Gln, Asp, Ser, Asn
Lys
Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp
Glu, Asn, Asp
Glu
Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met
Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp
Trp
TABLA II
Grupos de aminoacidos sinonimos mas preferidos
Aminoacido
Grupo sinonimo
Ser
Ser
Arg
His, Lys, Arg
Leu
Leu, Ile, Phe, Met
Pro
Ala, Pro
Grupos de aminoacidos sinonimos mas preferidos
Aminoacido
Grupo sinonimo
Thr
Thr
Ala
Pro, Ala
Val
Val, Met, Ile
Gly
Gly
Ile
Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe
Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr
Phe, Tyr
Cys
Cys, Ser
His
His, Gln, Arg
Gln
Glu, Gln, His
Asn
Asp, Asn
Lys
Lys, Arg
Asp
Asp, Asn
Glu
Glu, Gln
Met
Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp
Trp
TABLA III
Grupos de los aminoacidos sinonimos mas preferidos
Aminoacido
Grupo sinonimo
Ser
Ser
Arg
Arg
Leu
Leu, Ile, Met
Pro
Pro
Thr
Thr
Ala
Ala
Grupos de los aminoacidos sinonimos mas preferidos
Aminoacido
Grupo sinonimo
Val
Val
Gly
Gly
Ile
Ile, Met, Leu
Phe
Phe
Tyr
Tyr
Cys
Cys, Ser
His
His
Gln
Gln
Asn
Asn
Lys
Lys
Asp
Asp
Glu
Glu
Met
Met, Ile, Leu
Trp
Met
Los ejemplos de produccion de sustituciones aminoaddicas en protemas que pueden usarse para obtener mutemas de IFN-beta para usar en la presente invencion incluyen cualquiera de las etapas de los metodos conocidos, tales como se presentan en las patentes de EE.UU. 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, de Mark et al.; 5.116.943 de Koths 5 et al., 4.965.195 de Namen et al.; 4.879.111 de Chong et al.; y 5.017.691 de Lee et al.; y las protemas sustituidas con lisina, presentadas en la patente de EE.UU. n° 4.904.584 (Shaw et al.). Se han descrito mutemas espedficas de IFN-beta, por ejemplo, por Mark et al., 1984.
La expresion "protema fusionada" hace referencia a un polipeptido que comprende un IFN-beta, o una mutema del mismo, fusionado con otra protema que, p.ej., tiene un tiempo de residencia ampliado en fluidos corporales. Un IFN- 10 beta puede condensarse por tanto con otra protema, polipeptido o similar, p.ej., una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.
Los "derivados funcionales", como se usa en la presente memoria, abarcan los derivados de IFN-beta y sus mutemas y protemas condensadas, que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que aparecen como cadenas laterales sobre los residuos o los grupos N- o C-terminales mediante medios conocidos en la materia, y se 15 incluyen en la invencion con la condicion de que sigan siendo farmaceuticamente aceptables, es decir, no destruyan la actividad de la protema que es sustancialmente similar a la actividad de IFN-beta, y que no confieran propiedades toxicas a las composiciones que los contienen. Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar los sitios antigenicos y ampliar la residencia de IFN-beta en fluidos corporales. Otros derivados incluyen esteres alifaticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo 20 mediante una reaccion con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los residuos aminoaddicos formados con restos acilo (p.ej., grupos alcanoflo o aroMo carbodclico) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de residuos de serilo o treonilo) formados con restos acilo.
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Como "fracciones activas" de IFN-beta, o mutemas y protemas fusionadas, la presente invencion abarca cualquier fragmento o precursor de la cadena polipeptidica de la molecula de protema solo o junto con moleculas asociadas o residuos ligados al mismo, p.ej., residuos de azucar o fosfato, o agregados de la molecula de protema o de los residuos de azucar por sf mismos, a condicion de que dicha fraccion no tenga una actividad significativamente reducida en comparacion con el correspondiente IFN-beta.
El termino "sales" de IFN-beta en la presente memoria hace referencia a sales de grupos carboxilo y a sales de grupos amino de las protemas descritas anteriormente o analogos de las mismas. Pueden formarse sales de un grupo carboxilo por medios conocidos en la materia e incluyen sales inorganicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, ferricas o de cinc y similares, y sales con bases organicas como aquellas formadas, por ejemplo, con aminas tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procama y similares. Las sales de amina incluyen, por ejemplo, sales de acidos minerales tales como, por ejemplo, sales de acido clorhudrico o sales de acido sulfurico, y sales de acidos organicos tales como, por ejemplo, sales de acido acetico o sales de acido oxalico. Por supuesto, cualquiera de dichas sales debe retener la actividad biologica de las protemas (IFN-beta) relevantes para la presente invencion, es decir, la capacidad de unirse al correspondiente receptor e iniciar la senalizacion de receptor.
De acuerdo con la presente invencion, se prefiere particularmente el uso de IFN-beta humano recombinante como ingrediente activo de la invencion.
De acuerdo con la presente solicitud, se prefiere particularmente el uso de interferon beta-1a.
Definicion del polimero de poli(acido glutamico) injertado
El polfmero de poli(acido glutamico) injertado segun la invencion tiene una cadena principal lineal, o esqueleto, consistente en unidades de acido alfa-glutamico, correspondientes a la estructura (i) siguiente:
imagen1
El polfmero de poli(acido glutamico) injertado segun la invencion porta grupos alfa-tocoferol ligados por un enlace ester a algunos de los grupos carboxflicos pendientes.
Segun una realizacion particular, la distribucion de las unidades de glutamato injertadas con alfa-tocoferol es de tipo aleatorio.
"Tipo aleatorio" significa que las unidades de glutamico injertadas con alfa-tocoferol se distribuyen desigualmente entre la cadena de poli(acido glutamico).
A menos que se especifique otra cosa, el termino "glutamico" hace referencia a "acido glutamico" o "glutamato" a lo largo de la descripcion.
Alfa-tocoferol puede ser D-alfa-tocoferol (forma natural), L-alfa-tocoferol o D,L-alfa-tocoferol (todo racemico, sintetico).
El alfa-tocoferol de la invencion puede ser natural o sintetico. Preferiblemente, el alfa-tocoferol usado en la invencion es sintetico.
Segun una realizacion particularmente preferida, el polfmero de poli(acido glutamico) injertado no incluye otros injertos distintos de unidades de alfa-tocoferol.
En un medio acuoso, las funciones carboxflicas residuales (no injertadas) del polfmero de poli(acido glutamico) injertado son neutras (forma -COOH) o ionizadas (anion -COO-), dependiendo del pH y la composicion. La neutralidad del polfmero injertado requiere por tanto la presencia de un contraion, por ejemplo un cation monovalente inorganico tal como sodio.
Por tanto, en disolucion acuosa, tfpicamente a pH 6 a 8, el polfmero injertado esta principalmente en forma de poli(glutamato) injertado.
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Los poKmeros de poli(acido glutamico) injertados de la invencion tienen la formula (I) siguiente:
imagen2
en la que
■ A representa:
- un grupo -NHR en el que R representa un hidrogeno, un grupo alquilo lineal C2 a C10, ramificado C3 a C6 o un grupo bencilo, o
- una unidad aminoaddica unida al extremo N;
■ B representa un hidrogeno, un grupo acilo C2 a C6, un grupo acilo ramificado C3 a C10 o un piroglutamato;
■ p corresponde al numero medio de monomeros glutamicos portadores de un sustituyente de alfa-tocoferol;
■ s corresponde al numero medio de monomeros glutamicos no injertados.
La relacion de injerto se define como la relacion molar media p/(s+p) de sustituyentes de tocoferol a unidades de glutamico. La relacion p/(s+p) esta entre 4,5 y 5,5 %, preferiblemente es de aproximadamente 5 %.
El grado medio de polimerizacion GP= s+p esta entre 180 y 250, preferiblemente entre 200 y 240, en particular es de aproximadamente 220.
Los polfmeros de poli(acido glutamico) injertados de la invencion pueden obtenerse mediante metodos conocidos por los especialistas en la materia. Pueden obtenerse usando al menos los metodos descritos en la solicitud de patente WO 03/104303, y en particular el metodo siguiente.
