ES2563737T3 - Composiciones de IFN-beta, métodos de preparación y usos de las mismas - Google Patents
Composiciones de IFN-beta, métodos de preparación y usos de las mismas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2563737T3 ES2563737T3 ES12721844.4T ES12721844T ES2563737T3 ES 2563737 T3 ES2563737 T3 ES 2563737T3 ES 12721844 T ES12721844 T ES 12721844T ES 2563737 T3 ES2563737 T3 ES 2563737T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- ifn
- beta
- polymer
- grafted
- glutamic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 title claims abstract description 195
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 163
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 50
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 title 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims abstract description 193
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims abstract description 188
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 88
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 claims abstract description 73
- 125000001020 α-tocopherol group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 7
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims description 53
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 claims description 29
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 claims description 28
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 claims description 28
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 claims description 28
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 claims description 27
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 16
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims description 16
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 15
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 12
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 12
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 12
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 11
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 claims description 5
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 claims 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims 1
- -1 poly(glutamic acid) Polymers 0.000 abstract description 12
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 78
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 33
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 22
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 13
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 7
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical class CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 5
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 5
- 239000012729 immediate-release (IR) formulation Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 4
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 4
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical class OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVLOFXJWZQNNRX-UHFFFAOYSA-N 4-methylaniline;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.CC1=CC=C(N)C=C1 LVLOFXJWZQNNRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical class Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 2
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 2
- ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N Met-Met Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCSC ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical class OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- NQIHMZLGCZNZBN-PXNSSMCTSA-N Trp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)N)C(O)=O)=CNC2=C1 NQIHMZLGCZNZBN-PXNSSMCTSA-N 0.000 description 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 2
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010045269 tryptophyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 2
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-QLVXXPONSA-N (S,R,R)-alpha-tocopherol Chemical compound [H][C@@](C)(CCCC(C)C)CCC[C@@]([H])(C)CCC[C@@]1(C)CCC2=C(O1)C(C)=C(C)C(O)=C2C GVJHHUAWPYXKBD-QLVXXPONSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 1-dodecoxydodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCCCCCCCCCCC CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N Arg-His Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N Asn-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N Asn-Gln Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 1
- LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N Gln-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 101001059429 Homo sapiens MAP/microtubule affinity-regulating kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)[C@@H](C)CC BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N L-Met-L-Phe Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102100028920 MAP/microtubule affinity-regulating kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N Met-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- BVZABQIRMYTKCF-JSGCOSHPSA-N Trp-Met Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 BVZABQIRMYTKCF-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N Tyr-Trp Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C([O-])=O)C1=CC=C(O)C=C1 BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N divinylbenzene Substances C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229920000370 gamma-poly(glutamate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229950000038 interferon alfa Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002914 neoplasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 125000002640 tocopherol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 229940074410 trehalose Drugs 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-DYCDLGHISA-N trifluoroacetic acid-d1 Chemical compound [2H]OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-DYCDLGHISA-N 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/215—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
- A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
- A61K9/2018—Sugars, or sugar alcohols, e.g. lactose, mannitol; Derivatives thereof, e.g. polysorbates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Una composición farmacéutica sólida que comprende: - interferón beta (IFN-beta) y - un polímero de poli(ácido glutámico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo el índice de injerto molar medio de 4,5-5,5 % en moles, en la que la relación en peso/peso entre dicho polímero de poli(ácido glutámico) injertado e IFN-beta está entre 24 y 125.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Composiciones de IFN-beta, metodos de preparacion y usos de las mismas CAMPO DE LA INVENClON
La presente invencion se refiere a composiciones de interferon beta (IFN-beta), a sus metodos de preparacion y a la aplicacion de estos para obtener composiciones terapeuticas en forma de unidad de dosificacion que suministren iFN-beta durante un periodo de tiempo prolongado.
Antecedentes de interferones y su estabilizacion
Los interferones son citocinas, es decir, protemas solubles que transmiten mensajes entre las celulas y desempenan un papel esencial en el sistema inmunitario al ayudar a destruir microorganismos que causan infecciones y reparar cualquier dano resultante. Los interferones se secretan naturalmente por celulas infectadas y se identificaron por primera vez en 1957. Su nombre deriva del hecho de que "interfieren" con la replicacion y produccion vmcas.
Los interferones exhiben actividad tanto antivmca como antiproliferativa. En base a las propiedades bioqmmicas e inmunologicas, los interferones humanos de origen natural se agrupan en tres clases principales: interferon alfa, interferon beta e interferon gamma. Ademas, los interferones (IFN) son glucoprotemas producidas por el cuerpo en respuesta a una infeccion vmca. Inhiben la multiplicacion de virus en celulas protegidas. Los IFN, que consisten en una protema de bajo peso molecular, son notablemente no espedficos en su accion, es decir, el IFN inducido por un virus es eficaz contra un amplio intervalo de otros virus. Son, sin embargo, espedficos de especie, es decir, el IFN producido por una especie estimulara solo la actividad antivmca en celulas de la misma o una especie estrechamente relacionada. Los IFN fueron el primer grupo de citocinas que se explotaron por sus potenciales actividades antitumorales y antivmcas.
Los tres IFN principales se denominan IFN-a, IFN-p e IFN-y. Dichos tipos principales de IFN se clasificaron inicialmente segun sus celulas de origen (leucocitos, fibroblastos o linfocitos T). Sin embargo, resulto evidente que varios tipos podrian ser producidos por una celula. De aid que el IFN de leucocitos se llame ahora IFN-a, el IFN de fibroblastos es IFN-p y el IFN de linfocitos T es IFN-y. Hay tambien un cuarto tipo de IFN, el IFN de linfoblastoides, producido en la estirpe celular "Namalwa" (derivada de linfoma de Burkitt), que parece que produce una mezcla de ambos IFN de leucocitos y fibroblastos.
Cada clase de IFN contiene varios tipos distintos. Los IFN-p e IFN-y son cada uno el producto de un solo gen.
El interferon de fibroblastos humanos (IFN-p o IFN-beta) tiene actividad antivmca y puede estimular tambien los linfocitos citotoxicos naturales contra celulas neoplasicas. Es un polipeptido de aproximadamente 20.000 Da inducido por virus y ARN bicatenarios. A partir de la secuencia nucleoddica del gen del interferon de fibroblastos, clonado por tecnologfa de ADN recombinante, (Derynk et al., 1980) dedujeron la secuencia aminoaddica completa de la protema. Es de 166 aminoacidos de largo.
Shepard et al. 1981 describieron una mutacion en la base 842 (Cys ^ Tyr en la posicion 141) que anulaba su actividad antivmca, y una variante del clon con una delecion de los nucleotidos 1119-1121.
Mark et al. 1984 insertaron una mutacion artificial sustituyendo la base 469 (T) por (A), causando un cambio de aminoacidos de Cys ^ Ser en la posicion 17. Se ha resenado que el IFN-beta resultante era tan activo como el IFN- beta 'nativo' y estable durante almacenamiento a largo plazo (-70 °C).
Rebif® (Merck Serono) es interferon beta-1a, producido por estirpes celulares de mairnfero. Su denominacion comun internacional (DCI) recomendada es "interferon beta-1a".
La unidad de interferon o unidad internacional de interferon (U o UI) se define como la cantidad necesaria para proteger al 50 % de las celulas ante el dano vdico; el ensayo que puede usarse para medir la bioactividad es el ensayo de inhibicion del efecto citopatico, como se describio por primera vez por Rubinstein, et al., 1981 y Familletti, P. C., et al., 1981. En este ensayo antivdico de interferon, aproximadamente 1 unidad/ml de interferon es la concentracion necesaria para producir una inhibicion del efecto citopatico del 50 %. Las unidades de IFN-beta se determinan con respecto al patron de referencia internacional para Hu-IFN-beta proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (Pestka, S. 1986).
La unidad de interferon o unidad internacional de interferon (U o UI) se define como la cantidad necesaria para proteger al 50 % de las celulas ante el dano vdico; el ensayo que puede usarse para medir la bioactividad es el ensayo de inhibicion del efecto citopatico, como se describio por primera vez por Rubinstein, et al., 1981 y Familletti, P. C., et al., 1981. En este ensayo antivdico de interferon, aproximadamente 1 unidad/ml de interferon es la concentracion necesaria para producir un efecto citopatico del 50 %. Las unidades de IFN-beta se determinan con respecto al patron de referencia internacional para Hu-IFN-beta proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (Pestka, S. 1986).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Como con todos los productos farmaceuticos basados en protemas, es un obstaculo importante que debe superarse en el uso de IFN-beta como agente terapeutico la perdida de utilidad farmaceutica que puede ser el resultado de su inestabilidad en composiciones farmaceuticas.
Las inestabilidades ffsicas que amenazan la actividad y eficacia proteicas en las composiciones farmaceuticas incluyen la desnaturalizacion y formacion de agregados solubles e insolubles, mientras que las inestabilidades qmmicas incluyen hidrolisis, formacion de imida, oxidacion, racemizacion y desamidacion. Algunos de estos cambios son conocidos por conducir a la perdida o reduccion de la actividad farmaceutica de la protema de interes. En otros casos, los efectos precisos de estos cambios son desconocidos, pero los productos degradativos resultantes siguen siendo considerados farmaceuticamente inaceptables debido al potencial de efectos secundarios indeseables.
La estabilizacion de protemas en composiciones farmaceuticas sigue siendo un campo en que el ensayo y error desempena el papel principal (revisado por Wang (1999) Int. J. Pharm. 185: 129-188; Wang y Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42: S3-S26). Los excipientes que se anaden a las composiciones farmaceuticas proteicas para aumentar su estabilidad incluyen tampones, azucares, tensioactivos, aminoacidos, polietilenglicoles y polfmeros, pero los efectos estabilizantes de estos aditivos qmmicos vanan dependiendo de la protema.
Existe la necesidad de composiciones farmaceuticas de IFN-beta mejoradas que comprendan estabilizantes fisiologicamente compatibles que mejoren la solubilidad de esta protema y estabilicen la protema ante la formacion de agregados, potenciando asf su utilidad farmaceutica.
A pesar de los importantes esfuerzos que se han aplicado al problema, no se han producido todavfa composiciones farmaceuticas de IFN-beta completamente satisfactorias.
Se han descubierto ahora formas de unidad de dosificacion terapeutica que son faciles de preparar, proporcionan una liberacion prolongada de IFN-beta y estan disponibles en forma solida o lfquida.
La invencion
Es un objeto de la presente invencion proporcionar una composicion de liberacion prolongada de interferon beta adecuada para administracion una vez por semana.
Es otro objeto de la presente invencion proporcionar una composicion de liberacion prolongada de IFN-beta que libere un 60 % del IFN-beta durante mas de 120 min, preferiblemente mas de 180 min, usando una prueba in vitro T1 o un 60 % del IFN-beta durante mas de 60 min, preferiblemente mas de 90 min, usando una prueba in vitro T2, descritas a continuacion.
Es otro objeto de la presente invencion proporcionar una composicion solida que sea estable frente a la agregacion de IFN-beta, como que el porcentaje de agregados sea menor del 20 %, preferiblemente menor del 10 % y mas preferiblemente menor del 5 % de la cantidad total de IFN-beta despues de 2 anos de almacenamiento a 5 °C y despues de 6 meses a 25 °C.
Es otro objeto de la presente invencion proporcionar una composicion lfquida lista para inyectar que tenga una viscosidad menor de 1.000 mPa.s, medida a 20 °C y con un mdice de cizallamiento de 10 s, usando un reometro AR1000 (TA Instruments) o un aparato equivalente con una geometna de cono-placa y un cono de 4 cm y un angulo de 2°.
