JP2708141B2

JP2708141B2 - ヒトインターフェロン−β２Ａ及びヒトインターフェロン−β２Ｂ、該インターフェロンをコードする遺伝子を含むベクター、該インターフェロンを産生するセルライン及び該インターフェロンの医薬品としての用途

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Publication number: JP2708141B2
Application number: JP7006475A
Authority: JP
Inventors: レベルミシエル; ジルベルステインアツシヤー
Original assignee: イエダリサーチアンドデベロツプメントカンパニーリミテツド
Priority date: 1986-05-08
Filing date: 1995-01-19
Publication date: 1998-02-04
Anticipated expiration: 2013-02-04
Also published as: JPH07265084A; JPS62263200A; JP3158376B2; JP2648860B2; MX9203727A; JPH1052286A

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【産業上の利用分野】本発明はヒトインターフェロン−
β_2A及びヒトインターフェロン−β_2B、それらをコード
する遺伝子を含むベクター、それらを産生するセルライ
ン及びそれらの医薬品としての用途に関する。【０００２】【従来の技術】インターフェロンは、抗ウイルス活性及
び抗腫瘍活性を有し人体によって産生される重要な蛋白
である。その種特異性のために、臨床上の用途にはヒト
インターフェロンが要求される。インターフェロンは、
その抗体との反応に基づき、３つのタイプに分類され
る。すなわち、主として白血球によって産生されるイン
ターフェロン−α、主として繊維芽細胞によって産生さ
れるインターフェロン−β、及び主としてＴ−リンパ球
によって産生されるインターフェロン−γである。【０００３】２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡに応答してヒト繊維
芽細胞により産生されるインターフェロンは、主として
２０Ｋｄの糖蛋白ＩＦＮ−β₁であり、これは０．９ｋ
ｂのＲＮＡによってコードされ、このＲＮＡはイントロ
ンを除いた染色体９の遺伝子から得られるものである。
しかしながら、マイクロインジェクションによりカエル
卵母細胞に導入した時に、ＩＦＮ活性を生ぜしめる他の
別のｍＲＮＡが、ポリ（γＩ）（γＣ）に続いてシクロ
ヘキシミド（ＣＨＸ）−アクチノマイシンＤ処理によっ
てＩＦＮ誘導を受けたヒト繊維芽細胞において、観察さ
れている。またＩＦＮ−β₁の相補的（ｃ）ＤＮＡのク
ローニングの際に、共に誘導された１．３ｋｂの他の別
のＲＮＡに対応するｃＤＮＡクローンが単離されてお
り、このＲＮＡは網状赤血球の溶解物中の１つである２
３−２６Ｋｄのポリペプチドをコードしており、そして
卵母細胞においてヒトインターフェロン抗ウイルス活性
を生ぜしめることが調べられている〔Ｊ．Ｗｅｉｓｓｅ
ｎｂａｃｈら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，７１５２−７１５
６；英国特許Ｎｏ．２，０６３，８８２〕。【０００４】この活性は、抗ＩＦＮ−β₁抗体によって
阻止されることから、このポリペプチドはＩＦＮ−β₂
と呼ばれている。ＩＦＮ−β₂に対応するＲＮＡから得
られる蛋白とＩＦＮ−β₁とは、同一の抗体との交叉反
応により、それらの生物学的活性は阻止されるが、両者
の蛋白は免疫学上は区別されるものである。ＩＦＮ−β
₂ＲＮＡは、染色体９を除いたマウス−ヒトハイブリッ
ドにより形成されることから、ＩＦＮ−β₂の１．３ｋ
ｂのＲＮＡは、明らかにＩＦＮ−β₁遺伝子以外の他の
