FI87233C - Gen vilken kodar en mutein - Google Patents

Description

1 87233

Muteiinia koodaava geeni Selitys 5 Tekninen ala Tämä keksintö kuuluu yhdistelmä-DNA -tekniikan yleiseen alueeseen. Erityisesti se koskee mutationaalisesti muutettuja biologisesti aktiivisia proteiineja, jotka eroavat kanta-analogeistaan yhden tai useamman kysteiinitäh-10 teen korvautumisella/deletoitumisella.

Tekniikan taso

Biologisesti aktiiviset proteiinit, joita tuotetaan mikrobiaalisesti yhdistelmä-DNA (rDNA) -tekniikalla, säätiö tavat sisältää kysteiinitähteitä, jotka eivät ole välttämättömiä niiden aktiivisuudelle, mutta ovat vapaita muodostamaan ei toivottuja intermolekulaarisia tai intramoleku-laarisia sidoksia. Eräs sellainen proteiini on mikrobiaa-iisisti tuotettu ihmisen beeta-interferoni (IFN-8). VaLmis-20 tettaessa IFN-8:a rDNA-tekniikalla on havaittu, että kor keita IFN-8 -pitoisuuksia sisältävissä E.coli -uutteissa muodostuu mikrobiaalisesti tuotetun IFN-8:n dimeerejä ja oligomeerejä. Tämä multimeerien muodostuminen tekee IFN-’’ 8:n puhdistamisen ja eristämisen hyvin työlääksi ja aikaa- • 25 vieväksi ja tekee välttämättömäksi puhdistus- ja eristysme- netelmien useat lisävaiheet kuten proteiinin pelkistämisen puhdistuksen aikana ja uudelleenhapetuksen palauttamaan '.· ’ sen alkuperäisen rakenteen siten lisäten virheellisen di- • sulfisidoksen muodostumismahdollisuutta. Edelleen mikro- 30 biaalisesti tuotetulla IFN-8:11a on myös huomattu olevan johdonmukaisesti alhainen spesifinen aktiivisuus johtuen ehkä multimeerien tai umpimähkäisten intramolekulaaristen disulfidisiltojen muodostumisesta. Sen vuoksi olisi toivottavaa kyetä muuttamaan mikrobiaalisesti tuotettuja bio--· 35 logisesti aktiivisia proteiineja kuten INF-8:a tavalla, mi-kä ei vaikuta haitallisesti niiden aktiivisuuteen, mutta ..... vähentää tai eliminoi niiden kyvyn muodostaa intermoleku- 2 87233 iaarisia ristisidoksia tai intramolekulaarisia sidoksia, jotka aiheuttavat sen, että proteiini saa ei-toivotun ter- : tiäärison rakenteen (esim. rakenteen, joka vähentää proteiinin aktiivisuutta). : 5 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tuottaa koh dennetulla mutageneesitekniikalla mutationaalisesti muutettuja biologisesti aktiivisia proteiineja (sellaisia proteiineja kutsutaan "muteiineiksi", Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4th Ed, s. 381, Springer-Verlag (197 6)), 10 jotka säilyttävät kanta-analogiensa aktiivisuuden, mutta joilta puuttuu kyky muodostaa intermolekulaarisia sidoksia tai ei-toivottuja intramolekulaarisia disulfidisidoksia.

Tässä suhteessa Shepard, H.M. , et ai., Nature ( 1981) 2£4_: 563-565, kuvaavat ΙΡΝ-β:η muteiinin, jossa sen aminohappo-15 järjestyksen asemassa 141 kysteiini on korvattu tyrosiinil-la (alkuperäisessä ihmisen IFN-6:ssa on kolme kysteiiniä asemissa 17, 31 ja 141, Gene (1980) 11):11-15 ja Nature (I960) ^85:542-547). Tämä muteiini valmistettiin hybridi-geenin bakteeriekspressiolla, hybridigeeni rakennettiin 20 osittaisesta IFN-g-cDNA -kloonista, jossa oli G->A siirtymä IFN-B-geenin nukleotidissä 485. Muteiinilta puuttui alkuperäisen ΙΡΝ-β:η biologinen aktiivisuus, mikä johti tekijät päätelmään, että korvattu kysteiini oli välttämätön aktiivisuudelle.

25 Kohdennettu mutageneesitekniikka on hyvin tunnettua ja sitä ovat tarkastelleet Lather, R.F. ja Lecoq, J.P. teoksessa Genetic Engineering Academic Press (1983) s. 31_50.

Smith, M. ja Gillam, S. teoksessa Genetic Engineering:

Principles and Methods, Plenum Press (1981) 3:1-32 ovat 30 erityisesti tarkastelleet oligonuklotidi-kohdennettua muta-geneesia.

Keksinnön kuvaus : Keksintö ja sen sovellutusmuotoja esitetään patentti- 35 vaatimuksissa.

3 87233

Keksinnön yksi sovellutusrouoto ovat synteettiset rakenteelliset geenit, joissa on DNA-jaksoja, jotka on erityisesti muotoiltu ("muotoilijageenit") koodaamaan synteettisiä muteiineja.

5 Keksinnön sovellutusmuoto on myös menetelmä estää proteiinia, jossa on yksi tai useampi sellainen kyste-iinitähde, joka on vapaa muodostamaan ei toivotun disulfidisidoksen, muodostamasta sellaista sidosta tunnettu siitä, että proteiini muutetaan mutationaali-10 sesti deletoimalla kysteiinitähteet tai korvaamalla ne toisilla aminohapoilla.

Vielä yksi keksinnön sovellutusmuoto on menetelmä valmistaa yllä kuvattu synteettinen rakenteellinen geeni oligonukleotidi-kohdennetulla mutageneesilla, 15 jolle menetelmälle ovat tunnusomaisia seuraavat vai heet: (a) rakenteellisen geenin säikeen sisältävän yksisäikeisen DNA:n hybridisaatio; rakenteellinen geeni koodaa kantaproteiininmutanttioligonukleotidialukkeel-20 la, joka on komplementaarinen sille säikeen alueelle, joka sisältää deletoitavan tai korvattavan kysteiinin kodonin tai kodonin kanssa parin muodostavan vastakol-mikkokoodin, kumpi kulloinkin on kyseessä, lukuunottamatta yhteensopimattomuutta kodonin deleetion määritte-25 levän kodonin tai vastakolmikkokoodin, kumpi kulloinkin on kyseessä, tai mainitun toisen aminohapon koodaavan kolmikkokoodin kanssa, ^ 87233 (b) alukkeen pidentäminen DNA-polymeraasi11a muodostamaan mutationaalisen heterodupleksin; ja (c) mutationaalisen heterodupleksin kohdentuminen. Tässä menetelmässä käytettävät mutanttioligonukleotidi- 5 alukkeet ovat myös keksinnön sovellutusmuoto.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuva 1 on diagrammi IFN-8:n aminohappojärjestyksestä. Kuva 2 on kaavakuva, joka esittää mutantti-IFN-8-gee-10 nin valmistuksen oligonukleotidi-kohdennetulla mutagenee- s i1 ia.