Se ha observado sorprendente e inesperadamente que la combinacion de IFN-beta con polfmeros de poli(acido glutamico) injertados espedficos permite proporcionar composiciones de liberacion prolongada de IFN-beta faciles de inyectar con estabilidad mejorada, evidenciada por la baja cantidad de agregados formados.
La presente invencion se refiere por tanto a una composicion farmaceutica solida que comprende:
- interferon beta (IFN-beta) y
- un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000
g/mol, en particular entre 28.000 y 38.000 g/mol, y mas particularmente de aproximadamente 33.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles, en la que la
relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
La presente invencion se refiere adicionalmente a una composicion lfquida acuosa que comprende:
- IFN-beta y
- un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000
g/mol, en particular entre 28.000 y 38.000 g/mol, y mas particularmente de aproximadamente 33.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles, en la que la
relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
La presente invencion se refiere tambien a un metodo para preparar una composicion solida que comprende IFN- beta y un polfmero de poli(acido glutamico) injertado segun la invencion.
La invencion se refiere tambien a las composiciones Kquidas o solidas anteriores para uso en un metodo para el tratamiento terapeutico del cuerpo humano o animal, particularmente para uso en un metodo de tratamiento terapeutico de enfermedades autoinmunitarias cronicas del sistema nervioso central o de enfermedades neurodegenerativas, particularmente de esclerosis multiple o de smdrome clmico aislado.
La invencion se refiere tambien al uso de composiciones para la fabricacion de un farmaco para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias del sistema nervioso central o de enfermedades neurodegenerativas, particularmente de esclerosis multiple o smdrome clmico aislado.
Definicion del termino interferon beta
La expresion "interferon-beta (IFN-beta o IFN-p)", como se usa en la presente memoria, pretende incluir el interferon de fibroblastos, en particular de origen humano, obtenido mediante aislamiento a partir de fluidos biologicos u obtenido mediante tecnicas de ADN recombinante a partir de celulas hospedadoras procarioticas o eucarioticas, asf como sus mutemas, sales, derivados funcionales, variantes, analogos y fragmentos activos.
Como se usa en la presente memoria, el termino "mutemas" hace referencia a analogos de IFN-beta en que uno o mas residuos aminoaddicos de un IFN-beta natural se reemplazan por diferentes residuos aminoaddicos, o se eliminan, o se anaden uno o mas residuos aminoaddicos a la secuencia natural de IFN-beta, sin cambiar sustancialmente la actividad de los productos resultantes en comparacion con el IFN-beta de tipo silvestre. Estas mutemas se preparan mediante smtesis conocidas y/o mediante tecnicas de mutagenesis dirigida a sitio, o mediante cualquier otra tecnica conocida adecuada para ello. Las mutemas preferidas incluyen, p.ej., aquellas descritas por Shepard et al. (1981) o Mark et al. (1984).
Cualquiera de dichas mutemas tiene preferiblemente una secuencia aminoaddica suficientemente similar a la secuencia de IFN-beta para tener una actividad sustancialmente similar o incluso mejor que el IFN-beta. La funcion biologica del interferon es bien conocida para el experto en la tecnica, y estan establecidos y disponibles patrones biologicos, p.ej., en el Instituto Nacional de Patrones y Controles Biologicos (
http://immunology.org/links/NIBSc).
http://immunology.org/links/NIBSc).
Se han descrito bioensayos para la determinacion de la actividad de IFN. Un ensayo de IFN puede llevarse a cabo, por ejemplo, como se describe por Rubinstein et al., 1981. Por tanto, puede determinarse si cualquier mutema dada tiene una actividad sustancialmente similar, o incluso mejor, que el IFN mediante experimentacion rutinaria.
Las mutemas de IFN-beta que pueden usarse de acuerdo con la presente invencion, o acido nucleico que codifica las mismas, incluyen una serie finita de secuencias sustancialmente correspondientes como peptidos o polinucleotidos de sustitucion que un experto en la tecnica puede obtener rutinariamente, sin experimentacion indebida, sobre la base de las ensenanzas y la grna presentadas en la presente memoria.
Los cambios preferidos para mutemas de acuerdo con la presente invencion se denominan asf sustituciones "conservativas". Las sustituciones conservativas de aminoacidos de polipeptidos o protemas de la invencion pueden incluir aminoacidos sinonimos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoqmmicas suficientemente similares para que la sustitucion entre miembros del grupo conserve la funcion biologica de la molecula. Esta claro que tambien pueden realizarse inserciones y deleciones de aminoacidos en las secuencias definidas anteriormente sin alterar su funcion, en particular si las inserciones o deleciones implican solo unos pocos aminoacidos, p.ej., menos de treinta, y preferiblemente menos de diez, y no eliminan o desplazan a los aminoacidos que son cnticos para una conformacion funcional, p.ej., los residuos de cistema. Las protemas y las mutemas producidas mediante dichas deleciones y/o inserciones entran dentro del ambito de la presente invencion.
Preferiblemente, son grupos de aminoacidos sinonimos aquellos definidos en la Tabla I a continuacion. Mas preferiblemente, son grupos de aminoacidos sinonimos aquellos definidos en la Tabla II, y lo mas preferiblemente son grupos de aminoacidos sinonimos aquellos definidos en la Tabla III.
TABLAI
- Grupos preferidos de aminoacidos sinonimos
- Aminoacido
- Grupo sinonimo
- Ser
- Ser, Thr, Gly, Asn
- Arg
- Arg, Gln, Lys, Glu, His
- Grupos preferidos de aminoacidos sinonimos
- Aminoacido
- Grupo sinonimo
- Leu
- Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
- Pro
- Gly, Ala, Thr, Pro
- Thr
- Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
- Ala
- Gly, Thr, Pro, Ala
- Val
- Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
- Gly
- Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
- Ile
- Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
- Phe
- Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
- Tyr
- Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
- Cys
- Ser, Thr, Cys
- His
- Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
- Gln
- Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
- Asn
- Gln, Asp, Ser, Asn
- Lys
- Glu, Gln, His, Arg, Lys
- Asp
- Glu, Asn, Asp
- Glu
- Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
- Met
- Phe, Ile, Val, Leu, Met
- Trp
- Trp
TABLA II
- Grupos de aminoacidos sinonimos mas preferidos
- Aminoacido
- Grupo sinonimo
- Ser
- Ser
- Arg
- His, Lys, Arg
- Leu
- Leu, Ile, Phe, Met
- Pro
- Ala, Pro
- Grupos de aminoacidos sinonimos mas preferidos
- Aminoacido
- Grupo sinonimo
- Thr
- Thr
- Ala
- Pro, Ala
- Val
- Val, Met, Ile
- Gly
- Gly
- Ile
- Ile, Met, Phe, Val, Leu
- Phe
- Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
- Tyr
- Phe, Tyr
- Cys
- Cys, Ser
- His
- His, Gln, Arg
- Gln
- Glu, Gln, His
- Asn
- Asp, Asn
- Lys
- Lys, Arg
- Asp
- Asp, Asn
- Glu
- Glu, Gln
- Met
- Met, Phe, Ile, Val, Leu
- Trp
- Trp
TABLA III
- Grupos de los aminoacidos sinonimos mas preferidos
- Aminoacido
- Grupo sinonimo
- Ser
- Ser
- Arg
- Arg
- Leu
- Leu, Ile, Met
- Pro
- Pro
- Thr
- Thr
- Ala
- Ala
- Grupos de los aminoacidos sinonimos mas preferidos
- Aminoacido
- Grupo sinonimo
- Val
- Val
- Gly
- Gly
- Ile
- Ile, Met, Leu
- Phe
- Phe
- Tyr
- Tyr
- Cys
- Cys, Ser
- His
- His
- Gln
- Gln
- Asn
- Asn
- Lys
- Lys
- Asp
- Asp
- Glu
- Glu
- Met
- Met, Ile, Leu
- Trp
- Met
Los ejemplos de produccion de sustituciones aminoaddicas en protemas que pueden usarse para obtener mutemas de IFN-beta para usar en la presente invencion incluyen cualquiera de las etapas de los metodos conocidos, tales como se presentan en las patentes de EE.UU. 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, de Mark et al.; 5.116.943 de Koths 5 et al., 4.965.195 de Namen et al.; 4.879.111 de Chong et al.; y 5.017.691 de Lee et al.; y las protemas sustituidas con lisina, presentadas en la patente de EE.UU. n° 4.904.584 (Shaw et al.). Se han descrito mutemas espedficas de IFN-beta, por ejemplo, por Mark et al., 1984.
La expresion "protema fusionada" hace referencia a un polipeptido que comprende un IFN-beta, o una mutema del mismo, fusionado con otra protema que, p.ej., tiene un tiempo de residencia ampliado en fluidos corporales. Un IFN- 10 beta puede condensarse por tanto con otra protema, polipeptido o similar, p.ej., una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.
Los "derivados funcionales", como se usa en la presente memoria, abarcan los derivados de IFN-beta y sus mutemas y protemas condensadas, que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que aparecen como cadenas laterales sobre los residuos o los grupos N- o C-terminales mediante medios conocidos en la materia, y se 15 incluyen en la invencion con la condicion de que sigan siendo farmaceuticamente aceptables, es decir, no destruyan la actividad de la protema que es sustancialmente similar a la actividad de IFN-beta, y que no confieran propiedades toxicas a las composiciones que los contienen. Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar los sitios antigenicos y ampliar la residencia de IFN-beta en fluidos corporales. Otros derivados incluyen esteres alifaticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo 20 mediante una reaccion con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los residuos aminoaddicos formados con restos acilo (p.ej., grupos alcanoflo o aroMo carbodclico) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de residuos de serilo o treonilo) formados con restos acilo.
5
10
15
20
25
30
35
40
Como "fracciones activas" de IFN-beta, o mutemas y protemas fusionadas, la presente invencion abarca cualquier fragmento o precursor de la cadena polipeptidica de la molecula de protema solo o junto con moleculas asociadas o residuos ligados al mismo, p.ej., residuos de azucar o fosfato, o agregados de la molecula de protema o de los residuos de azucar por sf mismos, a condicion de que dicha fraccion no tenga una actividad significativamente reducida en comparacion con el correspondiente IFN-beta.
El termino "sales" de IFN-beta en la presente memoria hace referencia a sales de grupos carboxilo y a sales de grupos amino de las protemas descritas anteriormente o analogos de las mismas. Pueden formarse sales de un grupo carboxilo por medios conocidos en la materia e incluyen sales inorganicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, ferricas o de cinc y similares, y sales con bases organicas como aquellas formadas, por ejemplo, con aminas tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procama y similares. Las sales de amina incluyen, por ejemplo, sales de acidos minerales tales como, por ejemplo, sales de acido clorhudrico o sales de acido sulfurico, y sales de acidos organicos tales como, por ejemplo, sales de acido acetico o sales de acido oxalico. Por supuesto, cualquiera de dichas sales debe retener la actividad biologica de las protemas (IFN-beta) relevantes para la presente invencion, es decir, la capacidad de unirse al correspondiente receptor e iniciar la senalizacion de receptor.
De acuerdo con la presente invencion, se prefiere particularmente el uso de IFN-beta humano recombinante como ingrediente activo de la invencion.
De acuerdo con la presente solicitud, se prefiere particularmente el uso de interferon beta-1a.