遺伝子に由来している〔Ｕ．Ｎｉｒ，（１９８４）Ｐ
ｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，ＷｅｉｚｍａｎｎＩｎｓｔｉ
ｔｕｔｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉ
ｓｒａｅｌ〕。【０００５】【発明が解決しようとする課題】西独特許出願Ｎｏ．Ｐ
３，０４３，９８１には、純粋な形態のインターフェロ
ン−β₂の製造法が記載されている。この製造法によれ
ば、インターフェロン誘導剤により刺激を受けた時にイ
ンターフェロンを産生し得るヒト細胞を培養し、次いで
インターフェロン−β₂をコードするヒト細胞中のヌク
レオチド配列を含むＤＮＡを単離することを含む製造法
によって、インターフェロン−β₂を得ている。この製
造法においては、該誘導細胞からｍＲＮＡを単離精製
し、次いでｍＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを得、このＤ
ＮＡを適当なベクター中でクローン化している。【０００６】【課題を解決するための手段】上記の如くして得られる
遺伝子を単離しハムスターあるいはマウス細胞にトラン
スフェクションした場合に、ｄｓＲＮＡ及びシクロヘキ
シミドの刺激後にヒト特異的ＩＦＮ活性を生ぜしめる、
ＩＦＮ−β₂をコードするもう１つの別の遺伝子の存在
が証明された。ここで産生されたＩＦＮは、ＩＦＮ−β
₂に属すると認められる特性を持っているが、しかしな
がら、ＩＦＮ−β₂と同一のアミノ酸配列を有しておら
ず、これらはＩＦＮ−β_2A及びＩＦＮ−β_2Bと命名し
た。したがって、本発明の目的は生物学的に活性なヒト
ＩＦＮ−β_2A及びヒトＩＦＮ−β_2Bを単離することにあ
る。本発明の他の目的は、生物学的に活性なヒトＩＦＮ
−β_2A及びヒトＩＦＮ−β _2Bを製造することにある。【０００７】本発明の更に他の目的は、ヒトＩＦＮ−β
₂をコードするｃＤＮＡ、更に詳細にはヒトＩＦＮ−β
_2AをコードするｃＤＮＡ及びヒトＩＦＮ−β_2Bをコード
するｃＤＮＡを製造することにある。本発明の更に他の
目的は、ＩＦＮ−β₂のｃＤＮＡとハイブリダイズする
遺伝子を同定することにある。本発明の更に他の目的
は、ＩＦＮ−β_2AのｃＤＮＡあるいはＩＦＮ−β_2Bのｃ
ＤＮＡにハイブリダイズする遺伝子を同定することにあ
る。本発明の更に他の目的は、ＩＦＮ−β₂遺伝子を含
むゲノミッククローン、更に詳細にはＩＦＮ−β_2A遺伝
子を含むゲノミッククローン及びＩＦＮ−β_2B遺伝子を
含むゲノミッククローンを単離することにある。本発明
の更に他の目的は、ＩＦＮ−β_2A及び／又はＩＦＮ−β
_2B遺伝子、及びインターフェロン遺伝子の転写をコント
ロールするプロモーター配列を含む組み換えベクターを
提供することにある。本発明の更に他の目的は、生物学
的に活性なヒトＩＦＮ−β_2A及び／又はＩＦＮ−β_2Bを
産生する細胞を提供することにある。【０００８】本発明の更に他の目的は、ＩＦＮ−β_2A及
び／又はＩＦＮ−β_2Bの実質的な量を産生する細胞を提
供することにある。本発明の更に他の目的は、遺伝子組
み換え技術による、生物学的に活性なヒトＩＦＮ−β_2A
及び／又はＩＦＮ−β_2Bの製造法を提供することにあ
る。本発明の更に他の目的は、ウイルスの強力な転写プ
ロモーターに融合し、ハムスターあるいはマウス細胞に
トランスフェクションを行なった時に、実質的な量の生
物学的活性を有するヒトＩＦＮ−β_2A及び／又はヒトＩ
ＦＮ−β_2Bを産生する遺伝子を提供することにある。本
発明の更に他の目的は、細胞の成長あるいは分化、特に
末期のガン細胞の分化に望ましい影響を与える、ＩＦＮ
−β_2A及び／又はＩＦＮ−β_2Bの医薬品としての用途に
ある。本発明の更に他の目的は、ＩＦＮ−β_2A及び／又
はＩＦＮ−β_2Bの、繊維芽細胞の分化を阻止するあるい
