FI105203B - Menetelmä rekombinantti-ihmisinterferoni-beta-muteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 105203

Menetelmä rekombinantti-ihmisinterferoni-S-muteiinin valmistamiseksi

Selitys 5 Tekninen ala Tämä keksintö kuuluu yhdistelmä-DNA -tekniikan yleiseen alueeseen. Erityisesti se koskee mutationaalisesti muutettuja biologisesti aktiivisia proteiineja, jotka eroavat kanta-analogeistaan yhden tai useamman kysteiinitäh-10 teen korvautumisella/deletoitumisella.

Tekniikan taso

Biologisesti aktiiviset proteiinit, joita tuotetaan mikrobiaalisesti yhdistelmä-DNA (rDNA) -tekniikalla, saat-15 tavat sisältää kysteiinitähteitä, jotka eivät ole välttä mättömiä niiden aktiivisuudelle, mutta ovat vapaita muodostamaan ei toivottuja intermolekulaarisia tai intramoleku-laarisia sidoksia. Eräs sellainen proteiini on mikrobiaalisesti tuotettu ihmisen beeta-interferoni (IFN-β). Valmis-20 tettaessa IFN-3:a rDNA-tekniikalla on havaittu, että kor keita IFN-6 -pitoisuuksia sisältävissä E.coli -uutteissa muodostuu mikrobiaalisesti tuotetun IFN-B:n dimeerejä ja oligomeerejä. Tämä multimeerien muodostuminen tekee IFN-β:η puhdistamisen ja eristämisen hyvin työlääksi ja aikaa-’25 vieväksi ja tekee välttämättömäksi puhdistus- ja eristysme-netelmien useat lisävaiheet kuten proteiinin pelkistämisen puhdistuksen aikana ja uudelleenhapetuksen palauttamaan sen alkuperäisen rakenteen siten lisäten virheellisen di-sulfisidoksen muodostumismahdollisuutta. Edelleen mikro-30 biaalisesti tuotetulla IFN-6:lla on myös huomattu olevan johdonmukaisesti alhainen spesifinen aktiivisuus johtuen ehkä multimeerien tai umpimähkäisten intramolekulaaristen disulfidisiltojen muodostumisesta. Sen vuoksi olisi toivottavaa kyetä muuttamaan mikrobiaalisesti tuotettuja bio-35 logisesti aktiivisia proteiineja kuten INF-B:a tavalla, mikä ei vaikuta haitallisesti niiden aktiivisuuteen, mutta vähentää tai eliminoi niiden kyvyn muodostaa intermoleku- 2 105203 laarisia ristisidoksia tai intramolekulaarisia sidoksia, jotka aiheuttavat sen, että proteiini saa ei—toivotun ter-tiäärisen rakenteen (esim. rakenteen, joka vähentää proteiinin aktiivisuutta).

5 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tuottaa koh dennetulla mutageneesitekniikalla mutationaalisesti muutettuja biologisesti aktiivisia proteiineja (sellaisia proteiineja kutsutaan "muteiineiksi", Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4th Ed, s. 381, Springer-Verlag (1976)), 10 jotka säilyttävät kanta-analogiensa aktiivisuuden, mutta joilta puuttuu kyky muodostaa intermolekulaarisia sidoksia tai ei—toivottuja intramolekulaarisia disulfidisidoksia. Tässä suhteessa Shepard, H.M., et ai., Nature (1981) 294.: 563-565, kuvaavat IFN-8:n muteiinin, jossa sen aminohappo-15 järjestyksen asemassa 1*11 kysteiini on korvattu tyrosiinil-la (alkuperäisessä ihmisen IFN-6:ssa on kolme kysteiiniä asemissa 17, 31 ja 141, Gene (1980) 1Ό:11-15 ja Nature (1980) 285 : 5A2-5*47) Tämä muteiini valmistettiin hybridi-geenin bakteeriekspressiolla, hybridigeeni rakennettiin 20 osittaisesta IFN-6-cDNA -kloonista, jossa oli G-*-A siirtymä IFN-6-geenin nukleotidissä 485. Muteiinilta puuttui alkuperäisen IFN-6:n biologinen aktiivisuus, mikä johti tekijät päätelmään, että korvattu kysteiini oli välttämätön aktiivisuudelle.

25 Kohdennettu mutageneesitekniikka on hyvin tunnettua ja sitä ovat tarkastelleet Lather, R.F. ja Lecoq, J.P. teoksessa Genetic Engineering Academic Press (1983) s. 31-50. Smith, M. ja Gillam, S. teoksessa Genetic Engineering; Principles and Methods, Plenum Press (1981) 3:1-32 ovat : 30 erityisesti tarkastelleet oligonuklotidi-kohdennettua muta- geneesia.

Keksinnön kuvaus

Keksinnön kohteena on menetelmä synteettisen rekombinantti-35 ihmisinterferoni-β-muteiinin valmistamiseksi, missä menetelmässä a) valmistetaan rakenteellinen geeni, joka koodaa biolo- 3 105203 gisesti aktiivistä synteettistä ihmisen interferoni-β-muteiinia, jossa muteiinissa asemassa 17, numeroituna ihmisen luonnollisen interferoni-β:n mukaan, normaalisti oleva kysteiinitähde joka on vapaa muodostamaan disulfidisidoksen 5 ja joka ei ole välttämätön mainitulle biologiselle aktiivisuudelle, on deletoitu tai korvattu neutraalilla aminohapolla; b) viedään geeni replikoituvassa ja ekspressoituvassa muodossa isäntäorganismiin, joka isäntäorganismi on baktee-io ri, kuten E.coli. Pseudomonas, Bacillus subtilis. Bacillus thuringiensis tai Bacillus thermophilus, hiivalaji, eläinso-lu, kuten hiiren, rotan tai kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO)solu; ja c) ekspressoidaan geeni.

15

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuva 1 on diagrammi ΙΡΝ-β:η aminohappojärjestyksestä.

Kuva 2 on kaavakuva, joka esittää mutantti-IFN-B-gee-nin valmistuksen oligonukleotidi-kohdennetulla mutagenee-20 silla.

Kuva 3 on diagrammi IFN-g-geenin sisältävästä plasmi-dista ρβΐ-trp.

Kuva on diagrammi klooni vektori M13mp8-faagista.

Kuva 5 on kloonin Ml^-pl restriktiokartta.

25 Kuva 6 on sekvenssoituva geelinäyte mutantti-IFN-B

serl7 -geenistä, jossa on yksittäisen emäksen muutos koo-daavalla alueella.

Kuva 7 on diagrammi ekspressioplasmidista pTrp 3.

Kuva 8a esittää kloonin pSY2501 Hin fl-restriktiota ja 30 Kuva 8b esittää siitä saatavat kaksi 169 ep:n ja 28 ep:n fragmentit.