Definicion del polimero de poli(acido glutamico) injertado
El polfmero de poli(acido glutamico) injertado segun la invencion tiene una cadena principal lineal, o esqueleto, consistente en unidades de acido alfa-glutamico, correspondientes a la estructura (i) siguiente:
El polfmero de poli(acido glutamico) injertado segun la invencion porta grupos alfa-tocoferol ligados por un enlace ester a algunos de los grupos carboxflicos pendientes.
Segun una realizacion particular, la distribucion de las unidades de glutamato injertadas con alfa-tocoferol es de tipo aleatorio.
"Tipo aleatorio" significa que las unidades de glutamico injertadas con alfa-tocoferol se distribuyen desigualmente entre la cadena de poli(acido glutamico).
A menos que se especifique otra cosa, el termino "glutamico" hace referencia a "acido glutamico" o "glutamato" a lo largo de la descripcion.
Alfa-tocoferol puede ser D-alfa-tocoferol (forma natural), L-alfa-tocoferol o D,L-alfa-tocoferol (todo racemico, sintetico).
El alfa-tocoferol de la invencion puede ser natural o sintetico. Preferiblemente, el alfa-tocoferol usado en la invencion es sintetico.
Segun una realizacion particularmente preferida, el polfmero de poli(acido glutamico) injertado no incluye otros injertos distintos de unidades de alfa-tocoferol.
En un medio acuoso, las funciones carboxflicas residuales (no injertadas) del polfmero de poli(acido glutamico) injertado son neutras (forma -COOH) o ionizadas (anion -COO-), dependiendo del pH y la composicion. La neutralidad del polfmero injertado requiere por tanto la presencia de un contraion, por ejemplo un cation monovalente inorganico tal como sodio.
Por tanto, en disolucion acuosa, tfpicamente a pH 6 a 8, el polfmero injertado esta principalmente en forma de poli(glutamato) injertado.
5
10
15
20
25
30
35
Los poKmeros de poli(acido glutamico) injertados de la invencion tienen la formula (I) siguiente:
en la que
■ A representa:
- un grupo -NHR en el que R representa un hidrogeno, un grupo alquilo lineal C2 a C10, ramificado C3 a C6 o un grupo bencilo, o
- una unidad aminoaddica unida al extremo N;
■ B representa un hidrogeno, un grupo acilo C2 a C6, un grupo acilo ramificado C3 a C10 o un piroglutamato;
■ p corresponde al numero medio de monomeros glutamicos portadores de un sustituyente de alfa-tocoferol;
■ s corresponde al numero medio de monomeros glutamicos no injertados.
La relacion de injerto se define como la relacion molar media p/(s+p) de sustituyentes de tocoferol a unidades de glutamico. La relacion p/(s+p) esta entre 4,5 y 5,5 %, preferiblemente es de aproximadamente 5 %.
El grado medio de polimerizacion GP= s+p esta entre 180 y 250, preferiblemente entre 200 y 240, en particular es de aproximadamente 220.
Los polfmeros de poli(acido glutamico) injertados de la invencion pueden obtenerse mediante metodos conocidos por los especialistas en la materia. Pueden obtenerse usando al menos los metodos descritos en la solicitud de patente WO 03/104303, y en particular el metodo siguiente.
Los polfmeros de poli(acido alfa-glutamico) estan comercialmente disponibles, tales como los comercializados por Sigma-Aldrich® con la ref. 386847. Pueden sintetizarse tambien mediante la polimerizacion de antudridos de N- carboxiaminoacidos (NCA) descritos, por ejemplo, en el artfculo "Biopolymers, 1976, 15, 1869" y en el libro de H. R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles", Springer Verlag (1987). Puede hacerse referencia tambien a la patente FR 2.801.226.
El acoplamiento de alfa-tocoferol con algunas de las funciones carboxflicas del polfmero de poli(acido glutamico) se efectua facilmente haciendo reaccionar dicho polfmero con alfa-tocoferol en presencia de un agente de acoplamiento y un catalizador en un disolvente adecuado tal como dimetilformamida (DMF), N-metilpirrolidona (NMP) o dimetilsulfoxido (DMSO). El grado de injerto se controla qmmicamente mediante la estequiometna de los constituyentes y reactivos o el tiempo de reaccion.
Determinacion de la masa, relacion de injerto molar media y grado de polimerizacion del polimero de poli(acido glutamico) injertado
Se define el peso molecular medio por Mp (peso molecular maximo), medido por cromatograffa de exclusion por tamano.
Para medir el peso molecular medio, se precipita la muestra polimerica por acidificacion con acido clortudrico 0,1 N, se liofiliza y entonces se disuelve en NMP para analisis.
Se mide el peso molecular maximo medio absoluto mediante una cromatograffa de exclusion por tamano que comprende tres columnas secuenciales de poliestireno-co-divinilbenceno (5 pm/100 000 A, 5 ps/10.000 Ay 5 pm/1.000 A). Este dispositivo esta conectado con un detector de dispersion de luz a 18 angulos (p.ej. DAWN EOS - Wyatt Technology) y con un refractometro diferencial (p.ej. OptiLab REX - Wyatt Technology).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
La relacion de injerto molar media de alfa-tocoferol en el polfmero de poli(acido glutamico) injertado corresponde a la diferencia entre la relacion de alfa-tocoferol total medida y la relacion de alfa-tocoferol libre medida. La relacion de alfa-tocoferol total se determina por RMN- H, mientras que la relacion de alfa-tocoferol libre se determina por HPLC.
Se efectua la determinacion de la relacion de alfa-tocoferol total mediante RMN-1H con un espectrofotometro (Avance 300) equipado con una sonda de QNP. Se liofiliza la muestra polimerica y se disuelve entonces en acido trifluoroacetico deuterado para analisis.
Se consideran dos senales:
- el pico de aproximadamente 0,6 ppm corresponde a los protones de los cuatro grupos metilo de la cadena alifatica de alfa-tocoferol (12 protones),
- el pico de aproximadamente 4,5-4,7 ppm corresponde al proton en posicion a de la unidad de acido glutamico.
Se integra cada senal y se calibra como 100 el valor integral correspondiente al proton en posicion a de la unidad de acido glutamico.
Se considera a A el valor integral obtenido para la senal correspondiente a los protones de los cuatro grupos metilo de la cadena alifatica de alfa-tocoferol. La relacion de alfa-tocoferol total se da entonces por la ecuacion: % de alfa- tocoferol = A / 12.
Se efectua la determinacion de la relacion de alfa-tocoferol libre por HPLC mediante una columna microBondapak C18 (300 mm de largo, 3,9 mm de diametro interno, rellena con sflice esferica de 10 micrometro de diametro) proporcionada por Waters o similar, acondicionada a 40 °C y eluida en modo isocratico con una fase movil que comprende 25 % en vol. de metanol y 75 % en volumen de acetonitrilo, con un caudal de 1 ml/min.
La fraccion molar Xp de unidades monomericas injertadas con grupos de alfa-tocoferol, que corresponde a la relacion de injerto molar media de grupos alfa-tocoferol, se determina de este modo.
El grado medio de polimerizacion GP se calcula dividiendo el peso molecular medio de una cadena polimerica determinado por cromatograffa de exclusion por tamano como se describe anteriormente entre el peso molecular medio M de una unidad monomerica del porimero: GP= Mp/M
Este peso molecular medio de una unidad es la media de los pesos moleculares de las unidades constitutivas del polfmero, ponderado cada uno por la fraccion molar de esta unidad.
Se considera M1 el peso molecular medio de los monomeros de acido glutamico y M2 el peso molecular medio de los monomeros de acido glutamico injertados con alfa-tocoferol. El peso medio M se da por la siguiente formula:
M = X].M] + X9.M2
Antioxidante
Segun una realizacion particular, la composicion solida de IFN-beta o disolucion acuosa de IFN-beta comprende adicionalmente un antioxidante.
El antioxidante es, por ejemplo, metionina, cistema, acido ascorbico, un ascorbato, acido cftrico o un citrato. Una composicion preferida de la invencion incluye uno o mas antioxidantes diferentes.
El antioxidante de la invencion es preferiblemente metionina. La metionina usada en la invencion es particularmente L-metionina.
En particular, una composicion de la invencion comprende un antioxidante en una relacion en peso/peso de antioxidante/IFN-beta entre 2 y 7.
Lioprotector
Segun una realizacion particular de la invencion, una composicion solida de IFN-beta o una composicion acuosa lfquida de IFN-beta comprende adicionalmente un lioprotector.
El lioprotector es preferiblemente un azucar. Una composicion preferida de la invencion comprende uno o varios azucares diferentes. "Azucar" significa azucares sencillos (monosacaridos) o azucares complejos (cadenas compuestas por varias unidades de azucar tales como diholosidos) pero tambien, por extension, polioles.
Los ejemplos de lioprotectores incluyen lactosa, glucosa, fructosa y sacarosa. Son polioles adecuados, por ejemplo, manitol, xilitol, eritritol, sorbitol y trehalosa, maltodextrina y mezclas de los mismos. Son lioprotectores preferidos manitol o sacarosa, preferiblemente el ultimo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Los ejemplos de manitol incluyen diversas purezas de Pearlitol® comercializado por Roquette, especialmente Pearlitol® SD200.
Segun una realizacion preferida, una composicion de la invencion, particularmente una composicion de la invencion que comprende un antioxidante como se define anteriormente, comprende entre 50 y 600 mg de lioprotector por mg de IFN-beta.
Una solucion de IFN-beta acuosa lista para usar contiene ventajosamente metionina en una cantidad de 2 a 7 mg por mg de IFN-beta y sacarosa a una concentracion de 50 a 300 mg/ml.
Una composicion de la invencion que contiene un antioxidante y un lioprotector en disolucion acuosa tiene ventajosamente un pH de 6 a 8, preferiblemente de aproximadamente 7.
Aditivos de ajuste de osmolalidad y pH
Los aditivos que pueden usarse para el ajuste de la osmolalidad de la composicion incluyen, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, lactosa, glucosa, fructosa, sacarosa, manitol, xilitol, eritritol, sorbitol, trehalosa, maltodextrina y mezclas de los mismos.
Los aditivos usados para el ajuste del pH de la composicion incluyen, por ejemplo, un compuesto basico, especialmente una base mineral tal como un hidroxido, particularmente hidroxido de sodio. Pueden usarse tambien acido acetico o acido clortndrico.
Una composicion solida particularmente preferida contiene los siguientes ingredientes en las proporciones indicadas:
a) aproximadamente 0,5 mg de IFN-beta;
b) aproximadamente 22 mg de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles;
c) aproximadamente 1,5 mg de metionina; y
d) aproximadamente 76 mg de sacarosa;
o un multiplo o submultiplo de dichas cantidades.
Las cantidades anteriores pueden multiplicarse, por ejemplo, por un valor entre 0,3 y 5, tal como 0,3, 0,5, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 o incluso mas.
Otra composicion solida particularmente preferida de la invencion es una composicion deshidratada, particularmente un liofilizado, es decir una composicion liofilizada.
Preferiblemente, la naturaleza y cantidades de los ingredientes se seleccionan de tal modo que la composicion acuosa solida sea estable a 5 °C durante al menos 24 meses.