は感染後の硬化症を防止するための用途にある。【０００９】本発明によれば、生物学的に活性なインタ
ーフェロン−β₂（ＩＦＮ−β₂）分子の存在が確認さ
れ、これらの分子は組み換えＤＮＡ技術により製造され
る。かかるインターフェロン−β₂は、ｄｓＲＮＡある
いはウイルスによってインターフェロンの産生が誘導さ
れたヒト繊維芽細胞から分泌される糖蛋白である。ＩＦ
Ｎ−β₂は、繊維芽細胞により産生される全ＩＦＮ活性
の約５％に相当する。ＩＦＮ−β₂のアミノ酸配列は、
ｃＤＮＡを用いる方法により決定され、その配列は、ヒ
ト細胞により産生される他のＩＦＮ（ＩＦＮ−β₁，Ｉ
ＦＮ−α）の配列と約２０％だけ相同である。【００１０】本発明によれば、ＩＦＮ−β_2Aをコードす
るヒトｃＤＮＡあるいは遺伝子は、ウイルスの強力な転
写プロモーターに融合される。この融合ｃＤＮＡあるい
は遺伝子によって形質転換されたハムスター細胞は、ヒ
ト特異的インターフェロン活性を生ぜしめ、この活性に
より、ウイルスの複製及び細胞変性効果が阻止され、そ
してインターフェロンに対するヒト細胞の生物学的応答
に特有な蛋白が誘導される。単離しハムスターあるいは
マウス細胞にトランスフェクションした場合に、ｄｓＤ
ＮＡ及びシクロヘキシミドによる誘導後、ヒト特異的Ｉ
ＦＮ活性を生ぜしめる、ＩＦＮ−β₂をコードするもう
１つの別の遺伝子が見出された。この遺伝子により産生
されたＩＦＮは、ＩＦＮ−β₂に属すると認められる特
性を有しているが、そのアミノ酸配列は同一ではなく、
これらはＩＦＮ−β_2A及びＩＦＮ−β_2Bと命名した。【００１１】インターフェロンをコードするヌクレオチ
ド配列を含む、ヒト繊維芽細胞中の遺伝子を単離してい
る時に、インターフェロン−β₂の存在が確認された。
この時には、繊維芽細胞に対して、外因性の適当な因子
を作用させて、インターフェロンのｍＲＮＡの産生を誘
導せしめて、ｍＲＮＡを抽出した。また同時に、誘導化
処理を行なわない繊維芽細胞からも、ｍＲＮＡを抽出し
た。誘導化処理した及び処理しない細胞から抽出したｍ
ＲＮＡより、これらを鋳型として用いて、それぞれｃＤ
ＮＡプローブを合成した。誘導化処理した細胞から得た
ｍＲＮＡより、２本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで適当な
ベクターに挿入して、微生物にトランスフェクションし
た。次いでこの形質転換体を、当該ベクターを有する形
質転換体が選択的に増殖する条件下で培養して、第１代
のコロニーを得た。次いでこのコロニーから、更に第２
代のコロニーを形成せしめ、両者のコロニーからＤＮＡ
を抽出した。第２代のコロニーから得られたＤＮＡを、
前記した誘導化処理した細胞から得られるｍＲＮＡより
合成したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。【００１２】他方、第２代のコロニーから得られたＤＮ
Ａを、前記した誘導化処理を行なわない細胞から得たｍ
ＲＮＡより合成したｃＤＮＡプローブにもハイブリダイ
ズさせた。誘導化処理した細胞より得られるｃＤＮＡプ
ローブにはハイブリダイズするが、誘導化処理しない細
胞より得られるｃＤＮＡプローブにはハイブリダイズし
ないＤＮＡを有するコロニーを選択して、そのコロニー
よりＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを更に調べて、カエ
ル卵母細胞あるいは網状赤血球の溶解物中でインターフ
ェロンに翻訳されるｍＲＮＡとハイブリダイズするＤＮ
Ａを選択した。かかるＤＮＡが、本質的にインターフェ
ロンをコードするＤＮＡ、あるいはインターフェロンを
コードするＤＮＡを得るに十分な配列を含むＤＮＡであ
る。【００１３】かかる研究の際に、インターフェロンをコ
ードする他の別の２種のｍＲＮＡが、誘導化処理した繊
維芽細胞から単離されることが分かった。これらのｍＲ
ＮＡを、グリセロールを用いて遠心分離することによ
り、１１Ｓの画分に、少量のｍＲＮＡが沈渣した。これ
