KR20100137006A - 생물학적 또는 화학적 물질에 대한 예방 또는 치료를 위한 유전적으로 변형된 인간 탯줄 혈관주위 세포 - Google Patents

생물학적 또는 화학적 물질에 대한 예방 또는 치료를 위한 유전적으로 변형된 인간 탯줄 혈관주위 세포 Download PDF

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KR20100137006A
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제인 엘리자베스 에니스
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존 에드워드 데이비스
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티슈 리제너레이션 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 유전적으로 변형된 인간 탯줄 혈관주위 세포를 투여함으로써, 대상 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간)에서 생물학적 또는 화학적 물질에 의해 유발된 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

생물학적 또는 화학적 물질에 대한 예방 또는 치료를 위한 유전적으로 변형된 인간 탯줄 혈관주위 세포{GENETICALLY MODIFIED HUMAN UMBILICAL CORD PERIVASCULAR CELLS FOR PROPHYLAXIS AGAINST OR TREATMENT OF BIOLOGICAL OR CHEMICAL AGENTS}
본 발명은 유전적으로 변형된 인간 탯줄 혈관주위 세포를 투여함으로써, 대상 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간)에서 생물학적 또는 화학적 물질에 의해 유발된 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 방법에 유용한 유전적으로 변형된 인간 탯줄 세포 및 그를 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다.
임상학상 가치있는 치료 단백질을 위한 재조합 단백질 제조는 생명공학 산업의 엄청한 기술적 및 상업적 성공이었다. 모노클로날 항체 (MAb)는 2006년도에 전세계에서 206억 달러어치 시판되었고 가장 빠르게 성장하는 제약 부문이다. 상위 시판 US MAb 중 6개는 매년 1십억 달러 넘게 시판되고, 리툭산 (Rituxan)®이 단독으로 47억 달러어치 시판되어 선두이다.
국가 방어를 위한 MAb 활용은 생물무기 피해자의 치료 (및 감염성 질병, 예를 들어, SARS의 대규모 유행)를 담당하는 기관의 깊은 관심사항이다. 군사 및 민간 연구 프로그램에서는 몇몇 치료 목적의 MAb를 확인하였고, 일부 경우에 이를 생물학적 무기에 대한 의학적 대응책으로서 개발하는 과정을 시작하였다.
MAb가 제1선 대응책으로서 활용되려면 2가지 문제가 처리되어야 한다: 높은 약물 비용 및 복잡한 전달 시스템. "생물제제"의 제조 비용은 높다. MAb와 같은 재조합 단백질은 대규모 cGMP 제조 및 진핵/원핵생물 발효 시스템, 이어서 완료된 벌크 (bulk) 제약 활성의 하류 정제 및 연마를 포함한 고가의 공정에 의해 생산된다. 두 번째로, 주사를 통한 MAb 및 다른 단백질-기반 약물의 전달은 치료의 장애가 되었다. 통상적인 주사 또는 주입을 통한 MAb의 대규모 사용은 전장에서 또는 테러범 시나리오에서 생물무기 공격의 시간 및 인간 자원의 제약 내에서 비현실적인 것이다.
발명의 개요
본 발명은 유전적으로 변형되지 않은 인간 탯줄 혈관주위 세포 (HUCPVC)에 비해 HUCPVC 내에서 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 증가시키도록 유전적으로 변형된 HUCPVC를 투여함으로써, 생물학적 또는 화학적 물질로부터 공격 (challenge)에 대해 대상을 보호하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 측면에서, 그러한 방법에서 유용한 유전적으로 변형된 HUCPVC, 및 그러한 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 대상은 척추동물, 예를 들어 포유동물 (예를 들어, 인간)일 수 있다. HUCPVC는 그가 투여되는 대상에 비해 동종 (allogeneic) 또는 이종 (xenogeneic)일 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 생물학적 물질의 공격에 대해 보호하기 위해 대상에게 투여된다. 생물학적 물질은 병원체, 예를 들어 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충일 수 있다. 세균은 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 에스체리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 브루셀라 (Bruscella), 부르콜더리아 말레이 (Burkholderia mallei), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 또는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)일 수 있다. 바이러스는 가제츠 걸리 (Gadgets Gully) 바이러스, 카담 (Kadam) 바이러스, 키아사누르 (Kyasanur) 삼림병 바이러스, 랑가트 (Langat) 바이러스, 옴스크 (Omsk) 출혈열 바이러스, 포와산 (Powassan) 바이러스, 로얄 팜 (Royal Farm) 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 도약병 (Louping ill) 바이러스, 미반 (Meaban) 바이러스, 사우마레즈 리프 (Saumarez Reef) 바이러스, 튤레니이 (Tyuleniy) 바이러스, 아로아 (Aroa) 바이러스, 뎅기 바이러스, 케도우고우 (Kedougou) 바이러스, 카시파코어 (Cacipacore) 바이러스, 코우탕고 (Koutango) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 (Murray Valley) 뇌염 바이러스, 세인트루이스 (St. Louis) 뇌염 바이러스, 우수투 (Usutu) 바이러스, 웨스트 나일 (West Nile) 바이러스, 야오운데 (Yaounde) 바이러스, 코코베라 (Kokobera) 바이러스, 바가자 (Bagaza) 바이러스, 일레우스 (Ilheus) 바이러스, 이스라엘 칠면조 뇌수막척수염 바이러스, 느타야 (Ntaya) 바이러스, 템부수 (Tembusu) 바이러스, 지카 (Zika) 바이러스, 반지 (Banzi) 바이러스, 보우보이 (Bouboui) 바이러스, 엣지 힐 (Edge Hill) 바이러스, 쥬그라 (Jugra) 바이러스, 사보야 (Saboya) 바이러스, 세픽 (Sepik) 바이러스, 우간다 S 바이러스, 베셀스브론 (Wesselsbron) 바이러스, 황열병 바이러스, 엔테베 (Entebbe) 박쥐 바이러스, 요코세 (Yokose) 바이러스, 아포이 (Apoi) 바이러스, 카우본 릿지 (Cowbone Ridge) 바이러스, 주티아파 (Jutiapa) 바이러스, 모독 (Modoc) 바이러스, 살 비에자 (Sal Vieja) 바이러스, 산 페를리타 (San Perlita) 바이러스, 부칼라사 (Bukalasa) 박쥐 바이러스, 카레이 아일랜드 (Carey Island) 바이러스, 다카르 (Dakar) 박쥐 바이러스, 몬타나 (Montana) 수염박쥐 백질뇌염 바이러스, 프놈펜 (Phnom Penh) 박쥐 바이러스, 및 리오 브라보 (Rio Bravo) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEE), 서부 말 뇌염 바이러스 (WEE), 에볼라 (Ebola) 바이러스, 마르부르그 (Marburg) 바이러스, 천연두 바이러스, 우두 바이러스, 라사 (Lassa) 바이러스, 이피 (Ippy) 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 모발라 (Mobala) 바이러스, 모페이아 (Mopeia) 바이러스, 아마파리 (Amapari) 바이러스, 플렉살 (Flexal) 바이러스, 구아나리토 (Guanarito) 바이러스, 주닌 (Junin) 바이러스, 라티노 (Latino) 바이러스, 마추포 (Machupo) 바이러스, 올리베로스 (Oliveros) 바이러스, 파라나 (Parana) 바이러스, 피친데 (Pichinde) 바이러스, 피리탈 (Pirital) 바이러스, 사비아 (Sabia) 바이러스, 타카리베 (Tacaribe) 바이러스, 타미아미 (Tamiami) 바이러스, 및 화이트워터 아로요 (Whitewater Arroyo) 바이러스, 신 놈브레 (Sin Nombre) 바이러스, 한탄 (Hantaan) 바이러스, 리프트 밸리 (Rift Valley) 열 바이러스, 크리미언-콩고 (Crimean-Congo) 출혈열 바이러스, 두그베 (Dugbe) 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스 (EBV), 카포시 (Kaposi) 육종 연관-헤르페스바이러스 (KSHV), 인플루엔자바이러스 A, H5N1 조류 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 바이러스, 광견병 바이러스, 또는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)일 수 있다. 진균은 아스페길러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 더마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 칸디다 (Candida), 콕시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼 변종 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum var . capsulatum), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 스포로트릭스 스켄키이 (Sporothrix schenckii), 자이고마이세테스 (Zygomycetes) 종, 압시디아 코림비페라 (Absidia corymbifera), 리조무코르 푸실러스 (Rhizomucor pusillus), 또는 리조푸스 아리주스 (Rhizopus arrhizus)일 수 있다. 기생충은 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 피. 비박스 (P. vivax), 피. 오발레 (P. ovale), 피. 말라리아에 (P. malariae), 트리파노소마 (Trypanosoma) 종, 또는 레지오넬라 (Legionella) 종일 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 화학적 물질로부터 공격에 대해 보호하기 위해 대상에게 투여된다. 화학적 물질은 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 독소, 예를 들어 리신, 디프테리아 독소, 이. 콜라이 장독소, 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae) 장독소, 포도구균 (Staphylococcal) 장독소, 연쇄구균 (Streptococcal) 장독소, 또는 보툴리눔 독소일 수 있다. 화학적 물질은 합성에 의해 또는 천연에서 유래될 수 있다. 화학적 물질은 신경작용제, 수포제, 혈액작용제, 또는 호흡작용제일 수 있다. 화학적 물질은 질소 머스타드 (mustard), 황 머스타드, 아세틸콜린에스테라제 억제제, 또는 루위사이트 (Lewisite)일 수 있다. 화학물질은 삭시톡신, 비스(2-클로로에틸)에틸아민, 2-클로로비닐디클로로아르신, 2-클로로에틸클로로메틸술피드, 비스(2-클로로에틸)술피드, 사린 (GB), 시클로사린 (GF), 소만 (GD), 타분 (tabun) (GA), VX, 아미톤, PFIB, 3-퀴누클리디닐 벤질레이트, 포스겐, 디포스겐, 염화시안, 시안화수소, 또는 클로로피크린일 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, HUCPVC는 폴리펩티드, 예를 들어 항체, 항체 단편, 미생물 항원, 시토킨 또는 성장 인자, 호르몬, 응고 인자, 약물 내성 또는 항바이러스 내성 폴리펩티드, 항-독액제, 항산화제, 수용체 또는 리간드, 면역조절 인자, 검출가능한 표지, 또는 세포성 인자를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 폴리펩티드는 HUCPVC에 내인성 또는 비-내인성일 수 있다. 또다른 실시태양에서, HUCPVC는 2종 이상의 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 또다른 실시태양에서, HUCPVC는 항체 또는 항체 단편을 합성하고 분비할 수 있고; 항체 또는 항체 단편은 재조합, 인간화, 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 단일쇄 항체 (scFv), Fab, Fab'2, scFv, SMIP, 디아바디 (diabody), 나노바디 (nanobody), 앱타머 (aptamer), 또는 도메인 항체일 수 있다. 또다른 실시태양에서, 시토킨 또는 성장 인자는 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), TNF-β, 인터페론-알파 (IFN-α), IFN-β, IFN-γ, 인터류킨 1 (IL-1), IL-1β, 인터류킨 2-14, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), RANTES, MIP-1α, 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β), 혈소판 유래 성장 인자 (PGDF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 표피 성장 인자 (EGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 에리트로포이에틴 (EPO), 또는 트롬보포이에틴 (TPO)일 수 있다. 호르몬은 안지오텐시노겐, 안지오텐신, 부갑상선 호르몬 (PTH), 염기성 섬유모세포 성장 인자-2, 황체형성 호르몬, 난포 자극 호르몬, 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 바소프레신, 옥시토신, 소마토스타틴, 가스트린, 콜레시스토키닌, 렙틴, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 에피네프린, 노르에피네프린, 도파민, 칼시토닌, 또는 인슐린일 수 있다. 응고 인자는 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 또는 피브리노겐일 수 있다. 효소는 부티릴콜린에스테라제 (BChE), 아데노신 데아미나제, 글루코세레브로시다제, 알파-1 항트립신, 바이러스 티미딘 키나제, 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제, 망간 수퍼옥시드 디스뮤타제 (Mn-SOD), 카탈라제, 구리-아연-수퍼옥시드 디스뮤타제 (CuZn-SOD), 세포외 수퍼옥시드 디스뮤타제 (EC-SOD), 글루타티온 리덕타제, 페닐알라닌 히드록실라제, 산화질소 합성효소, 또는 파라옥시나제일 수 있다. 수용체 또는 리간드는 T-세포 수용체 (TCR), LDL 수용체, 표면-결합 면역글로불린, 가용형 CD4, 낭성 섬유증 막횡단 전도도 수용체 (CFTR), 또는 Fc 수용체일 수 있다. 면역조절 인자는 CTLA-4, VCP, PLIF, LSF-1, Nip, CD200, 유로모둘린, CD40L (CD154), FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, CD28, CD25, B7.1, B7.2, 또는 OX40L일 수 있다. 검출가능한 표지는 초록 형광 단백질 (GFP)일 수 있다. 세포성 인자는 시토크롬 b, ApoE, ApoC, ApoAI, MDR, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 유로키나제, 히루딘, β-글로빈, α-글로빈, HbA, ras, src, 또는 bcl일 수 있다. 폴리펩티드는 항원으로서 작용하여, 대상에서 생물학적 또는 화학적 물질에 대한 면역 반응을 생성시키는 세포성 단백질일 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, HUCPVC는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 바이러스 복제 또는 감염을 억제할 수 있는 RNA 간섭 (RNAi) 분자를 발현하도록 유전적으로 변형된다. RNAi 분자는 작은 억제성 RNA (siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 HUCPVC에 내인성 또는 비-내인성일 수 있다. 다른 실시태양에서, HUCPVC는 2종 이상의 올리고뉴클레오티드를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 대상은 본 발명의 유전적으로 변형된 HUCPVC를 투여받기 전에 생물학적 또는 화학적 물질에 노출되었다. 대상에게 단일 용량의 HUCPVC 또는 다수 용량의 HUCPVC가 투여될 수 있다. HUCPVC는 그를 필요로 하는 대상을 보호하기 위해 백신으로서 투여될 수 있다. HUCPVC는 대상에게 정맥내로, 근육내로, 경구로, 흡입에 의해, 비경구로, 복강내로, 동맥내로, 경피로, 설하로, 코 안으로, 볼을 통해, 리포좀에 의해, 지방을 통해 (adiposally), 눈으로, 눈 안으로, 피하로, 경막내로, 외용으로, 또는 국소로 투여될 수 있다. 대상에게 용량당 101 내지 1013개의 HUCPVC, 또는 용량당 103 내지 108개의 HUCPVC가 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 대상에게 투여되는 유전적으로 변형된 HUCPVC는 1주, 1개월, 또는 2개월 초과 동안 지속된다. HUCPVC는 대상 내에서 면역 인식을 피할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 HUCPVC가 아닌 적어도 하나의 중간엽 줄기 세포 (MSC)와 조합으로 투여된다. MSC는 유전적으로 변형되지 않은 MSC에 비해 MSC 내에서 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 증가시키도록 유전적으로 변형될 수 있다. MSC는 골수, 제대혈, 배아 난황낭, 태반, 피부, 또는 혈액으로부터 단리될 수 있다. MSC는 HUCPVC에 내인성 또는 비-내인성인 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 HUCPVC 치료의 예방 또는 치료 효과를 향상 또는 연장하는 하나 이상의 치료제와 조합으로 대상에게 투여될 수 있다. 치료제는 예를 들어 시토킨, 항바이러스제, 면역자극제, 또는 면역억제제일 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 투여된다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 생물학적 또는 화학적 물질의 치료 또는 그로부터 보호를 필요로 하는 대상에게 투여하기 위한 키트 내에 제공된다.