Los polfmeros de poli(acido alfa-glutamico) estan comercialmente disponibles, tales como los comercializados por Sigma-Aldrich® con la ref. 386847. Pueden sintetizarse tambien mediante la polimerizacion de antudridos de N- carboxiaminoacidos (NCA) descritos, por ejemplo, en el artfculo "Biopolymers, 1976, 15, 1869" y en el libro de H. R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles", Springer Verlag (1987). Puede hacerse referencia tambien a la patente FR 2.801.226.
El acoplamiento de alfa-tocoferol con algunas de las funciones carboxflicas del polfmero de poli(acido glutamico) se efectua facilmente haciendo reaccionar dicho polfmero con alfa-tocoferol en presencia de un agente de acoplamiento y un catalizador en un disolvente adecuado tal como dimetilformamida (DMF), N-metilpirrolidona (NMP) o dimetilsulfoxido (DMSO). El grado de injerto se controla qmmicamente mediante la estequiometna de los constituyentes y reactivos o el tiempo de reaccion.
Determinacion de la masa, relacion de injerto molar media y grado de polimerizacion del polimero de poli(acido glutamico) injertado
Se define el peso molecular medio por Mp (peso molecular maximo), medido por cromatograffa de exclusion por tamano.
Para medir el peso molecular medio, se precipita la muestra polimerica por acidificacion con acido clortudrico 0,1 N, se liofiliza y entonces se disuelve en NMP para analisis.
Se mide el peso molecular maximo medio absoluto mediante una cromatograffa de exclusion por tamano que comprende tres columnas secuenciales de poliestireno-co-divinilbenceno (5 pm/100 000 A, 5 ps/10.000 Ay 5 pm/1.000 A). Este dispositivo esta conectado con un detector de dispersion de luz a 18 angulos (p.ej. DAWN EOS - Wyatt Technology) y con un refractometro diferencial (p.ej. OptiLab REX - Wyatt Technology).
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La relacion de injerto molar media de alfa-tocoferol en el polfmero de poli(acido glutamico) injertado corresponde a la diferencia entre la relacion de alfa-tocoferol total medida y la relacion de alfa-tocoferol libre medida. La relacion de alfa-tocoferol total se determina por RMN- H, mientras que la relacion de alfa-tocoferol libre se determina por HPLC.
Se efectua la determinacion de la relacion de alfa-tocoferol total mediante RMN-1H con un espectrofotometro (Avance 300) equipado con una sonda de QNP. Se liofiliza la muestra polimerica y se disuelve entonces en acido trifluoroacetico deuterado para analisis.
Se consideran dos senales:
- el pico de aproximadamente 0,6 ppm corresponde a los protones de los cuatro grupos metilo de la cadena alifatica de alfa-tocoferol (12 protones),
- el pico de aproximadamente 4,5-4,7 ppm corresponde al proton en posicion a de la unidad de acido glutamico.
Se integra cada senal y se calibra como 100 el valor integral correspondiente al proton en posicion a de la unidad de acido glutamico.
Se considera a A el valor integral obtenido para la senal correspondiente a los protones de los cuatro grupos metilo de la cadena alifatica de alfa-tocoferol. La relacion de alfa-tocoferol total se da entonces por la ecuacion: % de alfa- tocoferol = A / 12.
Se efectua la determinacion de la relacion de alfa-tocoferol libre por HPLC mediante una columna microBondapak C18 (300 mm de largo, 3,9 mm de diametro interno, rellena con sflice esferica de 10 micrometro de diametro) proporcionada por Waters o similar, acondicionada a 40 °C y eluida en modo isocratico con una fase movil que comprende 25 % en vol. de metanol y 75 % en volumen de acetonitrilo, con un caudal de 1 ml/min.
La fraccion molar Xp de unidades monomericas injertadas con grupos de alfa-tocoferol, que corresponde a la relacion de injerto molar media de grupos alfa-tocoferol, se determina de este modo.
El grado medio de polimerizacion GP se calcula dividiendo el peso molecular medio de una cadena polimerica determinado por cromatograffa de exclusion por tamano como se describe anteriormente entre el peso molecular medio M de una unidad monomerica del porimero: GP= Mp/M
Este peso molecular medio de una unidad es la media de los pesos moleculares de las unidades constitutivas del polfmero, ponderado cada uno por la fraccion molar de esta unidad.
Se considera M1 el peso molecular medio de los monomeros de acido glutamico y M2 el peso molecular medio de los monomeros de acido glutamico injertados con alfa-tocoferol. El peso medio M se da por la siguiente formula:
M = X].M] + X9.M2
Antioxidante
Segun una realizacion particular, la composicion solida de IFN-beta o disolucion acuosa de IFN-beta comprende adicionalmente un antioxidante.
El antioxidante es, por ejemplo, metionina, cistema, acido ascorbico, un ascorbato, acido cftrico o un citrato. Una composicion preferida de la invencion incluye uno o mas antioxidantes diferentes.
El antioxidante de la invencion es preferiblemente metionina. La metionina usada en la invencion es particularmente L-metionina.
En particular, una composicion de la invencion comprende un antioxidante en una relacion en peso/peso de antioxidante/IFN-beta entre 2 y 7.
Lioprotector
Segun una realizacion particular de la invencion, una composicion solida de IFN-beta o una composicion acuosa lfquida de IFN-beta comprende adicionalmente un lioprotector.
El lioprotector es preferiblemente un azucar. Una composicion preferida de la invencion comprende uno o varios azucares diferentes. "Azucar" significa azucares sencillos (monosacaridos) o azucares complejos (cadenas compuestas por varias unidades de azucar tales como diholosidos) pero tambien, por extension, polioles.
Los ejemplos de lioprotectores incluyen lactosa, glucosa, fructosa y sacarosa. Son polioles adecuados, por ejemplo, manitol, xilitol, eritritol, sorbitol y trehalosa, maltodextrina y mezclas de los mismos. Son lioprotectores preferidos manitol o sacarosa, preferiblemente el ultimo.
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Los ejemplos de manitol incluyen diversas purezas de Pearlitol® comercializado por Roquette, especialmente Pearlitol® SD200.
Segun una realizacion preferida, una composicion de la invencion, particularmente una composicion de la invencion que comprende un antioxidante como se define anteriormente, comprende entre 50 y 600 mg de lioprotector por mg de IFN-beta.
Una solucion de IFN-beta acuosa lista para usar contiene ventajosamente metionina en una cantidad de 2 a 7 mg por mg de IFN-beta y sacarosa a una concentracion de 50 a 300 mg/ml.
Una composicion de la invencion que contiene un antioxidante y un lioprotector en disolucion acuosa tiene ventajosamente un pH de 6 a 8, preferiblemente de aproximadamente 7.
Aditivos de ajuste de osmolalidad y pH
Los aditivos que pueden usarse para el ajuste de la osmolalidad de la composicion incluyen, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, lactosa, glucosa, fructosa, sacarosa, manitol, xilitol, eritritol, sorbitol, trehalosa, maltodextrina y mezclas de los mismos.
Los aditivos usados para el ajuste del pH de la composicion incluyen, por ejemplo, un compuesto basico, especialmente una base mineral tal como un hidroxido, particularmente hidroxido de sodio. Pueden usarse tambien acido acetico o acido clortndrico.
Una composicion solida particularmente preferida contiene los siguientes ingredientes en las proporciones indicadas:
a) aproximadamente 0,5 mg de IFN-beta;
b) aproximadamente 22 mg de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles;
c) aproximadamente 1,5 mg de metionina; y
d) aproximadamente 76 mg de sacarosa;
o un multiplo o submultiplo de dichas cantidades.
Las cantidades anteriores pueden multiplicarse, por ejemplo, por un valor entre 0,3 y 5, tal como 0,3, 0,5, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 o incluso mas.
Otra composicion solida particularmente preferida de la invencion es una composicion deshidratada, particularmente un liofilizado, es decir una composicion liofilizada.
Preferiblemente, la naturaleza y cantidades de los ingredientes se seleccionan de tal modo que la composicion acuosa solida sea estable a 5 °C durante al menos 24 meses.
Metodo de fabricacion: Composicion solida de IFN-beta que comprende IFN-beta y polimero de poli(acido glutamico) injertado
La presente invencion proporciona particularmente un metodo para preparar la composicion solida de la invencion que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una disolucion lfquida acuosa de polfmero de poli(acido glutamico) injertado a una concentracion entre 20 y 30 mg/g;
(b) proporcionar una disolucion de IFN-beta a una concentracion entre 1 y 9 mg/ml; en la que esta presente al menos un compuesto seleccionado de un lioprotector, antioxidante y aditivo para el ajuste del pH, en al menos una de las disoluciones de la etapa (a) y la etapa (b);
(c) mezclar las disoluciones obtenidas en la etapa (a) y (b), de tal modo que, despues de mezclar, la composicion:
tenga una concentracion polimerica entre 4 y 16 mg/g, tenga una osmolalidad entre 100 y 250 mOsm/kg, tenga un pH entre 6,5 y 7,5;
(d) esterilizar al menos una vez la mezcla resultante; y
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(e) deshidratar la disolucion, formando dicha composicion solida.