を細胞中で翻訳せしめることにより、蛋白を得た。かか
る蛋白は、繊維芽細胞中から精製されるインターフェロ
ンの１つに対する抗体と反応して沈殿する分子量２０，
０００の蛋白である。この蛋白はヒトインターフェロン
−β₁であり、そのアミノ酸配列の１部は、Ｋｎｉｇｈ
ｔら〔（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０７，５２５−
５２６〕によって決定されている。１４Ｓの画分に多量
のｍＲＮＡが沈渣し、このｍＲＮＡからは、分子量２
３，０００の蛋白が得られた。この蛋白は、繊維芽細胞
から得られる純度の低いインターフェロンに対する抗体
と反応して沈澱した。【００１４】この蛋白をヒトインターフェロン−β₂と
命名した。インターフェロン−β₂に翻訳されるｍＲＮ
ＡとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンを前記した方
法と同様にして調製し、そのクローンを用いてＩＦＮ−
β₂のｃＤＮＡプローブを調製した。インターフェロン
−β₂に翻訳されるｍＲＮＡとハイブリダイズするｃＤ
ＮＡクローンである、ＩＦＮ−β₂クローンＡ３４１及
びＥ４７４は、それぞれ共通した配列を有しており、こ
れらを融合して、ＩＦＮ−β₂ＡＥ２０ｃＤＮＡを再構
築した（図１参照）。このＩＦＮ−β₂ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列を決定した。これにより、２３，５００ダ
ルトンの蛋白の産生が期待される２１２個のアミノ酸の
オープンリーディングフレームを有することが分かっ
た。転写−翻訳試験により、このｃＤＮＡは、上記の如
き蛋白をコードすることが確認された。【００１５】ヒト成人血球ＤＮＡをＥｃｏＲＩで部分消
化後、λシャロン４Ａ〔Ｙ．Ｍｏｒｙら、（１９８１）
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：１９７−２０
２〕中でクローン化して得られるヒト遺伝子ライブラリ
ーから、前記したＩＦＮ−β₂のｃＤＮＡプローブにハ
イブリダイズするゲノミッククローンＩＦＡ−２及びＩ
ＦＡ−１１を単離した。クローンＩＦＡ−２は、クロー
ンｃＤＮＡの各種セグメントとハイブリダイズする少な
くとも４つのエクソンを持つ遺伝子を含んでいる（図
１）。ＡＥ２０ｃＤＮＡの５′−末端の近くにＸｈｏ₁
部位があるため、ゲノミックセグメントＡ１３２（図
２）のマップ化を行なった。Ａ１３２は、このＸｈｏ₁
部位から７０ｂｐ下流の所で終るＩＦＡ−２の最初のエ
クソンを有している。Ｘｈｏ₁部位から４０ｂｐの位置
のＢｓｔＮ１部位をラベルしたＤＮＡプローブを用い
て、Ｓ１ヌクレアーゼ分析を行なうことにより、誘導化
処理を受けたヒト繊維芽細胞ＦＳ１１は、２０個分のヌ
クレオチド配列によって区別される、５′−末端Ｓ−１
あるいはＳ−２を有する２つのＩＦＮ−β₂ＲＮＡを含
んでいることが分かった（図３）。これら２つの開始点
は、その上流−３０の位置にあるＴＡＴＡボックスに続
いて存在している（図４）。Ｓ−２で終るＲＮＡは、各
種の誘導化処理条件下において、より長い他のＲＮＡよ
り、多かった（図３）。【００１６】異なる５′−末端を有する２つのＲＮＡ
は、細胞質のＲＮＡの場合にも観察された。従って、ヒ
ト細胞において、２つのＲＮＡが形成されて活性を示す
ことが明らかである。両者のＩＦＮ−β₂ＲＮＡを、ポ
リ（γＩ）（γＣ）によりヒト繊維芽細胞中で誘導し
た。この誘導は、ＩＦＮ−β₁ＲＮＡの場合〔Ｕ．Ｎｉ
ｒら、（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，
１２：６９７９−６９９３〕と同様に、ＩＦＮ自身を添
加することによって促進される。ＣＨＸで長時間（６．
５ｈ）処理することによってもＩＦＮ−β₂ＲＮＡは誘
導される。またＣＨＸの処理時間が短い（３．５ｈ）場
合には、ポリ（γＩ）（γＣ）のみででも有効である。