일반적으로, 본 발명은 대상에서 생물학적 또는 화학적 물질에 의해 유발된 질병 또는 질환을 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 유전적으로 변형된 HUCPVC의 용도를 제공한다.
정의
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "항체"는 전체 항체 또는 면역글로불린 및 그의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일쇄를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항체는 포유동물 (예를 들어, 인간 또는 마우스), 인간화, 키메라 (chimeric), 재조합, 합성 방식으로 생산된, 또는 천연적으로 단리된 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 항체 및 항체-유사 특성을 갖는 다른 단백질 스캐폴드 (scaffold)의 모든 공지된 형태를 포함한다. 예를 들어, 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 또는 항체-유사 특성을 갖는 단백질 스캐폴드, 예를 들어 피브로넥틴 또는 안키린 반복체일 수 있다. 항체는 Fab, Fab'2, scFv, SMIP, 디아바디, 나노바디, 앱타머 또는 도메인 항체일 수 있다. 항체는 임의의 다음 이소형을 가질 수 있다: IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), IgM, IgA (예를 들어, IgA1, IgA2 및 IgAsec), IgD 또는 IgE.
용어 "항체 단편"은 본원에서 사용될 때, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 구역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 및 VL 도메인을 포함하는 dAb; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)); (vii) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb; (viii) 단리된 상보성 결정 구역 (CDR); 및 (ix) 임의로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 이용하여 합성 링커에 의해 연결될 수 있어서, 이들은 VL 및 VH 구역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬 (단일쇄 Fv (scFv)로서 공지됨; 예를 들어 문헌 [Bird et al., Science 242:423-426 (1988)] 및 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)] 참조)로서 만들어진다.
용어 "유효량" 또는 "에 효과적인 양" 또는 "치료 유효량"은 요구되는 결과를 생성하기에, 예를 들어, 세균 또는 바이러스 감염의 예방 또는 치료하거나, 혈액 응고를 감소시키거나, 독액 (예를 들어, 뱀 독액)의 효과를 역전시키기 위해 충분한 유전적으로 변형된 HUCPVC의 양을 의미한다.
"유전적으로 변형된 HUCPVC"은 인간 (예를 들어, 군인)에게 투여될 때, 병원성 미생물 또는 화학적 물질 (예를 들어, 독소)에 의해 유발되는 질병 또는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는, 적어도 하나의 폴리펩티드 (예를 들어, 항체, 시토킨, 또는 호르몬) 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)를 재조합 방식으로 발현하는 인간 탯줄 혈관주위 세포를 의미한다. 상기 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드는 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대한 유전자 서열의 HUCPVC에 대한 전달 (예를 들어, 형질감염 또는 형질도입) 후에 HUCPVC에 의해 재조합 방식으로 생산될 것이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 구역 모두가 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991))]에 기재된 바와 같이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도되는 가변 구역을 갖는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 구역을 함유하는 경우에, 불변 구역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용될 때, 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프팅된 항체 (즉, 인간화 항체 또는 항체 단편)를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "인간화 항체"는 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유도된 가변 프레임워크 구역 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유도된 상보성 결정 구역 (예를 들어, 적어도 하나의 CDR)을 포함하는 가변 구역을 갖는 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함하는 임의의 항체 또는 항체 단편을 나타낸다.
"인터페론"은 포유동물 (예를 들어, 인간) 인터페론 -알파, -베타, -감마, 또는 -타우 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적 활성 단편, 예를 들어, IFN-α (예를 들어, IFN-α-1a; 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 2007/0274950 참조, IFN-α-1b, IFN-α-2a; 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 WO 07/044083 참조, 및 IFN-α-2b), IFN-β (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 7,238,344에 설명됨; IFN-b-1a (아보넥스 (AVONEX)® 및 레비프 (REBIF)®); 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,962,978에 설명됨, 및 IFN-β-1b (베타세론 (BETASERON)®, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,588,585; 4,959,314; 4,737,462; 및 4,450,103에 설명됨), IFN-g 및 IFN-t (본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,738,845 및 미국 특허 출원 공개 2004/0247565 및 2007/0243163에 설명됨)를 의미한다.
"제약상 허용되는 담체"는 그가 투여되는 유전적으로 변형된 HUCPVC의 치료적 특성을 보유하면서 치료 대상 (예를 들어, 인간)에게 생리학상 허용되는 담체를 의미한다. 하나의 예시적인 제약상 허용되는 담체는 생리학적 염수이다. 다른 생리학상 허용되는 담체 및 그의 제제는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA]에 설명되어 있다.
"치료하는"은 대상 (예를 들어, 인간)에서 질병 또는 질환 (예를 들어, 병원성 미생물 또는 독소에 의해 유발되는 감염성 질병)의 진행 또는 중증도, 또는 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 진행, 중증도 또는 빈도의 감소 (예를 들어 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 심지어 100%)를 의미한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 유전적으로 변형된 인간 탯줄 혈관주위 세포 (HUCPVC), 그를 포함하는 의료상 유용한 조성물, 및 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간에서 예를 들어 생물학적 물질 (예를 들어, 병원체, 예를 들어 세균, 바이러스, 진균 및 기생충에 의한 감염) 또는 화학적 물질 (예를 들어, 생물학적 또는 화학적 (예를 들어, 합성) 독소)에 의한 공격을 억제, 감소, 예방 또는 치료하기 위한 그의 투여를 제공한다. 또한, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 각각 생물학적 또는 화학적 무기에 사용되는 것을 포함한 병원체 또는 생물학적 또는 화학적 독소에 노출될 가능성이 있거나 노출된 포유동물에게 예방 또는 치료 목적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 환자, 예를 들어, 생물학적 또는 화학적 무기에 대한 노출 위험이 큰 군대 인력 (예를 들어, 군인), 의료 인력 (예를 들어, 의사 또는 간호사) 또는 민간 인력의 예방 또는 치료에 특히 적합하다. 추가로, 본 발명은 토착 감염성 물질 (예를 들어, 말라리아, 플라비바이러스 (Flavivirus), 예를 들어 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 및 황열병 바이러스)이 실질적인 보건 위험을 제시하는 세계 각 지역에 주재하는 군대 인력 또는 의료 인력의 예방 또는 치료를 제공한다.
HUCPVC는 치료되는 대상 (예를 들어, 인간)에 예방 또는 치료상 이익을 제공하는 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 폴리펩티드), 예를 들어 항체, 항체 단편, 시토킨, 호르몬, 응고 인자, 면역조절 인자, 검출가능한 표지 또는 효소를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 또한, HUCPVC는 치료되는 대상의 세포 과정 또는 그 내부에 존재하는 병원성 미생물 또는 독소를 조정하는 (예를 들어, 억제하는) 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 분자)를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. HUCPVC는 병원성 미생물 또는 독소에 대한 노출로부터 생기는 하나 이상의 질병 또는 질환의 예방 또는 치료를 위한 하나 이상의 치료적 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
유전적으로 변형된 HUCPVC는 HUCPVC 치료의 예방 또는 치료상 품질을 향상 또는 연장하기 위해 하나 이상의 진단제 또는 치료제 (예를 들어, 면역조절제, 예를 들어 인터페론-알파)와 동시-투여될 수 있다. HUCPVC는 또한 하나 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 조합될 수 있고, 정맥내로, 근육내로, 경구로, 흡입에 의해, 비경구로, 복강내로, 동맥내로, 경피로, 설하로, 코 안으로, 볼을 통해, 리포좀에 의해, 지방을 통해, 눈으로, 눈 안으로, 피하로, 경막내로, 외용으로, 또는 국소로 투여되도록 제형화될 수 있다. 추가의 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 유전적으로 변형된 HUCPVC 집단을 사용한 포유동물의 예방 또는 치료 목적의 처리를 위한, 사용지시서를 포함한 키트를 제공한다.
인간 탯줄 혈관주위 세포 ( HUCPVC )
인간 탯줄 혈관주위 세포 (HUCPVC)는 인간 탯줄의 워튼 젤리 (Wharton's Jelly) 내의 혈관주위 구역으로부터 얻은 다능성 세포의 비-조혈 중간엽 집단이다 (예를 들어, [Sarugaser et al., "Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A Source of mesenchymal progenitors," Stem Cells 23:220-229 (2005)] 참조). 미국 특허 출원 공개 2005/0148074 및 국제 특허 출원 공개 WO 2007/128115에서는 HUCPVC의 단리 및 시험관내 배양을 위한 방법을 설명하고 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다. HUCPVC는 표준 부착 조건 하에 배양될 때 각각의 계대배양 2-7에서 약 20시간 (혈청 의존적)의 배가 시간을 보이는, 비교적 빠른 증식을 추가의 특징으로 한다. 표현형상, HUCPVC는 수거 시에, Oct 4-, CD14-, CD19-, CD34-, CD44+, CD45-, CD49e+, CD90+, CD105(SH2)+, CD73(SH3)+, CD79b-, HLA-G-, CXCR4+ 및 c-kit+로서 특징지을 수 있다. 또한, HUCPVC는 혈관주위 구역 이외의 워튼 젤리 공급원으로부터 추출된 세포 집단에 비해 보다 높은 수준에서 CK8, CK18, CK19, PD-L2, CD146 및 3G5 (혈관주위세포 마커)에 대해 양성이다.