Mas particularmente, la presente invencion proporciona un metodo para preparar una composicion solida que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una disolucion lfquida acuosa de poKmero de poli(acido glutamico) injertado a una concentracion entre 20 y 30 mg/g;
(b) proporcionar una disolucion de IFN-beta a una concentracion entre 1 y 9 mg/ml, preferiblemente a una concentracion de 6 mg/ml; en el que esta presente al menos un compuesto seleccionado de un lioprotector, antioxidante y aditivo para el ajuste del pH, en al menos una de las disoluciones de la etapa (a) y la etapa (b);
(c) mezclar las disoluciones obtenidas en la etapa (a) y (b), de tal modo que, despues de mezclar, la composicion:
• tenga una concentracion polimerica entre 7 y 13 mg/g,
• tenga una osmolalidad entre 100 y 160 mOsm/kg,
• tenga un pH entre 6,8 y 7,2;
(d) esterilizar al menos una vez la mezcla resultante; y
(e) deshidratar la disolucion, formando dicha composicion solida.
Aun mas particularmente, la presente invencion proporciona un metodo para preparar una composicion solida que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una disolucion lfquida acuosa de polfmero de poli(acido glutamico) injertado a una concentracion entre 20 y 30 mg/g;
(b) proporcionar una disolucion de IFN-beta de 6 mg/ml; en la que esta presente al menos un compuesto seleccionado de un lioprotector, antioxidante y aditivo para el ajuste del pH, en al menos una de las disoluciones de la etapa (a) y la etapa (b);
(c) mezclar las disoluciones obtenidas en la etapa (a) y (b), de tal modo que, despues de mezclar, la composicion:
• tenga una concentracion polimerica de 9,7 mg/g,
• tenga una osmolalidad de 136 mOsm/kg,
• tenga un pH de 7,0;
(d) esterilizar al menos una vez la mezcla resultante; y
(e) deshidratar la disolucion, formando dicha composicion solida.
Preferiblemente, la composicion lfquida de la etapa (d) se almacena en reposo durante 2 h o mas, preferiblemente durante 4 h o mas, a temperatura ambiente antes de la deshidratacion.
Segun un metodo preferido, las etapas (a) y (b) pueden conseguirse en botellas de vidrio dotadas de agitadores magneticos, y preferiblemente en equipos escalables bien conocidos tales como tanques bien agitados y agitadores. Los agitadores se seleccionan entre aquellos que inducen flujos axiales o radiales, preferiblemente agitadores que inducen una tension de cizallamiento minima y mas preferiblemente la helice Mixel TT.
Segun una realizacion preferida, se efectua la etapa (d) mediante filtracion esteril y comprende varias etapas de filtracion, preferiblemente dos etapas separadas por al menos 2 h de agitacion a temperatura ambiente. En particular, pueden usarse filtros de 0,2 micrometros, tales como filtros Supor EKV dotados de membranas de polietersulfona de Pall.
Se deshidrata en la etapa (e) la disolucion filtrada obtenida en la etapa (d) mediante cualquier tecnica de deshidratacion bien conocida tal como liofilizacion, atomizacion o evaporacion, preferiblemente liofilizacion.
Segun una realizacion particular, se distribuye la disolucion en matraces o viales antes de la etapa de deshidratacion (e).
Segun otra realizacion particular, se rellenan los matraces o viales con perlas de vidrio.
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Una composicion solida segun la invencion permite, mediante la adicion de un disolvente tal como agua, preparar la correspondiente composicion Kquida. En particular, permite anadir por ejemplo agua para inyecciones (API) para preparar una composicion inyectable lfquida lista para usar.
Metodo para preparar una composicion liquida lista para usar
La invencion proporciona por tanto un metodo para preparar una composicion lfquida lista para usar, que comprende disolver una composicion solida anterior de IFN-beta y polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol e injertado aleatoriamente con sustituyentes de alfa-tocoferol, en el que la relacion de injerto media molar esta entre 4,5 y 5,5 % en moles, conteniendo preferiblemente dicha composicion solida un antioxidante y un lioprotector, en un volumen de diluyente tal que la concentracion de IFN- beta este entre 0,2 y 0,8 mg/ml y la concentracion de polfmero de poli(acido glutamico) injertado este entre 19 y 25 mg/ml en la composicion lfquida lista para usar.
La invencion se refiere tambien por lo tanto a una composicion lfquida acuosa que comprende:
- IFN-beta y
- un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo el mdice de injerto molar medio de 4,5-5,5 % en moles, en el que la relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
En una composicion lfquida preferida de la invencion, la concentracion de IFN-beta esta entre 0,2 y 0,8 mg/ml.
En otra composicion lfquida preferida de la invencion, la concentracion de polfmero de poli(acido glutamico) injertado esta entre l9 y 25 mg/ml.
En una composicion lfquida particularmente preferida de la invencion, la concentracion de IFN-beta esta entre 0,2 y 0,8 mg/ml y la concentracion de polfmero de poli(acido glutamico) injertado esta entre 19 y 25 mg/ml.
Las composiciones lfquidas particularmente preferidas de la invencion contienen los siguientes componentes:
a) aproximadamente 0,5 mg/ml de IFN-beta;
b) aproximadamente 22 mg/ml de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular
medio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles;
c) aproximadamente 1,5 mg/ml de metionina;
d) aproximadamente 76 mg/ml de sacarosa;
o un multiplo o submultiplo de dichas cantidades.
Esta composicion lfquida acuosa tiene preferiblemente un pH de aproximadamente 7 y una osmolalidad de aproximadamente 300 mOsm/kg.
Preferiblemente, la naturaleza y cantidades de los ingredientes se seleccionan de tal modo que la composicion lfquida acuosa tenga una viscosidad menor de 1.000 mPa.s, medida a 20 °C y a un mdice de cizallamiento de 10 s-1.
MATERIALES Y METODOS
Determinacion del tamano de los hidrogeles
El polfmero usado para la invencion es capaz de formar espontaneamente hidrogeles nanometricos altamente hidratados cuando se dispersa en un medio acuoso, en particular en agua, a un pH entre 6 y 8. El IFN-beta se asocia espontaneamente con los hidrogeles.
Se mide el diametro hidrodinamico medio promediado en volumen de los hidrogeles mediante dispersion dinamica de luz segun tecnicas bien conocidas, por ejemplo mediante un equipo Zeta sizer nano-ZS de Malvern o CGS 3 de ALV. En este ultimo caso, el angulo de dispersion es de 140°.
Para conseguir la medida, se disuelve la composicion solida en agua, obteniendo una concentracion polimerica de 22 mg/ml. Se anade entonces NaCl 0,15 M de tal modo que la concentracion polimerica sea de 1 mg/ml. Se agita suavemente la disolucion durante 24 horas y se filtra entonces a traves de dos filtros secuenciales respectivamente de 0,8 y 0,2 pm de tamano de poro, antes del analisis de dispersion dinamica de luz a un pH de entre 6 y 7.
El tiempo de adquisicion de la senal de dispersion es de 10 minutos. Se efectua la medida por triplicado en dos muestras de disolucion. El resultado es la media de las 6 medidas.
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Preferiblemente, segun la presente invencion, los hidrogeles tienen un diametro hidrodinamico medio promediado en volumen de entre 10 y 80 nm, preferiblemente entre 10 y 60 nm, y mas preferiblemente entre 10 y 30 nm.
Metodo de valoracion de la agregacion de IFN-beta
Una composicion adecuada segun la invencion tiene un porcentaje de agregados, medido con la prueba de estres (PE) siguiente, menor del 20 %, preferiblemente menor del 10 %, y mas preferiblemente menor del 5 % de la cantidad total de IFN-beta.
Pueden formarse dos tipos de agregados de IFN-beta: agregados irreversibles que no pueden disociarse por tensioactivos y agregados reversibles que se disocian por tensioactivos.