Kuva 3 on diagrammi IFN-8-geenin sisältävästä plasmi-dista p&ltrp.

Kuva 4 on diagrammi kloonivektori M13mp8-faagista.

15 Kuva 5 on kloonin Ml^-pl restriktiokartta.

Kuva 6 on sekvenssoituva geelinäyte mutantti-IFN-B seriy -geenistä, jossa on yksittäisen emäksen muutos koo-daavalla alueella.

Kuva 7 on diagrammi ekspressioplasmidista pTrp 3.

20 Kuva 8a esittää kloonin pSY2501 Hin fI-restriktiota ja

Kuva 8b esittää siitä saatavat kaksi 169 ep:n ja 28 ep:n fragmentit.

Kuva 9 on kloonin pSY2501 restriktiokartta.

Kuva 10 esittää muteiinin IFN-8serl7 koodaavan DNA-25 jakson ja sitä vastaavan aminohappojärjestyksen.

Kuva 11 on IFN~8serl7 vastaava yksittäinen 18.000 daltonin proteiinivyöhyke kloonien pSY2501 ja pSltrp -uutteissa.

0 35 5 87233

Menetelmät keksinnön toteuttamiseksi

Esillä oleva keksintö antaa: biologisesti aktiivisten proteiinien muteiineja, joissa sellaiset kysteiinitähteet, jotka eivät ole välttämättömiä biologiselle aktiivisuudel-5 le, on tarkoituksellisesti deletoitu tai korvattu muilla aminohapoilla eliminoimaan intermolekulaaristen ristisidos-ten ja virheellisen intramolekulaarisen disulfidisidoksen muodostumiskohdat; muteiineja koodaavia mutanttigeenejä ja menetelmää muteiinien valmistamiseksi.

10 Proteiineja, jotka voidaan mutationaalisesti muuttaa tämän keksinnön mukaisesti, voidaan identifioida saatavilla olevan tiedon avulla koskien biologisesti aktiivisten proteiinien kysteiinisisältcä ja kysteiinitähteiden merkitystä aktiivisuuden ja tertiäärisen rakenteen suhteen.

15 Niistä proteiineista, joista tällaista tietoa ei ole kirjallisuudesta saatavissa, tieto voidaan määrittää systemaattisesti muuttamalla proteiinin jokainen kysteiinitähde tässä kuvatuin menetelmin ja testaamalla saatujen muteiinien biologinen aktiivisuus ja niiden taipumus muodostaa 20 ei toivottuja intermolekulaarisia tai intramolekulaarisia disulfidisidoksia. Siis, vaikka keksintöä jäljempänä erityisesti kuvataan ja sovelletaan IFN-6- muteiinien suhteen, on selvää, että seuraavat menetelmät soveltuvat mille tahansa biologisesti aktiiviselle proteiinille, joka -·- 25 sisältää toiminnallisesti epäoleellisia kysteiinitähteitä, ..; jotka altistavat proteiinin muodostamaan ei toivotun disul- fidisidoksen. Esimerkkejä proteiineista, muista kuin IFN-6 , jotka voitaisiin muuttaa mutationaalisesti keksinnön mukaisilla menetelmillä, ovat lymfotoksiini (nekroosi-30 kasvaintekijä) ja pesäkkeitä stimuloiva faktori-1 ja IFN-al. Tämän tyyppisillä proteiineilla on tavallisesti pariton lukumäärä kysteiinitähteitä.

IFN-|3:n suhteen on kirjallisuudessa selvitetty, että '! sekä glykosyloidulla että glykosyloimattomalla IFNcllä on 35 kvalitatiivisesti samanlainen spesifinen aktiivisuus ja et-V tä sen vuoksi glykosyyliosaset eivät sisälly eivätkä vaiku ta IFN-($:n biologiseen aktiivisuuteen. Kuitenkin bakteriaa- 6 87233 lisesti tuotetulla glykosyloimattomalla IFN-6:lla on kvantitatiivisesti alhaisempi spesifinen aktiivisuus kuin alkuperäisellä glykosyloidulla IFN-0:lla. IFN-£:lla tiedetään olevan kolme kysteiinitähdettä asemissa 17, 31 ja lMl.

5 Shepard, et ai., edellä, ovat osoittaneet kysteiinin 141 olevan välttämätön biologiselle aktiivisuudelle. Neljä kysteiinitähdettä sisältävässä IFN-a:ssa on kaksi intramo-lekulaarista -S-S-sidosta: yksi välillä kys-29 ja kys-138 ja toinen välillä kys-1 ja kys-98. Perustuen IFN-B:n ja 10 IFN-a:n väliseen homologiaan IFN-g:n kys-läl voisi sisältyä intramolekulaariseen -S-S-sidokseen kys-31:n kanssa jättäen kys-17 vapaaksi muodostamaan intermolekulaarisia ristisidoksia. Joko deletoimalla kys-17 tai korvaamalla se eri aminohapolla voidaan määrittää, onko kys-17 välttä-15 mätön biologiselle aktiivisuudelle ja sen osuus -S-S-sidok-sen muodostumisessa. Jos kys-17 ei ole välttämätön proteiinin biologiselle aktiivisuudelle, saatavan proteiinin, josta kys-17 on deletoitu tai korvattu, spesifinen aktiivisuus saattaisi olla lähellä alkuperäisen IFN-fJ:n aktiivi-20 suutta ja mahdollisesti proteiinin eristäminen ja puhdistus myös helpottuisivat.

Käyttämällä oligonukleotidi-kohdennettua mutageneesime-netelmää synteettisellä oligonukleotidialukkeella voidaan tuottaa muotoilijageeni, joka saa aikaan kys-17 korvautumi-25 sen millä tahansa valittavissa olevalla aminohapolla. Oli-gonukleotidialuke on komplementaarinen IFN-(3-geenin alueelle kys-17-kodonissa, mutta sisältää yksittäisen tai moninkertaisia emäsmuutoksia tuossa kodonissa. Kun deleetio on toivottava, oligonukleotidialukkeesta puuttuu kys-17-kodoni. 30 Kys-17 muutetaan mieluiten neutraaliksi aminohapoksi kuten glysiiniksi, valiiniksi, alaniiniksi, lensiiniksi, isolen-siiniksi, tyrosiiniksi, fenyylialaniiniksi , histidiiniksi , tryptofaaniksi, seriiniksi, treoniiniksi ja metioniiniksi. Korvaavina aminohappoina käytetään mieluiten seriiniä ja 35 treoniinia, koska ne ovat kemiallisesti analogisia kysteii-nilie. Kun kysteiini poistetaan, muodostunut muteiini on yhden aminohapon lyhyempi kuin kantaproteiini tai mikro- 87233 7 t binaalisesti tuotettu IFN-β.