Kuva 9 on kloonin pSY2501 restriktiokartta.

Kuva 10 esittää muteiinin IFM-6serl7 koodaavan DNA-jakson ja sitä vastaavan aminohappojärjestyksen.

35 Kuva 11 on IFN-6serl7 vastaava yksittäinen 18.000 daltonin proteiinivyöhyke kloonien pSY2501 ja pBltrp -uutteissa.

4 105203

Menetelmät keksinnön toteuttamiseksi

Esillä oleva keksintö antaa: biologisesti aktiivisten proteiinien muteiineja, joissa sellaiset kysteiinitähteet, jotka eivät ole välttämättömiä biologiselle aktiivisuudel-5 le, on tarkoituksellisesti deletoitu tai korvattu muilla aminohapoilla eliminoimaan intermolekulaaristen ristisidos-ten ja virheellisen intramolekulaarisen disulfidisidoksen muodostumiskohdat; muteiineja koodaavia mutanttigeenejä ja menetelmää muteiinien valmistamiseksi.

10 Proteiineja, jotka voidaan mutationaalisesti muuttaa tämän keksinnön mukaisesti, voidaan identifioida saatavilla olevan tiedon avulla koskien biologisesti aktiivisten proteiinien kysteiinisisältöä ja kysteiinitähteiden merkitystä aktiivisuuden ja tertiäärisen rakenteen suhteen.

15 Niistä proteiineista, joista tällaista tietoa ei ole kirjallisuudesta saatavissa, tieto voidaan määrittää systemaattisesti muuttamalla proteiinin jokainen kysteiinitähde tässä kuvatuin menetelmin ja testaamalla saatujen muteiinien biologinen aktiivisuus ja niiden taipumus muodostaa 20 ei toivottuja intermolekulaarisia tai intramolekulaarisia disulfidisidoksia. Siis, vaikka keksintöä jäljempänä erityisesti kuvataan ja sovelletaan IFN-β- ja IL-2 -muteiinien suhteen, on selvää, että seuraavat menetelmät soveltuvat mille tahansa biologisesti aktiiviselle proteiinille, joka • > 25 sisältää toiminnallisesti epäoleellisia kysteiinitähteitä, jotka altistavat proteiinin muodostamaan ei toivotun disulfidisidoksen. Esimerkkejä proteiineista, muista kuin IFN-β ja IL-2, jotka voitaisiin muuttaa mutationaalisesti keksinnön mukaisilla menetelmillä, ovat lymfotoksiini (nekroosi-30 kasvaintekijä) ja pesäkkeitä stimuloiva faktori-1 ja IFN-cxl. Tämän tyyppisillä proteiineilla on tavallisesti pariton lukumäärä kysteiinitähteitä.

IFN-6:n suhteen on kirjallisuudessa selvitetty, että sekä glykosyloidulla että glykosyloimattomalla IFN:llä on 35 kvalitatiivisesti samanlainen spesifinen aktiivisuus ja että sen vuoksi glykosyyliosaset eivät sisälly eivätkä vaikuta IFN-β:n biologiseen aktiivisuuteen. Kuitenkin bakteriaa- 105203 lisesti tuotetulla glykosyloimattomalla IFN-B:lla on kvantitatiivisesti alhaisempi spesifinen aktiivisuus kuin alkuperäisellä glykosyloidulla IFN-B:lla. IFN-&:lla tiedetään olevan kolme kysteiinitähdettä asemissa 17, 31 ja 141.

5 Shepard, et ai., edellä, ovat osoittaneet kysteiinin l4l olevan välttämätön biologiselle aktiivisuudelle. Neljä kysteiinitähdettä sisältävässä IFN-a:ssa on kaksi intramo-lekulaarista -S-S-sidosta: yksi välillä kys-29 ja kys-138 ja toinen välillä kys-1 ja kys-98. Perustuen IFN-B:n ja 10 IFN-a:n väliseen homologiaan IFN-(3:n kys-141 voisi sisältyä intramolekulaariseen -S-S-sidokseen k-ys-31:n kanssa jättäen kys-17 vapaaksi muodostamaan intermolekulaarisia ristisidoksia. Joko deletoimalla kys-17 tai korvaamalla se eri aminohapolla voidaan määrittää, onko kys-17 välttä-15 mätön biologiselle aktiivisuudelle ja sen osuus -S-S-sidok-sen muodostumisessa. Jos kys-17 ei ole välttämätön proteiinin biologiselle aktiivisuudelle, saatavan proteiinin, josta kys-17 on deletoitu tai korvattu, spesifinen aktiivisuus saattaisi olla lähellä alkuperäisen IFN-B:n aktiivi-20 suutta ja mahdollisesti proteiinin eristäminen ja puhdistus myös helpottuisivat.

Käyttämällä oligonukleotidi-kohdennettua mutageneesime-netelmää synteettisellä oligonukleotidialukkeella voidaan tuottaa muotoilijageeni, joka saa aikaan kys-17 korvautumi-25 sen millä tahansa valittavissa'olevalla aminohapolla. Oli-gonukleotidialuke on komplementaarinen IFN-B-geenin alueelle kys-17-kodonissa, mutta sisältää yksittäisen tai moninkertaisia emäsmuutoksia tuossa kodonissa. Kun deleetio on toivottava, oligonukleotidialukkeesta puuttuu kys-17-kodoni. 30 Kys-17 muutetaan mieluiten neutraaliksi aminohapoksi kuten glysiiniksi, valiiniksi, alaniiniksi, lensiiniksi, isolen-siiniksi, tyrosiiniksi, fenyylialaniiniksi, histidiiniksi , tryptofaaniksi, seriiniksi, treoniiniksi ja metioniiniksi. Korvaavina aminohappoina käytetään mieluiten seriiniä ja 35 treoniinia, koska ne ovat kemiallisesti analogisia kysteii-nille. Kun kysteiini poistetaan, muodostunut muteiini on yhden aminohapon lyhyempi kuin kantaproteiini tai mikro- 6 105203 biaalisesti tuotettu IFN-β.

Ihmisen IL-2:ssa ilmoitetaan olevan kolme kysteiinitäh-dettä sijaiten proteiinin asemissa 58, 105 ja 125. Kuten IFN-6:n tapauksessa bakteerisoluista eristettäessä IL-2 on 5 aggregatoituneessa oligomeerisessa muodossa ja on pelkistettävä pelkistimillä, jotta saadaan hyvä saanto bakteeri-uutteista. Lisäksi puhdistettu pelkistetty IL-2-proteiini on epästabiili ja on mielellään varastoinnin ajaksi uudelleen hapetettava oligomeeriseen epäaktiiviseen muotoon.