Se efectua convenientemente la cuantificacion de los agregados irreversibles mediante un metodo de cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS).
Sin embargo, el metodo de SEC-SDS extrae, pero tambien disocia, los agregados reversibles, por ejemplo dfmeros no covalentes de IFN-beta. Obviamente, este metodo no es aplicable a la medida de los agregados reversibles.
Se ha desarrollado un segundo metodo, al que se hace referencia en adelante en la presente memoria como metodo de "transferencia Western", para cuantificar ambos tipos de agregados de IFN-beta.
Prueba de estres (PE):
Se disponen muestras de 0,7 ml de las composiciones recien preparadas para ensayar en viales de 3 ml y se calientan durante 30 min a 90 °C. Se analizan entonces las composiciones por SEC-SDS o por transferencia Western como se describe a continuacion.
Medida de las formas agregadas irreversiblemente por SEC-SDS:
Se ensaya el contenido de agregados irreversibles por comparacion con un patron de IFN-beta que contiene de 1 a
1.5 % de agregados irreversibles. Este patron consiste en IFN-beta agregado en disolucion acuosa a 100 °C durante
3.5 min, y diluido entonces en una disolucion de poli(acido glutamico) injertado.
Se diluyen tanto el patron como las muestras 20 veces en SDS al 2 %.
Se inyectan las muestras en un sistema cromatografico consistente en dos columnas conectadas en serie, TSK-Gel G4000 PWXL + TSK-Gel SuperAW400. La fase movil es una disolucion de PBS 3,3 mM que comprende un 0,3 % de SDS.
Cuando no se detectan agregados irreversibles, o estan por debajo del patron, se indica el contenido de agregado de la composicion como inferior al 2 %.
Cuando el contenido de agregados irreversibles esta por encima del patron, se estima la cuantificacion de agregados mediante la cuantificacion del IFN-beta no agregado (monomero).
Medida de agregados tanto irreversibles como reversibles por transferencia Western
Etapa 1:
Se diluyen 100 ng de composicion de IFN-beta en tampon de Laemmli a pH= 6,8 (0,01 % de SDS, solucion de tampon tris(hidroximetil)aminometano 62,4 mM, 0,06 % de azul de bromofenol, 10 % de glicerol) y se depositan en pocillos que contienen gel de poliacrilamida al 12 %.
Se mezclan tres disoluciones patron, que comprenden 1 ng, 3 ng y 5 ng de IFN-beta, con polfmero de poli(acido glutamico) injertado en la misma proporcion que las muestras para analizar.
Se separan entonces el polfmero de poli(acido glutamico) injertado, IFN-beta y agregados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS). El tampon de circulacion es un "tampon de circulacion XT MES" (Biorad - Ref 1610789) que contiene entre 1 y 2,5 % de SDS.
Etapa 2:
Despues de la migracion de las protemas en el gel, se transfieren las diferentes formas de IFN-beta (monomero y agregados) a una membrana de nitrocelulosa. Se revela entonces espedficamente el IFN-beta usando un anticuerpo primario anti-IFN-beta seguido de un anticuerpo secundario acoplado con fosfatasa alcalina. Se tine entonces la membrana con una mezcla de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3'-indolilo/p-toluidina (BCIP) y cloruro de nitroazul de tetrazolio (NBT), en que se detecta el IFN-beta por los anticuerpos.
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Despues de tenir, los agregados de IFN-beta aparecen como bandas coloreadas bien separadas. La comparacion visual directa de las intensidades de banda permite la determinacion del contenido de agregado en las composiciones ensayadas.
Determinacion del perfil de liberacion in vitro de la composicion segun la invencion.
Se inyectan las composiciones en un material de porosidad controlada a traves del cual circula un tampon sintetico que contiene PBS 10 mM, 2 % de SDS y BSA 30 mg/ml. Se recogen muestras a intervalos regulares (cada 30 minutos para la composicion de la invencion y cada 2 minutos para la composicion que no contiene el polfmero de poli(acido glutamico)) con un recolector de fracciones (FC204 de Gilson) y se analiza por valoracion ELISA (FUJIREBIO ref. KAC1201) el contenido de IFN-beta.
Dependiendo del experimento, puede usarse cualquier version descrita de aqu en adelante.
Prueba in vitro T1
Se efectua la prueba de liberacion in vitro usando un aparato de flujo de temperatura controlada (una celda de flujo de SOTAX - No.3239 - con un diametro de 22,6 mm) rellena de perlas de vidrio de 1 mm de diametro de SOTAX - No. F200-0110 en su parte inferior. Se inyecta una masa constante de disolucion en un material inerte y de porosidad controlada (pieza de espuma de 30 mm de altura y 25 cm de diametro de Carpenter - No. RP30263) localizada en la parte superior de la camara del aparato. Se hace circular un tampon sintetico que contiene PBS 10 mM, 2 % de SDS y BSA 30 mg/ml a traves de esta camara a una temperatura de 37 °C y a un caudal de 0,5 ml/min. Se inyectan 50 pl de la muestra en el material inerte y de porosidad controlada a una profundidad de 0,5 cm usando una jeringuilla de 100 pl dotada de una aguja de 50 mm. Se pesa la jeringuilla antes y despues de la inyeccion para determinar precisamente la cantidad de disolucion inyectada.
Se expresan los resultados como porcentaje de IFN-beta liberado en cada punto temporal frente a la cantidad total de IFN-beta liberado durante 16 horas.
Prueba in vitro T2
Se efectua la prueba de liberacion in vitro usando un aparato de flujo de temperatura controlada (una celda de flujo de SOTAX - No.3239 - con un diametro de 22,6 mm) totalmente rellena de perlas de vidrio de 1 mm de diametro de SOTAX - No. F200-0110 en su parte inferior. Se inyecta una masa constante de disolucion en el lecho de perlas de vidrio (medio inerte y de porosidad controlada). Se hace circular un tampon sintetico que contiene PBS 10 mM, 2 % de SDS y BSA 30 mg/ml a traves de esta camara a una temperatura de 37 °C y a un caudal de 0,5 ml/min. Se inyectan 50 pl de la muestra en el material inerte y de porosidad controlada a una profundidad de 0,5 cm usando una jeringuilla de 100 pl dotada de una aguja de 50 mm. Se pesa la jeringuilla antes y despues de la inyeccion para determinar precisamente la cantidad de disolucion inyectada.
Se expresan los resultados como porcentaje de IFN-beta liberado en cada punto temporal frente a la cantidad total de IFN-beta liberado durante 15 horas.
La invencion se describira ahora mediante las siguientes figuras, ejemplos y experimentos.
FIGURAS
La Figura 1 representa la concentracion plasmatica de IFN-beta liberado en funcion del tiempo, en la que: ©©representa la concentracion plasmatica de IFN-beta liberado de la composicion lfquida F,
♦♦representa la concentracion plasmatica de IFN-beta liberado de la composicion de liberacion inmediata, PREPARACIONES
Preparacion 1: PoKmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 220 injertado con aproximadamente 5 % en moles de alfa-tocoferol (polimero P1)
Se preparo como sigue una disolucion acuosa de polimero de poli(acido glutamico) injertado con un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 220 injertado con aproximadamente 5 % en moles de alfa-tocoferol:
Se disolvieron 15 g de poli(acido alfa-L-glutamico), que tiene un GP de aproximadamente 220 obtenido por polimerizacion de NCAGluOMe seguida de hidrolisis, en 288 ml de dimetilformamida (DMF) y se calento a 80 °C. Se enfrio la disolucion a 15 °C y se anadieron sucesivamente 2,5 g de alfa-tocoferol racemico (> 98 % obtenido en Fluka®) disueltos en 8 ml de DMF, 280 mg de 4-dimetilaminopiridina disueltos en 1 ml de DMF y 1,6 g de diisopropilcarbodiimida disueltos en 6 ml de DMF. Despues de 3,5 h de agitacion, se neutralizo el medio de reaccion con hidroxido de sodio acuoso. Se purifico entonces el polimero por ultrafiltracion usando una membrana de 1 kDa y se concentro a aproximadamente 30 mg/ml. Se filtro la disolucion a traves de una membrana de 0,22 pm y se almaceno a 5 °C antes del uso en la siguiente etapa. El rendimiento era de aproximadamente 85 % del polimero P1.