HUCPVC 의 잇점
폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 인간 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드)를 재조합 방식으로 발현하기 위해 사용될 때, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 다른 세포 기반 요법에 비해 몇 가지의 잇점을 제공한다. HUCPVC는 동종 또는 이종 숙주에게 투여될 때 낮은 면역원성을 보이기 때문에, 다른 동종 또는 이종 세포에 비해 숙주 내에서 수명이 증가된다. HUCPVC는 또한 치료상 유의한 수준의 관심있는 단백질 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, HUCPVC가 발현하도록 유전적으로 변형된 재조합 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드)를 생성시키는 유전자 발현 양식을 확립시켰다. 추가로, HUCPVC는 빠르게 증식하지만, 다른 세포 기반 유전자 요법 비히클에 비해 증식 질환 위험이 감소된다. 대상 (예를 들어, 인간)의 예방 또는 치료를 위한 유전적으로 변형된 HUCPVC의 이들 유리한 특징을 각각 아래에서 상세히 논의한다.
유전적으로 변형된 HUCPVC의 낮은 면역원성으로 인해 이들은 척추동물 대상, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간, 특히 동종 또는 이종 수여자에의 투여를 위한 이상적인 비히클이다. HUCPVC는 숙주 면역계에 의한 추적을 피하는 그들의 능력에 기초하여 낮은 면역원성을 갖는 것으로 나타났다 (예를 들어, 문헌 [Sarugaser et al., (2005)] 및 미국 특허 출원 공개 2005/0148074 참조). 따라서, 예를 들어 인간 (즉, 공여자)으로부터 수거된 HUCPVC는 시험관 내에서 배양되고, 유전적으로 변형된 HUCPVC에 대해 숙주에서 동종특이적 (allo-specific) 면역 반응을 유발하지 않으면서 다른 관련되지 않은 HLA-미스매치된 인간 (즉, 숙주)에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ennis et al., "In vitro immunologic properties of human umbilical cord perivascular cells" Cytotherapy 10(2): 174-181 (2008)] 참조). 따라서, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 숙주 면역계의 활성화로 인한 치료 효능의 상실 없이 이종성 인간 집단, 또는 심지어 이종발생 집단에게 투여될 수 있다. 또한, 실질적으로 임의의 척추동물 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간)에서 HUCPVC를 사용하는 능력 때문에, 응급 상황 (예를 들어, 감염성 질병 유행) 동안 사용하기 위한 대규모 제조 및 보관 (즉, "비축")이 가능하다.
HUCPVC의 낮은 면역원성 때문에, 다른 동종 또는 이종 세포에 비해 처리된 숙주 내에서 이들 세포의 생체내 수명이 증가한다. 유사한 중간엽 세포는 동종으로 전달될 때 인간 숙주 내에서 수년 동안 지속하는 것으로 기록되었고 (Le Blanc et al., "Fetal mesenchymal stem-cell engraftment in bone after in utero transplantation in a patient with severe osteogenesis imperfecta," Transplantation 79(11):1607-1614 (2005)), 따라서, HUCPVC는 척추동물 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간) 숙주 내에서 주사 후에 적어도 수 주 내지 수 개월 (예를 들어, 2주, 4주, 6주, 2개월 이상) 동안 지속될 것으로 예상할 수 있다. 치료 또는 예방을 위한 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드의 제공을 위해 (예를 들어, 바이러스 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드의 제공에 의해) 사용되는 HUCPVC의 수명은 다른 백신 접종 또는 치료 기술에 비해 잇점을 제공한다. 전통적인 백신 또는 치료제는 개체에서 보호 또는 치료 효과를 제공하기 위해 다수의 투여를 필요로 하지만, 치료 유효량의 유전적으로 변형된 HUCPVC는 단일 용량으로 개체에게 투여될 수 있다. 별법으로, 예방 또는 치료를 제공하기 위해서 2회 이상 용량의 유전적으로 변형된 HUCPVC가 투여될 수 있다. 미생물 병원체 또는 독소에 의해 유발된 질병 또는 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용되는 유전적으로 변형된 HUCPVC의 수명은 군대 배치의 불확실성 때문에 요법제 또는 백신의 다수 투여가 불가능한 군대 인력 (예를 들어, 군인)에 투여하기 위해 특히 유용하다.
HUCPVC의 다른 유리한 특성은 이들이 치료 목적의 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드의 재조합 발현을 허용하기 위한 많은 표준 형질감염 및 형질도입 기술에 의해 유전적으로 쉽게 변형될 수 있다는 것이다. 본원에 추가로 설명된 바와 같이, 유전자 전달은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스 및 렌티바이러스) 및 핵산 형질감염 (예를 들어, 리포좀, 양이온성 비히클, 또는 전기천공과 조합한 DNA 플라스미드)을 이용하여 달성할 수 있다.
전형적으로 골수 공여를 필요로 하는 많은 다른 중간엽 줄기 세포 집단과는 달리, HUCPVC는 출산 후에 보통 폐기되는 인간 탯줄로부터 신뢰가능하게 수집될 수 있다. 산업국에서, 인간 제대혈 생성물은 미래의 가능한 자가 또는 동종-이식을 위해 현재 정례적으로 수집되고 보관된다. 따라서, 본 발명의 방법에 따른 팽창 및 유전자 변형을 위한 HUCPVC의 수집은 다른 중간엽 줄기 세포 집단의 수집과 연관된 많은 물류 제약이 없다.
마지막으로, HUCPVC는 짧은 집단 배가 시간 (예를 들어, [Sarugaser et al., 2005] 참조)을 가져서, 그를 필요로 하는 포유동물 (예를 들어, 인간)에 대한 투여를 위해 유전적으로 변형된 HUCPVC의 신속한 대규모 제조를 허용한다. HUCPVC는 실질적으로 효소 텔로머라제가 결여되고, 따라서, 이들 세포는 세포자멸이 일어나기 전에 미리 정해진 수의 분할을 초과하여 분할할 수 없기 때문에 증식성 질병 위험이 최소이다. 동물 실험에서, HUCPVC는 심지어 임상학상 적용가능한 것보다 더 큰 크기 차수의 수로 투여될 때에도 종양을 생성하는 것으로 알려져 있지 않다.
재조합 폴리펩티드 및 올리고뉴클레오티드 발현
본 발명에서, HUCPVC는 하나 이상의 폴리펩티드 (예를 들어, 항체, 시토킨, 또는 호르몬) 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA 분자)를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있어서, 치료 유효량으로 제공될 때 유전적으로 변형된 HUCPVC가 생물학적 (예를 들어, 병원성 미생물) 또는 화학적 (예를 들어, 독소) 물질에 의한 공격을 억제, 감소, 예방 또는 치료하기 위해 "스탤스 (stealth) 세포"로서 작용한다. 면역조절 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 또한 숙주 면역 반응을 조정하기 (예를 들어 증가 또는 감소시키기) 위해 HUCPVC 내에서 발현될 수 있다. HUCPVC에서 발현된 폴리펩티드는 분비되거나 형질막 표면 상에 디스플레이될 수 있다 (예를 들어, 막-결합 수용체 또는 리간드). 1종 이상의 생물학적 또는 화학적 물질의 치료 또는 그에 대한 보호를 허용하도록, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 단일 HUCPVC에서 동시-발현될 수 있다.
항체 및 항체 단편
본 발명은 추가로 병원성 미생물 또는 화학적 물질 (예를 들어, 독소)에 특이적으로 결합하고 중화시키는, 유전적으로 변형된 HUCPVC에 의한 항체 (예를 들어, 인간화 모노클로날 항체) 또는 항체 단편의 발현을 제공한다. 실시예 1에 제시된 바와 같이, 항체 또는 항체 단편을 발현하는 HUCPVC는 병원성 미생물 또는 화학적 물질에 노출되거나 노출될 가능성이 있는 척추동물 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간 (예를 들어, 군인))을 각각 치료 또는 보호하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역계를 조절하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 항체는 TNF 억제제 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골), 알렘투주맙, 아펠리모맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 아토롤리무맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베르틸리무맙, 세델리주맙, 클레놀릭시맙, 다클리주맙, 도를리모맙 아리톡스, 도를릭시주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 엘실리모맙, 에를리주맙, 파랄리모맙, 폰톨리주맙, 갈릭시맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 골리무맙, 고밀릭시맙, 이발리주맙, 이놀리모맙, 이필리무맙, 켈릭시맙, 레브릴리주맙, 레르델리무맙, 루밀릭시맙, 마슬리모맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 모롤리무맙, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 네렐리모맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오말리주맙, 오텔릭시주맙, 파스콜리주맙, 펙셀리주맙, 리툭수맙, 레슬리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 시플리주맙, 탈리주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 바팔릭시맙, 베팔리모맙, 비실리주맙, 자놀리무맙, 지랄리무맙 및 졸리모맙 아리톡스를 포함한다.
백신으로서 미생물 항원
미생물 병원체 (예를 들어, 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충)으로부터 유도된 하나 이상의 항원을 발현하는 HUCPVC는 치료 대상에서 보호 또는 치료 목적의 면역 반응을 유도하기 위해 백신으로서 사용될 수 있다. 투여 시에, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 숙주 면역계에 의해 외래물질로서 인식되는 미생물 항원을 발현한다. 적응 면역 반응 (예를 들어, 숙주 항체 및 T 세포)의 활성화를 포함한, 항원에 대한 1차 면역 반응의 발생은 미생물 병원체를 사용한 감염 시에 강력하고 장기 지속하는 2차 반응을 생성시킨다. 백신에서 세균, 바이러스, 진균 및 기생충 폴리펩티드의 사용, 및 본 발명의 방법에 따른 HUCPVC 내의 발현을 위해 적합한 이들 미생물로부터 유도된 면역원성 항원의 백신은 당업계에 공지되어 있다.
시토킨 및 성장 인자
본 발명은 유전적으로 변형된 HUCPVC에 의한 시토킨 및 성장 인자의 발현을 제공한다. 많은 시토킨은 면역조절 특징을 갖고, 면역 반응을 증대시키거나 면역병리학적 반응을 둔화시키기 위해 사용될 수 있다. HUCPVC에서 발현될 수 있는 시토킨 및 성장 인자의 예는 종양 괴사 인자 (TNF), 예를 들어 TNF-α; 인터페론 (예를 들어, 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ), 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-β 및 인터류킨 2-14), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 케모킨 (예를 들어, RANTES 및 MIP-1α), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β) 수퍼패밀리의 구성원, 혈소판 유래 성장 인자 (PGDF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 표피 성장 인자 (EGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 에리트로포이에틴 (EPO), 및 트롬보포이에틴 (TPO)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
호르몬
본 발명은 유전적으로 변형된 HUCPVC에 의한 호르몬의 발현을 제공한다. HUCPVC에서 발현될 수 있는 호르몬의 예는 안지오텐시노겐, 안지오텐신, 부갑상선 호르몬 (PTH), 염기성 섬유모세포 성장 인자-2, 황체형성 호르몬, 난포 자극 호르몬, 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 바소프레신, 옥시토신, 소마토스타틴, 가스트린, 콜레시스토키닌, 렙틴, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 에피네프린, 노르에피네프린, 도파민, 칼시토닌 및 인슐린을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
혈액 응고 인자
본 발명은 유전적으로 변형된 HUCPVC에 의한 혈액 응고 인자의 발현을 제공한다. HUCPVC에서 발현될 수 있는 응고 인자의 예는 인자 VII, VIII 및 IX, 및 피브리노겐을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
효소
HUCPVC에서 발현될 수 있는 효소의 예는 부티릴콜린에스테라제 (BChE), 아데노신 데아미나제, 글루코세레브로시다제, 알파-1 항트립신, "자살 (suicide)" 폴리펩티드 (예를 들어, 바이러스 티미딘 키나제 (TK), 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 또는 수두 대상 포진 바이러스로부터 유도된 TK), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제, 항산화제 (예를 들어, 망간 수퍼옥시드 디스뮤타제 (Mn-SOD), 카탈라제, 구리-아연-수퍼옥시드 디스뮤타제 (CuZn-SOD), 세포외 수퍼옥시드 디스뮤타제 (EC-SOD) 및 글루타티온 리덕타제), 페닐알라닌 히드록실라제, 산화질소 합성효소 및 파라옥시나제를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
면역조절 인자
HUCPVC에서 발현될 수 있는 면역조절 인자의 예는 CTLA-4, VCP, PLIF, LSF-1, Nip, CD200, 유로모둘린, CD40L (CD154), FasL, CD27L, CD30L, 4-IBBL, CD28, CD25, B7.1, B7.2 및 OX40L을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
수용체 및 리간드
HUCPVC에서 발현될 수 있는 수용체 및 리간드의 예는 T-세포 수용체 (TCR), LDL 수용체, 표면-결합 면역글로불린, 가용형 CD4, 낭성 섬유증 막횡단 전도도 수용체 (CFTR) 및 Fc 수용체를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
검출가능한 표지
그를 필요로 하는 포유동물 (예를 들어, 인간)에 대한 이들 세포의 임상 적용을 돕기 위해 HUCPVC에서 검출가능한 표지가 발현될 수 있다. 임상의는 예를 들어 혈액 또는 조직 샘플을 단리하고, 검출가능한 표지의 존재에 대해 분석함으로써, 환자에게 투여된 표지된 HUCPVC의 양 및 수명을 결정할 수 있다. 검출가능한 표지는 형광 분자, 예를 들어 초록 형광 단백질 (GFP)을 포함한다.