10 Kolmen kysteiinin läsnäolo merkitsee, että uudelleenhape-tuksen aikana proteiini voi-umpimähkäisesti muodostaa yhden kolmesta mahdollisesta intramolekulaarisesta disulfidi-sillasta vain yhden niistä ollessa oikea, alkuperäisestä molekyylistä löydettävä silta. Koska alkuperäisen IL-2-15 proteiinin disulfidirakennetta ei tunneta, on mahdollista käyttää esillä olevaa keksintöä aiheuttamaan mutaatioita IL-2-geenin kodoneissa 58, 105 ja 125 ja tunnistaa, mitkä kysteiinitähteet ovat välttämättömiä aktiivisuudelle ja sen vuoksi luultavimmin sisältyvät alkuperäisen disulfidi-20 sillan muodostumiseen. Samalla kertaa voidaan muuttaa sellainen kysteiinitähde, joka ei ole välttämätön aktiivisuudelle, jotta estetään virheellisten intramolekulaaristen disulfidisiltojen muodostuminen ja minimoidaan intermoleku-... laaristen disulfidisiltojen mahdollisuus deletoimalla tai m m 25 korvaamalla vapaa kysteiinitähde.

Oligonukleotidialukkeen koon määrää alukkeen stabiilin hybridisaation tarve sen geenin alueelle, jossa mutaatio aiheutetaan ja tällä hetkellä saatavissa olevien oligonuk-leotidien syntetisoimismenetelmien rajoitukset. Smith, M.

; 30 ja Gillam, S., edellä, ovat kuvanneet oligonukleotidi-koh- dennetussa mutageneesissa käytettävien oligonukleotidien muotoilussa huomioonotettavia seikkoja (esim. kokonaiskoko, mutaatiokohdan sivulla olevien osien koko). Yleensä oligo-nukleotidin kokonaispituus on sellainen, millä optimoidaan 35 stabiili, ainutlaatuinen hybridisaatio mutaatiokohdassa 5' ja 3' pidentymien mutaatiokohdasta ollessa riittävän kokoisia estämään DNA-polymeraasin eksonukleaasiaktiivisuudella 7 105203 korjaamasta mutaatiota. Esillä olevan keksinnön mukaisesti mutageneesissa käytetyt oligonukleotidit sisältävät tavallisesti noin 12:sta noin 2^:än emästä, mieluummin noin I4:sta noin 20:een emästä ja vielä mieluummin noin 15:sta 5 noin l8:aan emästä. Ne sisältävät tavallisesti ainakin noin kolme muutetun tai puuttuvan kodonin 3’-emästä.

Modifioidun IFN-f}-geenin valmistusmenetelmä sisältää selvästi IFN-6-geenin kodonissa 17 (TGT) aiheutetun paikka-spesifisen mutageneesin käyttäen synteettistä nukleotidi-10 aluketta, josta puuttuu kodoni tai se on muutettu koodaamaan toinen aminohappo. Kun treoniini korvaa kysteiinin ja aluke hybridisoidaan IFN-8-geenin vastasäikeeseen, suositeltavin nukleotidialuke on GCAATTTTCACTCAG (alleviivaus osoittaa muutetun kodonin). Kun on toivottavaa deletoida 15 kysteiini, suositeltavin aluke on AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG, josta puuttuu kysteiinin TGT-kodoni. Kun seriini korvaa kysteiinin, 17-nukleotidialuke, GCAATTTTCAGAGTCAG, joka sisältää seriinin AGT-kodonin, on valittu aluke. Ensimmäisen emäksen T-+-A siirtymä kys-17-kodonissa aiheuttaa kys-20 teiinin vaihtumisen seriiniksi. On huomattava, että kun käytetään deleetioita, sopiva DNA-jakson tulkintarakenne täytyy säilyttää halutun proteiinin ekspressiota varten.

Aluke hybridisoidaan yksisäikeiseen faagiin, kuten M13, fd tai 0x17^, johon IFN-0-geenin säie on kloonattu. On ” 25 selvää, että faagissa voi olla joko geenin tuntosäie tai vastasäie. Kun faagissa on vastasäie, aluke on identtinen sille tuntosäikeen alueelle, joka sisältää mutaatiolla muutettavan kodonin, lukuunottamatta yhteensopimattomuutta kodonin deleetion määrittelevän kodonin tai toisen aminoha-30 pon koodaavan kolmikkokoodin kanssa. Kun faagissa on tun-: tosäie, aluke on komplementaarinen sille tuntosäikeen alueelle, joka sisältää mutaatiolla muutettavan kodonin, lukuunottamatta tarkoituksenmukaista yhteensopimattomuutta kolmikkokoodissa, joka muodostaa parin deletoitavan kodo-35 nin kanssa. Smith, M. ja Gillam, S., edellä, ovat kuvanneet olosuhteita, joita voidaan käyttää hybridisaatiossa. Lämpötila vaihtelee tavallisesti noin 0°C:sta 70°C:seen, 8 105203 tavallisemmin noin 10°C:sta 50°C:seen. Hybridisaation jälkeen aluke liitetään faagi-DNA:han reaktiolla DNA-polyme-raasi I:n, T^-DNA-polymeraasin, käänteiskopioijaentsyymin tai muun sopivan DNA-polymeraasin kanssa. Saatu dsDNA 5 muutetaan suljetuksi dsDNA-renkaaksi käsittelemällä DNA- ligaasilla kuten T^-DNA-ligaasilla. DNA-molekyylin sisältämät yksisäikeiset alueet voidaan tuhota Sl-endonukleaasi-käsittelyllä.

Oligonukleotidi-kohdennettua mutageneesia voidaan salo maila tavalla käyttää valmistettaessa mutantti-IL-2-geeni, •joka koodaa muteiinin, jolla on IL-2-aktiivisuus, mutta kysteiini 125 on vaihdettu seriiniin 125. Suositeltavin oligonukleotidialuke, jota käytetään tämän mutantti-IL-2-geenin valmistuksessa, kun faagissa on geenin tuntosäie, 15 on GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATC. Tässä oligonukleotidissä on OG muutos IL-2-geenin kodonin 125 kanssa parin muodostavan kolmikkokoodin keskimmäisessä emäksessä.

Saatu mutationaalinen heterodupleksi siirretään sitten sopivaan isäntäorganismiin tai soluun. Heterodupleksin 20 kohdentuminen isännässä tuottaa jälkeläisiä kummastakin säikeestä. Kohdentumisen jälkeen mutanttigeeni voidaan eristää mutanttisäikeen jälkeläisistä, liittää sopivaan ekspressiovektoriin ja vektori on tapana transformoida sopivaan isäntäorganismiin tai soluun. Sopivimpia vektorei- • · 25 ta ovat plasmidit pBR322, pCRl ja niiden muunnokset, synteettiset vektorit yms. Sopivia isäntäorganismeja ovat Lcoli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, erilaiset hiivalajit, Bacillus thermophilus, eläinsolut, kuten hiiren, rotan tai kiinalaisen hamsterin 30 muna (CHO)-solut, kasvisolut, eläin- ja kasvi-isännät yms.