Metodo de fabricacion: Composicion solida de IFN-beta que comprende IFN-beta y polimero de poli(acido glutamico) injertado
La presente invencion proporciona particularmente un metodo para preparar la composicion solida de la invencion que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una disolucion lfquida acuosa de polfmero de poli(acido glutamico) injertado a una concentracion entre 20 y 30 mg/g;
(b) proporcionar una disolucion de IFN-beta a una concentracion entre 1 y 9 mg/ml; en la que esta presente al menos un compuesto seleccionado de un lioprotector, antioxidante y aditivo para el ajuste del pH, en al menos una de las disoluciones de la etapa (a) y la etapa (b);
(c) mezclar las disoluciones obtenidas en la etapa (a) y (b), de tal modo que, despues de mezclar, la composicion:
tenga una concentracion polimerica entre 4 y 16 mg/g, tenga una osmolalidad entre 100 y 250 mOsm/kg, tenga un pH entre 6,5 y 7,5;
(d) esterilizar al menos una vez la mezcla resultante; y
5
10
15
20
25
30
35
40
(e) deshidratar la disolucion, formando dicha composicion solida.
Mas particularmente, la presente invencion proporciona un metodo para preparar una composicion solida que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una disolucion lfquida acuosa de poKmero de poli(acido glutamico) injertado a una concentracion entre 20 y 30 mg/g;
(b) proporcionar una disolucion de IFN-beta a una concentracion entre 1 y 9 mg/ml, preferiblemente a una concentracion de 6 mg/ml; en el que esta presente al menos un compuesto seleccionado de un lioprotector, antioxidante y aditivo para el ajuste del pH, en al menos una de las disoluciones de la etapa (a) y la etapa (b);
(c) mezclar las disoluciones obtenidas en la etapa (a) y (b), de tal modo que, despues de mezclar, la composicion:
• tenga una concentracion polimerica entre 7 y 13 mg/g,
• tenga una osmolalidad entre 100 y 160 mOsm/kg,
• tenga un pH entre 6,8 y 7,2;
(d) esterilizar al menos una vez la mezcla resultante; y
(e) deshidratar la disolucion, formando dicha composicion solida.
Aun mas particularmente, la presente invencion proporciona un metodo para preparar una composicion solida que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una disolucion lfquida acuosa de polfmero de poli(acido glutamico) injertado a una concentracion entre 20 y 30 mg/g;
(b) proporcionar una disolucion de IFN-beta de 6 mg/ml; en la que esta presente al menos un compuesto seleccionado de un lioprotector, antioxidante y aditivo para el ajuste del pH, en al menos una de las disoluciones de la etapa (a) y la etapa (b);
(c) mezclar las disoluciones obtenidas en la etapa (a) y (b), de tal modo que, despues de mezclar, la composicion:
• tenga una concentracion polimerica de 9,7 mg/g,
• tenga una osmolalidad de 136 mOsm/kg,
• tenga un pH de 7,0;
(d) esterilizar al menos una vez la mezcla resultante; y
(e) deshidratar la disolucion, formando dicha composicion solida.
Preferiblemente, la composicion lfquida de la etapa (d) se almacena en reposo durante 2 h o mas, preferiblemente durante 4 h o mas, a temperatura ambiente antes de la deshidratacion.
Segun un metodo preferido, las etapas (a) y (b) pueden conseguirse en botellas de vidrio dotadas de agitadores magneticos, y preferiblemente en equipos escalables bien conocidos tales como tanques bien agitados y agitadores. Los agitadores se seleccionan entre aquellos que inducen flujos axiales o radiales, preferiblemente agitadores que inducen una tension de cizallamiento minima y mas preferiblemente la helice Mixel TT.
Segun una realizacion preferida, se efectua la etapa (d) mediante filtracion esteril y comprende varias etapas de filtracion, preferiblemente dos etapas separadas por al menos 2 h de agitacion a temperatura ambiente. En particular, pueden usarse filtros de 0,2 micrometros, tales como filtros Supor EKV dotados de membranas de polietersulfona de Pall.
Se deshidrata en la etapa (e) la disolucion filtrada obtenida en la etapa (d) mediante cualquier tecnica de deshidratacion bien conocida tal como liofilizacion, atomizacion o evaporacion, preferiblemente liofilizacion.
Segun una realizacion particular, se distribuye la disolucion en matraces o viales antes de la etapa de deshidratacion (e).
Segun otra realizacion particular, se rellenan los matraces o viales con perlas de vidrio.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Una composicion solida segun la invencion permite, mediante la adicion de un disolvente tal como agua, preparar la correspondiente composicion Kquida. En particular, permite anadir por ejemplo agua para inyecciones (API) para preparar una composicion inyectable lfquida lista para usar.
Metodo para preparar una composicion liquida lista para usar
La invencion proporciona por tanto un metodo para preparar una composicion lfquida lista para usar, que comprende disolver una composicion solida anterior de IFN-beta y polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol e injertado aleatoriamente con sustituyentes de alfa-tocoferol, en el que la relacion de injerto media molar esta entre 4,5 y 5,5 % en moles, conteniendo preferiblemente dicha composicion solida un antioxidante y un lioprotector, en un volumen de diluyente tal que la concentracion de IFN- beta este entre 0,2 y 0,8 mg/ml y la concentracion de polfmero de poli(acido glutamico) injertado este entre 19 y 25 mg/ml en la composicion lfquida lista para usar.
La invencion se refiere tambien por lo tanto a una composicion lfquida acuosa que comprende:
- IFN-beta y
- un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo el mdice de injerto molar medio de 4,5-5,5 % en moles, en el que la relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
En una composicion lfquida preferida de la invencion, la concentracion de IFN-beta esta entre 0,2 y 0,8 mg/ml.
En otra composicion lfquida preferida de la invencion, la concentracion de polfmero de poli(acido glutamico) injertado esta entre l9 y 25 mg/ml.
En una composicion lfquida particularmente preferida de la invencion, la concentracion de IFN-beta esta entre 0,2 y 0,8 mg/ml y la concentracion de polfmero de poli(acido glutamico) injertado esta entre 19 y 25 mg/ml.
Las composiciones lfquidas particularmente preferidas de la invencion contienen los siguientes componentes:
a) aproximadamente 0,5 mg/ml de IFN-beta;
b) aproximadamente 22 mg/ml de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular
medio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles;
c) aproximadamente 1,5 mg/ml de metionina;
d) aproximadamente 76 mg/ml de sacarosa;
o un multiplo o submultiplo de dichas cantidades.
Esta composicion lfquida acuosa tiene preferiblemente un pH de aproximadamente 7 y una osmolalidad de aproximadamente 300 mOsm/kg.
Preferiblemente, la naturaleza y cantidades de los ingredientes se seleccionan de tal modo que la composicion lfquida acuosa tenga una viscosidad menor de 1.000 mPa.s, medida a 20 °C y a un mdice de cizallamiento de 10 s-1.
MATERIALES Y METODOS
Determinacion del tamano de los hidrogeles
El polfmero usado para la invencion es capaz de formar espontaneamente hidrogeles nanometricos altamente hidratados cuando se dispersa en un medio acuoso, en particular en agua, a un pH entre 6 y 8. El IFN-beta se asocia espontaneamente con los hidrogeles.
Se mide el diametro hidrodinamico medio promediado en volumen de los hidrogeles mediante dispersion dinamica de luz segun tecnicas bien conocidas, por ejemplo mediante un equipo Zeta sizer nano-ZS de Malvern o CGS 3 de ALV. En este ultimo caso, el angulo de dispersion es de 140°.
Para conseguir la medida, se disuelve la composicion solida en agua, obteniendo una concentracion polimerica de 22 mg/ml. Se anade entonces NaCl 0,15 M de tal modo que la concentracion polimerica sea de 1 mg/ml. Se agita suavemente la disolucion durante 24 horas y se filtra entonces a traves de dos filtros secuenciales respectivamente de 0,8 y 0,2 pm de tamano de poro, antes del analisis de dispersion dinamica de luz a un pH de entre 6 y 7.
El tiempo de adquisicion de la senal de dispersion es de 10 minutos. Se efectua la medida por triplicado en dos muestras de disolucion. El resultado es la media de las 6 medidas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Preferiblemente, segun la presente invencion, los hidrogeles tienen un diametro hidrodinamico medio promediado en volumen de entre 10 y 80 nm, preferiblemente entre 10 y 60 nm, y mas preferiblemente entre 10 y 30 nm.
Metodo de valoracion de la agregacion de IFN-beta
Una composicion adecuada segun la invencion tiene un porcentaje de agregados, medido con la prueba de estres (PE) siguiente, menor del 20 %, preferiblemente menor del 10 %, y mas preferiblemente menor del 5 % de la cantidad total de IFN-beta.
Pueden formarse dos tipos de agregados de IFN-beta: agregados irreversibles que no pueden disociarse por tensioactivos y agregados reversibles que se disocian por tensioactivos.
Se efectua convenientemente la cuantificacion de los agregados irreversibles mediante un metodo de cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS).
Sin embargo, el metodo de SEC-SDS extrae, pero tambien disocia, los agregados reversibles, por ejemplo dfmeros no covalentes de IFN-beta. Obviamente, este metodo no es aplicable a la medida de los agregados reversibles.
Se ha desarrollado un segundo metodo, al que se hace referencia en adelante en la presente memoria como metodo de "transferencia Western", para cuantificar ambos tipos de agregados de IFN-beta.
Prueba de estres (PE):
Se disponen muestras de 0,7 ml de las composiciones recien preparadas para ensayar en viales de 3 ml y se calientan durante 30 min a 90 °C. Se analizan entonces las composiciones por SEC-SDS o por transferencia Western como se describe a continuacion.
Medida de las formas agregadas irreversiblemente por SEC-SDS:
Se ensaya el contenido de agregados irreversibles por comparacion con un patron de IFN-beta que contiene de 1 a
1.5 % de agregados irreversibles. Este patron consiste en IFN-beta agregado en disolucion acuosa a 100 °C durante
3.5 min, y diluido entonces en una disolucion de poli(acido glutamico) injertado.
Se diluyen tanto el patron como las muestras 20 veces en SDS al 2 %.
Se inyectan las muestras en un sistema cromatografico consistente en dos columnas conectadas en serie, TSK-Gel G4000 PWXL + TSK-Gel SuperAW400. La fase movil es una disolucion de PBS 3,3 mM que comprende un 0,3 % de SDS.
Cuando no se detectan agregados irreversibles, o estan por debajo del patron, se indica el contenido de agregado de la composicion como inferior al 2 %.
Cuando el contenido de agregados irreversibles esta por encima del patron, se estima la cuantificacion de agregados mediante la cuantificacion del IFN-beta no agregado (monomero).
Medida de agregados tanto irreversibles como reversibles por transferencia Western
Etapa 1:
Se diluyen 100 ng de composicion de IFN-beta en tampon de Laemmli a pH= 6,8 (0,01 % de SDS, solucion de tampon tris(hidroximetil)aminometano 62,4 mM, 0,06 % de azul de bromofenol, 10 % de glicerol) y se depositan en pocillos que contienen gel de poliacrilamida al 12 %.
Se mezclan tres disoluciones patron, que comprenden 1 ng, 3 ng y 5 ng de IFN-beta, con polfmero de poli(acido glutamico) injertado en la misma proporcion que las muestras para analizar.
Se separan entonces el polfmero de poli(acido glutamico) injertado, IFN-beta y agregados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS). El tampon de circulacion es un "tampon de circulacion XT MES" (Biorad - Ref 1610789) que contiene entre 1 y 2,5 % de SDS.