대사물 및 다른 세포 인자
HUCPVC에서 발현될 수 있는 대사물 및 다른 인자의 예는 시토크롬 b, 콜레스테롤 운반 또는 대사 폴리펩티드 (예를 들어, ApoE, ApoC, ApoAI), 약물 내성 또는 항-바이러스 내성 폴리펩티드 (예를 들어, MDR, 리보자임, 안티센스 RNA, 항-바이러스 프로테아제), 항-독액제, 혈관형성 펩티드, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 뇨 플라스미노겐 활성인자 (예를 들어, 유로키나제), 히루딘, 혈관활성 펩티드, 글로빈 (예를 들어, β-글로빈, α-글로빈, HbA), 원발암유전자 (protooncogene) (예를 들어, ras, src 및 bcl), 및 분비 펩티드 (예를 들어, 안지오텐신 전환 효소, 혈관 평활근 칼슘 채널, 또는 아드레날린성 수용체의 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있는)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
RNA 간섭
HUCPVC는 환자 (예를 들어, 인간)에게 투여될 때 하나 이상의 RNA 간섭 (RNAi) 분자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. RNAi는 특이적 RNA 분자의 분해를 일으키거나 특이적 유전자의 전사를 방해함으로써 유전자 발현을 억제하는 기전이다. RNAi 기전에 대한 핵심은 작은 간섭 RNA 가닥 (siRNA)이고, 이는 표적화된 메신저 RNA (mRNA) 분자에 대한 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는다. siRNA는 유전자 발현을 서열-특이적 방식으로 억제하거나 하향-조절할 수 있는 짧은 단일 가닥 핵산 분자이다 (예를 들어, 문헌 ([Zamore et al., Cell 101:25 33 (2000)]; [Bass, Nature 411:428-429 (2001)]; [Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001)]; 및 국제 PCT 공개 WO 00/44895 (Kreutzer et al.); 국제 PCT 공개 WO 01/36646 (Zernicka-Goetz et al.); 국제 PCT 공개 WO 99/32619 (Fire); 국제 PCT 공개 WO 00/01846 (Plaetinck et al.); 국제 PCT 공개 WO 01/29058 (Mello and Fire); 국제 PCT 공개 WO 99/07409 (Deschamps-Depaillette); 및 국제 PCT 공개 WO 00/44914 (Li et al.)를 참조한다. 유전자 침묵 (silencing)에서 사용하기 위한 siRNA 분자의 제조 방법은 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 7,078,196에 설명되어 있다.
본 발명에서 RNAi 기술 (예를 들어, siRNA 분자)의 적용은 몇몇 방식으로 일어날 수 있고, 각각은 HUCPVC 집단 내에서 유전자 생성물의 기능적 침묵을 일으킨다. 하나 이상의 내인성 HUCPVC 유전자 생성물의 기능적 침묵은 생체 내에서 HUCPVC 수명을 증가시키거나 (예를 들어, 하나 이상의 전-세포자멸 유전자 생성물을 침묵시킴으로써), 또는 치료 목적의 폴리펩티드 (예를 들어, 항체, 시토킨 또는 호르몬)의 발현을 증가시킬 수 있다.
RNAi 물질 (예를 들어, siRNA 분자)에 의한 기능적 유전자 침묵은 반드시 표적화된 유전자 생성물의 완전한 억제를 포함하는 것은 아니다. 몇몇 경우에, RNAi 물질에 의해 유발된 유전자 생성물 발현의 근소한 감소는 숙주 세포, 조직, 장기 또는 동물에서 유의한 기능적 또는 표현형 변화로 번역될 수 있다. 따라서, 유전자 침묵은 기능적 동등물임이 이해되고, 침묵을 달성하기 위한 유전자 생성물 분해 정도는 유전자 표적 또는 숙주 세포 종류 사이에서 상이할 수 있다. 유전자 침묵은 유전자 생성물 발현을 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 감소시킬 수 있다. 우선적으로, 유전자 생성물 발현은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% (즉, 완전한 억제) 감소된다.
HUCPVC 의 유전자 변형
HUCPVC 내에서 비-내인성 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드의 재조합 발현은 몇몇 상이한 표준 유전자 전달 양식을 이용함으로써 달성할 수 있다. 이들 양식, 그들의 잇점 및 제약을 아래에 추가로 논의한다. HUCPVC를 유전적으로 변형시키는 예시적인 방법은 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 2007/128115에 또한 논의되어 있다.
형질도입 (바이러스 벡터)
형질도입은 표적 세포의 유전자 변형을 허용하는 바이러스에 의한 표적 세포 (예를 들어, HUCPVC)의 감염이다. 많은 바이러스가 포유동물 세포에 결합하여 감염시키고, 그들의 유전 물질을 그들의 복제 사이클의 일부로서 숙주 세포 내로 도입시킨다. 일부 종류의 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스)는 그들의 바이러스 게놈을 숙주 게놈 내로 통합시킨다. 이것은 그 바이러스의 유전자를 숙주 세포의 수명 동안 숙주 세포의 유전자 사이에 포함시킨다. 유전자 전달을 위해 변형된 바이러스에서, 공여 유전자 (예를 들어, 인간화 모노클로날 항체)가 바이러스 게놈 내로 삽입된다. 감염성 또는 친화성 (tropism) (예를 들어, 가성형태화 (pseudotyping))을 개선하고, 복제 역량을 감소 또는 제거하고, 면역원성을 감소시키기 위해 바이러스에 추가의 변형이 이루어진다. 새로 도입된 포유동물 유전자는 감염된 숙주 세포 또는 유기체 내에서 발현될 것이고, 결함성 숙주 유전자를 교체하면 결함 유전자에 의해 유발된 병태 또는 질병을 개선시킬 수 있다. 아데노바이러스 및 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함)가 이들 바이러스를 유전적으로 변형시키고 그의 생활 사이클을 이용하는 능력 때문에 아래 논의된 바와 같이 유전자 요법 용도를 위해 특히 매력적인 양식이다.
아데노바이러스
재조합 아데노바이러스 벡터는 HUCPVC 내에서 폴리펩티드 (예를 들어, 항체, 시토킨, 또는 응고 인자) 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)의 발현을 위해 몇몇 유의한 잇점을 제공한다. 바이러스는 극히 고역가에서 제조되고, 비-복제 세포를 감염시키고, 유도된 주사 또는 관류 후에 생체 내에서 표적 세포의 고효율 및 고수준 형질도입을 부여할 수 있다. 또한, 아데노바이러스는 그들의 DNA를 숙주 게놈 내로 통합시키지 않으므로, 상기 유전자 요법 양식은 자발적인 증식성 질환을 유도하는 위험이 감소된다. 동물 모델에서, 아데노바이러스 유전자 전달은 일반적으로 약 1주 동안 고수준 발현을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 트랜스젠 (transgene) 발현의 지속기간이 연장될 수 있고, 조직-특이적 프로모터를 사용함으로써 이소성 발현이 감소될 수 있다. 아데노바이러스 벡터 자체의 분자 공학처리에서 다른 개선이 보다 지속된 트랜스젠 발현 및 더 적은 염증을 일으킨다. 이는 소위 추가의 초기 아데노바이러스 유전자 내에 특이적 돌연변이를 보유하는 "제2 세대" 벡터 및 cre-lox 전략을 활용하는 실질적으로 모든 바이러스 유전자가 삭제되는 "무기력 (gutless)" 벡터에서 보인다 ([Engelhardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6196-6200 (1994)] 및 [Kochanek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5731-5736 (1996)]). 또한, 비-병원성 파르보바이러스로부터 유도된 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)가 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있고, 이는 이들 벡터가 세포 면역 반응을 거의 유발시키지 않고, 대부분의 시스템 내에서 수 개월 지속하는 트랜스젠 발현을 생성하기 때문이다. 조직-특이적 프로모터의 포함도 유익하다.
레트로바이러스
대상 또는 세포 내로 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드의 전달에 유용한 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스를 포함한 레트로바이러스이다. 아데노바이러스와 달리, 레트로바이러스 내의 유전 물질은 RNA 분자 형태인 한편, 그의 숙주의 유전 물질은 DNA 형태이다. 레트로바이러스가 숙주 세포를 감염시킬 때 그의 RNA를 일부 효소와 함께 세포 내로 도입시킬 것이다. 레트로바이러스로부터 상기 RNA 분자는 그의 RNA 분자로부터 역전사로 불리는 과정을 통해 이중 가닥 DNA 카피 (프로바이러스)를 생산할 것이다. 세포 핵 내로 수송 후에, 프로바이러스 DNA는 숙주 염색체 내에 통합되어, 감염된 세포 및 발생할 수 있는 임의의 자손 세포의 게놈을 영구적으로 변경시킨다. 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 유전자를 HUCPVC와 같은 세포 내로 영구적으로 도입시키는 능력은 유전자 요법을 위해 사용되는 레트로바이러스의 정의하는 특징이다. 레트로바이러스는 바이러스 감염 및 프로바이러스 통합을 촉진시키기 위해 몇몇 보조 단백질을 포함하는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)를 포함한 바이러스의 패밀리인 렌티바이러스를 포함한다.
유전자 요법에 레트로바이러스를 사용하는데 있어서 한 가지 문제는 인테그라제 효소가 바이러스의 유전 물질을 숙주의 게놈 내의 임의의 자의적인 위치에 삽입할 수 있다는 점이다. 유전 물질이 숙주 세포의 원래의 유전자 중 하나의 중간에 우연히 삽입되면, 상기 유전자는 파괴될 것이다 (예를 들어, 삽입 돌연변이 유발). 유전자가 우연히 하나의 조절성 세포 분열이 되면, 비제어된 세포 분열 (예를 들어, 암)이 일어날 수 있다. 상기 문제는 아연 핑거 (zinc finger) 뉴클레아제를 사용함으로써 또는 통합의 부위를 특이적 염색체 부위로 유도하기 위해 베타-글로빈 로커스 제어 구역과 같은 특정 서열을 포함함으로써 최근에 처리되기 시작하였다. 상기 고려사항에도 불구하고, 레트로바이러스 및 렌티바이러스는 유전자 요법 용도에 상당한 효용성이 있다. 현재, "3세대" 렌티바이러스 벡터는 총 복제 불능, 넓은 친화성, 및 포유동물 세포에 대한 증가된 유전자 전달 능력을 특징으로 한다 ([Mangeat, B. and Trono, D., "Lentiviral vectors and antiretroviral intrinsic immunity," Human Gene Therapy 16(8):913-920 (2005)] 및 [Wiznerowicz, M. and Trono, D., "Harnessing HIV for thearpy, basic research and biotechnology," Trends Biotechnol. 23(1):42-7 (2005)] 참조). 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 또는 고양이 내인성 바이러스 RD114 외피 당단백질로 가성형태화된 렌티바이러스가 HUCPVC를 형질도입시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 [Zhang et al., "Transduction of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells by using lentivirus vectors pseudotyped with modified RD114 envelope glycoproteins," J. Virol. 78(3):1219-1229 (2004)] 참조). 미국 특허 5,919,458, 5,994,136 및 7,198,950에서는 표적 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 렌티바이러스의 생산 및 사용을 설명하고 있다.
다른 바이러스 벡터
아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터 이외에, 요구되는 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 DNA 벡터 (예를 들어, 플라스미드)를 대상 또는 세포 내로 전달하기 위해 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 이들은 예를 들어 문헌 [Wattanapitayakul and Bauer (Biomed. Pharmacother 54:487-504 (2000)] 및 이 문헌에서 인용된 문헌에 기재된 것을 포함한다.