On huomattava, että kun valittu isäntä transformoidaan vektorilla, sopivat promoottori-operaattori-jaksot siirretään myös, jotta saadaan aikaan muteiinin ekspressio. Isännät voivat olla prokarioottisia tai eukarioottisia (mene-35 telmiä, joilla DNA insertoidaan eukarioottisoluihin, on kuvattu PCT-hakemuksissa numerot US 81/00239 ja US 81/002*40, tulleet julkisiksi 3. syyskuuta 1981). E.coli ja CHO-solut 105203 ovat sopivimmat isännät. Esillä olevan keksinnön mukaisesti saatavat muteiinit voivat olla glykosyloituja tai glyko-syloimattomia riippuen glykosylaation tapahtumisesta alkuperäisessä kantaproteiinissa tai muteiinin tuottamiseen 5 käytettävässä isäntäorganismissa. Haluttaessa saatu glyko-syloimaton muteiini, kun E.coli tai Bacillus on isäntäorga-nismi, voidaan haluttaessa glykosyloida in vitro kemiallisilla, entsymaattisilla tai muilla sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

10 Esillä olevan keksinnön suositeltavimmassa sovellutus- muodossa koskien IFN-8:a kysteiinitähde IFN-6:n aminohappo-järjestyksen asemassa 17, kuten kuva 1 osoittaa, vaihdetaan seriiniksi DNA-jakson tuntosäikeessä olevan kodonin 17 ensimmäisen emäksen T-+A siirtymällä. DNA-jakso' koodaa 15 muodostuvan IFN-S:n. Paikkaspesifinen mutageneesi aiheutetaan käyttäen synteettistä 17-nukleotidialuketta GCAATTTTCAGAGTCAG, joka on identtinen seitsemäntoista nukleotidin jaksolla IFN-β'.η tuntosäikeessä kodonin 17 alueella lukuunottamatta yksittäisen emäksen yhteensopimattomuut-20 ta kodonin 17 ensimmäisessä emäksessä. Yhteensopimaton kohta on alukkeen nukleotidissa 12. On huomattava, että geneettinen koodi on degeneroitunut ja että monia aminohappoja saattaa koodata useampi kuin yksi kodoni. Esimerkik-.. si seriinin emäskoodi on kuudella tavalla degeneroitunut 25 niin, että kodonit TCT, TCG, TCC, TCA, AGT ja ACG kaikki koodaavat seriiniä. AGT-kodoni valittiin sopivuuden takia suositeltavimmaksi sovellutusmuodoksi. Samalla tavalla treoniinia koodaa mikä tahansa kodoneista ACT, ACA, ACC ja ACG. On tarkoitettu, että kun yksi kodoni eritellään tie-. .· 30 tylle aminohapolle, se sisältää kaikki degeneroituneet ko donit, jotka koodaavat sitä aminohappoa. 17 nukleotidin jakso hybridisoidaan yksisäikeisen M13-faagin DNArhan, jossa on IFN-6-geenin vastasäie. Oligonukleotidialuke liitetään sitten DNA:han käyttäen DNA-polymeraasi I Klenow-35 fragmenttia ja saatu dsDNA muutetaan suljetuksi DNA-ren- kaaksi T^-ligaasilla. Saadun mutationaalisen heterodyplek-sin kohdentuminen tuottaa yhteensopimattoman alueen sisäl- 10 . 105203 tävän DNA-säikeen klooneja. Mutanttikloonit voidaan tunnistaa ja seuloa spesifisten restriktiokohtien ilmaantumisen tai katoamisen avulla, antibioottiresistenssin tai -herkkyyden avulla tai muilla sinänsä tunnetuilla menetel-5 millä. Kun kysteiini korvataan seriinillä, T-*-A siirtymä, esitetty kuvassa 2, päättyy uuden Hinf I -restriktiokohdan ilmaantumiseen rakenteellisessa geenissä. Mutanttiklooni tunnistetaan käyttäen oligonukleotidialuketta koettimena mutatoituneiden faagiplakkien hybridisaatioseulonnassa.

10 Alukkeella on yksittäinen yhteensopimaton kohta, kun se on hybridisoitunut kantayksilöön, mutta täydellinen yhteensopivuus, kun se on hybridisoitunut mutatoituneen faagin DNA:han, kuten on·esitetty kuvassa 2. Sen jälkeen voidaan suunnitella hybridisaatio-olosuhteet, joissa oligonukleo-15 tidialuke on suositeltavimmin hybridisoitunut mutatoitunee-seen DNA:hän, mutta ei kanta-DNA:han. Äskettäin muodostuneen Hinf I-kohdan avulla voidaan myös varmistaa yksittäinen emäsmuutos IFN-0-geenissä.

M13-faagin DNArssa oleva mutatoitunut geeni eristetään 20 ja liitetään sopivaan ekspressiovektoriin kuten plasmidiin pTrp3 ja E.coli-kanta MM29^ transformoidaan vektorilla. Transformanttien ja niiden jälkeläisten viljelyyn sopivat kasvatusalustat ovat tuttuja alan ämmättimiehilie. IFN-3:n ekspressoitunut muteiini eristetään, puhdistetaan ja karak-25 terisoidaan.

Seuraavat esimerkit on esitetty helpottamaan esillä olevan keksinnön ymmärtämistä ja ne on tarkoitettu ainoastaan valaisemaan esillä olevaa keksintöä. Niitä ei pidä : tulkita millään tavalla keksintöä rajoittaviksi. Esimer- 30 kit 1-9 kuvaavat IFN-B-muteiinin valmistusta.