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Se encontro que el peso molecular maximo absoluto (Mp) medido por un detector de dispersion de luz a 18 angulos (MALLS) conectado con una cromatograffa de exclusion por tamano organica era de 31.000 g/mol. La relacion de injerto de alfa-tocoferol, estimada por espectroscopia de RMN de proton, era de 5,1 % en moles.
Preparacion 2: Disolucion de IFN-beta
Se concentro una disolucion diluida de IFN-beta en tampon acetato 50 mM (Merck Serono, Suiza - 0,377 mg/ml o 0,399 mg/l dependiendo de los lotes de disolucion) mediante ultrafiltracion frontal a temperatura ambiente, procurando una disolucion de IFN-beta concentrada a 6 mg/ml.
Preparacion 3: Disolucion de excipientes
Se disolvieron 4,7 g de metionina, 229,3 g de sacarosa y 4,6 g de disolucion de hidroxido de sodio 1 N en 1645,4 g de agua para inyecciones (API). Se mantuvo la disolucion resultante con agitacion moderada durante 15 min a temperatura ambiente.
Preparacion 4: Preparacion de una composicion liquida acuosa de poKmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1526,0 g de la disolucion de excipientes obtenida en la Preparacion 3 a 1974,0 g de disolucion de polfmero P1 (disolucion de polfmero P1 28,2 mg/ml) obtenida mediante el metodo descrito en la Preparacion 1. Se agito suavemente esta disolucion durante al menos 15 min a temperatura ambiente.
Se anadieron 145 g de disolucion de IFN-beta 6 mg/ml de la Preparacion 2 a 2409,4 g de la disolucion intermedia anterior. Se agito la mezcla resultante a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de esterilizar por filtracion usando filtros de 0,2 pm.
Preparacion 5: Preparacion de una composicion liquida acuosa de poKmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se preparo la Preparacion 5 usando un protocolo similar al descrito para la Preparacion 4, usando 2227,8 g de disolucion de polfmero P1 y ajustando consiguientemente las cantidades de excipientes y IFN-beta para obtener al final de esta etapa una disolucion que tiene la misma composicion y pH que la Preparacion 4.
Preparacion 6: Preparacion de una composicion liquida acuosa de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se preparo la Preparacion 6 usando un protocolo similar al descrito para la Preparacion 4, usando 1553,4 g de la disolucion de excipientes obtenida en la Preparacion 3, 1688,6 g de disolucion de polfmero P1 y 1450,1 g de agua para inyecciones (API).
Se anadieron 177,9 g de disolucion de IFN-beta 6 mg/ml de la Preparacion 2 a 4682,1 g de la disolucion intermedia anterior. Se agito la mezcla resultante a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de esterilizar por filtracion usando filtros de 0,2 pm.
Preparacion 7: Polimero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 100 injertado con aproximadamente 5 % en moles de alfa-tocoferol (polimero P2)
Se preparo una disolucion acuosa de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 100 injertado con aproximadamente 5 % en moles de alfa-tocoferol usando un protocolo similar al descrito para la Preparacion 1, usando un polfmero de poli(acido glutamico) bruto que tiene un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 100.
Se estimo que el peso molecular maximo (Mp) era de aproximadamente 15.000 g/mol. La relacion de injerto de alfa- tocoferol, estimada como se describe en el metodo anterior, era de aproximadamente 5 % en moles.
Preparacion 8: Preparacion de una composicion liquida acuosa de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se preparo la Preparacion 8 usando un protocolo similar al descrito para la Preparacion 6, usando 8,5 g de disolucion de polfmero P1 y ajustando consiguientemente las cantidades de excipientes y IFN-beta para obtener al final de esta etapa una disolucion que tiene la misma composicion y pH que la Preparacion 6.
Preparacion 9: Preparacion de una composicion liquida acuosa de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta fuera del alcance de la invencion
Se prepara una disolucion de excipientes segun un protocolo similar al de la Preparacion 3, usando 0,02 g de metionina, 0,96 g de sacarosa y 9,01 g de agua para inyecciones (API). Se anadieron 8,42 g de la disolucion de excipientes anterior a 9,66 g de agua para inyecciones (API) y a 7,31 g de disolucion del polfmero P2 (disolucion del
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poKmero P2 46,7 mg/ml) obtenida mediante el metodo descrito en la Preparacion 7. disolucion durante al menos 15 min a temperature ambiente.
Se anadieron 0,96 g de disolucion de IFN-beta 6 mg/ml de la Preparacion 2 a 25,33 g anterior. Se agito la mezcla resultante a temperatura ambiente durante al menos 2 h.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Preparacion de una composicion solida de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se dejo reposar durante 16 h la disolucion obtenida en la Preparacion 4, se dividio entonces en viales de 5 ml y se
relleno cada uno con 2,06 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofilizo entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo SMH-150) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 72 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Ejemplo 2: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua para inyecciones por vial de producto liofilizado del Ejemplo 1 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una disolucion de la invencion. Se dan las caractensticas de esta disolucion reconstituida en el Experimento 1 siguiente.
Ejemplo 3: Preparacion de una composicion solida de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se dejo reposar durante 16 h la disolucion obtenida en la Preparacion 5, se dividio entonces en viales de 5 ml y se
relleno cada uno con 2,06 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofilizo entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo SMH-150) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 72 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Ejemplo 4: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua para inyecciones por vial de producto liofilizado del Ejemplo 3 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una composicion de la invencion. Se dan las caractensticas de esta disolucion reconstituida en el Experimento 1 siguiente.
Ejemplo 5: Preparacion de una composicion solida de polimeros de poli(acido glutamico) injertados e IFN- beta de la invencion
Se dejo reposar durante 2 h la mezcla final de la disolucion obtenida en la Preparacion 6, se dividio entonces en viales de 5 ml y se relleno cada uno con 3,08 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofiliza entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo SMH-150) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 96 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Ejemplo 6: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua p.p.i. para inyecciones por vfal de liofilizado del Ejemplo 5 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una disolucion reconstituida de la invencion. Se dan las caractensticas de esta disolucion reconstituida en el Experimento 1 siguiente.
Ejemplo 7: Preparacion de una composicion solida de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se dejo reposar durante 2 h la mezcla final de la disolucion obtenida en la Preparacion 8, se dividio entonces en viales de 5 ml y se relleno cada uno con 3,08 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofiliza entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo PL45) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 98 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Se agito suavemente esta de la disolucion intermedia
Ejemplo 8: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua p.p.i. para inyecciones por vial de liofilizado del Ejemplo 7 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una disolucion reconstituida de la invencion cuya composicion teorica se da 5 en la Tabla A siguiente.
Tabla A - Caracteristicas de las formulaciones del Ejemplo 8 de la invencion
Analisis
Ejemplo 8
CIFN-beta (mg/ml)
0,5
Cpoi (mg/ml)
22
Ejemplo 9: Preparacion de una composicion solida de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta fuera del alcance de la invencion
10 Se dejo reposar durante 2 h la mezcla final de la disolucion obtenida en la Preparacion 9, se dividio entonces en viales de 5 ml y se relleno cada uno con 3,08 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofiliza entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo PL45) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 98 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Ejemplo 10: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) 15 injertado e IFN-beta fuera del alcance de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua p.p.i. para inyecciones por vial de liofilizado del Ejemplo 9 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una disolucion reconstituida de la invencion cuya composicion teorica se da en la Tabla B siguiente.
Tabla B - Caracteristicas de las formulaciones del Ejemplo 10 fuera del alcance de la invencion
Analisis
Ejemplo 10
CIFN-beta (mg/ml)
0,5
Cpoi (mg/ml)
30
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EXPERIMENTOS
Experimento 1: Caracterizacion de composiciones liquidas acuosas de los Ejemplos 2, 4 y 6
Concentracion de IFN-beta
Se midio la concentracion de IFN-beta (CiFN-beta) por HPLC (columna C4 en fase inversa Symmetry300) con un 25 gradiente de elucion con fases compuestas por agua/acetonitrilo + 0,1 % de acido trifluoroacetico (TFA) + polioxietileno(23)laurileter 0,4 g/l (fase A 70/30; fase B 0/100). Se realizo una extraccion preliminar de la muestra con una disolucion de seroalbumina bovina 6 g/l segun un factor de dilucion de 3.
Se efectuo la cuantificacion de IFN-beta en las composiciones frente a un intervalo patron de IFN-beta.