Etapa 2:
Despues de la migracion de las protemas en el gel, se transfieren las diferentes formas de IFN-beta (monomero y agregados) a una membrana de nitrocelulosa. Se revela entonces espedficamente el IFN-beta usando un anticuerpo primario anti-IFN-beta seguido de un anticuerpo secundario acoplado con fosfatasa alcalina. Se tine entonces la membrana con una mezcla de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3'-indolilo/p-toluidina (BCIP) y cloruro de nitroazul de tetrazolio (NBT), en que se detecta el IFN-beta por los anticuerpos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Despues de tenir, los agregados de IFN-beta aparecen como bandas coloreadas bien separadas. La comparacion visual directa de las intensidades de banda permite la determinacion del contenido de agregado en las composiciones ensayadas.
Determinacion del perfil de liberacion in vitro de la composicion segun la invencion.
Se inyectan las composiciones en un material de porosidad controlada a traves del cual circula un tampon sintetico que contiene PBS 10 mM, 2 % de SDS y BSA 30 mg/ml. Se recogen muestras a intervalos regulares (cada 30 minutos para la composicion de la invencion y cada 2 minutos para la composicion que no contiene el polfmero de poli(acido glutamico)) con un recolector de fracciones (FC204 de Gilson) y se analiza por valoracion ELISA (FUJIREBIO ref. KAC1201) el contenido de IFN-beta.
Dependiendo del experimento, puede usarse cualquier version descrita de aqu en adelante.
Prueba in vitro T1
Se efectua la prueba de liberacion in vitro usando un aparato de flujo de temperatura controlada (una celda de flujo de SOTAX - No.3239 - con un diametro de 22,6 mm) rellena de perlas de vidrio de 1 mm de diametro de SOTAX - No. F200-0110 en su parte inferior. Se inyecta una masa constante de disolucion en un material inerte y de porosidad controlada (pieza de espuma de 30 mm de altura y 25 cm de diametro de Carpenter - No. RP30263) localizada en la parte superior de la camara del aparato. Se hace circular un tampon sintetico que contiene PBS 10 mM, 2 % de SDS y BSA 30 mg/ml a traves de esta camara a una temperatura de 37 °C y a un caudal de 0,5 ml/min. Se inyectan 50 pl de la muestra en el material inerte y de porosidad controlada a una profundidad de 0,5 cm usando una jeringuilla de 100 pl dotada de una aguja de 50 mm. Se pesa la jeringuilla antes y despues de la inyeccion para determinar precisamente la cantidad de disolucion inyectada.
Se expresan los resultados como porcentaje de IFN-beta liberado en cada punto temporal frente a la cantidad total de IFN-beta liberado durante 16 horas.
Prueba in vitro T2
Se efectua la prueba de liberacion in vitro usando un aparato de flujo de temperatura controlada (una celda de flujo de SOTAX - No.3239 - con un diametro de 22,6 mm) totalmente rellena de perlas de vidrio de 1 mm de diametro de SOTAX - No. F200-0110 en su parte inferior. Se inyecta una masa constante de disolucion en el lecho de perlas de vidrio (medio inerte y de porosidad controlada). Se hace circular un tampon sintetico que contiene PBS 10 mM, 2 % de SDS y BSA 30 mg/ml a traves de esta camara a una temperatura de 37 °C y a un caudal de 0,5 ml/min. Se inyectan 50 pl de la muestra en el material inerte y de porosidad controlada a una profundidad de 0,5 cm usando una jeringuilla de 100 pl dotada de una aguja de 50 mm. Se pesa la jeringuilla antes y despues de la inyeccion para determinar precisamente la cantidad de disolucion inyectada.
Se expresan los resultados como porcentaje de IFN-beta liberado en cada punto temporal frente a la cantidad total de IFN-beta liberado durante 15 horas.
La invencion se describira ahora mediante las siguientes figuras, ejemplos y experimentos.
FIGURAS
La Figura 1 representa la concentracion plasmatica de IFN-beta liberado en funcion del tiempo, en la que: ©©representa la concentracion plasmatica de IFN-beta liberado de la composicion lfquida F,
♦♦representa la concentracion plasmatica de IFN-beta liberado de la composicion de liberacion inmediata, PREPARACIONES
Preparacion 1: PoKmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 220 injertado con aproximadamente 5 % en moles de alfa-tocoferol (polimero P1)
Se preparo como sigue una disolucion acuosa de polimero de poli(acido glutamico) injertado con un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 220 injertado con aproximadamente 5 % en moles de alfa-tocoferol:
Se disolvieron 15 g de poli(acido alfa-L-glutamico), que tiene un GP de aproximadamente 220 obtenido por polimerizacion de NCAGluOMe seguida de hidrolisis, en 288 ml de dimetilformamida (DMF) y se calento a 80 °C. Se enfrio la disolucion a 15 °C y se anadieron sucesivamente 2,5 g de alfa-tocoferol racemico (> 98 % obtenido en Fluka®) disueltos en 8 ml de DMF, 280 mg de 4-dimetilaminopiridina disueltos en 1 ml de DMF y 1,6 g de diisopropilcarbodiimida disueltos en 6 ml de DMF. Despues de 3,5 h de agitacion, se neutralizo el medio de reaccion con hidroxido de sodio acuoso. Se purifico entonces el polimero por ultrafiltracion usando una membrana de 1 kDa y se concentro a aproximadamente 30 mg/ml. Se filtro la disolucion a traves de una membrana de 0,22 pm y se almaceno a 5 °C antes del uso en la siguiente etapa. El rendimiento era de aproximadamente 85 % del polimero P1.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se encontro que el peso molecular maximo absoluto (Mp) medido por un detector de dispersion de luz a 18 angulos (MALLS) conectado con una cromatograffa de exclusion por tamano organica era de 31.000 g/mol. La relacion de injerto de alfa-tocoferol, estimada por espectroscopia de RMN de proton, era de 5,1 % en moles.
Preparacion 2: Disolucion de IFN-beta
Se concentro una disolucion diluida de IFN-beta en tampon acetato 50 mM (Merck Serono, Suiza - 0,377 mg/ml o 0,399 mg/l dependiendo de los lotes de disolucion) mediante ultrafiltracion frontal a temperatura ambiente, procurando una disolucion de IFN-beta concentrada a 6 mg/ml.
Preparacion 3: Disolucion de excipientes
Se disolvieron 4,7 g de metionina, 229,3 g de sacarosa y 4,6 g de disolucion de hidroxido de sodio 1 N en 1645,4 g de agua para inyecciones (API). Se mantuvo la disolucion resultante con agitacion moderada durante 15 min a temperatura ambiente.
Preparacion 4: Preparacion de una composicion liquida acuosa de poKmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1526,0 g de la disolucion de excipientes obtenida en la Preparacion 3 a 1974,0 g de disolucion de polfmero P1 (disolucion de polfmero P1 28,2 mg/ml) obtenida mediante el metodo descrito en la Preparacion 1. Se agito suavemente esta disolucion durante al menos 15 min a temperatura ambiente.
Se anadieron 145 g de disolucion de IFN-beta 6 mg/ml de la Preparacion 2 a 2409,4 g de la disolucion intermedia anterior. Se agito la mezcla resultante a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de esterilizar por filtracion usando filtros de 0,2 pm.
Preparacion 5: Preparacion de una composicion liquida acuosa de poKmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se preparo la Preparacion 5 usando un protocolo similar al descrito para la Preparacion 4, usando 2227,8 g de disolucion de polfmero P1 y ajustando consiguientemente las cantidades de excipientes y IFN-beta para obtener al final de esta etapa una disolucion que tiene la misma composicion y pH que la Preparacion 4.
Preparacion 6: Preparacion de una composicion liquida acuosa de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se preparo la Preparacion 6 usando un protocolo similar al descrito para la Preparacion 4, usando 1553,4 g de la disolucion de excipientes obtenida en la Preparacion 3, 1688,6 g de disolucion de polfmero P1 y 1450,1 g de agua para inyecciones (API).
Se anadieron 177,9 g de disolucion de IFN-beta 6 mg/ml de la Preparacion 2 a 4682,1 g de la disolucion intermedia anterior. Se agito la mezcla resultante a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de esterilizar por filtracion usando filtros de 0,2 pm.
Preparacion 7: Polimero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 100 injertado con aproximadamente 5 % en moles de alfa-tocoferol (polimero P2)
Se preparo una disolucion acuosa de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 100 injertado con aproximadamente 5 % en moles de alfa-tocoferol usando un protocolo similar al descrito para la Preparacion 1, usando un polfmero de poli(acido glutamico) bruto que tiene un grado de polimerizacion (GP) de aproximadamente 100.
Se estimo que el peso molecular maximo (Mp) era de aproximadamente 15.000 g/mol. La relacion de injerto de alfa- tocoferol, estimada como se describe en el metodo anterior, era de aproximadamente 5 % en moles.
Preparacion 8: Preparacion de una composicion liquida acuosa de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se preparo la Preparacion 8 usando un protocolo similar al descrito para la Preparacion 6, usando 8,5 g de disolucion de polfmero P1 y ajustando consiguientemente las cantidades de excipientes y IFN-beta para obtener al final de esta etapa una disolucion que tiene la misma composicion y pH que la Preparacion 6.
Preparacion 9: Preparacion de una composicion liquida acuosa de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta fuera del alcance de la invencion
Se prepara una disolucion de excipientes segun un protocolo similar al de la Preparacion 3, usando 0,02 g de metionina, 0,96 g de sacarosa y 9,01 g de agua para inyecciones (API). Se anadieron 8,42 g de la disolucion de excipientes anterior a 9,66 g de agua para inyecciones (API) y a 7,31 g de disolucion del polfmero P2 (disolucion del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
poKmero P2 46,7 mg/ml) obtenida mediante el metodo descrito en la Preparacion 7. disolucion durante al menos 15 min a temperature ambiente.
Se anadieron 0,96 g de disolucion de IFN-beta 6 mg/ml de la Preparacion 2 a 25,33 g anterior. Se agito la mezcla resultante a temperatura ambiente durante al menos 2 h.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Preparacion de una composicion solida de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se dejo reposar durante 16 h la disolucion obtenida en la Preparacion 4, se dividio entonces en viales de 5 ml y se
relleno cada uno con 2,06 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofilizo entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo SMH-150) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 72 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Ejemplo 2: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua para inyecciones por vial de producto liofilizado del Ejemplo 1 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una disolucion de la invencion. Se dan las caractensticas de esta disolucion reconstituida en el Experimento 1 siguiente.
Ejemplo 3: Preparacion de una composicion solida de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se dejo reposar durante 16 h la disolucion obtenida en la Preparacion 5, se dividio entonces en viales de 5 ml y se
relleno cada uno con 2,06 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofilizo entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo SMH-150) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 72 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Ejemplo 4: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua para inyecciones por vial de producto liofilizado del Ejemplo 3 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una composicion de la invencion. Se dan las caractensticas de esta disolucion reconstituida en el Experimento 1 siguiente.
Ejemplo 5: Preparacion de una composicion solida de polimeros de poli(acido glutamico) injertados e IFN- beta de la invencion
Se dejo reposar durante 2 h la mezcla final de la disolucion obtenida en la Preparacion 6, se dividio entonces en viales de 5 ml y se relleno cada uno con 3,08 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofiliza entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo SMH-150) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 96 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Ejemplo 6: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua p.p.i. para inyecciones por vfal de liofilizado del Ejemplo 5 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una disolucion reconstituida de la invencion. Se dan las caractensticas de esta disolucion reconstituida en el Experimento 1 siguiente.