Esimerkki 1 IFN-B-geenin kloonaus M13~vektoriin G.F. Temple et ai, Nature (1982) 296:537-5^0 ovat esit-^ täneet havainnollisesti M13~faagivektorin käytön yksisäi- keisen DNA-templaatin lähteenä. IFN-B-geenin E.coli-trp- 105203 promoottorin kontrollissa sisältävä plasmidi pBltrp (kuva 3) pilkottiin restriktioentsyymeillä Hind III ja xho II. M13mp8 (J. Messing, "Third Cleveland Symposium on Macro-molecules: Recombinant DNA", Ed. A. Walton, Elsevier Press, 5 143-153/1981)) -kohdentuva (RF)-DNA (kuva 4) pilkottiin restriktioentsyymeillä Hind III ja BamHI ja sekoitettiin pBltrp-DNA:n kanssa, joka oli sitä ennen pilkottu Hind III:11a ja xho II:11a. Seos ligatoitiin sen jälkeen T^-DNA -ligaasilla ja ligatoitu DNA transformoitiin sopiviin 10 E.coli kannan JM 103-soluihin ja viljeltiin Xgal-indikaat-torimaljoilla (J. Messing, et ai., Nucleic Acids Res (1981) £:309-321). Rekombinanttifaagin sisältävät plakit (valkoiset p-lakit) kerättiin, siirrostettiin tuoreeseen JM 103 -viljelmään ja RF-molekyylien kopiot valmistettiin infek-15 toiduista soluista (H.D. Birnboim ja J. Doly, Nucleic Acid Res (1979) 2:1513-1523). RF-molekyylit pilkottiin erilaisilla restriktioentsyymeillä IFN-6-insertin sisältävien kloonien tunnistamiseksi. Erään sellaisen kloonin (M13-61) restriktiokartta on kuvassa 5· Kloonista M13-B1 val-20 mistettiin yksisäikeinen (rs) faagi-DNA toimimaan synteet tistä oligonukleotidia käyttävän paikkaspesifisen mutage-neesin templaattina.

Esimerkki 2 25 Paikkaspesifinen mutageneesi

Neljäkymmentä pikomoolia synteettistä oligonukleotidiä GCAATTTTCAGAGTCAG (aluke) käsiteltiin.T^-kinaasilla seoksessa, jossa oli 0,1 mM adenosiinitrifosfaattia (ATP), 50 mM hydroksimetyyliaminometaanihydrokloridia (Tris-Hcl) pH • : 30 8,0, 10 mM MgCl2:a, 5 mM ditiotreitolia (DTT) ja 9 yksik köä T^-kinaasia, 50 yl:ssa 37°C:ssa 1 h. Kinasoitu aluke (12 pmol) hybridisoitiin 5 yg:aan ss M13-61-DNA:ta 50 yl:ssa seosta, joka sisälsi 50 mM NaCl:a, 10 mM Tris-Hcl:a, pH 8,0, 10 mM MgCl2:a ja 10 mM β-merkaptoetanolia kuumen- 35 netaan 67°C:ssa 5 min ja 42°C:ssa 25 min. Lämpökäsitelty seos jäähdytettiin sitten jäissä ja lisättiin sen jälkeen 50 yl:aan reaktioseosta, joka sisälsi 0,5 mM:sena kutakin 105203 deoksinukleosiditrifcsfaattia (dNTA), 80 mM Tris-HCl:a, pH 7,^, 8 mM MgCl2:a, 100 mM NaCl:a, 9 yksikköä DNA-poly- meraasi I Klenow-fragmenttia, 0,5 mM ATP:tä ja 2 yksikköä T^-DNA-ligaasia, inkuboitiin 37°C:ssa 3 h ja 23°C:ssa 2 h.

5 Reaktio lopetettiin sen jälkeen uuttamalla fenolilla ja etanolisaostuksella. DNA liuotettiin seokseen, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl:a , pH 8,0, 10 mM etyleenidiaminotetra-

etikkahappoa (EDTA) , 50 % sakkaroosia ja 0,05 % bromifenyy-lisinistä ja elektroforesoitiin 0,8 % agaroosigeelillä 10 etidiumbromidin, 2 yg/ml, läsnäollessa. DNA-vyöhykkeet, jotka vastasivat K13-Sl:n RF-muctoja, eluoitiin geelile-vyistä perkloraattimenetelmällä (R.W. Davis, et ai., "Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., s. 178-179 (1980)). Eluoitu DNA siirrettiin 15 sopiviin JM 103-soluihin, kasvatettiin yön yli ja ssDNA

eristettiin viljelmäsupernatantista. Tätä ssDNA:ta käytettiin templaattina seuraavassa alukkeen pidennyksessä, DNA:n geelipuhdistetut RF-muodot siirrettiin sopiviin JM 103-soluihin, levitettiin agarmaljoille ja inkuboitiin yli 20 yön faagiplakkien saamiseksi.

Esimerkki 3

Paikkaspesifinen mutageneesi

Edellä oleva esimerkin 2 koe toistetaan, mutta käyte-” 25 tään synteettisenä oligonukleotidialukkeena GCAATTTTCAGACTCAG:tä muuttamaan IFN-B-geenin kodoni 17 kysteiiniä koodaavasta treoniinia koodaavaksi.

Esimerkki ^ : 30 Paikkaspesifinen deleetio

Edellä oleva esimerkin 2 koe toistetaan, mutta käytetään synteettisenä oligonukleotidialukkeena AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG:tä poistamaan IFN-B-geenin kodoni 17.

105203

Esimerkki 5

Mutagenoitujen plakkien seulonta ja tunnistaminen

Sekä mutatoituja M13-Bl-plakkeja (esimerkki 1) sisältävät maljat että mutatoimattomia M13-f31-faagiplakkeja sisäl-5 tävät kaksi maljaa jäähdytettiin i+°C:seen ja plakit kultakin maljalta siirrettiin kahdelle ympyränmuotoiselle nitro-selluloosasuodattimelle asettamalla kuiva suodatin agarmal-jalle: ensimmäinen suodatin 5 min:ksi ja toinen suodatin

15 minrksi. Suodattimet asetettiin sen jälkeen 5 minrksi 10 paksuille suodatinpapereille, joihin oli imeytetty 0,2 N

NaOH:a, 1,5 M NaCl:a ja 0,2 % Triton X-100: a ja neutraloitiin asettamalla vielä 5 minrksi suodatinpapereille, joihin oli imeytetty 0,5 M Tris-HClara, pH 7,5 ja 0,5 M NaClra. Suodattimet pestiin kahdesti samalla tavalla asettamalla 15 ne suodattimille, joihin oli imeytetty 2 x SSCrtä (standardi sitraattiliuos), kuivattiin ja pidettiin sen jälkeen va-kuumiuunissa 80°C:ssa 2 h. Kaksoissuodattimet esihybridi-soitiin 55°C:ssa li h 10 ml:11a per suodatin DNA-hybridi-saatiopuskuria (5 x SSC, pH 7,0, 4 x Denhardtin liuos 20 (polyvinyylipyrrolidiini, fikoli ja härän seerumin albumiini, 1 x = 0,02 % kutakin), 0,1 % natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 50 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,0 ja 100 ug/ml denaturoitua lohen siemennesteen DNArta). Prllä leimattu koetin valmistettiin kinasoimalla oligonukleotidialuke 25 ^Prllä merkityllä ATPrllä.* Suodattimet hybridisoitiin "32 5