Concentracion de polfmero
30 Se efectuo una hidrolisis acida total de la muestra. Se derivatizo el producto con orto-ftalaldehndo y se analizo por HPLC en fase inversa, determinando la concentracion de polfmero Cpol.
Osmolalidad
Se determino la osmolalidad de la composicion usando un osmometro Fiske (MARK3).
Se dan en la Tabla 1 los resultados obtenidos:
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Analisis
Ejemplo 2 Ejemplo 4 Ejemplo 6
CIFN-beta (mg/ml)
0,51 0,50 0,48
Cpoi (mg/ml)
22 22 22
pH
6,9 6,9 7
Osmolalidad (mOsm/kg)
318 308 306
Viscosidad (mPa.s)
48 53 21
Tamano de partfcula (nm)
18 17 17
Experimento 2: Actividad antivirica
Se valoro la actividad antivirica de IFN-beta mediante una prueba de inhibicion del efecto citopatico; esta prueba esta basada en la capacidad del IFN-beta de proteger a celulas WISH (celulas amnioticas de origen humano) de la accion citopatogenica del VSV (virus de estomatitis vesicular). La interpretacion de la prueba esta basada en el hecho de que muchos virus tales como VSV conducen a la muerte celular, que puede cuantificarse indirectamente tinendo celulas vivas. Por lo tanto, el efecto citopatico puede usarse para cuantificar la proteccion por interferon. La valoracion indirecta de la muerte celular esta basada en la medida de la viabilidad, estimada por la cantidad de sales de tetrazolio (MTT) que penetran en las celulas vivas. El metodo implica determinar el porcentaje de celulas protegidas con un espectrofotometro automatico y analisis segun el modelo de lmeas paralelas de 3 puntos para la evaluacion estadfstica del tttulo de IFN.
Protocolo:
Se efectuo la prueba en placas de microvaloracion.
a. Se anadio un pequeno volumen de medio de cultivo (MEM / 5 % de FBS) a cada pocillo.
b. En la placa, se efectuaron tres diluciones sucesivas (oscilacion de 1,5 de una fila a otra) para la muestra de interferon beta y la disolucion patron, de modo que se obtengan tres concentraciones de interferon beta (0,08 ng/ml, 0,12 ng/ml, 0,l8 ng/ml) colocadas en la curva de dosis y respuesta lineal.
c. Se anadio una suspension de celulas WISH (4*104 celulas/pocillo) a cada pocillo y se incubaron las placas a 37 °C durante 18-22 h en un incubador bajo 5 % de CO2 humidificado.
d. Se anadio una suspension de VSV a cada pocillo, excepto en los pocillos de control que contienen solo MEM / 2,5 % de FBS.
e. Se incubaron las placas a 37 °C durante 20 a 28 h en un incubador bajo 5 % de CO2 humidificado.
f. Despues de la verificacion por microscopia invertida de que:
(1) en la fila del control vmco positivo al menos un 80 % de las celulas monan y
(2) el porcentaje medio de proteccion en presencia del patron de IFN-beta es de aproximadamente 84 % para el patron no diluido, 45% para dilucion a 1/1,5 y 27 % para dilucion a 1/3,
se marcan los cultivos con el tinte MTT espedfico.
g. Se determina la intensidad del color midiendo la densidad optica (DO) a 595 nm usando un espectrofotometro automatico.
h. Para cuantificar la actividad de IFN-beta, se analizan entonces las medidas de densidad optica (DO) usando software informatico (Colombo).
Se dan en la Tabla 2 los resultados obtenidos:
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Ejemplo 2 Ejemplo 4
Actividad antivmca en MUI/ml (% de recuperacion) *
125,4 (96) 129,8 (101)
* Porcentaje de recuperacion obtenida frente a la actividad teorica esperada para la protema nativa a la misma concentracion y en las mismas condiciones que la prueba antivmca.
Estos resultados evidencian que la actividad antivmca de la protema IFN-beta de las composiciones de los Ejemplos 2 y 4 de la invencion se conserva en un 100 %.
Experimento 3: Evaluacion de la agregacion de IFN-beta
Valoracion del porcentaje de formas agregadas irreversibles por cromatograffa de exclusion en presencia de dodecilsulfato de sodio (SeC-SDS)
Se determino el porcentaje de formas agregadas irreversibles de IFN-beta en las muestras mediante cromatograffa de exclusion por tamano. El sistema cromatografico consiste en dos columnas conectadas en serie (TSK-Gel G4000PWXL + TSK-Gel SuperAW400) y una fase movil que contiene un detergente, dodecilsulfato de sodio (SDS), (0,3 % de SDS - tampon PBS 3,3 mM).
Se evalua el contenido de agregado irreversible de las composiciones por comparacion con un patron de IFN-beta que contiene de 1 a 1,5 % de dfmeros irreversibles. Este patron consiste en IFN-beta agregado a 100 °C durante 3,5 min diluido en una matriz que reproduce la muestra. Se diluyeron el patron y las muestras 20 veces en SDS al 2 % antes del analisis.
Se compara el perfil cromatografico de cada muestra con el perfil del material agregado patron. Cuando no se detectan agregados irreversibles en la muestra para tratar, o estan por debajo del patron, se da el contenido de agregado de la muestra como por debajo de 2 %.
Cuando el contenido de agregados irreversibles esta por encima de patron, se estima la cuantificacion de agregados mediante la cuantificacion del IFN-beta no agregado (monomero).
Porcentaje de formas agregadas por el metodo de transferencia Western (TW)
Se valoro tambien el porcentaje de formas agregadas de IFN-beta en las muestras por transferencia Western. Se diluyeron 100 ng de muestras de IFN-beta en tampon de Laemmli a pH= 6,8 (0,01 % de SDS, Tris 62,4 mM, 0,06 % de azul de bromofenol, 10 % de glicerol) y se depositaron en los pocillos de un gel de poliacrilamida al 12 %. Para cuantificar el mdice de agregados de las muestras analizadas, se deposito una serie de tres patrones de monomeros de disolucion bruta de IFN-beta en diferentes pocillos del gel para el analisis de cada muestra. Los tres patrones inclrnan 1 ng, 3 ng y 5 ng de IFN-beta por pocillo, correspondientes respectivamente a 1 %, 3 % y 5 % en comparacion con 100 ng de IFN-beta depositado para las muestras. Se depositaron estos patrones despues de la mezcla improvisada de la disolucion bruta de IFN-beta con el poffmero P1 a la misma relacion que las composiciones de IFN-beta y poffmero P1 de la invencion para analizar.
En una primera fase, se separaron las muestras por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS).
En una segunda fase, despues de la migracion del poffmero de poli(acido glutamico) injertado, el IFN-beta y los agregados en el gel, se separaron y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Se revelo entonces espedficamente el IFN-beta usando un anticuerpo primario anti-IFN-beta seguido de un anticuerpo secundario acoplado con fosfatasa alcalina. Se tino entonces la membrana con una mezcla de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3'- indolilo/p-toluidina (BCIP) y cloruro de nitroazul de tetrazolio (NBT), en que se detecto el IFN-beta por los anticuerpos.
Despues de tenir, se determino la relacion de agregados en las composiciones ensayadas comparando visualmente las intensidades de las bandas de patrones y de la posible banda de agregados.
Se dan en la Tabla 3 los resultados obtenidos:
Valoracion de las formas agregadas de IFN-beta
Ejemplo 2 Ejemplo 4
% de formas agregadas (TW)
no medido <1
% de formas agregadas (SEC-SDS)
<2 <2
Experimento 4: Valoracion de la agregacion de IFN-beta en una composicion de la invencion
Se preparo una composicion Ifquida acuosa como se describe en el Ejemplo 2, que contiene aproximadamente 0,5 5 mg/ml de IFN-beta y 22 mg/ml de poffmero de poli(acido glutamico) injertado.
Se comparo el contenido de agregados de la composicion acuosa con el de una disolucion de referencia de IFN-beta 0,4 mg/ml que no contema poffmero de poli(acido glutamico) injertado.
Se dispusieron 0,7 ml de cada una de las composiciones ensayadas en viales de 3 ml y se calentaron las disoluciones durante 30 min a 90 °C.
10 i) Cromatograffa de exclusion por tamano
Despues de calentar, se analizo cada composicion por cromatograffa de exclusion por tamano en presencia de SDS como se describe en el Experimento 3. Se calculo el pico correspondiente al IFN-beta no modificado (monomero) a partir de una serie de patrones de IFN-beta que engloban la concentracion descrita.