Oligonukleotidialukkeen koon määrää alukkeen stabiilin hybridisaation tarve sen geenin alueelle, jossa mutaatio aiheutetaan ja tällä hetkellä saatavissa 5 olevien oligonukleotidien syntetisoimismenetelmien rajoitukset. Smith, M. ja Gillam, S., edellä, ovat kuvanneet oligonukleotidi-kohdennetussa mutageneesissa käytettävien oligonukleotidien muotoilussa huomioonotettavia seikkoja (esim. kokonaiskoko, mutaatiokoh-10 dan sivulla olevien osien koko). Yleensä oligonukleoti- din kokonaispituus on sellainen, millä optimoidaan stabiili, ainutlaatuinen hybridisaatio mutaatiokohdassa 5' ja 3' pidentymien mutaatiokohdasta ollessa riittävän kokoisia estämään DNA-polymeraasin eksonukleaasiaktii-15 visuudella korjaamasta mutaatiota. Esillä olevan keksinnön mukaisesti mutageneesissa käytetyt oligonuk-leotidit sisältävät tavallisesti noin 12:sta noin 24:än emästä, mieluummin noin 14:sta noin 20:een emästä ja vielä mieluummin noin 15:sta noin 18:aan emästä. Ne 20 sisältävät tavallisesti ainakin noin kolme muutetun tai puuttuvan kodonin 3'-emästä.

Modifioidun ΙΓΝ-β-geenin valmistusmenetelmä sisältää selvästi ΙΕΝ-β-geenin kodonissa 17 (TGT) aiheutetun paikkaspesifisen mutageneesin käyttäen synteettistä 25 nukleotidialuketta, josta puuttuu kodoni tai se on muutettu koodaamaan toinen aminohappo. Kun treoniini korvaa kysteiinin ja aluke hybridisoidaan IFN-p-geenin vastasäikeeseen, suositeltavin nukleotidialuke on GCAATTTTCACTCAG (alleviivaus osoittaa muutetun kodo-30 nin). Kun on toivottavaa deletoida kysteiini, suositel tavin aluke on AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG, josta puuttuu 8 87233 kysteiinin TGT-kodoni. Kun seriini korvaa kysteiinin, 17-nukleotidialuke, GCAATTTTCAGAGTCAG. joka sisältää seriinin AGT-kodonin, on valittu aluke. Ensimmäisen emäksen T-*A siirtymä kys-17-kodonissa aiheuttaa kyste-5 iinin vaihtumisen seriiniksi. On huomattava, että kun käytetään deleetioita, sopiva DNA-jakson tulkintaraken-ne täytyy säilyttää halutun proteiinin ekspressiota varten.

Aluke hybridisoidaan yksisäikeiseen faagiin, kuten 10 M13, fd tai 0x174, johon IFN-p-geenin säie on kloonat tu. On selvää, että faagissa voi olla joko geenin tuntosäie tai vastasäie. Kun faagissa on vastasäie, aluke on identtinen sille tuntosäikeen alueelle, joka sisältää mutaatiolla muutettavan kodonin, lukuunotta-15 matta yhteensopimattomuutta kodonin deleetion määritte levän kodonin tai toisen aminohapon koodaavan kolmikko-koodin kanssa. Kun faagissa on tuntosäie, aluke on komplementaarinen sille tuntosäikeen alueelle, joka sisältää mutaatiolla muutettavan kodonin, lukuunotta-20 matta tarkoituksenmukaista yhteensopimattomuutta kolmikkokoodissa, joka muodostaa parin deletoitavan kodonin kanssa. Smith, M. ja Gillam, S., edellä, ovat kuvanneet olosuhteita, joita voidaan käyttää hybri-disaatiossa. Lämpötila vaihtelee tavallisesti noin 25 0 °C:sta 70 °C:seen, tavallisemmin noin 10 °C:sta 50 °C:seen. Hybridisaation jälkeen aluke liitetään faagi-DNA:han reaktiolla DNA-polymeraasi I:n, T4-DNA-polymeraasin, käänteiskopioijaentsyymin tai muun sopivan DNA-polymeraasin kanssa. Saatu dsDNA muutetaan 30 suljetuksi dsDNA-renkaaksi käsittelemällä DNA-ligaasil- la kuten T4-DNA-ligaasilla. DNA-molekyylin sisältämät 9 87233 yksisäikeiset alueet voidaan tuhota Sl-endonukleaasi-käsittelyllä.

Saatu mutationaalinen heterodupleksi siirretään sitten sopivaan isäntäorganismiin tai soluun. Hetero-5 dupleksin kohdentuminen isännässä tuottaa jälkeläisiä kummastakin säikeestä. Kohdentumisen jälkeen mutantti-geeni voidaan eristää mutanttisäikeen jälkeläisistä, liittää sopivaan ekspressiovektoriin ja vektori on tapana transformoida sopivaan isäntäorganismiin tai 10 soluun. Sopivimpia vektoreita ovat plasmidit pBR322, pCRl ja niiden muunnokset, synteettiset vektorit yms. Sopivia isäntäorganismeja ovat E.coli. Pseudomonas. Bacillus subtilis. Bacillus thurinaiensis. erilaiset hiivalajit, Bacillus thermophilus. eläinsolut, kuten 15 hiiren, rotan tai kiinalaisen hamsterin muna (CHO)- solut, kasvisolut, eläin- ja kasvi-isännät yms. On huomattava, että kun valittu isäntä transformoidaan vektorilla, sopivat promoottori-operaattori-jaksot siirretään myös, jotta saadaan aikaan muteiinin eks-20 pressio. Isännät voivat olla prokarioottisia tai eukarioottisia (menetelmiä, joilla DNA insertoidaan eukarioottisoluihin, on kuvattu PCT-hakemuksessa numerot US 81/00239 ja US 81/00240, tulleet julkisiksi 3. syyskuuta 1981). E.coli ja CHO-solut 10 i 87233 ovat sopivimmat isännät. Esillä olevan keksinnön mukaisesti saatavat muteiinit voivat olla glykosyloituja tai glyko-syioimattomia riippuen glykosylaation tapahtumisesta alkuperäisessä kantaproteiinissa tai muteiinin tuottamiseen 5 käytettävässä isäntäorganismissa. Haluttaessa saatu glykosy loimaton muteiini, kun E.coli tai Bacillus on isäntäorga-nismi, voidaan haluttaessa glykosyloida in vitro kemiallisilla, entsymaattisilla tai muilla sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