Prllä leimattuun alukkeeseen, 3,5 x 10 tuiketta per min/ml, kukin suodatin 5 mlrssa DNA-hybridisaatiopuskuria 55°C:ssa 2k h. Suodattimia pestiin kutakin 55°C:ssa 30 min. pesupuskureissa, jotka sisälsivät 0,1 % SDSrää ja vä-: 30 heneviä määriä SSCrtä. Suodattimia pestiin aluksi pusku rilla, joka sisälsi 2 x SSCrtä ja mutatoimattomia M13-81-plakkeja sisältävistä kontrollisuodattimista tarkistettiin käyttäen Geiger-laskijaa, oliko niissä radioaktiivisuutta. SSC:n konsentraatiota alennettiin asteittain ja suodatti-35 mia pestiin, kunnes mutatoimattomia M13-$l-plakkeja sisältävissä kontrollisuodattimissa ei havaittu enää radioaktiivisuutta. Alhaisin käytetty SSC:n konsentraatio oli 14 105203 0,1 x SSC. Suodattimia kuivattiin ilmassa ja autoradiogra-fioitiin -70°C:ssa 2-3 päivää. A80 mutatoitua M13-&l-plak-kia ja 100 mutatoimatonta kontrolliplakkia seulottiin ki-nasoidulla oligonukleotidikoettimella. Yhtään kontrolli-5 plakkia ei hybridisoitu koettimella, kun taas 5 mutatoitua M13-£51-plakkia hybridisoitiin koettimella.

Yksi viidestä mutatoidusta M13-61-plakista (M13-SY2501) siirrettiin JM103-viljelmään. ssDNA valmistettiin superna-tantista ja kaksisäikeinen (ds) DNA valmistettiin solupal-10 losista. ssDNA:ta käytettiin templaattina kloonin dideok-si-sekvensoinnissa käyttäen M13-yleisaluketta. Sekvenssi-analyysin tulos esitetään kuvassa 6, mikä varmistaa, että TGT-kys-kodoni on muuttunut AGT-ser-kodomiksi.

15 Esimerkki 6

Mutatoidun IFN-g:n ekspressio E.colissa RF-DNA M13-SY2501:stä pilkottiin restriktioentsyymeil-lä Hin d III ja Xho II ja 520 ep:n inserttifragmentti puhdistettiin 1 JS :11a agaroosigeelillä. E. coli-trp-promootto-20 rin (kuva 7) sisältävä plasmidi pTrp3 pilkottiin entsyymeillä Hin d III ja Bam H I, sekoitettiin puhdistetun M13-SY2501-DNA-fragmentin kanssa ja ligatoitiin T^-DNA-ligaa-sin läsnäollessa. Ligatoitu DNA transformoitiin E.coli-kantaan MM29^. Ampisilliiniresistentit transformantit seu-25 lottiin tetrasykliiniherkkyyden suhteen. Viiden ampisil- liiniresistentin, tetrasykliinille herkän kloonin plasmidi-DNA pilkottiin Hin f I:llä, jotta saatiin seulottua M13-SY2501-insertti. Kuva 8a esittää erään klooneista (pSY2501) Hin f I -restriktiomallin verrattuna alkuperäi-: 30 sen INF-6-kioonin, pBltrp, Hin f I-malliin. Kuten odotet tua pSY2501:ssä on ylimääräinen Hin f I -kohta halkaisten 197 ep:n sisäisen IFN-B-fragmentin 169 ep:n fragmentiksi ja 28 ep:n fragmentiksi (kuva 8b). Kloonin pSY2501 restrik-tiokartta esitetään kuvassa 9. Mutantti-IFN-^-geenin täy-35 dellinen DNA-jakso esitetään kuvassa 10 yhdessä ennustetun aminohappojärjestyksen kanssa.

Klooniksi pSY2501 nimetty plasmidi on tallennettu lai- 105203 tokseen Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Fermentation Laboratory, Northern Regional Research Center, Science and Education Administration, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Preoria, Illinois 5 60604 ja sille on annettu tulonumerot CMCC No. 1533 ja NRRL No. B-15356.

pSY2501:n ja p61trp:n, mukaanlukien niiden jälkeläiset, viljelmiä kasvatettiin optiseen tiheyteen (OFg0Q) mistettiin soluvapaita uutteita ja IFN-6:n antiviraalinen 10 aktiivisuus tutkittiin GM2767~soluilla mikrotiiterikokeel-la. Kloonin pSY2501 uutteiden aktiivisuus oli kolmesta kymmeneen kertaan korkeampi kuin pBltrprn (taulukko I), osoittaen kloonin pSY2501 joko syntetisoivan enemmän IFN-β-aktiivisuutta omaavaa proteiinia tai valmistetulla' proteii-15 nilla oli korkeampi spesifinen aktiivisuus.

Taulukko I

Uute Antiviraalinen aktiivisuus (U/ml) PSY2501 6 x 105 20 p(31trp 1 x 105 ptrp 5 (kontrolli) 50

Jotta saatiin ratkaistua, syntetisoiko klooni pSY2501 useita kertoja aktiivisempaa proteiinia, molempien kloonien 25 uutteita elektroforesoitiin SDS-polyakryyliamidigeelillä yhdessä kontrolliuutteen kanssa ja geeliä pidettiin Coomassia Blue-väriaineessa, jotta proteiinit saatiin näkyviin. Kuten kuva 11 osoittaa, oli vain yksi proteiinivyö-hyke, joka vastasi ilmeisesti 18.000 daltonin proteiinia, - 30 jota oli mukana pSY2501 ja pBltrp-kloonien uutteissa, mut ta ei ptrp 3’.n kontrolliuutteessa. Tämän proteiinin, jonka molekyylipaino oli noin 20.000 daltonia, mutta joka näkyy geelimigraatiomallissa 18.000 daltonin proteiinina, osoitettiin aikaisemmin puhdistamalla tämä proteiini 35 pBltrp-uutteista olevan IFN-$. Koska tätä proteiinia on vähemmän pSY2501-uutteissa kuin pBltrp-uutteissa, proteiinin spesifinen aktiivisuus kloonin pSY2501 uutteissa oli 105203 korkeampi kuin kloonin pgltrp uutteissa.

Esimerkki 7 IFN-gserl7 puhdistus 5 IFN-gserl7 otettiin talteen E.colista, joka oli transformoitu tuottamaan IFN-317· E.colia kasvatettiin seuraavalla kasvatusalustalla OD-arvoon 10-11 680 nm:ssä (kuivapaino 8,4 g/1).