Se dan en la Tabla 4 los resultados obtenidos:
15 Tabla 4 - Valoracion de la agregacion
Pico de monomero de IFN-beta antes del calentamiento Pico de monomero de IFN-beta despues de 30 min de calentamiento
(%) (%)
Disolucion de la invencion
100 108
Disolucion de referencia
100 44
Estos resultados muestran claramente que elrna un 100 % del IFN-beta como IFN-beta monomerico en la composicion calentada de la invencion, mientras que permanece solo un 44 % en la disolucion de control.
ii) Transferencia Western
20 Se evaluo tambien la presencia o ausencia de agregados de IFN-beta en las muestras por transferencia Western (metodo descrito en el Experimento 3).
El analisis de la membrana despues de la tincion revela la presencia de agregados en la disolucion de referencia (no segun la invencion) calentada durante 30 min a 90 °C, y revela adicionalmente una disminucion de la cantidad de monomero respecto a la muestra no calentada de disolucion de referencia. En cambio, para la muestra calentada de 25 la composicion de la formulacion segun la invencion, no se detecto agregado, y la cantidad de monomero era identica a la de la muestra de una composicion no calentada segun la invencion.
Este segundo metodo confirma la ausencia de agregados en la composicion de la invencion.
En conclusion, las pruebas anteriores prueban que una composicion de la invencion previene la agregacion de IFN- beta.
30 Experimento 5: Estabilidad de composiciones liofilizadas de la invencion
Se dispusieron viales que conteman las composiciones solidas de los Ejemplos 1 y 3 en camaras mantenidas a 5 y 25 °C.
Se sacaron los viales en diferentes momentos y se reconstituyeron con agua como se describe en los Ejemplos 2 y 4. Se analizaron las composiciones lfquidas usando los metodos descritos en los experimentos anteriores y se presentan los resultados en las Tablas 5 y 6.
Tabla 5 - Estabilidad de las composiciones de los Ejemplos 1 y 3 mantenidos a 5 °C
Analisis
Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
CIFN-beta
T=0 0,51 0,50
en mg/ml
1 mes 0,49 0,51
2 meses 0,50 no medido
3 meses 0,53 0,50
6 meses 0,51 0,52
9 meses 0,52 0,48
12 meses 0,50 0,49
18 meses 0,54 0,53
24 meses 0,53 no medido
Cpol
T=0 22 22
en mg/ml
1 mes 21 no medido
2 meses 21 no medido
3 meses 23 22
6 meses 22 22
9 meses 22 22
12 meses 21 22
18 meses 22 22
24 meses 22 no medido
pH
T=0 6,9 6,9
1 mes 7,0 7,0
2 meses 6,9 no medido
3 meses 6,9 6,9
6 meses 6,9 6,9
9 meses 6,8 6,9
Analisis
Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
12 meses 7,0 7,0
18 meses 6,9 6,9
24 meses 6,8 no medido
Osmolalidad
T=0 318 308
en mOsm/kg
1 mes 319 307
2 meses 281 no medido
3 meses 311 306
6 meses 300 308
9 meses 296 294
12 meses 306 300
18 meses 305 306
24 meses 305 no medido
Actividad antivmca
T=0 no medido 129,8 (101)
en MUI/ml (% de recuperacion)
1 mes no medido 121,9 (95)
2 meses
no medido no medido
3 meses no medido 125,6 (98)
6 meses no medido 134,3 (105)
9 meses no medido 123,6 (97)
12 meses 125,4 (96) 131 (102)
18 meses no medido 136,6 (107)
24 meses 137,6 (106) no medido
% de formas agregadas (TW)
T=0 no medido <1
1 mes no medido <1
2 meses no medido no medido
3 meses no medido <1
6 meses <1 <1
9 meses <1 <1
Analisis
Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
12 meses <1 <1
18 meses <1 <1
24 meses <1 no medido
% de formas agregadas (SEC-SDS)
T=0 <2 <2
1 mes <2 <2
2 meses <2 no medido
3 meses <2 <2
6 meses <2 <2
9 meses <2 <2
12 meses <2 <2
18 meses <2 <2
24 meses <2 no medido
Tamano de partfcula
T=0 18 17
en nm
1 mes 17 18
3 meses 19 17
6 meses 18 17
9 meses 18 18
12 meses 18 18
18 meses 18 17
24 meses 18 no medido
Tabla 6 - Estabilidad de las composiciones de los Ejemplos 1 y 3 mantenidos a 25 °C
Analisis
Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
CIFN-beta en mg/ml
T=0 0,51 0,50
1 mes
0,48 0,51
2 meses
0,48 0,50
3 meses
0,53 0,50
Analisis
Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
6 meses 0.53 0,51
Cpol
T=0 22 22
en mg/ml
1 mes 22 22
2 meses 22 22
3 meses 22 22
6 meses 22 22
PH
T=0 6,9 6,9
1 mes 6,9 7,0
2 meses 6,9 6,9
3 meses 6,9 6,9
6 meses 6,9 6,9
Osmolalidad
T=0 318 308
en mOsm/kg
1 mes 333 305
2 meses 316 310
3 meses 324 307
6 meses 312 299
Actividad antivmca
T=0 no medido 129,8 (101)
en MUI/ml (% de recuperacion)
1 mes no medido 130,1 (102)
2 meses
no medido 130,0 (102)
3 meses 121,5 (93) 123,6 (97)
6 meses no medido 124,7 (97)
% de formas agregadas
T=0 no medido <1
(TW)
1 mes no medido <1
2 meses no medido <1
3 meses no medido <1
6 meses <1 <1
% de formas agregadas
T=0 <2 <2
Analisis
Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
(SEC-SDS)
1 mes <2 <2
2 meses <2 <2
3 meses <2 <2
6 meses <2 <2
Tamano de partfcula
T=0 18 17
en nm
1 mes 19 18
2 meses 19 18
3 meses 18 19
6 meses 17 18
Los valores anteriores prueban claramente que las composiciones liofilizadas de la invencion son estables durante un periodo de al menos 24 meses a 5 °C y al menos 6 meses a 25 °C. En particular, son estables frente a la agregacion de IFN-beta, como se muestra por el porcentaje de monomero de IFN-beta restante superior al 98 % 5 durante el mismo periodo, mientras que la bioactividad del iFN-beta antivmco asf formulado no cambia.
Experimento 6: Farmacocinetica de composiciones segun la invencion en monos Cynomolgus
Se ensayaron una composicion lfquida F preparada como se describe en el Ejemplo 2 y una formulacion comercial de liberacion inmediata (FCLI).
Se administraron ambas composiciones por via subcutanea a una dosis de 84 mg/kg en un volumen de 0,17 ml/kg a 10 24 monos divididos en 6 grupos.
Se dan en la Tabla 7 los resultados obtenidos:
Tabla 7 - Farmacocinetica comparada
Composicion
Cmax (pg/ml) Tmax (h) AUC 0-t (ng.h/ml) T > LID (h) BDR (%)
FCLI
1155 0,75 14,6 51 100
Composicion F
2199 48 91,5 122 52
BDR: biodisponibilidad relativa comparada con la forma de liberacion inmediata.
Cmax: concentracion plasmatica maxima.
tmax: tiempo al que la concentracion plasmatica es maxima.
ABC : area bajo la curva.
T> LID (limite inferior de deteccion): periodo durante el cual el ingrediente activo es detectable.
La biodisponibilidad de IFN-beta en la composicion lfquida F era del 52 % de la de la composicion de liberacion 15 inmediata. El IFN-beta era detectable mucho mas tiempo en la composicion lfquida F que en la composicion de liberacion inmediata.
Como se muestra en la Figura 1, el perfil plasmatico de IFN-beta liberado de la composicion lfquida F se extiende durante un periodo de al menos 120 h. Esta formulacion permite una administracion semanal a los pacientes.
Experimento 7: Caracterizacion del perfil de liberacion in vitro de las composiciones segun la invencion en comparacion con una composicion fuera del alcance de la invencion usando la prueba T1
Se prepararon las composiciones Ifquidas como se describe en los Ejemplos 2 y 4 y se ensayaron adicionalmente usando la prueba T1. Para cada composicion lfquida, se repitio la prueba in vitro 6 veces. Se preparo una disolucion 5 lfquida fuera del alcance de la invencion, a saber que comprende solo 0,5 mg/ml de IFN-beta, y obtenida mediante la simple disolucion de la disolucion de IFN-beta en un tampon de acetato de sodio 50 mM para comparacion. Se ensayo la disolucion de IFN-beta fuera del alcance de la invencion 3 veces en la misma prueba de T1.