10 Esillä olevan keksinnön suositeltavimmassa sovellutus- muodossa koskien IFN-8:a kysteiinitähde IFN-8:n aminohappojärjestyksen ;is,omassa 17, kuten kuva 1 osoittaa, vaihdetaan seriiniksi DNA-jakson tuntosäikeessä olevan kodonin 17 ensimmäisen emäksen T-*-A siirtymällä. DNA-jakso koodaa 15 muodostuvan IFN-6:n. Paikkaspesifinen mutageneesi aiheutetaan käyttäen synteettistä 17-nukleotidialuketta GCAATTTTCAGAGTCAG, joka on identtinen seitsemäntoista nukleotidin jaksolla IFN-8:n tuntosäikeessä kodonin 17 alueella lukuunottamatta yksittäisen emäksen yhteensopimattomuut-20 ta kodonin 17 ensimmäisessä emäksessä. Yhteensopimaton kohta on alukkeen nukleotidissa 12. On huomattava, että geneettinen koodi on degeneroitunut ja että monia aminohappoja saattaa koodata useampi kuin yksi kodoni. Esimerkiksi seriinin emäskoodi on kuudella tavalla degeneroitunut 25 niin, että kodonit TCT, TCG, TCC, TCA, AGT ja ACG kaikki koodaavat seriiniä. AGT-kodoni valittiin sopivuuden takia suositeltavimmaksi sovellutusmuodoksi. Samalla tavalla treoniinia koodaa mikä tahansa kodoneista ACT, ACA, ACC ja ACG. On tarkoitettu, että kun yksi kodoni eritellään tie-30 tylle aminohapolle, se sisältää kaikki degeneroituneet kodonit, jotka koodaavat sitä aminohappoa. 17 nukleotidin jakso hybridisoidaan yksisäikeisen M13-faagin DNAthan, jossa on IFN-8-geenin vastasäie. Oligonukleotidialuke liitetään sitten DNA than käyttäen DNA-polymeraasi I Klenow-35 fragmenttia ja saatu dsDNA muutetaan suljetuksi DNA-renkaaksi T^-ligaasilla. Saadun mutationaalisen heterodyplek-sin kohdentuminen tuottaa yhteensopimattoman alueen sisäl- 11 8 7 2 35 tävän DNA-säikeen klooneja. Mutanttikloonit voidaan tunnistaa ja seuloa spesifisten restriktiokohtien ilmaantumisen tai katoamisen avulla, antibioottiresistenssin tai -herkkyyden avulla tai muilla sinänsä tunnetuilla menetel-5 millä. Kun kysteiini korvataan seriinillä, T-*-A siirtymä, esitetty kuvassa 2, päättyy uuden Hinf I -restriktickohdan ilmaantumiseen rakenteellisessa geenissä. Mutanttiklooni tunnistetaan käyttäen oligonukleotidialuketta koettimena mutatoituneiden faagiplakkien hybridisaatioseulonnassa.

10 Alukkeella on yksittäinen yhteensopimaton kohta, kun se on hybridisoitunut kantayksilöön, mutta täydellinen yhteensopivuus, kun se on hybridisoitunut mutatoituneen faagin DNA:han, kuten on esitetty kuvassa 2. Sen jälkeen voidaan suunnitella hybridisaatio-olosuhteet, joissa oligonukleo-15 tidialuke on suositeltavimmin hybridisoitunut mutatoitunee-seen DNA:han, mutta ei kanta-DNA:han. Äskettäin muodostuneen Hinf I-kohdan avulla voidaan myös varmistaa yksittäinen emäsmuutos IFN-0-geenissä.

M13~faagin DNArssa oleva mutatoitunut geeni eristetään 20 ja liitetään sopivaan ekspressiovektoriin kuten plasmidiin pTrp3 ja E. coli-kanta MM291* transformoidaan vektorilla. Transformanttien ja niiden jälkeläisten viljelyyn sopivat kasvatusalustat ovat tuttuja alan ammattimiehille. IFN-g:n ekspressoitunut muteiini eristetään, puhdistetaan ja karak-25 terisoidaan.

Seuraavat esimerkit on esitetty helpottamaan esillä olevan keksinnön ymmärtämistä ja ne on tarkoitettu ainoastaan valaisemaan esillä olevaa keksintöä. Niitä ei pidä tulkita millään tavalla keksintöä rajoittaviksi. Esimer-30 kit 1-9 kuvaavat IFN-B-muteiinin valmistusta. Esimerkit 10-15 kuvaavat IL-2-muteiinin valmistusta.

Esimerkki 1 IFN-g-geenin kloonaus M13-vektoriin 35 G.F. Temple et ai, Nature (1982) 296:537-5^0 ovat esit täneet havainnollisesti M13~faagivektorin käytön yksisäi-keisen DNA-templaatin lähteenä. IFN-0-geenin E.coli-trp- ΐ2 87233 ί promoottorin kontrollissa sisältävä plasmidi pgltrp (kuva 3) pilkottiin restriktioentsyymeillä Hind III ja xho II. j M13mp8 (J. Messing, "Third Cleveland Symposium on Macro-molecules: Recombinant DNA", Ed. A. Walton, Elsevier Press, 5 143-153/1981)) -kohdentuva (RF)-DNA (kuva 4) pilkottiin restriktioentsyymeillä Hind III ja BamHI ja sekoitettiin pBltrp-DNA:n kanssa, joka oli sitä ennen pilkottu Hind III:11a ja xho II:lla. Seos ligatoitiin sen jälkeen T^-DNA -ligaasilla ja ligatoitu DNA transformoitiin sopiviin 10 E.coli kannan JM 103-soluihin ja viljeltiin Xgal-indikaat-torimaljoilla (J. Messing, et ai., Nucleic Acids Res (1981) 9:309-321). Rekombinanttifaagin sisältävät plakit (valkoiset plakit) kerättiin, siirrostettiin tuoreeseen JM 103 -viljelmään ja RF-molekyylien kopiot valmistettiin infek-15 toiduista soluista (H.D. Birnboim ja J. Doly, Nucleic Acid Res ( 1979) 7:1513-1523) · RF-molekyylit pilkottiin erilaisilla restriktioentsyymeillä IFN-8-insertin sisältävien kloonien tunnistamiseksi. Erään sellaisen kloonin (MI3- 31) restriktiokartta on kuvassa 5. Kloonista M13-31 val-20 niistettiin yksisäikeinen (rs) faagi-DNA toimimaan synteet tistä oligonukleotidia käyttävän paikkaspesifisen mutage-neesin templaattina.

Esimerkki 2 25 Paikkaspesifinen mutageneesi

Neljäkymmentä pikomoolia synteettistä oligonukleotidiä GCAATTTTCAGAGTCAG (aluke) käsiteltiin T^-kinaasilla seoksessa, jossa oli 0,1 mM adenosiinitrifosfaattia (ATP), 50 mM hydroksimetyyliaminometaanihydrokloridia (Tris-Hcl) pH 30 8,0, 10 mM MgCl^a, 5 mM ditiotreitolia (DTT) ja 9 yksik köä T^-kinaasia, 50 yl:ssa 37°C:ssa 1 h. Kinasoitu aluke (12 pmol) hybridisoitiin 5 ug:aan ss M13-61-DNA:ta 50 ul:ssa seosta, joka sisälsi 50 mM NaCl:a, 10 mM Tris-Hcl:a, pH 8,0, 10 mM MgClgja ja 10 mM β-merkaptoetanolia kuumen- 35 netaan 67°C:ssa 5 min ja 42°C:ssa 25 min. Lämpökäsitelty seos jäähdytettiin sitten jäissä ja lisättiin sen jälkeen 50 yl:aan reaktioseosta, joka sisälsi 0,5 mM:sena kutakin 1: l} «7233 deoksinukleosiditrifosfaattia (dNTA), 80 mM Tris-HCl:a, pH 7,M, 8 mM MgCl^ta, 100 mM NaCl:a, 9 yksikköä DNA-poly- moraasi I Klenow-fragmenttia, 0,5 mM ATP:tä ja 2 yksikköä T^-DNA-ligaasia, inkuboitiin 37°C:ssa 3 h ja 25°C:ssa 2 h.