10 Aineosa Konsentraatio

NH^Cl 20 mM

K2S0^ 16,1 mM

KH2POl4 .7,8 mM

Na2HP0^ 12,2 mM '

15 MgSO^ · 7H20 3 mM

Na^-sitraatti · 2H20 1,5 mM

MnSO^ · iJH20 30 μΜ

ZnSO^ · 7H20 30 yM

CuSO^ · 5H20 . 3 yM

20 L-tryptofaani 70 mg/1

FeSO^ 7H20 72 yM

tiamiini · HCl 20 mg/1 glukoosi iJO g/1 pH-kontrolli NH^OHilla ' " 25 9,9 1 (9,9 kg) transformoitua E.coli-massaa jäähdytettiin 20°C:seen ja konsentroitiin antamalla massan kulkea poikittaisvirtaussuodattimen läpi keskimääräisen paineen pudotuksen ollessa ~ 110 kpa ja muuttumattomalla suodoksen 30 virtausnopeudella 260 ml/min, kunnes suodos painoi 8,8 kg. Konsentraatti (noin yksi litra) tyhjennettiin astiaan ja jäähdytettiin 15°C:seen. Konsentraatin solut hajotettiin kuljettamalla konsentraatti Manton-Gaulin -homogenisaatto-rin läpi 5°C:ssa, - 69.000 kpa:ssa. Homogenisaattori pes-35 täin yhdellä litralla fosfaattipuskuria, pH 7,^ (PBS), ja pesuneste lisättiin hajonneeseen solumassaan niin, että lopullinen tilavuus oli kaksi litraa. Tätä määrää sentrifu- „ 105203 goitiin keskeytymättömäsi kiihtyvyydellä 12000 x g ja virtausnopeudella 50 ml/min. Kiinteä aine erotettiin superna-tantista ja suspendoitiin uudelleen neljään litraan PBS:a, joka sisälsi 2 p-% SDS:a. Tätä suspensiota sekoitettiin 5 huoneen lämpötilassa 15 min, minkä jälkeen suspendoitua ainetta ei ollut näkyvissä. Liuos uutettiin sen jälkeen 2-butanolilla tilavuussuhteessa 1:1, 2-butanoli : liuos. Uuttaminen suoritettiin neste-neste-faasierottimessa käyttäen virtausnopeutta 200 ml/min. Sen jälkeen orgaaninen 10 faasi erotettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 21»3 g proteiinia. Tämä suspendoitiin uudelleen tislattuun veteen tilavuussuhteessa 1:10.

Talteenotettu tuote tutkittiin ihmisen IFN-f5-aktiivi-suuden suhteen käyttäen koetta, joka perustui suojautumi-15 seen virusperäistä sytopaattista vaikutusta (CPE) vastaan. Koe tehtiin mikrotiitterilevyillä. Viisikymmentä yl minimivaatimukset täyttävää elatusainetta laitettiin jokaiseen syvennykseen ja 25 ui näytettä laitettiin ensimmäiseen syvennykseen ja 1:3 tilavuuslaimennuksista tehtiin sarja seu-20 raaviin syvennyksiin. Virus (rakkulainen stomatiitti), solu (ihmisen fibroblasti GM-2767) ja referenssi-IFN-8-kont-rollit siirrostettiin jokaiselle levylle. Referenssi-IFN-f3:a käytettiin 100 yksikköä per ml. Sen jälkeen levyjä sä-teilytettiin UV-valolla 10 min. Säteilytyksen jälkeen 100

E

25 yl solususpensiota (1,2 x 10 solua/ml) lisättiin jokaiseen syvennykseen ja levyjä inkuboitiin 18-2*4 h. Virusliuosta lisättiin yksi plakinmuodostusyksikkö per solu jokaiseen syvennykseen paitsi solukontroliiin. Sen jälkeen levyjä inkuboitiin, kunnes viruskontrolli osoitti 100 % CPE:tä.

. 30 Tämä tapahtui tavallisesti 18-2*4 h virusliuoksen lisäämi sen jälkeen. Koetuloksia tulkittiin suhteessa sen refe-renssi-IFN-8-kontrollin syvennyksen sijaintiin, joka näyte osoitti 50 % CPE:tä. Tästä kohdasta määritettiin levyn kaikkien näytteiden interferonin tiitteri. Talteenotetun 35 tuotteen spesifisen aktiivisuuden arvoksi saatiin 5 x 10^ U/mg.

18 105203

Esimerkki 8

Happosaostus ja kromatografinen puhdistus

Esimerkin 7 menetelmä toistettiin paitsi että nestefaasin ja orgaanisen faasin uuton ja erotuksen jälkeen sekä 5 sen jälkeen, kun orgaaninen faasi oli sekoitettu PBS:n kanssa tilavuussuhteessa 3:1, seoksen pH alennettiin noin 5'.een lisäämällä jääetikkaa. Saatu saostuma erotettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 10000-17000 x g 15 min ja kakku liuotettiin uudelleen seokseen, joka sisälsi 10 % 10 p/t SDS:ää, 10 mM DTT:tä, 50 mM natriumasetaattipuskuria (pH 5,5) ja kuumennettiin 80°C:ssa 5 min.

Sen jälkeen liuos pantiin Brownlee RP-300, 10 yM, "Aquapore"-kolonniin käyttäen Beckman-gradienttisysteemiä. Puskuri A oli 0,1 55:nen trifluorietikkahappo (TFA) vesi-15 liuoksena; puskuri B oli 0,1 5S:nen TFA asetonitriilissä. Havaitseminen tapahtui ultraviolettiabsorptiolla 280 nmrssä. Liuotinjärjestelmä muodosti lineaarisen gradientin 0 £:sesta puskuri B:stä 100 5?:seen puskuri B:hen kolmessa tunnissa. Korkeimmat interferoniaktiivisuudet sisäl- 20 tävät fraktiot yhdistettiin ja yhdistetyn interferonival- 7 misteen spesifiseksi aktiivisuudeksi saatiin 9 x 10 :stä 8 3,8 x 10° kansainvälistä yksikköä per mg proteiinia verrat- 8 tuna alkuperäisen IFN-8:n aktiivisuuteen noin 2 x 10 U/mg. 25 Esimerkki 9 IFN-8serl7 biokemiallinen karakterisointi

Aminohappokoostumus määritettiin IFN:n 40 yg .suuruisten näytteiden 24-72 h:n pituisen hydrolyysin jälkeen 200 yi:ssa 5,7 N HCl:a, joka sisälsi 0,1 % fenolia, lämpötilas-30 sa 108°C. Proliini ja kysteiini määritettiin samalla tavalla per muurahaishappohapetuksen jälkeen; tässä tapauksessa fenoli jätettiin pois hydrolyysista. Tryptofaani analysoitiin 400 yl suuruisten näytteiden 24 h:n hydrolyysin jälkeen 5,7 N HClrssa, joka sisälsi 10 % merkaptoetik-35 kahappoa (ei fenolia). Analyysi suoritettiin Beckman 121 HB aminohappoanalysaattorilla käyttäen yksittäistä AA 10 hartsikolonnia.