형질감염
네이키드 ( naked ) DNA 및 올리고뉴클레오티드
폴리펩티드 (예를 들어, 항체, 시토킨 또는 호르몬)를 코딩하는 네이키드 DNA 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 벡터, 예를 들어 플라스미드), 또는 RNA 간섭 분자 (예를 들어, siRNA 또는 shRNA)가 또한 HUCPVC를 유전적으로 변형하기 위해 사용될 수 있다. 이는 비-바이러스 형질감염의 가장 간단한 방법이다. 네이키드 DNA 플라스미드의 근육내 주사를 사용하여 수행된 임상 시험은 일부 성공하였지만; 발현은 다른 형질감염 방법에 비해 낮았다. 네이키드 DNA의 전달을 위한 다른 효율적인 방법에는 전기천공, 및 고압 기체를 이용하여 DNA-코팅된 금 입자를 세포 내로 쏘는 "유전자 총 (gun)"의 사용이 있다.
리포플렉스 ( lipoplex ) 및 폴리플렉스 ( polyplex )
HUCPVC 내로 DNA 벡터 (예를 들어, 플라스미드)의 전달을 개선하기 위해, DNA는 손상으로부터 보호될 수 있고, 세포 내로 그의 도입은 촉진될 수 있다. 리포플렉스 및 폴리플렉스는 형질감염 과정 동안 전달 DNA를 바람직하지 않은 분해로부터 보호하는 능력이 있다. 플라스미드 DNA는 미셀 (micelle) 또는 리포좀과 같은 유기화된 구조로 지질로 덮일 수 있다. 유기화된 구조가 DNA와 복합화되면 리포플렉스로 불린다. 3가지 종류의 지질이 존재한다: 음이온성 (음대전된), 중성, 또는 양이온성 (양대전된). 양이온성 지질을 이용하는 리포플렉스는 유전자 전달에 대한 효용성이 입증되었다. 양이온성 지질은 그들의 양전하로 인해 음대전된 DNA와 자연적으로 복합화된다. 또한, 그들의 전하로 인해 이들은 세포막과 상호작용하여, 리포플렉스의 세포내이입이 일어나고, DNA가 세포질 내로 방출된다. 양이온성 지질은 또한 세포에 의한 DNA 분해에 대해 보호한다.
중합체와 DNA의 복합체는 폴리플렉스로 불린다. 대부분의 폴리플렉스는 양이온성 중합체로 구성되고, 그들의 생산은 이온성 상호작용에 의해 조절된다. 폴리플렉스 및 리포플렉스의 작용 방법 사이의 하나의 큰 차이는 폴리플렉스는 그들의 DNA 로드를 세포질 내로 방출할 수 없다는 점이고, 따라서, 이를 위해, 불활성화된 아데노바이러스와 같은 엔도좀-용해제 (세포내이입 동안 만들어지는 엔도좀을 용해시키기 위해)와의 동시-형질감염이 일어나야 한다. 그러나, 이는 항상 그러한 것은 아니고; 폴리에틸렌이민과 같은 중합체는 키토산 및 트리메틸키토산과 같이 그 자체의 엔도좀 파괴 방법을 갖는다.
하이브리드 방법
모든 유전자 전달 방법이 단점을 갖기 때문에, 2가지 이상의 기술을 조합한 일부 하이브리드 방법이 개발되었다. 예를 들어, 비로좀 (virosome)은 리포좀을 불활성화된 바이러스와 조합시킨다. 상기 방법은 바이러스 또는 리포좀 방법 단독에 비해 호흡 상피 세포에서 더 효율적인 유전자 전달을 일으키는 것으로 나타났다. 다른 방법은 다른 바이러스 벡터를 양이온성 지질과 혼합하거나, 바이러스를 혼성화시키는 것을 포함한다. 이들 각각의 방법이 HUCPVC 내로 DNA 벡터 (예를 들어, 플라스미드)의 전달을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.
덴드리머 ( dendrimer )
HUCPVC를 유전적으로 변형하기 위해 덴드리머가 또한 사용될 수 있다. 덴드리머는 구형 형상의 고도로 분지된 거대분자이다. 입자의 표면은 많은 방식으로 기능화될 수 있고, 생성되는 구성체의 특성 중 많은 것은 그의 표면에 의해 결정된다. 특히, 양이온성 덴드리머 (즉, 표면 양전하를 갖는 덴드리머)를 제작하는 것이 가능하다. DNA 플라스미드와 같은 유전 물질의 존재 하에, 전하 상보성이 핵산과 양이온성 덴드리머의 일시적인 회합을 일으킨다. 그의 목적지에 도달하면, 덴드리머-핵산 복합체는 이어서 세포내이입을 통해 HUCPVC 내로 흡수된다.
생물학적 및 화학적 물질
본 발명의 방법은 생물학적 또는 화학적 물질에 노출되었거나 노출 위험이 증가된 대상 (예를 들어, 인간, 예를 들어 군대 인력)에게 유전적으로 변형된 HUCPVC의 투여를 제공한다.
세균
본 발명의 방법은 대상 (예를 들어, 인간)에서 세균 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 인간 질병 또는 병을 유발하는 세균은 슈도모나스 애루기노사, 살모넬라 티피무륨, 에스체리키아 콜라이, 클렙시엘라 뉴모니애, 브루셀라, 부르콜더리아 말레이, 예르시니아 페스티스, 및 바실러스 안트라시스를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
바이러스
본 발명의 방법은 대상 (예를 들어, 인간)에서 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 인간 질병 또는 병을 유발하는 바이러스는 플라비바이러스 (예를 들어, 가제츠 걸리 바이러스, 카담 바이러스, 키아사누르 삼림병 바이러스, 랑가트 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 포와산 바이러스, 로얄 팜 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 도약병 바이러스, 미반 바이러스, 사우마레즈 리프 바이러스, 튤레니이 바이러스, 아로아 바이러스, 뎅기 바이러스, 케도우고우 바이러스, 카시파코어 바이러스, 코우탕고 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 야오운데 바이러스, 코코베라 바이러스, 바가자 바이러스, 일레우스 바이러스, 이스라엘 칠면조 뇌수막척수염 바이러스, 느타야 바이러스, 템부수 바이러스, 지카 바이러스, 반지 바이러스, 보도우이 바이러스, 엣지 힐 바이러스, 쥬그라 바이러스, 사보야 바이러스, 세픽 바이러스, 우간다 S 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 황열병 바이러스, 엔테베 박쥐 바이러스, 요코세 바이러스, 아포이 바이러스, 카우본 릿지 바이러스, 주티아파 바이러스, 모독 바이러스, 살 비에자 바이러스, 산 페를리타 바이러스, 부칼라사 박쥐 바이러스, 카레이 아일랜드 바이러스, 다카르 박쥐 바이러스, 몬타나 수염박쥐 백질뇌염 바이러스, 프놈펜 박쥐 바이러스, 및 리오 브라보 바이러스), 토가바이러스 (Togavirus) (예를 들어, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEE), 및 서부 말 뇌염 바이러스 (WEE)), 필로바이러스 (Filovirus) (예를 들어, 에볼라 바이러스 (예를 들어, 아이보리 코스트 (Ivory Coast), 레스톤 (Reston), 수단, 우간다, 및 자이레 균주), 마르부르그 바이러스 (예를 들어, 앙골라 (Angola), Ci67, 무소케 (Musoke), 포프 (Popp), 및 라븐 (Ravn) 균주)), 폭스바이러스 (Poxvirus) (예를 들어, 천연두 바이러스, 우두 바이러스), 아레나바이러스 (Arenavirus) (예를 들어, 라사 바이러스 (예를 들어, 죠시아 (Josiah), LP, 및 GA391 균주), 이피 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 모발라 바이러스, 모페이아 바이러스, 아마파리 바이러스, 플렉살 바이러스, 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라티노 바이러스, 마추포 바이러스, 올리베로스 바이러스, 파라나 바이러스, 피친데 바이러스, 피리탈 바이러스, 사비아 바이러스, 타카리베 바이러스, 타미아미 바이러스 및 화이트워터 아로요 바이러스), 분야바이러스 (Bunyavirus) (예를 들어, 신 놈브레 바이러스, 한탄 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 크리미언-콩고 출혈열 바이러스 및 나이로바이러스 (예를 들어, 두그베 바이러스)), 헤르페스바이러스 (Herpesvirus) (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 및 카포시 육종 연관-헤르페스바이러스 (KSHV)), 오르토믹소바이러스 (Orthomyxovirus) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 인플루엔자바이러스 A (예를 들어, H5N1 조류 인플루엔자), B 및 C), 코로나바이러스 (Coronavirus) (예를 들어, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 바이러스), 및 랍도바이러스 (Rhabdovirus) (예를 들어, 광견병 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스 (VSV))를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
진균
본 발명의 방법은 대상 (예를 들어, 인간)에서 진균 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 인간 질병 또는 병을 유발하는 진균은 아스페길러스, 블라스토마이세스 더마티티디스, 칸디다, 콕시디오이데스 이미티스, 크립토코커스 네오포르만스, 히스토플라스마 캅술라툼 변종 캅술라툼, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스, 스포로트릭스 스켄키이, 및 자이고마이세테스 (예를 들어, 압시디아 코림비페라, 리조무코르 푸실러스 및 리조푸스 아리주스)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
기생충
본 발명의 방법은 대상 (예를 들어, 인간)에서 기생충 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 인간 질병 또는 병을 유발하는 기생충은 톡소플라스마 곤디이, 플라스모듐 (팔시파룸, 비박스, 오발레, 및 말라리아에), 트리파노소마 종 및 레지오넬라 종을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
화학적 물질 (독소)
본 발명의 방법은 화학적 물질 (예를 들어, 독소, 화학적 무기, 또는 수포제)에 대한 포유동물 (예를 들어, 인간)의 노출에 의해 유발된 질병, 증상, 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 포유동물 질병 또는 병을 유발하는 화학적 물질은 리신, 디프테리아 독소, 에스체리키아 콜라이 장독소, 비브리오 콜레라에 장독소, 포도구균 장독소, 연쇄구균 장독소, 보툴리눔 독소, 삭시톡신, 질소 머스타드 (예를 들어, 비스(2-클로로에틸)에틸아민), 루위사이트 (예를 들어, 2-클로로비닐디클로로아르신), 황 머스타드 (예를 들어, 2-클로로에틸클로로메틸술피드 및 비스(2-클로로에틸)술피드), 사린 (GB; O-이소프로필 메틸포스포노플루오리데이트), 시클로사린 (GF), 소만 (GD; O-피나콜릴 메틸포스포노플루오리데이트), 타분 (GA; O-에틸, n,n-디메틸포스포르아미도시아니데이트), VX (O-에틸 S-2-디이소프로필아미노에틸 메틸포스포노티올레이트), 아미톤, PFIB, 3-퀴누클리디닐 벤질레이트, 포스겐, 디포스겐, 염화시안, 시안화수소, 클로로피크린, 및 아세틸콜린에스테라제 억제제 (예를 들어, 노비초크 (Novichok) 물질)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 유전적으로 변형된 HUCPVC 를 사용하여 치료될 수 있는 대상
생물학적 또는 화학적 물질, 예를 들어 병원체 또는 독소를 사용한 공격을 치료, 억제, 감소 또는 예방하기 위해 본 발명의 방법에 따른 유전적으로 변형된 HUCPVC의 투여가 유익할 수 있는 대상. 이들 대상은 예를 들어, 척추동물, 예를 들어 새 (예를 들어, 가금류, 예를 들어 닭, 칠면조, 거위, 오리, 뇌조, 고니, 공작, 산비둘기, 비둘기, 및 꿩), 파충류 (예를 들어, 뱀 및 도마뱀), 양서류 (예를 들어, 개구리 및 도롱뇽), 포유동물 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 원숭이, 침팬지, 유인원), 유제류 (예를 들어, 말, 소, 염소, 돼지, 양, 당나귀, 및 사슴), 개 및 고양이를 포함한다.
투약 및 투여
본 발명은 치료 유효량으로 하나 이상의 폴리펩티드 (예를 들어, 항체, 시토킨, 또는 호르몬) 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)를 발현하는 유전적으로 변형된 HUCPVC를 제공한다. 유전적으로 변형된 HUCPVC는 예방 또는 치료 목적의 처치를 위해 비경구 (예를 들어, 근육내, 피하, 및 정맥내), 코 안, 외용, 경구, 또는 경피 수단에 의한 것과 같은 국소 투여를 위해 의도된다. 일반적으로, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 비경구로 (예를 들어, 정맥내, 근육내, 또는 피하 주사에 의해) 또는 병태가 침범된 영역에서 관절내 주사로 투여된다. 추가의 투여 경로는 혈관내, 동맥내, 복강내, 뇌실내, 경막내, 및 코, 눈, 공막내, 눈 안, 직장, 외용 또는 에어로졸 흡입 투여를 포함한다.