Ejemplo 7: Preparacion de una composicion solida de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se dejo reposar durante 2 h la mezcla final de la disolucion obtenida en la Preparacion 8, se dividio entonces en viales de 5 ml y se relleno cada uno con 3,08 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofiliza entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo PL45) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 98 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Se agito suavemente esta de la disolucion intermedia
Ejemplo 8: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua p.p.i. para inyecciones por vial de liofilizado del Ejemplo 7 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una disolucion reconstituida de la invencion cuya composicion teorica se da 5 en la Tabla A siguiente.
Tabla A - Caracteristicas de las formulaciones del Ejemplo 8 de la invencion
- Analisis
- Ejemplo 8
- CIFN-beta (mg/ml)
- 0,5
- Cpoi (mg/ml)
- 22
Ejemplo 9: Preparacion de una composicion solida de polimero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta fuera del alcance de la invencion
10 Se dejo reposar durante 2 h la mezcla final de la disolucion obtenida en la Preparacion 9, se dividio entonces en viales de 5 ml y se relleno cada uno con 3,08 g de disolucion y 3 perlas de vidrio de 4,76 mm de diametro.
Se liofiliza entonces en un liofilizador USIFROID (Modelo PL45) con un ciclo de liofilizacion durante un total de 98 h, produciendo una composicion solida de la invencion.
Ejemplo 10: Preparacion de una composicion acuosa reconstituida de un polimero de poli(acido glutamico) 15 injertado e IFN-beta fuera del alcance de la invencion
Se anadieron 1,3 ml de agua p.p.i. para inyecciones por vial de liofilizado del Ejemplo 9 y se agitaron manualmente durante unos pocos minutos, obteniendo una disolucion reconstituida de la invencion cuya composicion teorica se da en la Tabla B siguiente.
Tabla B - Caracteristicas de las formulaciones del Ejemplo 10 fuera del alcance de la invencion
- Analisis
- Ejemplo 10
- CIFN-beta (mg/ml)
- 0,5
- Cpoi (mg/ml)
- 30
20
EXPERIMENTOS
Experimento 1: Caracterizacion de composiciones liquidas acuosas de los Ejemplos 2, 4 y 6
Concentracion de IFN-beta
Se midio la concentracion de IFN-beta (CiFN-beta) por HPLC (columna C4 en fase inversa Symmetry300) con un 25 gradiente de elucion con fases compuestas por agua/acetonitrilo + 0,1 % de acido trifluoroacetico (TFA) + polioxietileno(23)laurileter 0,4 g/l (fase A 70/30; fase B 0/100). Se realizo una extraccion preliminar de la muestra con una disolucion de seroalbumina bovina 6 g/l segun un factor de dilucion de 3.
Se efectuo la cuantificacion de IFN-beta en las composiciones frente a un intervalo patron de IFN-beta.
Concentracion de polfmero
30 Se efectuo una hidrolisis acida total de la muestra. Se derivatizo el producto con orto-ftalaldehndo y se analizo por HPLC en fase inversa, determinando la concentracion de polfmero Cpol.
Osmolalidad
Se determino la osmolalidad de la composicion usando un osmometro Fiske (MARK3).
Se dan en la Tabla 1 los resultados obtenidos:
5
10
15
20
25
30
- Analisis
- Ejemplo 2 Ejemplo 4 Ejemplo 6
- CIFN-beta (mg/ml)
- 0,51 0,50 0,48
- Cpoi (mg/ml)
- 22 22 22
- pH
- 6,9 6,9 7
- Osmolalidad (mOsm/kg)
- 318 308 306
- Viscosidad (mPa.s)
- 48 53 21
- Tamano de partfcula (nm)
- 18 17 17
Experimento 2: Actividad antivirica
Se valoro la actividad antivirica de IFN-beta mediante una prueba de inhibicion del efecto citopatico; esta prueba esta basada en la capacidad del IFN-beta de proteger a celulas WISH (celulas amnioticas de origen humano) de la accion citopatogenica del VSV (virus de estomatitis vesicular). La interpretacion de la prueba esta basada en el hecho de que muchos virus tales como VSV conducen a la muerte celular, que puede cuantificarse indirectamente tinendo celulas vivas. Por lo tanto, el efecto citopatico puede usarse para cuantificar la proteccion por interferon. La valoracion indirecta de la muerte celular esta basada en la medida de la viabilidad, estimada por la cantidad de sales de tetrazolio (MTT) que penetran en las celulas vivas. El metodo implica determinar el porcentaje de celulas protegidas con un espectrofotometro automatico y analisis segun el modelo de lmeas paralelas de 3 puntos para la evaluacion estadfstica del tttulo de IFN.
Protocolo:
Se efectuo la prueba en placas de microvaloracion.
a. Se anadio un pequeno volumen de medio de cultivo (MEM / 5 % de FBS) a cada pocillo.
b. En la placa, se efectuaron tres diluciones sucesivas (oscilacion de 1,5 de una fila a otra) para la muestra de interferon beta y la disolucion patron, de modo que se obtengan tres concentraciones de interferon beta (0,08 ng/ml, 0,12 ng/ml, 0,l8 ng/ml) colocadas en la curva de dosis y respuesta lineal.
c. Se anadio una suspension de celulas WISH (4*104 celulas/pocillo) a cada pocillo y se incubaron las placas a 37 °C durante 18-22 h en un incubador bajo 5 % de CO2 humidificado.
d. Se anadio una suspension de VSV a cada pocillo, excepto en los pocillos de control que contienen solo MEM / 2,5 % de FBS.
e. Se incubaron las placas a 37 °C durante 20 a 28 h en un incubador bajo 5 % de CO2 humidificado.
f. Despues de la verificacion por microscopia invertida de que:
(1) en la fila del control vmco positivo al menos un 80 % de las celulas monan y
(2) el porcentaje medio de proteccion en presencia del patron de IFN-beta es de aproximadamente 84 % para el patron no diluido, 45% para dilucion a 1/1,5 y 27 % para dilucion a 1/3,
se marcan los cultivos con el tinte MTT espedfico.
g. Se determina la intensidad del color midiendo la densidad optica (DO) a 595 nm usando un espectrofotometro automatico.
h. Para cuantificar la actividad de IFN-beta, se analizan entonces las medidas de densidad optica (DO) usando software informatico (Colombo).
Se dan en la Tabla 2 los resultados obtenidos:
5
10
15
20
25
30
35
40
- Ejemplo 2 Ejemplo 4
- Actividad antivmca en MUI/ml (% de recuperacion) *
- 125,4 (96) 129,8 (101)
- * Porcentaje de recuperacion obtenida frente a la actividad teorica esperada para la protema nativa a la misma concentracion y en las mismas condiciones que la prueba antivmca.
Estos resultados evidencian que la actividad antivmca de la protema IFN-beta de las composiciones de los Ejemplos 2 y 4 de la invencion se conserva en un 100 %.
Experimento 3: Evaluacion de la agregacion de IFN-beta
Valoracion del porcentaje de formas agregadas irreversibles por cromatograffa de exclusion en presencia de dodecilsulfato de sodio (SeC-SDS)
Se determino el porcentaje de formas agregadas irreversibles de IFN-beta en las muestras mediante cromatograffa de exclusion por tamano. El sistema cromatografico consiste en dos columnas conectadas en serie (TSK-Gel G4000PWXL + TSK-Gel SuperAW400) y una fase movil que contiene un detergente, dodecilsulfato de sodio (SDS), (0,3 % de SDS - tampon PBS 3,3 mM).
Se evalua el contenido de agregado irreversible de las composiciones por comparacion con un patron de IFN-beta que contiene de 1 a 1,5 % de dfmeros irreversibles. Este patron consiste en IFN-beta agregado a 100 °C durante 3,5 min diluido en una matriz que reproduce la muestra. Se diluyeron el patron y las muestras 20 veces en SDS al 2 % antes del analisis.
Se compara el perfil cromatografico de cada muestra con el perfil del material agregado patron. Cuando no se detectan agregados irreversibles en la muestra para tratar, o estan por debajo del patron, se da el contenido de agregado de la muestra como por debajo de 2 %.
Cuando el contenido de agregados irreversibles esta por encima de patron, se estima la cuantificacion de agregados mediante la cuantificacion del IFN-beta no agregado (monomero).
Porcentaje de formas agregadas por el metodo de transferencia Western (TW)
Se valoro tambien el porcentaje de formas agregadas de IFN-beta en las muestras por transferencia Western. Se diluyeron 100 ng de muestras de IFN-beta en tampon de Laemmli a pH= 6,8 (0,01 % de SDS, Tris 62,4 mM, 0,06 % de azul de bromofenol, 10 % de glicerol) y se depositaron en los pocillos de un gel de poliacrilamida al 12 %. Para cuantificar el mdice de agregados de las muestras analizadas, se deposito una serie de tres patrones de monomeros de disolucion bruta de IFN-beta en diferentes pocillos del gel para el analisis de cada muestra. Los tres patrones inclrnan 1 ng, 3 ng y 5 ng de IFN-beta por pocillo, correspondientes respectivamente a 1 %, 3 % y 5 % en comparacion con 100 ng de IFN-beta depositado para las muestras. Se depositaron estos patrones despues de la mezcla improvisada de la disolucion bruta de IFN-beta con el poffmero P1 a la misma relacion que las composiciones de IFN-beta y poffmero P1 de la invencion para analizar.
En una primera fase, se separaron las muestras por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS).
En una segunda fase, despues de la migracion del poffmero de poli(acido glutamico) injertado, el IFN-beta y los agregados en el gel, se separaron y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Se revelo entonces espedficamente el IFN-beta usando un anticuerpo primario anti-IFN-beta seguido de un anticuerpo secundario acoplado con fosfatasa alcalina. Se tino entonces la membrana con una mezcla de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3'- indolilo/p-toluidina (BCIP) y cloruro de nitroazul de tetrazolio (NBT), en que se detecto el IFN-beta por los anticuerpos.
Despues de tenir, se determino la relacion de agregados en las composiciones ensayadas comparando visualmente las intensidades de las bandas de patrones y de la posible banda de agregados.
Se dan en la Tabla 3 los resultados obtenidos:
- Valoracion de las formas agregadas de IFN-beta
- Ejemplo 2 Ejemplo 4
- % de formas agregadas (TW)
- no medido <1
- % de formas agregadas (SEC-SDS)
- <2 <2
Experimento 4: Valoracion de la agregacion de IFN-beta en una composicion de la invencion
Se preparo una composicion Ifquida acuosa como se describe en el Ejemplo 2, que contiene aproximadamente 0,5 5 mg/ml de IFN-beta y 22 mg/ml de poffmero de poli(acido glutamico) injertado.
Se comparo el contenido de agregados de la composicion acuosa con el de una disolucion de referencia de IFN-beta 0,4 mg/ml que no contema poffmero de poli(acido glutamico) injertado.
Se dispusieron 0,7 ml de cada una de las composiciones ensayadas en viales de 3 ml y se calentaron las disoluciones durante 30 min a 90 °C.
10 i) Cromatograffa de exclusion por tamano
Despues de calentar, se analizo cada composicion por cromatograffa de exclusion por tamano en presencia de SDS como se describe en el Experimento 3. Se calculo el pico correspondiente al IFN-beta no modificado (monomero) a partir de una serie de patrones de IFN-beta que engloban la concentracion descrita.