5 Reaktio lopetettiin sen jälkeen uuttamalla fenolilla ja etanolisaostuksella. DNA liuotettiin seokseen, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl:a , pH 8,0, 10 mM etyleenidiaminotetra-

etikkahappoa (EDTA), 50 % sakkaroosia ja 0,05 % bromifenyy-lisinistä ja elektroforesoitiin 0,8 % agaroosigeelillä 10 etidiumbromidin, 2 yg/ml, läsnäollessa. DNA-vyöhykkeet, jotka vastasivat M13-61:n RF-muctoja, eluoitiin geelile-vyistä perkloraattimenetelmällä (R.W. Davis, et ai., "Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., s. 178-179 (1980)). Eluoitu DNA siirrettiin 15 sopiviin JM 103-soluihin, kasvatettiin yön yli ja ssDNA

eristettiin viljelmäsupernatantista. Tätä ssDNA:ta käytettiin templaattina seuraavassa alukkeen pidennyksessä, DNA:n geelipuhdistetut RF-muodot siirrettiin sopiviin JM 103-soluihin, levitettiin agarmaljoille ja inkuboitiin yli 20 yön faagiplakkien saamiseksi.

Esimerkki 3

Paikkaspesifinen mutageneesi

Edellä oleva esimerkin 2 koe toistetaan, mutta käyte-25 tään synteettisenä oligonukleotidialukkeena GCAATTTTCAGACTCAG:tä muuttamaan IFN-g-geenin kodoni 17 kysteiiniä koodaavasta treoniinia koodaavaksi.

'-. Esimerkki ^ 30 Palkkasper. ifinen deleetio

Edollä oleva esimerkin 2 koe toistetaan, mutta käytetään synteettisenä oligonukleotidialukkeena AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG:tä poistamaan IFN-B-geenin kodoni . :V 17.

1ί4 87233 !

Esimerkki 5 I

- ,

Mutagenoitujen plakkien seulonta ja tunnistaminen !

Sekä mutatoituja M13-f31-plakkej a (esimerkki 1) sisältä- ! vät maljat että mutatoimattomia M13-Bl-faagiplakkeja sisäl-5 tävät kaksi maljaa jäähdytettiin 4°C:seen ja plakit kultakin maljalta siirrettiin kahdelle ympyränmuotoiselle nitro-selluloosasuodattimelle asettamalla kuiva suodatin agarmal-jalle: ensimmäinen suodatin 5 min:ksi ja toinen suodatin

15 min:ksi. Suodattimet asetettiin sen jälkeen 5 min:ksi 10 paksuille suodatinpapereille, joihin oli imeytetty 0,2 N

NaOH:a, 1,5 M NaClra ja 0,2 % Triton X-100:a ja neutraloitiin asettamalla vielä 5 min:ksi suodatinpapereille, joihin oli imeytetty 0,5 M Tris-HCla:a, pH 7,5 ja 0,5 M NaClra. Suodattimet pestiin kahdesti samalla tavalla asettamalla 15 ne suodattimille, joihin oli imeytetty 2 x SSCrtä (standardi sitraattiliuos), kuivattiin ja pidettiin sen jälkeen va-kuumiuunissa 80°C:ssa 2 h. Kaksoissuodattimet esihybridi-soitiin 55°C:ssa 4 h 10 ml:11a per suodatin DNA-hybridi-saatiopuskuria (5 x SSC, pH 7,0, x Denhardtin liuos 20 (polyvinyylipyrrolidiini, fikoli ja härän seerumin albumii ni, 1 x = 0,02 % kutakin), 0,1 % natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 50 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,0 ja 100 ug/ml denaturoitua lohen siemennesteen DNArta). Prllä leimattu koetin valmistettiin kinasoimalla oligonukleotidialuke 25 ^2P:llä merkityllä ATPrllä. Suodattimet hybridisoitiin 32 5

Prllä leimattuun alukkeeseen, 3,5 x 10 tuiketta per min/ml, kukin suodatin 5 mlrssa DNA-hybridisaatiopuskuria 55°C:ssa 2M h. Suodattimia pestiin kutakin 55°C:ssa 30 min. pesupuskureissa, jotka sisälsivät 0,1 % SDSrää ja vä-30 heneviä määriä SSCrtä. Suodattimia pestiin aluksi puskurilla, joka sisälsi 2 x SSCrtä ja mutatoimattomia M13-61-plakkeja sisältävistä kontrollisuodattimista tarkistettiin käyttäen Geiger-laskijaa, oliko niissä radioaktiivisuutta.

SSCrn konsentraatiota alennettiin asteittain ja suodatti-35 mia pestiin, kunnes mutatoimattomia M13_Bl-plakkeja sisältävissä kontrollisuodattimissa ei havaittu enää radioaktiivisuutta. Alhaisin käytetty SSCrn konsentraatio oli i5 87233 0,1 x see. Suodattimia kuivattiin ilmassa ja autorad i ogra-rioitiin -Y0°C:ssa 2-3 päivää. 480 mutatoitua M13-61-plak-kia ja 100 mutatoimatonta kontrollipiakkia seulottiin ki-nasoidulla oligonukleotidikoettimella. Yhtään kontrolli-5 plakkia ci hybridisoitu koet time 11a, kun taas 5 mutatoitua Ml i-iU-p lakki a hybridisoitii n koettimella.

Yksi viidestä mutatoidusta Ml3-81-plakista (M13-SY?50i) siirrettiin JM103-viljelmään. ssDNA valmistettiin superna-tantista ja kaksisäikeinen (ds) DNA valmistettiin solupal-10 losista. ssDNA:ta käytettiin templaattina kloonin dideok-si-sekvensoinnissa käyttäen M13~yleisaluketta. Sekvenssi-analyysin tulos esitetään kuvassa 6, mikä varmistaa, että TGT-kys-kodoni on muuttunut AGT-ser-kodomiksi.