유전적으로 변형된 HUCPVC는 예방 또는 치료 목적의 처치를 위해 투여될 수 있다. 예방 용도에서, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 병원체 또는 화학적 물질 (예를 들어, 화학적 물질)의 공격에 대한 임상학상 결정된 소인 또는 증가된 감수성이 있는 대상 (예를 들어, 인간)에게 투여된다. 예를 들어, 부티릴콜린에스테라제 (BChE)를 발현하도록 유전적으로 변형된 HUCPVC는 유전적으로 변형된 HUCPVC 내에서 발현되는 BChE 폴리펩티드가 몇몇 화학적 물질을 대사할 수 있기 때문에 화학적 물질의 공격을 치료 또는 예방하기 위해 BChE 유전자에 대해 동종접합 열성인 대상 (예를 들어, 군인)에게 투여될 수 있다.
유전적으로 변형된 HUCPVC는 미생물 병원체 또는 화학적 물질의 공격에 의한 임상 질병을 지연 또는 감소시키거나, 바람직하게는 그의 발병을 예방하기 위해 충분한 양으로 대상 (예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 치료 용도에서, 유전적으로 변형된 HUCPVC는 이미 미생물 병원체에 의한 감염 또는 화학적 물질에의 노출로 고통받는 대상 (예를 들어, 군인)에게 이들 물질의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기 위해 충분한 양으로 투여된다. 상기 목적을 달성하기 위해 적당한 HUCPVC의 수를 "치료 유효 용량"으로 규정한다. 상기 용도를 위해 효과적인 양은 질병 또는 병태의 중증도와 환자의 체중 및 일반적인 상태에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 단일 또는 다수 용량으로 대상에게 투여된 유전적으로 변형된 HUCPVC의 총수는 예를 들어, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109개 이상의 세포일 수 있지만, 효과적인 용량은 아마도 용량당 103 내지 107개의 세포 범위일 것이다. 바람직하게는, 유전적으로 변형된 HUCPVC를 그를 필요로 하는 대상에게 단일 용량으로 투여한다. 유전적으로 변형된 HUCPVC는 초기 용량에 이어서, 1회 이상의 매시간, 매일, 매주, 매월 또는 격월 간격의 추가용량 투여로서 또한 적용될 수 있다. 유전적으로 변형된 HUCPVC의 총 유효량은 볼러스로서 또는 비교적 짧은 기간에 걸친 주입에 의한 단일 용량으로서 대상에게 투여될 수 있거나, 분획화된 치료 프로토콜을 이용하여 투여될 수 있고, 여기서 다수 용량은 보다 연장된 기간에 걸쳐 투여된다 (예를 들어, 4-6, 8-12, 14-16, 또는 18-24시간마다, 또는 2-4일, 1-2주마다, 매월 1회, 또는 2개월마다 1회). 별법으로, 혈액 내에 치료 유효 농도를 유지하기 위해 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
본 발명의 방법에 따라 대상 (예를 들어, 인간)에게 투여될 유전적으로 변형된 HUCPVC의 치료 유효량은 숙련된 당업자가 결정할 수 있다. 고려할 수 있는 인자는 예를 들어, 대상의 연령, 체중, 상태의 개별적인 차이 (예를 들어, 대상이 노출된 또는 노출될 수 있는 물질의 종류, 대상에 대한 생물학적 또는 화학적 물질 (예를 들어, 병원성 감염 또는 독소)의 효과의 중증도), 및 생물학적 또는 화학적 물질에 대한 노출 수준을 포함한다. 생물학적 또는 화학적 물질에 대한 노출은 잘 특성화된 생리학적 마커를 사용하여 결정할 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 [Black and Nort, "Biological Markers of Exposure to Chemical Warfare Agents" in Chemical Warfare Agents, Second Edition (Second Edition), John Wiley & Sons, Ltd., 2007] 참조).
본 발명은 대상 (예를 들어, 인간)에게 제2의 유전적으로 변형된 HUCPVC 집단의 동시-투여를 제공하고, 여기서 제2 HUCPVC 집단은 예방 또는 치료 용도를 위한 하나 이상의 상이한 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 발현한다. 별법으로, HUCPVC가 아닌 하나 이상의 중간엽 줄기 세포 (MSC)가 투여될 수 있다. 상기한 경우에, MSC는 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 그러나, HUCPVC 또는 MSC 집단을 동시에 또는 동일한 방식으로 투여하는 것이 항상 필요한 것은 아니다. 일부 경우에, 제2 집단의 투여는 제1 집단에 대한 투여 기간의 완료 직후에 시작할 수 있거나 반대일 수 있다. 2개의 투여 기간 사이의 그러한 시간 간격은 1일 내지 1주, 1개월 이상 범위일 수 있다. 몇몇 경우에, 2종의 유전적으로 변형된 HUCPVC 집단은 초기에 동시투여되고, 후속적으로 다음 기간에 개별적으로 투여될 수 있다 (예를 들어, 특정 바이러스 혈청형 또는 균주에 대해 보호성인 단일 모노클로날 항체를 개별적으로 발현하는 2종 이상의 HUCPVC 집단의 투여). 추가로, HUCPVC 집단은 예방 또는 치료 용도를 위해 1종 초과의 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 발현하도록 변형될 수 있어서, 다수 투여에 대한 필요를 제거한다.
유효량을 포함하는 본 발명의 조성물의 단일 또는 다수 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20회 이상) 투여는 용량 수준 및 패턴을 치료하는 임상의 (예를 들어, 의사 또는 수의사)에 의해 선택되면서 수행할 수 있다. 용량 및 투여 스케쥴은 감염성 미생물 또는 화학적 물질에의 노출의 중증도 또는 가능성에 기초하여 결정하고 조정할 수 있다. 또한, 유전적으로 변형된 HUCPVC를 투여한 대상 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간 (예를 들어, 군인))을 임상의에 의해 일반적으로 실시되는 방법 또는 본원에 기재된 것에 따라 치료 과정 내내 모니터링할 수 있다.
적합한 제형을 위해 하나 이상의 생리학상 허용되는 부형제 또는 담체가 또한 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 적합한 제형은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed., 1985]에서 발견된다. 약물 전달 방법에 대한 간단한 검토에 대해서는 문헌 [Langer, Science 249:1527-1533, 1990]을 참조한다.
추가의 치료 요법
본 발명은 유전적으로 변형된 HUCPVC와 조합으로 하나 이상의 치료제 (예를 들어, 항-미생물제, 예를 들어 항-바이러스 화합물)의 동시-투여를 제공한다. 예를 들어, 추가의 치료제는 상기 치료제에 대해 효과적인 것으로 공지된 농도로 본원에 기재된 유전적으로 변형된 HUCPVC와 함께 투여될 수 있다. 특히 유용한 치료제는 예를 들어 시토킨, 항바이러스제, 면역자극제, 면역억제제 및 면역화 백신을 포함한다.
일부 경우에, 유전적으로 변형된 HUCPVC 및 추가의 치료제는 적어도 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 10시간, 12시간, 18시간, 24시간, 3일, 7일, 14일 또는 1개월 간격으로 투여된다. 각각의 성분의 투여량 및 투여 빈도는 독립적으로 조절될 수 있다. 본원에 설명되는 추가의 치료제는 추가의 활성 또는 불활성 성분과 함께, 예를 들어 통상적인 제약상 허용되는 담체 내에서 혼합될 수 있다. 제약상 담체는 대상에게 본 발명의 조성물의 투여에 적합한 임의의 상용성 비-독성 물질일 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 예를 들어 물, 염수, 버퍼 및 예를 들어 문헌 [Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey]에 기재된 다른 화합물을 포함한다. 연속 투여를 위해 서방형 제형 또는 서방형 장치가 또한 사용될 수 있다. 추가의 치료 요법은 치료 대상의 생활 방식에 대한 변형을 포함한 다른 치료법을 포함할 수 있다.
시토킨
추가의 치료제로서 시토킨이 유전적으로 변형된 HUCPVC와 조합되어 사용될 수 있다. 예시적인 시토킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, G-CSF, IL-15, GM-CSF, OSM, LIF, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, TNF-α, TNF-β, LT-β, IL-8, MCP-1, MIP-α, MIP-β, RANTES, TGF-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA 및 MIF이다.
항바이러스제
추가의 치료제로서 항바이러스제가 유전적으로 변형된 HUCPVC와 조합되어 또는 별개의 투여로 사용될 수 있다. 예시적인 항바이러스제는 아바카비르, 아시클로비르, 아사이클로비르, 아데포비르, 아만타딘, 암프레나비르, 아르비돌, 아타자나비르, 아트리플라, 브리부딘, 시도포비르, 콤비비르, 다루나비르, 델라비르딘, 디다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르티드, 엔테카비르, 도입 억제제, 팜시클로비르, 고정 용량 조합물, 포미비르센, 포삼프레나비르, 포스카르넷, 포스포넷, 융합 억제제, 간시클로비르, 가르다실, 이바시타빈, 이무노비르, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비르, 이노신, 인테그라제 억제제, 인터페론 타입 III, 인터페론 타입 II, 인터페론 타입 I, 인터페론, 라미부딘, 로피나비르, 로비라이드, MK-0518, 마라비록, 모록시딘, 넬피나비르, 네비라핀, 넥사비르, 뉴클레오시드 유사체, 오셀타미비르, 펜시클로비르, 페라미비르, 플레코나릴, 포도필로톡신, 프로테아제 억제제, 역전사효소 억제제, 리바비린, 리만타딘, 리토나비르, 사퀴나비르, 스타부딘, 상승적 인핸서, 테노포비르, 테노포비르 디소프록실, 티프라나비르, 트리플루리딘, 트리지비르, 트로만타딘, 트루바다, 발라시클로비르, 발간시클로비르, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 잘시타빈, 자나미비르 및 지도부딘이다. 예시적인 항바이러스제는 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,093,550 및 6,894,033에 나열되어 있다.
면역자극제
제약 조성물의 면역원성은 본 발명의 조성물이 면역자극제 또는 어쥬번트 (adjuvant)와 동시-투여되는 경우에 유의하게 개선될 수 있다. 예시적인 면역자극제는 인산알루미늄, 수산화알루미늄, QS21, Quil A (및 그의 유도체 및 성분), 인산칼슘, 수산화칼슘, 수산화아연, 당지질 유사체, 아미노산의 옥토데실 에스테르, 무라밀 디펩티드, 폴리포스파젠, 지단백질, ISCOM 매트릭스, DC-Chol, DDA, 시토킨, 및 다른 어쥬번트 및 그의 유도체를 포함한다. 면역계의 세포를 자극 또는 동시 자극할 수 있는 다른 분자는 CD40L (CD154), FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, CD28, CD25, B7.1, B7.2, 및 OX40L을 포함한다.
면역억제제
예를 들어, 감염과 연관된 면역병상 (예를 들어, 뎅기 출혈열 증후군)을 예방하거나 독소에 대한 노출과 연관된 염증을 감소시키기 위해, 치료된 개체의 면역계를 억제하는 것이 바람직할 수 있다. 면역억제제는 투여된 HUCPVC의 숙주 거부를 감소시켜, 생체 내에서 이들 세포의 수명을 증가시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 예시적인 면역억제제는 아베티무스, 데포롤리무스, 에베롤리무스, 구스페리무스, 피메크롤리무스, 시롤리무스, 타크롤리무스, 템시롤리무스, 아나킨라, 아자티오프린, 시클로스포린, 레플루노미드, 메토트렉세이트, 미코페놀산 및 탈리도마이드를 포함한다. TNF 억제제 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골), 알렘투주맙, 아펠리모맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 아토롤리무맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베르틸리무맙, 세델리주맙, 클레놀릭시맙, 다클리주맙, 도를리모맙 아리톡스, 도를릭시주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 엘실리모맙, 에를리주맙, 파랄리모맙, 폰톨리주맙, 갈릭시맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 골리무맙, 고밀릭시맙, 이발리주맙, 이놀리모맙, 이필리무맙, 켈릭시맙, 레브릴리주맙, 레르델리무맙, 루밀릭시맙, 마슬리모맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 모롤리무맙, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 네렐리모맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오말리주맙, 오텔릭시주맙, 파스콜리주맙, 펙셀리주맙, 리툭수맙, 레슬리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 시플리주맙, 탈리주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 바팔릭시맙, 베팔리모맙, 비실리주맙, 자놀리무맙, 지랄리무맙 및 졸리모맙 아리톡스를 포함한, 면역억제를 일으키는 많은 모노클로날 항체가 또한 당업계에 공지되어 있다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 의미가 없다.