Se dan en la Tabla 4 los resultados obtenidos:
15 Tabla 4 - Valoracion de la agregacion
- Pico de monomero de IFN-beta antes del calentamiento Pico de monomero de IFN-beta despues de 30 min de calentamiento
- (%) (%)
- Disolucion de la invencion
- 100 108
- Disolucion de referencia
- 100 44
Estos resultados muestran claramente que elrna un 100 % del IFN-beta como IFN-beta monomerico en la composicion calentada de la invencion, mientras que permanece solo un 44 % en la disolucion de control.
ii) Transferencia Western
20 Se evaluo tambien la presencia o ausencia de agregados de IFN-beta en las muestras por transferencia Western (metodo descrito en el Experimento 3).
El analisis de la membrana despues de la tincion revela la presencia de agregados en la disolucion de referencia (no segun la invencion) calentada durante 30 min a 90 °C, y revela adicionalmente una disminucion de la cantidad de monomero respecto a la muestra no calentada de disolucion de referencia. En cambio, para la muestra calentada de 25 la composicion de la formulacion segun la invencion, no se detecto agregado, y la cantidad de monomero era identica a la de la muestra de una composicion no calentada segun la invencion.
Este segundo metodo confirma la ausencia de agregados en la composicion de la invencion.
En conclusion, las pruebas anteriores prueban que una composicion de la invencion previene la agregacion de IFN- beta.
30 Experimento 5: Estabilidad de composiciones liofilizadas de la invencion
Se dispusieron viales que conteman las composiciones solidas de los Ejemplos 1 y 3 en camaras mantenidas a 5 y 25 °C.
Se sacaron los viales en diferentes momentos y se reconstituyeron con agua como se describe en los Ejemplos 2 y 4. Se analizaron las composiciones lfquidas usando los metodos descritos en los experimentos anteriores y se presentan los resultados en las Tablas 5 y 6.
Tabla 5 - Estabilidad de las composiciones de los Ejemplos 1 y 3 mantenidos a 5 °C
- Analisis
- Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
- CIFN-beta
- T=0 0,51 0,50
- en mg/ml
- 1 mes 0,49 0,51
- 2 meses 0,50 no medido
- 3 meses 0,53 0,50
- 6 meses 0,51 0,52
- 9 meses 0,52 0,48
- 12 meses 0,50 0,49
- 18 meses 0,54 0,53
- 24 meses 0,53 no medido
- Cpol
- T=0 22 22
- en mg/ml
- 1 mes 21 no medido
- 2 meses 21 no medido
- 3 meses 23 22
- 6 meses 22 22
- 9 meses 22 22
- 12 meses 21 22
- 18 meses 22 22
- 24 meses 22 no medido
- pH
- T=0 6,9 6,9
- 1 mes 7,0 7,0
- 2 meses 6,9 no medido
- 3 meses 6,9 6,9
- 6 meses 6,9 6,9
- 9 meses 6,8 6,9
- Analisis
- Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
- 12 meses 7,0 7,0
- 18 meses 6,9 6,9
- 24 meses 6,8 no medido
- Osmolalidad
- T=0 318 308
- en mOsm/kg
- 1 mes 319 307
- 2 meses 281 no medido
- 3 meses 311 306
- 6 meses 300 308
- 9 meses 296 294
- 12 meses 306 300
- 18 meses 305 306
- 24 meses 305 no medido
- Actividad antivmca
- T=0 no medido 129,8 (101)
- en MUI/ml (% de recuperacion)
- 1 mes no medido 121,9 (95)
- 2 meses
- no medido no medido
- 3 meses no medido 125,6 (98)
- 6 meses no medido 134,3 (105)
- 9 meses no medido 123,6 (97)
- 12 meses 125,4 (96) 131 (102)
- 18 meses no medido 136,6 (107)
- 24 meses 137,6 (106) no medido
- % de formas agregadas (TW)
- T=0 no medido <1
- 1 mes no medido <1
- 2 meses no medido no medido
- 3 meses no medido <1
- 6 meses <1 <1
- 9 meses <1 <1
- Analisis
- Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
- 12 meses <1 <1
- 18 meses <1 <1
- 24 meses <1 no medido
- % de formas agregadas (SEC-SDS)
- T=0 <2 <2
- 1 mes <2 <2
- 2 meses <2 no medido
- 3 meses <2 <2
- 6 meses <2 <2
- 9 meses <2 <2
- 12 meses <2 <2
- 18 meses <2 <2
- 24 meses <2 no medido
- Tamano de partfcula
- T=0 18 17
- en nm
- 1 mes 17 18
- 3 meses 19 17
- 6 meses 18 17
- 9 meses 18 18
- 12 meses 18 18
- 18 meses 18 17
- 24 meses 18 no medido
Tabla 6 - Estabilidad de las composiciones de los Ejemplos 1 y 3 mantenidos a 25 °C
- Analisis
- Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
- CIFN-beta en mg/ml
- T=0 0,51 0,50
- 1 mes
- 0,48 0,51
- 2 meses
- 0,48 0,50
- 3 meses
- 0,53 0,50
- Analisis
- Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
- 6 meses 0.53 0,51
- Cpol
- T=0 22 22
- en mg/ml
- 1 mes 22 22
- 2 meses 22 22
- 3 meses 22 22
- 6 meses 22 22
- PH
- T=0 6,9 6,9
- 1 mes 6,9 7,0
- 2 meses 6,9 6,9
- 3 meses 6,9 6,9
- 6 meses 6,9 6,9
- Osmolalidad
- T=0 318 308
- en mOsm/kg
- 1 mes 333 305
- 2 meses 316 310
- 3 meses 324 307
- 6 meses 312 299
- Actividad antivmca
- T=0 no medido 129,8 (101)
- en MUI/ml (% de recuperacion)
- 1 mes no medido 130,1 (102)
- 2 meses
- no medido 130,0 (102)
- 3 meses 121,5 (93) 123,6 (97)
- 6 meses no medido 124,7 (97)
- % de formas agregadas
- T=0 no medido <1
- (TW)
- 1 mes no medido <1
- 2 meses no medido <1
- 3 meses no medido <1
- 6 meses <1 <1
- % de formas agregadas
- T=0 <2 <2
- Analisis
- Tiempo Ejemplo 1 Ejemplo 3
- (SEC-SDS)
- 1 mes <2 <2
- 2 meses <2 <2
- 3 meses <2 <2
- 6 meses <2 <2
- Tamano de partfcula
- T=0 18 17
- en nm
- 1 mes 19 18
- 2 meses 19 18
- 3 meses 18 19
- 6 meses 17 18
Los valores anteriores prueban claramente que las composiciones liofilizadas de la invencion son estables durante un periodo de al menos 24 meses a 5 °C y al menos 6 meses a 25 °C. En particular, son estables frente a la agregacion de IFN-beta, como se muestra por el porcentaje de monomero de IFN-beta restante superior al 98 % 5 durante el mismo periodo, mientras que la bioactividad del iFN-beta antivmco asf formulado no cambia.
Experimento 6: Farmacocinetica de composiciones segun la invencion en monos Cynomolgus
Se ensayaron una composicion lfquida F preparada como se describe en el Ejemplo 2 y una formulacion comercial de liberacion inmediata (FCLI).
Se administraron ambas composiciones por via subcutanea a una dosis de 84 mg/kg en un volumen de 0,17 ml/kg a 10 24 monos divididos en 6 grupos.
Se dan en la Tabla 7 los resultados obtenidos:
Tabla 7 - Farmacocinetica comparada
- Composicion
- Cmax (pg/ml) Tmax (h) AUC 0-t (ng.h/ml) T > LID (h) BDR (%)
- FCLI
- 1155 0,75 14,6 51 100
- Composicion F
- 2199 48 91,5 122 52
BDR: biodisponibilidad relativa comparada con la forma de liberacion inmediata.
Cmax: concentracion plasmatica maxima.
tmax: tiempo al que la concentracion plasmatica es maxima.
ABC : area bajo la curva.
T> LID (limite inferior de deteccion): periodo durante el cual el ingrediente activo es detectable.
La biodisponibilidad de IFN-beta en la composicion lfquida F era del 52 % de la de la composicion de liberacion 15 inmediata. El IFN-beta era detectable mucho mas tiempo en la composicion lfquida F que en la composicion de liberacion inmediata.
Como se muestra en la Figura 1, el perfil plasmatico de IFN-beta liberado de la composicion lfquida F se extiende durante un periodo de al menos 120 h. Esta formulacion permite una administracion semanal a los pacientes.
Experimento 7: Caracterizacion del perfil de liberacion in vitro de las composiciones segun la invencion en comparacion con una composicion fuera del alcance de la invencion usando la prueba T1
Se prepararon las composiciones Ifquidas como se describe en los Ejemplos 2 y 4 y se ensayaron adicionalmente usando la prueba T1. Para cada composicion lfquida, se repitio la prueba in vitro 6 veces. Se preparo una disolucion 5 lfquida fuera del alcance de la invencion, a saber que comprende solo 0,5 mg/ml de IFN-beta, y obtenida mediante la simple disolucion de la disolucion de IFN-beta en un tampon de acetato de sodio 50 mM para comparacion. Se ensayo la disolucion de IFN-beta fuera del alcance de la invencion 3 veces en la misma prueba de T1.
Resultados:
Se da en la Tabla 8 la cantidad de IFN-beta acumulada liberada por cada composicion ensayada:
10 Tabla 8 - Cantidad acumulada de IFN-beta liberado de las composiciones en funcion del tiempo (% de IFN beta liberado frente a cantidad de IFN-beta inicial inyectado en la prueba in vitro- media de 6 o 3 ensayos)
- Composiciones
- Disolucion de IFN-beta 0,5 mg/ml sin polimero de poli(acido glutamico) injertado (%) Composicion liquida del Ejemplo 2 segun la invencion (%) Composicion liquida del Ejemplo 4 segun la invencion (%)
- Tiempo (h)
- 0,03
- 0,3 no medido no medido
- 0,10
- 31,4 no medido no medido
- 0,13
- 52,1 no medido no medido
- 0,17
- 61,7 no medido no medido
- 0,20
- 73,6 no medido no medido
- 0,27
- 88,1 no medido no medido
- 0,30
- 91,8 no medido no medido
- 0,33
- 94,3 no medido no medido
- 0,37
- 95,7 no medido no medido
- 0,40
- 96,9 no medido no medido
- 0,47
- 98,4 no medido no medido
- 0,50
- no medido 2,7 4,7
- 0,60
- 100 no medido no medido
- 1
- - 12,3 15,8
- 1,5
- - 20,5 25,2
- 2
- - 27,7 33,2
- 2,5
- - 34,7 40,8
- 3
- - 41,7 47,8
- 3,5
- - 48,6 54,6
- Composiciones
- Disolucion de IFN-beta 0,5 mg/ml sin polimero de poli(acido glutamico) injertado (%) Composicion liquida del Ejemplo 2 segun la invencion (%) Composicion liquida del Ejemplo 4 segun la invencion (%)
- Tiempo (h)
- 4
- - 55,3 61,0
- 4,5
- - 62,0 67,2
- 5
- - 68,0 73,0
- 5,5
- - 73,8 78,3
- 8
- - 79,3 83,1
- 7
- - 87,9 90,3
- 8
- - 93,0 95,7
- 9
- - 95,8 98,5
- 12
- - 99,9 99,9
- 16
- - 100,0 100,0
- 22
- - 100,0 100,0
Se libero IFN-beta a un nivel del 50 % en pocos minutos de la disolucion de IFN-beta sin polfmero de poli(acido glutamico) injertado, mientras que se libero la misma cantidad de las composiciones lfquidas segun la invencion despues de mas de 2 horas.
5 La liberacion de IFN-beta era mucho mas prolongada en una composicion de la invencion comparada con una disolucion de IFN-beta.