15 Esimerkki 6

Mutatoidun IFN-g:n ekspressio E.colissa RF-DNA M13-SY2501:stä pilkottiin restriktioentsyymeil-lö Uin d ITI ja Xho II ja 520 ep:n inserttifragmentti puhdistettiin 1 £:.1 la agaroosigeeli llä. E, coli-trp-promootto-20 rin (kuva 7) sisältävä plasmidi pTrp3 pilkottiin entsyymeillä Hin d III ja Bam H I, sekoitettiin puhdistetun M13~ SY2501-DNA-fragmentin kanssa ja ligatoitiin T^-DNA-ligaa-sin läsnäollessa. Ligatoitu DNA transformoitiin E.coli-kantaan MM294. Ampisilliiniresistentit transformantit seu-25 lottiin tetrasykliiniherkkyyden suhteen. Viiden ampisil- liiniresistentin, tetrasykliinille herkän kloonin plasmidi-DNA pilkottiin Hin f I:llä, jotta saatiin seulottua MI3-SY 25OI-insert ti. Kuva 8a esittää erään klooneista (pSY2501) Hin f I -restriktiomallin verrattuna alkuperäi-30 sen lNF-8-kloonin, pPltrp, Hin f I-malliin. Kuten odotettua pSY250 l:ssä on y limääräinen H in f I -kohta halkaisten 197 ep: n sisäisen IFN-3-fragmentin 169 ep:n fragmentiksi ja 28 ep:n fragmentiksi (kuva 8b). Kloonin pSY2501 restrik-tiokartta esitetään kuvassa 9. Mutantti-IFN-8-geenin täy-35 dellinen DNA-jakso esitetään kuvassa 10 yhdessä ennustetun aminohappojärjestyksen kanssa.

Klooniksi pSY2501 nimetty plasmidi on tallennettu lai- i6 87233 tokseen Agricultural Research Culture Collection (NRRL), >

Fermentation Laboratory, Northern Regional Research Center,

Science and Education Administration, U.S. Department of :

Agriculture, 1815 North University Street, Preoria, Illinois 5 60604 ja sille on annettu tulonumerot CMCC No. 1533 ja NRRL No. B-15356.

pSY2501:n ja pBltrp:n, mukaanlukien niiden jälkeläiset, viljelmiä kasvatettiin optiseen tiheyteen 1,0. Vai- 1 mistettiin soluvapaita uutteita ja IFN-(3:n antiviraalinen 10 aktiivisuus tutkittiin GM2767-solui11a mikrotiiterikokeel-la. Kloonin pSY2501 uutteiden aktiivisuus oli kolmesta kymmeneen kertaan korkeampi kuin p£ltrp:n (taulukko I), osoittaen kloonin pSY2501 joko syntetisoivan enemmän IFN-β-aktiivisuutta omaavaa proteiinia tai valmistetulla proteii-15 nilla oli korkeampi spesifinen aktiivisuus.

Taulukko I

Uute Antiviraalinen aktiivisuus (U/ml) pSY2501 6 x 105 20 pBltrp 1 x 105 ptrp 3 (kontrolli) 30

Jotta saatiin ratkaistua, syntetisoiko klooni pSY2501 useita kertoja aktiivisempaa proteiinia, molempien kloonien 25 uutteita elektroforesoitiin SDS-polyakryyliamidigeelillä yhdessä kontrolliuutteen kanssa ja geeliä pidettiin Coomassia Blue-väriaineessa, jotta proteiinit saatiin näkyviin. Kuten kuva 11 osoittaa, oli vain yksi proteiinivyö-hyke, joka vastasi ilmeisesti 18.000 daltonin proteiinia, 30 jota oli mukana pSY2501 ja pgltrp-kloonien uutteissa, mutta ei ptrp 3:n kontrolliuutteessa. Tämän proteiinin, jonka molekyylipaino oli noin 20.000 daltonia, mutta joka näkyy geelimigraatiomallissa 18.000 daltonin proteiinina, osoitettiin aikaisemmin puhdistamalla tämä proteiini 35 pBltrp-uutteista olevan IFN-β. Koska tätä proteiinia on vähemmän pSY250i-uutteissa kuin pgltrp-uutteissa, proteiinin spesifinen aktiivisuus kloonin pSY2501 uutteissa oli 17 87232 korkeampi kuin kloonin pgltrp uutteissa.

Esimerkki 7 IFN-gserl7 puhdistus 5 IPN-gserl7 otettiin talteen E.colista, joka oli transformoitu tuottamaan IFN-B17· Ecolia kasvatettiin seuraavalla kasvatusalustalla OD-arvoon 10-11 680 nm:ssä (kuivapaino 8,4 g/1).

10 Aineosa Konsentraatio

NH^Cl 20 mM

K2S0^ 16,1 mM

KH2P04 7,8 mM

Na2HP0i| 12,2 mM

15 MgSO^ · 7H20 3 mM

Na^-sitraatti · 2H20 1,5 mM

MnSO^ · 4H20 30 yM

ZnSOjj · 7H20 30 yM

CuSO^ · 5H20 3 yM

20 L-tryptofaani 70 mg/1

FeSO^ · 7H20 72 yM

tiamiini · HCl 20 mg/1 glukoosi 40 g/1 pH-kontrolli NH^OHilla · - 25 9,9 1 (9,9 kg) transformoitua E.coli-massaa jäähdytettiin 20°C:seen ja konsentroitiin antamalla massan kulkea poikittaisvirtaussuodattimen läpi keskimääräisen paineen pudotuksen ollessa ~ 110 kpa ja muuttumattomalla suodoksen 30 virtausnopeudella 260 ml/min, kunnes suodos painoi 8,8 kg. Konsentraatti (noin yksi litra) tyhjennettiin astiaan ja jäähdytettiin 15°C:seen. Konsentraatin solut hajotettiin kuljettamalla konsentraatti Manton-Gaulin -homogenisaatto-;· rin läpi 5°C:ssa, ~ 69.000 kparssa. Homogenisaattori pes- 35 tiin yhdellä litralla fosfaattipuskuria, pH 7,4 (PBS), ja pesuneste lisättiin hajonneeseen solumassaan niin, että lopullinen tilavuus oli kaksi litraa. Tätä määrää sentrifu- i8 87233 goitiin keskeytymättömästi kiihtyvyydellä 12000 x g ja vir- j tausnopeudella 50 ml/min. Kiinteä aine erotettiin superna- i tantista ja suspendoitiin uudelleen neljään litraan PBS:a, j joka sisälsi 2 p-% SDS:a. Tätä suspensiota sekoitettiin 5 huoneen lämpötilassa 15 min, minkä jälkeen suspendoitua ainetta ei ollut näkyvissä. Liuos uutettiin sen jälkeen 2-butanolilla tilavuussuhteessa 1:1, 2-butanoli : liuos.

Uuttaminen suoritettiin neste-neste-faasierottimessa käyttäen virtausnopeutta 200 ml/min. Sen jälkeen orgaaninen 10 faasi erotettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 21,3 g proteiinia. Tämä suspendoitiin uudelleen tislattuun veteen tilavuussuhteessa 1:10.

Talteenotettu tuote tutkittiin ihmisen IFN-3-aktiivi-suuden suhteen käyttäen koetta, joka perustui suojautumi-15 seen virusperäistä sytopaattista vaikutusta (CPE) vastaan.