Resultados:
Se da en la Tabla 8 la cantidad de IFN-beta acumulada liberada por cada composicion ensayada:
10 Tabla 8 - Cantidad acumulada de IFN-beta liberado de las composiciones en funcion del tiempo (% de IFN beta liberado frente a cantidad de IFN-beta inicial inyectado en la prueba in vitro- media de 6 o 3 ensayos)
Composiciones
Disolucion de IFN-beta 0,5 mg/ml sin polimero de poli(acido glutamico) injertado (%) Composicion liquida del Ejemplo 2 segun la invencion (%) Composicion liquida del Ejemplo 4 segun la invencion (%)
Tiempo (h)
0,03
0,3 no medido no medido
0,10
31,4 no medido no medido
0,13
52,1 no medido no medido
0,17
61,7 no medido no medido
0,20
73,6 no medido no medido
0,27
88,1 no medido no medido
0,30
91,8 no medido no medido
0,33
94,3 no medido no medido
0,37
95,7 no medido no medido
0,40
96,9 no medido no medido
0,47
98,4 no medido no medido
0,50
no medido 2,7 4,7
0,60
100 no medido no medido
1
- 12,3 15,8
1,5
- 20,5 25,2
2
- 27,7 33,2
2,5
- 34,7 40,8
3
- 41,7 47,8
3,5
- 48,6 54,6
Composiciones
Disolucion de IFN-beta 0,5 mg/ml sin polimero de poli(acido glutamico) injertado (%) Composicion liquida del Ejemplo 2 segun la invencion (%) Composicion liquida del Ejemplo 4 segun la invencion (%)
Tiempo (h)
4
- 55,3 61,0
4,5
- 62,0 67,2
5
- 68,0 73,0
5,5
- 73,8 78,3
8
- 79,3 83,1
7
- 87,9 90,3
8
- 93,0 95,7
9
- 95,8 98,5
12
- 99,9 99,9
16
- 100,0 100,0
22
- 100,0 100,0
Se libero IFN-beta a un nivel del 50 % en pocos minutos de la disolucion de IFN-beta sin polfmero de poli(acido glutamico) injertado, mientras que se libero la misma cantidad de las composiciones lfquidas segun la invencion despues de mas de 2 horas.
5 La liberacion de IFN-beta era mucho mas prolongada en una composicion de la invencion comparada con una disolucion de IFN-beta.
Experimento 8: Caracterizacion del perfil de liberacion in vitro de una composicion segun la invencion en comparacion con composiciones fuera del alcance de la invencion usando la prueba T2
Se prepararon las composiciones lfquidas como se describe en los Ejemplos 8 y 10 y se ensayaron adicionalmente 10 usando la prueba T2. Para cada composicion lfquida, se repitio la prueba in vitro 3 veces.
Resultados:
Se da en la Tabla 9 la cantidad de IFN-beta acumulada liberado por cada composicion ensayada:
Tabla 9 - Cantidades acumuladas de IFN-beta liberado de las composiciones en funcion del tiempo (% de IFN-beta liberado frente a cantidad de IFN-beta inicial inyectado en la prueba in vitro- media de 3 ensayos)
Composiciones
Composicion liquida del Ejemplo 8 segun la invencion (%) Composicion liquida del Ejemplo 10 fuera del alcance de la invencion (%)
Tiempo (h)
0,50
5,6 27,5
1
24,2 82,6
1,5
51,2 96,9
2
66,9 98,1
Composiciones
Composicion liquida del Ejemplo 8 segun la invencion (%) Composicion liquida del Ejemplo 10 fuera del alcance de la invencion (%)
Tiempo (h)
2,5
79,3 98,3
3
88,5 98,3
3,5
94,8 98,4
4
97,5 98,4
4,5
98,8 98,4
5,5
98,9 98,5
7,5
99,3 98,5
11,5
100,0 99,7
15
100,0 100,0
Se libero IFN-beta a un nivel del 60 % en menos de 1 h de la composicion Kquida fuera del alcance de la invencion (Ejemplo 10), mientras que se libero la misma cantidad de las composiciones Kquidas segun la invencion despues de mas de 1,5 horas (Ejemplo 8).
5 La liberacion de IFN-beta era mucho mas prolongada en una composicion de la invencion comparado con las composiciones lfquidas fuera del alcance de la invencion.
REFERENCIAS
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4. Pestka, S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations", en "Methods in Enzymology" (S. Pestka, ed.), Academic Press, Nueva York 119, 14-23.
5. Rubinstein, S.,Familletti, P.C. y Pestka, S. "Convenient Assay for Interferons". J. Virol. 1981; 37, 755-758.
15 6. Shepard H. M. et al., Nature 1981; 294, 563-565.

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion farmaceutica solida que comprende:
    - interferon beta (IFN-beta) y
    - un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y
  2. 40.000 g/mol injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo el mdice de injerto molar medio de 4,5-5,5 % en moles, en la que la relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
  3. 2. La composicion segun la reivindicacion 1, en la que la relacion de injerto molar media de sustituyentes de alfa-tocoferol es de aproximadamente 5 %.
  4. 3. La composicion segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende adicionalmente un antioxidante a una relacion en peso/peso de antioxidante/IFN-beta entre 2 y 7.
  5. 4. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un lioprotector a una relacion en peso/peso de lioprotector/IFN-beta entre 50 y 600.
  6. 5. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente:
    - metionina en una relacion en peso/peso de metionina/IFN-beta entre 2 y 7;
    - sacarosa en una relacion en peso/peso de sacarosa/IFN-beta entre 50 y 600.
  7. 6. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:
    a) aproximadamente 0,5 mg de IFN-beta;
    b) aproximadamente 22 mg de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles;
    c) aproximadamente 1,5 mg de metionina; y
    d) aproximadamente 76 mg de sacarosa;
    o un multiplo o submultiplo de dichas cantidades.
  8. 7. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un liofilizado.
  9. 8. Una composicion lfquida acuosa que comprende:
    - IFN-beta y
    - un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y
  10. 40.000 g/mol injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo el mdice de injerto molar medio de 4,5-5,5 % en moles, en la que la relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
  11. 9. La composicion lfquida de la reivindicacion 8, en la que la concentracion de IFN-beta esta entre 0,2 y 0,8 mg/ml.
  12. 10. La composicion lfquida de las reivindicaciones 8 o 9, en la que la concentracion de polfmero de poli(acido glutamico) injertado esta entre 19 y 25 mg/ml.
  13. 11. La composicion lfquida segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende:
    a) aproximadamente 0,5 mg/ml de IFN-beta;
    b) aproximadamente 22 mg/ml de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular
    medio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles;
    c) aproximadamente 1,5 mg/ml de metionina;
    d) aproximadamente 76 mg/ml de sacarosa;
  14. 12. Un metodo para preparar una composicion solida que comprende IFN-beta y un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes de
    alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles y siendo la relacion en peso/peso entre dicho poUmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta entre 24 y 125, que comprende las siguientes etapas:
    (a) proporcionar una disolucion Kquida acuosa de polfmero de poli(acido glutamico) injertado a una
    5 concentracion entre 20 y 30 mg/g;
    (b) proporcionar una disolucion de IFN-beta a una concentracion entre 1 y 9 mg/ml; en la que esta presente al menos un compuesto seleccionado de lioprotector, antioxidante y aditivo para el ajuste del pH en al menos una de las disoluciones de la etapa (a) y la etapa (b);
    (c) mezclar las disoluciones obtenidas en la etapa (a) y (b), de tal modo que, despues de mezclar, la
    10 composicion:
    15
    • tenga una concentracion de polfmero entre 4 y 16 mg/g,
    • tenga una osmolalidad entre 100 y 250 mOsm/kg,
    • tenga un pH entre 6,5 y 7,5;
    (d) esterilizar al menos una vez la mezcla resultante; y
    (e) deshidratar la disolucion, formando dicha composicion solida.
  15. 13. Una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso en un metodo para el tratamiento terapeutico del cuerpo humano o animal.
  16. 14. Una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso en un metodo de tratamiento terapeutico de enfermedades autoinmunitarias cronicas del sistema nervioso central o de enfermedades 20 neurologicas.
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