Experimento 8: Caracterizacion del perfil de liberacion in vitro de una composicion segun la invencion en comparacion con composiciones fuera del alcance de la invencion usando la prueba T2
Se prepararon las composiciones lfquidas como se describe en los Ejemplos 8 y 10 y se ensayaron adicionalmente 10 usando la prueba T2. Para cada composicion lfquida, se repitio la prueba in vitro 3 veces.
Resultados:
Se da en la Tabla 9 la cantidad de IFN-beta acumulada liberado por cada composicion ensayada:
Tabla 9 - Cantidades acumuladas de IFN-beta liberado de las composiciones en funcion del tiempo (% de IFN-beta liberado frente a cantidad de IFN-beta inicial inyectado en la prueba in vitro- media de 3 ensayos)
- Composiciones
- Composicion liquida del Ejemplo 8 segun la invencion (%) Composicion liquida del Ejemplo 10 fuera del alcance de la invencion (%)
- Tiempo (h)
- 0,50
- 5,6 27,5
- 1
- 24,2 82,6
- 1,5
- 51,2 96,9
- 2
- 66,9 98,1
- Composiciones
- Composicion liquida del Ejemplo 8 segun la invencion (%) Composicion liquida del Ejemplo 10 fuera del alcance de la invencion (%)
- Tiempo (h)
- 2,5
- 79,3 98,3
- 3
- 88,5 98,3
- 3,5
- 94,8 98,4
- 4
- 97,5 98,4
- 4,5
- 98,8 98,4
- 5,5
- 98,9 98,5
- 7,5
- 99,3 98,5
- 11,5
- 100,0 99,7
- 15
- 100,0 100,0
Se libero IFN-beta a un nivel del 60 % en menos de 1 h de la composicion Kquida fuera del alcance de la invencion (Ejemplo 10), mientras que se libero la misma cantidad de las composiciones Kquidas segun la invencion despues de mas de 1,5 horas (Ejemplo 8).
5 La liberacion de IFN-beta era mucho mas prolongada en una composicion de la invencion comparado con las composiciones lfquidas fuera del alcance de la invencion.
REFERENCIAS
1. Derynk R. et al., Nature 1980; 285, 542-547.
2. Familletti, P. C., Rubinstein, S. y Pestka, S. 1981 "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for 10 Interferon," en "Methods in Enzymology", vol. 78 (S. Pestka, ed.), Academic Press, Nueva York, 387-394;
3. Mark D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (18) 5662-5666 (1984).
4. Pestka, S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations", en "Methods in Enzymology" (S. Pestka, ed.), Academic Press, Nueva York 119, 14-23.
5. Rubinstein, S.,Familletti, P.C. y Pestka, S. "Convenient Assay for Interferons". J. Virol. 1981; 37, 755-758.
15 6. Shepard H. M. et al., Nature 1981; 294, 563-565.
Claims (16)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Una composicion farmaceutica solida que comprende:- interferon beta (IFN-beta) y- un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y
- 40.000 g/mol injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo el mdice de injerto molar medio de 4,5-5,5 % en moles, en la que la relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
- 2. La composicion segun la reivindicacion 1, en la que la relacion de injerto molar media de sustituyentes de alfa-tocoferol es de aproximadamente 5 %.
- 3. La composicion segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende adicionalmente un antioxidante a una relacion en peso/peso de antioxidante/IFN-beta entre 2 y 7.
- 4. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un lioprotector a una relacion en peso/peso de lioprotector/IFN-beta entre 50 y 600.
- 5. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente:- metionina en una relacion en peso/peso de metionina/IFN-beta entre 2 y 7;- sacarosa en una relacion en peso/peso de sacarosa/IFN-beta entre 50 y 600.
- 6. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:a) aproximadamente 0,5 mg de IFN-beta;b) aproximadamente 22 mg de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles;c) aproximadamente 1,5 mg de metionina; yd) aproximadamente 76 mg de sacarosa;o un multiplo o submultiplo de dichas cantidades.
- 7. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un liofilizado.
- 8. Una composicion lfquida acuosa que comprende:- IFN-beta y- un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y
- 40.000 g/mol injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo el mdice de injerto molar medio de 4,5-5,5 % en moles, en la que la relacion en peso/peso entre dicho polfmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta esta entre 24 y 125.
- 9. La composicion lfquida de la reivindicacion 8, en la que la concentracion de IFN-beta esta entre 0,2 y 0,8 mg/ml.
- 10. La composicion lfquida de las reivindicaciones 8 o 9, en la que la concentracion de polfmero de poli(acido glutamico) injertado esta entre 19 y 25 mg/ml.
- 11. La composicion lfquida segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende:a) aproximadamente 0,5 mg/ml de IFN-beta;b) aproximadamente 22 mg/ml de polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecularmedio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes de alfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles;c) aproximadamente 1,5 mg/ml de metionina;d) aproximadamente 76 mg/ml de sacarosa;
- 12. Un metodo para preparar una composicion solida que comprende IFN-beta y un polfmero de poli(acido glutamico) injertado que tiene un peso molecular medio entre 26.000 y 40.000 g/mol, injertado con sustituyentes dealfa-tocoferol, siendo la relacion de injerto molar media de 4,5-5,5 % en moles y siendo la relacion en peso/peso entre dicho poUmero de poli(acido glutamico) injertado e IFN-beta entre 24 y 125, que comprende las siguientes etapas:(a) proporcionar una disolucion Kquida acuosa de polfmero de poli(acido glutamico) injertado a una5 concentracion entre 20 y 30 mg/g;(b) proporcionar una disolucion de IFN-beta a una concentracion entre 1 y 9 mg/ml; en la que esta presente al menos un compuesto seleccionado de lioprotector, antioxidante y aditivo para el ajuste del pH en al menos una de las disoluciones de la etapa (a) y la etapa (b);(c) mezclar las disoluciones obtenidas en la etapa (a) y (b), de tal modo que, despues de mezclar, la10 composicion:15• tenga una concentracion de polfmero entre 4 y 16 mg/g,• tenga una osmolalidad entre 100 y 250 mOsm/kg,• tenga un pH entre 6,5 y 7,5;(d) esterilizar al menos una vez la mezcla resultante; y(e) deshidratar la disolucion, formando dicha composicion solida.
- 13. Una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso en un metodo para el tratamiento terapeutico del cuerpo humano o animal.
- 14. Una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso en un metodo de tratamiento terapeutico de enfermedades autoinmunitarias cronicas del sistema nervioso central o de enfermedades 20 neurologicas.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161488544P | 2011-05-20 | 2011-05-20 | |
| EP11305617 | 2011-05-20 | ||
| US201161488544P | 2011-05-20 | ||
| EP11305617 | 2011-05-20 | ||
| PCT/EP2012/059086 WO2012159945A1 (en) | 2011-05-20 | 2012-05-16 | Ifn-beta compositions, preparation methods and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2563737T3 true ES2563737T3 (es) | 2016-03-16 |
Family
ID=44650568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES12721844.4T Active ES2563737T3 (es) | 2011-05-20 | 2012-05-16 | Composiciones de IFN-beta, métodos de preparación y usos de las mismas |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9272020B2 (es) |
| EP (1) | EP2709595B1 (es) |
| ES (1) | ES2563737T3 (es) |
| WO (1) | WO2012159945A1 (es) |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4588585A (en) | 1982-10-19 | 1986-05-13 | Cetus Corporation | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins |
| US4737462A (en) | 1982-10-19 | 1988-04-12 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β |
| US4959314A (en) | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| US5116943A (en) | 1985-01-18 | 1992-05-26 | Cetus Corporation | Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein |
| US5017691A (en) | 1986-07-03 | 1991-05-21 | Schering Corporation | Mammalian interleukin-4 |
| US4879111A (en) | 1986-04-17 | 1989-11-07 | Cetus Corporation | Treatment of infections with lymphokines |
| US4965195A (en) | 1987-10-26 | 1990-10-23 | Immunex Corp. | Interleukin-7 |
| US4904584A (en) | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| FR2801226B1 (fr) | 1999-11-23 | 2002-01-25 | Flamel Tech Sa | Suspension colloidale de particules submicroniques de vectorisation de principes actifs et son mode de preparation |
| FR2840614B1 (fr) | 2002-06-07 | 2004-08-27 | Flamel Tech Sa | Polyaminoacides fonctionnalises par de l'alpha-tocopherol et leurs applications notamment therapeutiques |
| FR2862541B1 (fr) | 2003-11-21 | 2007-04-20 | Flamel Tech Sa | Formulations pharmaceutiques pour la liberation prolongee d'interferons et leurs applications therapeutiques |
| WO2005105565A1 (en) | 2004-04-29 | 2005-11-10 | Single Buoy Moorings Inc. | Side-by-side hydrocarbon transfer system |
| EP1877077A2 (en) * | 2005-02-03 | 2008-01-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | An implantable interferon-containing device |
| FR2915683B1 (fr) | 2007-05-03 | 2009-08-07 | Flamel Technologies Sa | Formulations pharmaceutiques auto-precipitantes pour la liberation modifiee de principe actif |
| FR2915748B1 (fr) | 2007-05-03 | 2012-10-19 | Flamel Tech Sa | Acides polyglutamiques fonctionnalises par des groupes cationiques et des groupements hydrophobes et leurs applications, notamment therapeutiques |
-
2012
- 2012-05-16 WO PCT/EP2012/059086 patent/WO2012159945A1/en active Application Filing
- 2012-05-16 EP EP12721844.4A patent/EP2709595B1/en active Active
- 2012-05-16 ES ES12721844.4T patent/ES2563737T3/es active Active
- 2012-05-16 US US14/118,757 patent/US9272020B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20140105858A1 (en) | 2014-04-17 |
| EP2709595B1 (en) | 2016-02-03 |
| US9272020B2 (en) | 2016-03-01 |
| EP2709595A1 (en) | 2014-03-26 |
| WO2012159945A1 (en) | 2012-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2381674T3 (es) | Método de estabilizar proteínas | |
| CN1993139B (zh) | 稳定的干扰素液体制剂 | |
| ES2387236T3 (es) | Formulaciones de interferón beta pegilado | |
| ES2205481T3 (es) | Microparticulas biodegradables para la liberacion sostenida de farmacos terapeuticos. | |
| ES3019509T3 (en) | Pharmaceutical composition of glp-1/glp-2 dual agonists | |
| ES3002132T3 (en) | Lyophilized pharmaceutical composition of fc-peptide fusion protein | |
| ES2374530T3 (es) | Formulaciones líquidas de interferón estabilizado. | |
| ES2921235T3 (es) | Preparación estabilizada de variante de interferón beta | |
| CA2545632C (en) | A pharmaceutical composition comprising an active principle and a non-detergent sulphobetaine | |
| ES2563737T3 (es) | Composiciones de IFN-beta, métodos de preparación y usos de las mismas | |
| ES2885764T3 (es) | Nuevo sistema de liberación de proteínas hidrófobas | |
| Neuhofer | Development of lipid based depot formulations using interferon-beta-1b as a model protein | |
| KR101781945B1 (ko) | 인터페론 베타 변이체의 안정화 제제 | |
| KR20070030855A (ko) | 단백질을 안정화하는 방법 | |
| JPH06247870A (ja) | インターロイキン−６を含有する医薬製剤 | |
| US20120294832A1 (en) | Composition comprising interferon alpha | |
| WO2012160485A1 (en) | Composition comprising interferon alpha |