Koe tehtiin mikrotiitterilevyillä. Viisikymmentä yl minimivaatimukset täyttävää elatusainetta laitettiin jokaiseen syvennykseen ja 25 ui näytettä laitettiin ensimmäiseen syvennykseen ja 1:3 tilavuuslaimennuksista tehtiin sarja seu-20 raaviin syvennyksiin. Virus (rakkulainen stomatiitti), solu (ihmisen fibroblasti GM-2707) ja referenssi-IFN-3-kont-rollit siirrostettiin jokaiselle levylle. Referenssi-IFN-3:a käytettiin 100 yksikköä per ml. Sen jälkeen levyjä sä-teilytettiin UV-valolla 10 min. Säteilytyksen jälkeen 100 25 yl solususpensiota (1,2 x 10 solua/ml) lisättiin jokaiseen syvennykseen ja levyjä inkuboitiin 18—2^ h. Virusliuosta lisättiin yksi plakinmuodostusyksikkö per solu jokaiseen syvennykseen paitsi solukontrolliin. Sen jälkeen levyjä inkuboitiin, kunnes viruskontrolli osoitti 100 % CPE:tä.

30 Tämä tapahtui tavallisesti 18-2¾ h virusliuoksen lisäämisen jälkeen. Koetuloksia tulkittiin suhteessa sen refe-renssi-IFN-3-kontrollin syvennyksen sijaintiin, joka näyte osoitti 50 % CPE:tä. Tästä kohdasta määritettiin levyn kaikkien näytteiden interferonin tiitteri. Talteenotetun 35 tuotteen spesifisen aktiivisuuden arvoksi saatiin 5 x 10^ U/mg.

19 87233

Esimerkki 8

Happosaostus ja kromatografinen puhdistus

Esimerkin 7 menetelmä toistettiin paitsi että nestefaasin ja orgaanisen faasin uuton ja erotuksen jälkeen sekä 5 sen jälkeen, kun orgaaninen faasi oli sekoitettu PBS:n kanssa tilavuussuhteessa 3:1, seoksen pH alennettiin noin 5:een lisäämällä jääetikkaa. Saatu saostuma erotettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 10000-17000 x g 15 min ja kakku liuotettiin uudelleen seokseen, joka sisälsi 10 % 10 p/t SDS:ää, 10 mM DTT:tä, 50 mM natriumasetaattipuskuria (pH 5,5) ja kuumennettiin 80°C:ssa 5 min.

Sen jälkeen liuos pantiin Brownlee RP-300, 10 yM, "Aquapore”-kolonniin käyttäen Beckman-gradienttisysteemiä. Puskuri A oli 0,1 %:nen trifluorietikkahappo (TFA) vesi-15 liuoksena; puskuri B oli 0,1 Ji:nen TFA asetonitriilissä. Havaitseminen tapahtui ultraviolettiabsorptiolla 280 nmtssä. Liuotinjärjestelmä muodosti lineaarisen gradientin 0 öisestä puskuri B:stä 100 itseen puskuri B:hen kolmessa tunnissa. Korkeimmat interferoniaktiivisuudet sisäl- ,Ό tävät fraktiot yhdistettiin ja yhdistetyn interferonival- , . 7 misteen spesifiseksi aktiivisuudeksi saatiin 9 x 10 :stä

Q

3,8 x 10 kansainvälistä yksikköä per mg proteiinia verrat- g tuna alkuperäisen IFN-8:n aktiivisuuteen noin 2 x 10 U/mg. 25 Esimerkki 9 I FJJ - f,:;er]'( b i o k emi a 1 linen karakter isoint i

Aminohappokoostumus määritettiin IFN:n 40 yg suuruisten näytteiden 24-72 h:n pituisen hydrolyysin jälkeen 200 yltssa 5,7 N HClra, joka sisälsi 0,1 % fenolia, lämpötilaako sa 108°0. Proliini ja kysteiini määritettiin samalla tavalla per muurahaishappohapetuksen jälkeen; tässä tapauksessa fenoli jätettiin pois hydrolyysista. Tryptofaani analysoitiin 400 yl suuruisten näytteiden 24 h:n hydrolyysin jälkeen 5,7 N HCl:ssa, joka sisälsi 10 % merkaptoetik-35 kahappoa (ei fenolia). Analyysi suoritettiin Beckman 121 HB aminohappoanalysaattorilla käyttäen yksittäistä AA 10 hartsikolonnia.

i 20 87233 i

Puhdistetun IFN-8serl7 tyypillisistä 24-, 48-, 72-tunnin happohydrolyyseistä laskettu aminohappokoostumus täsmäsi hyvin sen aminohappokoostumuksen kanssa, joka ennustettiin IFN-geenin kloonien DNA-jaksosta, miinus puut-5 tuva N-pääte metioniini.

Puhdistetun IFN:n pääteaminohappojen ensimmäisten 58 tähteen aminohappojärjestys määritettiin 0,7 mg näytteellä laitteella Beckman 890C sequanator 0,1 M Quadrol-puskuril-la. PHT-aminohapot määritettiin vastakkaisfaasi-HPLC:llä 10 Altex ultrapallo ODS-kolonnissa (4,6 x 250 mm) 45°C:ssa eluoitiin 1,3 min:ssa 40 %:sessa puskuri B:ssä ja 8,4 min 40-70 /5:sta puskuri B:stä, missä puskuri A oli 0,0115 M natriumasetaatti, 5 % tetrahydrofuraani (THF), pH 5,11 ja puskuri B oli 10 % THF asetonitriiIissä.

15 IFN-gserl7 määritetty N-pääteaminohappojärjestys so pii yhteen DNA-jaksosta ennustetun odotetun järjestyksen kanssa lukuunottamatta puuttuvaa N-päätemetioniinia.

Kuten edellä osoitettiin IFN-Bserl7 -valmisteen spesifinen aktiivisuus on hyvin lähellä tai parempi kuin alku-20 peräisen IFN-B:n aktiivisuus. IFN-Bserl7 ei ole vapaita sulfhydryyliryhmiä, mutta näyttää olevan yksi -S-S-sidos ainoiden jäljelle jääneiden kysteiinien välillä asemissa 31 ja l4l. Proteiini ei muodosta helposti oligomeerejä ja näyttää olevan oleellisesti monomeerisessä muodossa. Tämän 25 keksinnön mukaisesti saatu IFN-Bserl7 voidaan formuloida farmaseuttisesti hyväksyttäväksi valmisteeksi joko yksittäisenä tuotteena tai erilaisten muotojen seoksena iner-teissä, myrkyttömissä, allergeenittömissä, fysiologisesti sopivissa kantajaväliaineissa käytettäväksi kliinisesti 30 tai terapeuttisesti syöpäterapiassa tai olosuhteissa, joissa auttaa interferoniterapia ja virusinfektioihin. Sellaisiin väliaineisiin kuuluvat, mutta eivät rajoitu, tislattu vesi, fysiologinen suolaliuos, Lingerin liuos, Hankin liuos yms. Muita myrkyttömiä ja liukenevia lisäaineita ku-35 ten dekstoosia, HSA:ta (ihmisen seerumin albumiini) yms.

voi optimaalisesti sisältyä mukaan. Terapeuttiset valmisteet voidaan antaa oraalisesti tai parenteraalisesti kuten 21 87233 laskimonsisäisinä, lihaksensisäisinä, vatsaontelon sisäisinä ja ihonalaisina annostuksina. Tämän keksinnön mukaisia modifioituja lFN-3-valmisteita voidaan myös käyttää paikallisesti sellaisiin tarkoituksiin tavallisesti käytettävis-5 sä sopivissa väliaineissa.