19 105203

Puhdistetun IFN-6serl7 tyypillisistä 24-, il8-, 72-tunnin happohydrolyyseistä laskettu aminohappokoostumus täsmäsi hyvin sen aminohappokoostumuksen kanssa, joka ennustettiin IFN-geenin kloonien DNA-jaksosta, miinus puut-5 tuva N-pääte metioniini.

Puhdistetun IFN:n pääteaminohappojen ensimmäisten 58 tähteen aminohappojärjestys määritettiin 0,7 mg näytteellä laitteella Beckman 890C sequanator 0,1 M Quadrol-puskuril-la. PHT-aminohapot määritettiin vastakkaisfaasi-HPLC:llä 10 Altex ultrapallo ODS-kolonnissa (H,6 x 250 mm) m°C:ssa eluoitiin 1,3 minrssa HO $:sessa puskuri B:ssä ja 8,JJ min AO—70 ?:sta puskuri B:stä, missä puskuri A oli 0,0115 M natriumasetaatti, 5 % tetrahydrofuraani (THF), pH 5,11 ja puskuri B oli 10 % THF asetonitriilissä.

15 IFN-0serl7 määritetty N-pääteaminohappojärjestys so pii yhteen DNA-jaksosta ennustetun odotetun järjestyksen kanssa lukuunottamatta puuttuvaa N-päätemetioniinia.

Kuten edellä osoitettiin IFN-6serl7 -valmisteen spesifinen aktiivisuus on hyvin lähellä tai parempi kuin alku-20 peräisen IFN-0:n aktiivisuus. IFN-0serl7 ei ole vapaita sulfhydryyliryhmiä, mutta näyttää olevan yksi -S-S-sidos ainoiden jäljelle jääneiden kysteiinien välillä asemissa 31 ja 141. Proteiini ei muodosta helposti oligomeerejä ja näyttää olevan oleellisesti monomeerisessä muodossa. Tämän 25 keksinnön mukaisesti saatu IFN-0serl7 voidaan formuloida farmaseuttisesti hyväksyttäväksi valmisteeksi joko yksittäisenä tuotteena tai erilaisten muotojen seoksena iner-teissä, myrkyttömissä, allergeenittömissä, fysiologisesti sopivissa kantajaväliaineissa käytettäväksi kliinisesti - 30 tai terapeuttisesti syöpäterapiassa tai olosuhteissa, jois sa auttaa interferoniterapia ja virusinfektioihin. Sellaisiin väliaineisiin kuuluvat, mutta eivät rajoitu, tislattu vesi, fysiologinen suolaliuos, Lingerin liuos, Hankin liuos yms. Muita myrkyttömiä ja liukenevia lisäaineita ku-35 ten dekstoosia, HSA:ta (ihmisen seerumin albumiini) yms.

voi optimaalisesti sisältyä mukaan. Terapeuttiset valmisteet voidaan antaa oraalisesti tai parenteraalisesti kuten 105203 laskimonsisäisinä, lihaksensisäisinä, vatsaontelon sisäisinä ja ihonalaisina annostuksina. Tämän keksinnön mukaisia modifioituja IFN-B-valmisteita voidaan myös käyttää paikallisesti sellaisiin tarkoituksiin tavallisesti käytettävis-5 sä sopivissa väliaineissa.

Edellä kuvatun IFN-B-muteiinin pääasiallisin etu on siinä, että vapaa sulfhydryyliryhmä eliminoituu IFN-fi:n asemassa 17 siten pakottaen proteiinin muodostamaan oikean * disulfidisidoksen kys-31:n ja kys-l4l:n välille ja muteii-10 ni omaksuu rakenteen, joka näennäisesti vaaditaan täyteen biologiseen aktiivisuuteen. IFN-0serl7 kohonnut spesifinen aktiivisuus mahdollistaa pienempien annost-en käytön terapeuttisissa käyttötarkoituksissa. Kun on deletoitu kysteiini asemassa 17 ja eliminoitu vapaa -SH-ryhmä, IFN-15 Sseri7 -proteiini ei muodosta dimeerejä ja oligomeerejä niin helposti kuin mikrobiaalisesti tuotettu IFN-β. Tämä helpottaa proteiinin puhdistusta ja lisää sen stabiilisuut-ta.

Claims (11)

1. 21 105203
2. 1. Menetelmä synteettisen rekombinantti-ihmisinterferoni-β-muteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) valmistetaan rakenteellinen geeni, joka koodaa biologisesti s aktiivistä synteettistä ihmisen interferoni-P-muteiinia, jossa muteiinissa asemassa 17, numeroituna ihmisen luonnollisen interferoni -β:n mukaan, normaalisti oleva kysteiinitähde joka on vapaa muodostamaan disulfidisidoksen ja joka ei ole välttämätön io mainitulle biologiselle aktiivisuudelle, on deletoitu tai korvattu neutraalilla aminohapolla; b) viedään geeni replikoituvassa ja ekspressoituvassa muodossa isäntäorganismiin, joka isäntäorganismi on bakteeri, kuten ELssli, Pseudomonas. Bacillus subtilis,
3. 15 Bacillus thurinoiensis tai Bacillus thermophilus, hiivalaji, eläinsolu, kuten hiiren, rotan tai kiinalaisen hamsterin munasarja(CHO)solu; ja c) ekspressoidaan geeni.
4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kysteiinitähde on kor-.. vattu seriinillä tai treoniinilla.
5. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet 25 t u siitä, että muteiini on seriini17interferoni-P-muteiini jolla on ihmisen luonnollisen interferoni-β:n aktiivisuus ja jossa on kuvion 10 mukainen johdettu aminohapposekvenssi N-terminaalisella metioniinilla tai ilman sitä.
6. 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muteiini on glykosyloimaton. 22 1 0 5 2 0 3
7. 5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kysteiinitähde on IFN-b:n asemassa 17 ja kysteiinitähde on korvattu seriinitähteellä.
8. 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on E.coli tai sen jälkeläinen.
9. 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, ίο tunnettu siitä, että ekspressiovektori on plasmidi pSY2501, jonka restriktiokartta on α I— - = O S'*-»»» ” H» ö S *555 t» 5 5 5
10. 15 Ui *** O. * IX » ,m_I_I_I_L ^\trppo . IFN-β 7 ·?- / %\ £ J * L-LLj V
11. 20 X' Xho\\± I ΧΛ0»=Τ J 25 \ / % . ja jonka talletustunnus on CMCC No. 1533 ja NRRL no. B-15356. 30 105203