실시예 1: 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 ( VEEV ) E2 항원에 대한 인간화 모 노클로날 항체를 발현하는 HUCPVC .
생물학적 무기 물질로서 VEEV 의 역사
3가지 모든 말 뇌염 열인 베네수엘라 말 뇌염 (VEE), 서부 말 뇌염 (WEE), 및 동부 말 뇌염 (EEE)은 잠재적인 생물학적 무기 물질이다. 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV)가 그의 감염 능력 (사람을 감염시키기 위해 단지 10-100개의 비리온이 필요하다) 및 무력화제로서의 유효성으로 인해 무기로 사용하기 위해 특히 매력적인 물질이다. VEEV 감염은 거의 치명적이지 않지만, 인플루엔자와 유사한 중증 증상을 유발시키고, 따라서 진단하기 어려울 수 있다. 뇌염 열은 뇌의 염증 및 장기 부작용, 예를 들어 신경계 손상을 일으킨다. VEEV를 사용한 잠재적인 생물학적 공격은 에어로졸화 경로를 통할 것이지만, VEEV가 아르보바이러스 (arbovirus)이므로 모기가 가장 활성인 기간 동안 가장 효과적일 것이다. VEEV는 또한 안정한 액체 또는 건조된 형태로 유포될 수 있다.
미국의 무기화 VEEV는 그의 생물학적 무기 프로그램의 종료 전에 공격용 무능화제였다. 소련에서도 또한 VEEV를 무능화제로서 무기화하였다. 소련의 과학자들은 또한 VEEV 게놈을 천연두 바이러스 내로 스플라이싱하여 실험하였다. 결과는 현미경 하에 천연두를 닮았지만 그의 숙주에서 상이한 증상을 일으킨 재조합 천연두-VEE 키메라 바이러스였다. 1959년에, 소련 의료 인력이 VEEV를 담은 동결건조 바이알을 사고로 떨어뜨렸고, 20명의 실험실 직원이 감염되었다. 상기 실험실 사고 및 VEEV의 다른 자연 발생하는 돌발이 에어로졸화 VEEV의 감염성을 입증한다.
유전자 페이로드 ( Payload ): 인간화 항- E2 / VEEV 항체
인간 IgG1 중쇄 불변 구역 및 1A4A1의 단일쇄 단편 가변 항체를 코딩하는 재조합 유전자 융합체 (pRSmA116huFc)을 생산하였다 (Hu et al., "Humanization and mammalian expression of a murine monoclonal antibody against Venezuelan equine encephalitis virus," Vaccine 25:3210-3214 (2007)). 쥐 모노클로날 항체 1A4A1은 VEEV의 외피 당단백질 E2의 보존된 중화 에피토프를 인식하는 것으로 밝혀졌다 (Roehrig et al., "The neutralizing site on the E2 glycoprotein of Venezuelan equine encephalomyelitis (TC085) virus is composed of multiple conformationally stable epitopes," Virology 142:347-356 (1985)). 상기 유전자 융합체를 인간 세포에서 고수준 구성적 발현을 유도하기 위해 아데노-연관 바이러스 (AAV)의 전사 제어 하에 놓았다.
항- E2 VEEV 재조합체 항체 생산의 시험관 내 평가
HUCPVC를 배양하고 (예를 들어, [Ennis et al., (2008)] 참조), 모노클로날 항체 1A4A1을 발현시키기 위해 pAAV-RsmA116huFc로 형질도입시킨다. 추가의 실험 (예를 들어, ELISA)으로 유전적으로 변형된 HUCPVC가 생산할 수 있는 재조합 항체의 양을 확인하고, 상기 발현의 수명을 설명할 것이다. 추가로, 재조합 항체의 생물학적 활성, 및 VEEV 비리온을 중화시키는 그들의 능력을 확인하기 위해 결합 연구를 수행할 것이다.
생체내 항체 생산, 약동학 및 효능
생물학상 활성 항-VEEV 항체를 분비하는 것으로 밝혀진 안정한 HUCPVC 형질감염체를 i.v., i.m., 또는 피하 투여에 의해 마우스 내로 도입할 것이다. 골수 기질로부터의 생물학상 유사한 세포는 생체 내에서 이종성으로 사용될 때 거부되지 않으므로 면역적격 마우스를 사용할 것이고 (Plotnikov et al., "Xenografted adult human mesenchymal stem cells provide a platform for sustained biological pacemaker function in canine heart" Circulation 116:706-713 (2007)), 래트에서 HUCPVC를 사용한 예비 실험에서는 거부를 보이지 않는다 (공개되지 않은 데이타). 순차적인 혈청 샘플을 항-VEEV 항체의 양, 품질 및 수명에 대해 평가할 것이다.
병원체 공격 실험
처리된 마우스에서 일단 항-VEEV MAb의 치료 수준이 확인되면, 표준 방법을 이용하여 발현된 MAb의 보호 효과를 측정하기 위해 마우스에게 코 안 VEEV 공격으로 시험접종할 것이다.
실시예 2: 보호 면역 반응을 자극하기 위해 에볼라 바이러스 당단백질 ( GP )를 발현하는 HUCPVC .
유전자 페이로드 : 에볼라 바이러스 ( 자이레 균주)의 당단백질
자이레 에볼라바이러스 균주 메잉가 (Mayinga) (ZEBOV)의 당단백질 (GP)을 발현하는 rVSV 벡터를 생성한다 (예를 들어 [Garbutt et al., J Virol. 78: 5458-65, 2004] 및 [Jones et al., Nat Med 11: 786-90, 2005] 참조). 구체적으로, 박테리오파지 T7 프로모터 서열이 측면에 접하는 5개의 VSV 유전자 (핵단백질 (N), 포스포단백질 (P), 매트릭스 단백질 (M), 당단백질 (G), 및 중합효소 (L)), VSV 리더 서열, 간염 바이러스 델타 바이러스 리보자임 서열, 및 T7 종결인자 서열을 함유하는 플라스미드를 사용한다. G 및 L 유전자 사이에, 독특한 링커 부위 (Xho-NheI)이 존재하고, 발현시킬 에볼라 바이러스 당단백질에 대한 전사 개시 및 중지 신호가 측면에 접한다. 배양된 HUCPVC를 pVSV/에볼라 GP 벡터로 다양한 감염 다중도에서 형질도입시킨다.
당단백질 생산 및 항원성의 시험관내 평가
형질도입된 HUCPVC를 표준 면역블로팅 분석, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 (Western blot), 도트 (dot) 블롯, 또는 면역침전을 이용하여 에볼라 GP 발현에 대해 시험한다.
혼합 림프구 반응, 림프증식 분석, 및 세포독성 분석 (예를 들어, 크롬 방출 또는 IFN-감마 ELISPOT)을 이용하여, 배양액 내에서 림프구를 자극하기 위해 사용될 때 발현된 에볼라 GP의 항원성을 결정하였다.
생체내 당단백질 생산, 약동학 및 효능
GP 발현 및 항원성의 시험관내 확인 시에, 항-GP 면역성을 준비시키기 위해 배양된 HUCPVC를 마우스에게 정맥내로 및 복강내로 투여한다. 면역화 후 1주 간격에서, 마우스를 희생시키고, 비장 및 림프절 (예를 들어, 액와, 서혜, 및 상완)을 수거한다. 상기 설명된 바와 같은 림프증식 및 세포독성 분석을 이용하여, 적응적 항-GP 면역 반응 (예를 들어, T 세포 및 중화 항체)의 폭 및 효능을 결정한다.
실시예 3: 많은 상이한 바이러스에 대한 광범위 보호를 제공하기 위해 인터페론을 발현하는 HUCPVC .
환자 (예를 들어, 군인)에게 투여되는 HUCPVC 내의 인터페론의 재조합 발현은 많은 상이한 바이러스 (예를 들어, 출혈열 바이러스)에 대해 광범위 보호를 제공할 수 있다. 유전적으로 변형된 HUCPVC에 의해 생산된 인터페론 (IFN)은 병원성 바이러스에 노출되거나 감염된 환자에 의해 예방 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다. 치료제로서 투여될 때, IFN은 짧은 생체내 반감기를 보인다. 1종 이상의 IFN (예를 들어, IFN-알파)을 발현하도록 유전적으로 변형된 HUCPVC의 투여는 IFN의 방출 및 전달을 연장시킴으로써 상기 단점을 극복한다. IFN의 표준 임상 투여는 IFN의 빠른 붕괴 운동학 때문에 빈번한 주사 또는 변형 (예를 들어, peg화)를 필요로 한다. 본 실시예에서, 상기 문제는 유전적으로 변형된 HUCPVC를 이용하여 IFN-알파를 제공함으로써 극복된다.
유전자 페이로드 : 인터페론 알파 ( IFN -α)
HUCPVC를 인터페론-알파를 발현하는 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스)로 형질도입시킨다. HUCPVC 염색체 내로 프로바이러스 DNA의 통합 시에, IFN-α의 발현 및 분비를 유도하기 위해 구성적 활성인 프로모터 (예를 들어, CMV 프로모터)를 사용한다.
IFN -α 생산의 시험관내 평가
형질도입된 HUCPVC를 표준 면역블로팅 분석, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, 도트 블롯, 또는 면역침전을 이용하여 IFN-α 발현에 대해 시험한다. IFN-α 활성을 문헌 [Foser et ai, "Improved biological and transcriptional activity of monopegylated interferon-alpha-2a isomers," The Pharmacogenomics Jour. 3:312-319 (2003)]에 설명된 바와 같이 항증식 분석에 의해 확인한다.
생체내 IFN -α 생산, 약동학 및 효능
INF-α 발현 및 활성의 시험관내 확인 시에, 배양된 HUCPVC를 마우스에게 정맥내로 또는 복강내로 투여한다. 예방 효능의 연구를 위해, 마우스에게 HUCPVC 투여 1주 후에 바이러스 (예를 들어, LCMV)를 시험접종한다. 추가로, 유전적으로 변형된 HUCPVC의 투여 1주 전에 이들 세포의 치료 가능성을 평가하기 위해 일부 마우스를 바이러스 (예를 들어, LCMV)로 감염시킨다. 혈청 샘플로부터 유래된 바이러스 역가를 실험 과정 동안 계산하고, 생체내 효능을 결정하기 위해 HUCPVC/IFN-α 처리를 받지 않은 마우스에 대해 플로팅한다.