Edellä kuvatun IFN-3-muteiinin pääasiallisin etu on siinä, että vapaa sulfhydryyliryhmä eliminoituu IFN-g:n asemassa 17 siten pakottaen proteiinin muodostamaan oikean d.i suit'id i. sidoksen kys-31:n ja kys-l^llin välille ja muteii-10 ni omaksuu rakenteen, joka näennäisesti vaaditaan täyteen biologiseen aktiivisuuteen. IFN-3serl7 kohonnut spesifinen aktiivisuus mahdollistaa pienempien annost-en käytön terapeuttisissa käyttötarkoituksissa. Kun on deletoitu kysteiini asemassa 17 ja eliminoitu vapaa -SH-ryhmä, IFN-15 6serl7 -proteiini ei muodosta dimeerejä ja oligomeerejä niin helposti kuin mikrobiaalisesti tuotettu IFN-3. Tämä helpottaa proteiinin puhdistusta ja lisää sen stabiilisuut-ta.

Claims (12)

22 8 7 2 3 3

1. Muteiinia koodaava rakenteellinen geeni, tunnettu siitä, että geenissä on DNA-jakso, joka koodaa biologisesti aktiivisen proteiinin synteettisen muteiinin, jossa j 5 proteiinissa on ainakin yksi kysteiinitähde, joka on vapaa j muodostamaan disulfidisidoksen ja joka ei ole välttämätön mainitulle biologiselle aktiivisuudelle, joka proteiini on ihmisen IFN-β, jonka aminohapposekvenssi vastaa sekvenssiä » 10 5 10 15 20 j MetSerTyrAsnieu LeuGlyPheLeuGln ArgSerSerAsnPhe GlnCysGlnlysLeu · 25 30 35 40 Le.'rpGl'v ?'jaSn GlyArgLeuGluTyr CysleulysAspArg tetAsnPheAspIle 45 50 55 60 Pr;·•jGluI-eLvs G1 nLeuGI nGI nPhe G1nly$GluA$pAla AlaLeuThrlleTyr 65 70 75 80 GluMetLeuGl nAsn IlePheATallePhe ArgGlnAspSerSer SerThrGlyTrpAsn 15 85 90 95 100 GluThrlleValGlu AsnLeuLeuAlaAsn ValTyrHlsGlnlle AsnHIsleulysThr 105 110 115 120 ValLeuGluGluLys LeuGluLysGluAsp PheThrArgGlylys LeuHetSerSerLeu 125 130 135 140 HIsLeuLysArgTyr TyrGlyArglleLeu HIsTyrleuLysAla LysGluTyrSerHIs 145 150 155 160 CysAlaTrpThrJle VaiArgValGluIle LeuAgAsnPheTyr PheileAsnArgLeu 0 165 17 C 175 180 Th Ό1 y Tyri euArg Asr,— ja jolla muteiinilla on IFN-p:n asemassa 17 oleva kyste-25 iinitähde deletoitu tai korvattu toisella aminohapolla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geeni, tunnettu i siitä, että kysteiinitähde on korvattu seriinillä tai treoniinillä, parhaiten seriinillä.

3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen 30 geenin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) hybridisoidaan rakenteellisen geenin säikeen sisältävä yksisäikeinen DNA, joka geeni koodaa mainitun proteiinin, mutanttioligonukleotidialukkeella, joka on komplementaarinen mainitun kysteiinitähteen kodonin tai 35 mainitun kodonin kanssa parin muodostavan vastakolmikko- koodin, kumpi kulloinkin on kyseessä, sisältävän mainitun säikeen alueelle, lukuunottamatta yhteensopimattomuutta 87233 mainitun kodonin tai mainitun vastakolmikkokoodin kanssa, joka määrittelee mainitun toisen aminohapon koodaavan kolmikkokoodin; b) aluke pidennetään DNA-polymeraasilla muodostamaan 5 mutationaalinen heterodupleksi; ja c) replikoidaan mainittu mutationaalinen heterodupleksi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhteensopimaton kohta määrittelee seriinin tai 10 treoniinin koodaavan kolmikkokoodin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhteensopimaton kohta määrittelee seriinin kodonin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että säie on IFN-βιη vastasäie ja mutanttioligonuk- leotidialuke on GCAATTTTCAGAGTCAG.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 3-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksisäikeinen DNA on yksisäikeinen faagi, joka sisältää mainitun säikeen ja vaiheen b) matationaa1inen heterodupleksi muutetaan suljetuksi heterodupleksirenkaaksi.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 3-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu replikaatio aiheutetaan transformoimalla sopiva bakteeri-isäntä suljetulla ^ 25 heterodupleksirenkaalla ja viljelemällä saatavia transfor- mantteja.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 3-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää lisävaiheet heteroduplek-sin mutanttisäikeen jälkeläisten eristämiseksi, DNA:n 30 eristämiseksi mainituista jälkeläisistä ja mainitun geenin eristämiseksi mainittujen jälkeläisten DNA:sta.

10. Oligonukleotidi käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen rakenteellisen geenin valmistuksessa oligonukleotidi-kohdennetulla mutageneesilla, tunnettu 35 siitä, että oligonukleotidillä on nukleotidijärjestys, joka on komplementaarinen kysteiinitähteen kodonin tai mainitun kodonin kanssa parin muodostavan vastakolmikko- .f i f 24 87233 koodin, kumpi kulloinkin on kyseessä, sisältävän raken-teellisen geenin säikeelle, lukuunottamatta yhteensopimattomuutta mainitun kodonin kanssa, joka määrittelee toisen aminohapon koodaavan kolmikkokoodin.

11. Menetelmä estää biologisesti aktiivista proteiinia, jolla on ainakin yksi kysteiinitähde, joka on vapaa muodostamaan disulfidisidoksen, muodostamasta mainittua sidosta, tunnettu siitä, että proteiini on IFN-β ja että se muutetaan mutationaalisesti deletoimalla kysteiinitähde j 10 17, joka ei ole välttämätön mainitulle biologiselle j aktiivisuudelle, tai korvaamalla mainittu kysteiinitähde toisella aminohapolla.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kysteiinitähde korvataan seriinillä tai 15 treoniinillä. i 87233 Patentkravi