다른 실시태양
본 발명을 그의 구체적인 실시태양에 관련하여 설명하였지만, 추가 변형이 가능하고, 본원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르고, 본 발명이 속하는 기술 분야 내의 공지의 또는 통상적인 실시 내에 있는 본 발명의 개시내용으로부터 벗어난 내용을 포함하는 본 발명의 임의의 변화, 용도 또는 변용을 포괄하는 것으로 의도됨이 이해될 것이고, 상기 제시된 필수 특징에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은, 마치 각각의 독립적인 간행물 또는 특허 출원이 그 전체가 참조로 포함됨을 구체적으로 및 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

Claims (57)

  1. 유전적으로 변형되지 않은 인간 탯줄 혈관주위 세포 (HUCPVC)에 비해 HUCPVC 내에서 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 증가시키도록 유전적으로 변형된 HUCPVC를 대상에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 HUCPVC는 생물학적 또는 화학적 물질로부터 상기 대상을 보호하는 것인, 생물학적 또는 화학적 물질의 공격으로부터 대상을 보호하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상이 척추동물인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 척추동물이 포유동물인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 HUCPVC가 상기 대상에게 동종 (allogeneic) 또는 이종 (xenogeneic)인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 물질이 병원체인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 병원체가 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세균이 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 에스체리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 브루셀라 (Bruscella), 부르콜더리아 말레이 (Burkholderia mallei), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 및 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 중에서 선택되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 바이러스가 가제츠 걸리 (Gadgets Gully) 바이러스, 카담(Kadam) 바이러스, 키아사누르 (Kyasanur) 삼림병 바이러스, 랑가트 (Langat) 바이러스, 옴스크 (Omsk) 출혈열 바이러스, 포와산 (Powassan) 바이러스, 로얄 팜 (Royal Farm) 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 도약병 (Louping ill) 바이러스, 미반 (Meaban) 바이러스, 사우마레즈 리프 (Saumarez Reef) 바이러스, 튤레니이 (Tyuleniy) 바이러스, 아로아 (Aroa) 바이러스, 뎅기 바이러스, 케도우고우 (Kedougou) 바이러스, 카시파코어 (Cacipacore) 바이러스, 코우탕고 (Koutango) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 (Murray Valley) 뇌염 바이러스, 세인트루이스 (St. Louis) 뇌염 바이러스, 우수투 (Usutu) 바이러스, 웨스트 나일 (West Nile) 바이러스, 야오운데 (Yaounde) 바이러스, 코코베라 (Kokobera) 바이러스, 바가자 (Bagaza) 바이러스, 일레우스 (Ilheus) 바이러스, 이스라엘 칠면조 뇌수막척수염 바이러스, 느타야 (Ntaya) 바이러스, 템부수 (Tembusu) 바이러스, 지카 (Zika) 바이러스, 반지 (Banzi) 바이러스, 보우보이 (Bouboui) 바이러스, 엣지 힐 (Edge Hill) 바이러스, 쥬그라 (Jugra) 바이러스, 사보야 (Saboya) 바이러스, 세픽 (Sepik) 바이러스, 우간다 S 바이러스, 베셀스브론 (Wesselsbron) 바이러스, 황열병 바이러스, 엔테베 (Entebbe) 박쥐 바이러스, 요코세 (Yokose) 바이러스, 아포이 (Apoi) 바이러스, 카우본 릿지 (Cowbone Ridge) 바이러스, 주티아파 (Jutiapa) 바이러스, 모독 (Modoc) 바이러스, 살 비에자 (Sal Vieja) 바이러스, 산 페를리타 (San Perlita) 바이러스, 부칼라사 (Bukalasa) 박쥐 바이러스, 카레이 아일랜드 (Carey Island) 바이러스, 다카르 (Dakar) 박쥐 바이러스, 몬타나 (Montana) 수염박쥐 백질뇌염 바이러스, 프놈펜 (Phnom Penh) 박쥐 바이러스, 및 리오 브라보 (Rio Bravo) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE), 동부 말 뇌염 바이러스 (EEE), 서부 말 뇌염 바이러스 (WEE), 에볼라 (Ebola) 바이러스, 마르부르그 (Marburg) 바이러스, 천연두 바이러스, 우두 바이러스, 라사 (Lassa) 바이러스, 이피 (Ippy) 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 모발라 (Mobala) 바이러스, 모페이아 (Mopeia) 바이러스, 아마파리 (Amapari) 바이러스, 플렉살 (Flexal) 바이러스, 구아나리토 (Guanarito) 바이러스, 주닌 (Junin) 바이러스, 라티노 (Latino) 바이러스, 마추포 (Machupo) 바이러스, 올리베로스 (Oliveros) 바이러스, 파라나 (Parana) 바이러스, 피친데 (Pichinde) 바이러스, 피리탈 (Pirital) 바이러스, 사비아 (Sabia) 바이러스, 타카리베 (Tacaribe) 바이러스, 타미아미 (Tamiami) 바이러스, 및 화이트워터 아로요 (Whitewater Arroyo) 바이러스, 신 놈브레 (Sin Nombre) 바이러스, 한탄 (Hantaan) 바이러스, 리프트 밸리 (Rift Valley) 열 바이러스, 크리미언-콩고 (Crimean-Congo) 출혈열 바이러스, 두그베 (Dugbe) 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스 (EBV), 카포시 (Kaposi) 육종 연관-헤르페스바이러스 (KSHV), 인플루엔자바이러스 A, H5N1 조류 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자바이러스 B, 인플루엔자바이러스 C, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 바이러스, 광견병 바이러스, 및 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 중에서 선택되는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 진균이 아스페길러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 더마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 칸디다 (Candida), 콕시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼 변종 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum var. capsulatum), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 스포로트릭스 스켄키이 (Sporothrix schenckii), 자이고마이세테스 (Zygomycetes) 종, 압시디아 코림비페라 (Absidia corymbifera), 리조무코르 푸실러스 (Rhizomucor pusillus), 및 리조푸스 아리주스 (Rhizopus arrhizus) 중에서 선택되는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 기생충이 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 피. 비박스 (P. vivax), 피. 오발레 (P. ovale), 피. 말라리아에 (P. malariae), 트리파노소마 (Trypanosoma) 종, 및 레지오넬라 (Legionella) 종 중에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 화학적 물질이 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 독소인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 독소가 리신, 디프테리아 독소, 이. 콜라이 (E. coli) 장독소, 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae) 장독소, 포도구균 (Staphylococcal) 장독소, 연쇄구균 (Streptococcal) 장독소, 및 보툴리눔 독소 중에서 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 화학적 물질이 합성에 의해 또는 천연에서 유래되는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 화학적 물질이 신경작용제, 수포제, 혈액작용제 및 호흡작용제 중에서 선택되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 화학적 물질이 질소 머스타드 (mustard), 황 머스타드, 아세틸콜린에스테라제 억제제 및 루위사이트 (Lewisite) 중에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 화학적 물질이 삭시톡신, 비스(2-클로로에틸)에틸아민, 2-클로로비닐디클로로아르신, 2-클로로에틸클로로메틸술피드, 비스(2-클로로에틸)술피드, 사린 (GB), 시클로사린 (GF), 소만 (GD), 타분 (tabun) (GA), VX, 아미톤, PFIB, 3-퀴누클리디닐 벤질레이트, 포스겐, 디포스겐, 염화시안, 시안화수소, 클로로피크린 중에서 선택되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체, 항체 단편, 미생물 항원, 시토킨 또는 성장 인자, 호르몬, 응고 인자, 약물 내성 또는 항-바이러스 내성 폴리펩티드, 항-독액제, 항산화제, 수용체 또는 리간드, 면역조절 인자, 검출가능한 표지, 및 세포성 인자 중에서 선택되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포가 상기 항체 또는 항체 단편을 합성하고 분비하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 재조합 또는 인간화된 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 모노클로날인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 단일쇄 항체 (scFv), Fab, Fab'2, scFv, SMIP, 디아바디, 나노바디, 앱타머, 또는 도메인 항체인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 시토킨 또는 성장 인자가 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), TNF-β, 인터페론-알파 (IFN-α), IFN-β, IFN-γ, 인터류킨 1 (IL-1), IL-1β, 인터류킨 2-14, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), RANTES, MIP-1α, 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β), 혈소판 유래 성장 인자 (PGDF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 표피 성장 인자 (EGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 에리트로포이에틴 (EPO), 및 트롬보포이에틴 (TPO) 중에서 선택되는 것인 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 호르몬이 안지오텐시노겐, 안지오텐신, 부갑상선 호르몬 (PTH), 염기성 섬유모세포 성장 인자-2, 황체형성 호르몬, 난포 자극 호르몬, 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 바소프레신, 옥시토신, 소마토스타틴, 가스트린, 콜레시스토키닌, 렙틴, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 에피네프린, 노르에피네프린, 도파민, 칼시토닌, 및 인슐린 중에서 선택되는 것인 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 응고 인자가 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 및 피브리노겐 중에서 선택되는 것인 방법.
  26. 제18항에 있어서, 상기 효소가 부티릴콜린에스테라제 (BChE), 아데노신 데아미나제, 글루코세레브로시다제, 알파-1 항트립신, 바이러스 티미딘 키나제, 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제, 망간 수퍼옥시드 디스뮤타제 (Mn-SOD), 카탈라제, 구리-아연-수퍼옥시드 디스뮤타제 (CuZn-SOD), 세포외 수퍼옥시드 디스뮤타제 (EC-SOD), 글루타티온 리덕타제, 페닐알라닌 히드록실라제, 산화질소 합성효소, 및 파라옥시나제 중에서 선택되는 것인 방법.
  27. 제18항에 있어서, 상기 수용체 또는 리간드가 T-세포 수용체 (TCR), LDL 수용체, 표면-결합 면역글로불린, 가용형 CD4, 낭성 섬유증 막횡단 전도도 수용체 (CFTR), 및 Fc 수용체 중에서 선택되는 것인 방법.
  28. 제18항에 있어서, 상기 면역조절 인자가 CTLA-4, VCP, PLIF, LSF-1, Nip, CD200, 유로모둘린, CD40L (CD154), FasL, CD27L, CD30L, 4-1 BBL, CD28, CD25, B7.1, B7.2, 및 OX40L 중에서 선택되는 것인 방법.
  29. 제18항에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 초록 형광 단백질 (GFP)인 방법.
  30. 제18항에 있어서, 상기 세포성 인자가 시토크롬 b, ApoE, ApoC, ApoAI, MDR, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 유로키나제, 히루딘, β-글로빈, α-글로빈, HbA, ras, src, 및 bcl 중에서 선택되는 것인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 바이러스 복제 또는 감염을 억제할 수 있는 RNA 간섭 (RNAi) 분자 중에서 선택되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 RNAi 분자가 작은 억제성 RNA (siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자인 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 대상이 상기 투여 전에 상기 생물학적 또는 화학적 물질에 노출된 것인 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 HUCPVC를 포함하는 조성물의 단일 용량을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  35. 제1항에 있어서, 상기 HUCPVC가 상기 대상을 보호하기 위해 백신으로서 투여되는 것인 방법.
  36. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항원으로서 작용하여, 상기 대상에서 상기 생물학적 또는 화학적 물질에 대한 면역 반응을 생성시키는 세포성 단백질인 방법.
  37. 제1항에 있어서, 상기 세포가 상기 대상 내에서 1주 초과 동안 지속되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 HUCPVC가 상기 대상 내에서 1개월 초과 동안 지속되는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 HUCPVC가 상기 대상 내에서 2개월 초과 동안 지속되는 것인 방법.
  40. 제1항에 있어서, 상기 HUCPVC가 상기 대상에게 정맥내로, 근육내로, 경구로, 흡입에 의해, 비경구로, 복강내로, 동맥내로, 경피로, 설하로, 코 안으로, 볼을 통해, 리포좀에 의해, 지방을 통해 (adiposally), 눈으로, 눈 안으로, 피하로, 경막내로, 외용으로, 또는 국소로 투여되는 것인 방법.
  41. 제1항에 있어서, 상기 HUCPVC가 상기 대상 내에서 면역 인식을 피하는 것인 방법.
  42. 제1항에 있어서, 상기 대상에게 용량당 101 내지 1013개의 HUCPVC가 투여되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 대상에게 용량당 103 내지 108개의 HUCPVC가 투여되는 것인 방법.
  44. 제1항에 있어서, 상기 HUCPVC가 2종 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  45. 제1항에 있어서, HUCPVC가 아닌 적어도 하나의 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 MSC가, 유전적으로 변형되지 않은 MSC에 비해 상기 MSC 내에서 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 증가시키도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상기 MSC가 골수, 제대혈, 배아 난황낭, 태반, 피부, 또는 혈액으로부터 단리되는 것인 방법.
  48. 제1항에 있어서, 하나 이상의 치료제를 상기 대상에게 투여하는 것을 더 포함하고, 여기서 상기 치료제는 HUCPVC 치료의 예방 또는 치료상 이익을 향상 또는 연장시키는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 치료제가 시토킨, 항바이러스제, 면역자극제, 또는 면역억제제인 방법.
  50. 제1항에 있어서, 상기 HUCPVC가 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 투여되는 것인 방법.
  51. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 상기 HUCPVC에 내인성인 방법.
  52. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 상기 HUCPVC에 내인성이 아닌 방법.
  53. 제46항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 상기 MSC에 내인성인 방법.
  54. 제46항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 상기 MSC에 내인성이 아닌 방법.
  55. 유전적으로 변형되지 않은 인간 탯줄 혈관주위 세포 (HUCPVC)에 비해 HUCPVC 내에서 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 증가시키도록 유전적으로 변형된 HUCPVC를 포함하고, 여기서 상기 HUCPVC는 생물학적 또는 화학적 물질에 대한 보호를 제공하는 것인 키트.
  56. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한, 유전적으로 변형된 인간 탯줄 혈관주위 세포.
  57. 제약상 허용되는 담체 및 제56항에 따른 유전적으로 변형된 인간 탯줄 혈관주위 세포를 포함하고, 여기서 상기 세포는 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 사용하기에 효과적인 용량으로 존재하는 것인 제약 조성물.
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J201 Request for trial against refusal decision
E801 Decision on dismissal of amendment
B601 Maintenance of original decision after re-examination before a trial
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL NUMBER: 2016101007327; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20161228

Effective date: 20180531