ｄｓＲＮＡを添加することなしにＣＨＸのみで誘導した
場合に、ＩＦＮ−β₂ＲＮＡはわずかしか誘導されず、
このことによりＩＦＮ−β₁と区別することができる。【００１７】ＩＦＡ−２遺伝子を発現せしめるために、
ＳＶ４０初期プロモーターを有するＤＮＡ構築体を作成
した。ＩＦＡ−２ＤＮＡの４．８ｋｂセグメントを、
合成オリゴヌクレオチドを介してｐＳＶＥ３ＤＮＡ
〔Ｙ．Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ５，（１９８４）Ｄ
ＮＡ，３，２９４−３０８〕に融合して、ＡＴＧコドン
が、ＳＶ４０の前初期のＲＮＡの開始点から１５０ｂｐ
下流に来るようにした（ｐＳＶＩＦＡ２−ＩＩ，図５参
照）。ｐＳＶＩＦＡ２−ＩＩＤＮＡを、ｃｏｓ７サル細
胞〔Ｙ．Ｇｌｕｚｍａｎ，（１９８１）Ｃｅｌｌ，２
３：１７５−１８２〕に導入し、ＩＦＮ−β₂ｃＤＮＡ
を用いたノーザンブロット法により、１．３５と２．２
ｋｂの２つのＲＮＡを検出した。これら２つのＲＮＡ
は、それぞれＩＦＮ−β₂で転写が終るＲＮＡ、あるい
はＳＶ４０ポリアデニル化部位で転写が終るＲＮＡに対
応していた（図５）。【００１８】ｐＳＶＩＦＡ２−ＩＩＤＮＡの過渡的発現
が行なわれているＣｏｓ７細胞の培地について、ヒトＦ
Ｓ１１及びウイッシ（Ｗｉｓｈ）細胞〔Ｄ．Ｎｏｖｉｃ
ｋら、（１９８３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：
９０５−９１０〕に与えるところの、ＶＳＶの細胞効果
に対する抑制作用に基づいて、ＩＦＮ活性を測定した。
抗ウイルス活性は、ｐＳＶＩＦＡ２−ＩＩＤＮＡトラ
ンスフェクション２日後に、明らかに検出された（第１
表）。１ユニットあたりのＩＦＮ−β₂の抗ウイルス比
活性は、ＩＦＮ−β₁の１／３０−１／１００であり、
ＩＦＮ−α₁のそれ（５−１０×１０⁶ユニット／ｍ
ｇ）に近かった。ＩＦＡ−２遺伝子の発現が行なわれて
いる培地のＩＦＮ力価は、予想された通り、同じＳＶ４
０プロモーターの下流に組み込んだＩＦＮ−β₁遺伝子
が発現される場合の力価の約３％であった（第１表）。【００１９】更には、ｐＳＶＩＦＡ２−ＩＩＤＮＡを導
入したＣｏｓ７細胞の培地にＦＳ１１細胞をさらすこと
によって、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ〔Ｍ．
Ｒｅｖｅｌら、（１９８１）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．７９：１４９−１６１〕が誘導されることから、ｐ
ＳＶＩＦＡ２−ＩＩＤＮＡがトランスフェクションされ
た細胞中でＩＦＮ−β₂活性が生起することが証明され
た（図６）。（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの誘
導は、用量依存的でありまた抗ウイルス活性に量的に対
応している。【００２０】また、ＩＦＡ−２遺伝子を、Ｓ−２の近く
のＸｈｏ₁部位にＳＶ４０プロモーターが位置するよう
に融合した（ｐＳＶＩＦＡ２−ＩＤＮＡ、図５）。ハム
スターＣＨＯ−Ｋ１ＤＨＦＲ^-細胞に、ｐＳＶＩＦＡ２
−Ｉ及びｐＳＶＤＨＦＲ〔Ｙ．Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋ
ｙら、（１９８４）ＤＮＡ，３：２９４−３０８〕ＤＮ
Ａを共にトランスフェクションし、安定な形質転換体Ｓ
Ｉ−１５を単離した。このセルラインについては、ヒト
ＦＳ１１及びＷｉｓｈ細胞を用いて測定した時、１０−
５０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ抗ウイルス活性が観察された。一
方、ｐＳＶＤＨＦＲＤＮＡのみを導入したＣＨＯ細胞
の場合には、ヒトＩＦＮの生成については何ら観察され
なかった（第１表）。ＳＩ−１５培養の培地を濃縮する
ことによって、約３０００Ｕ／ｍｌの力価を有するγＩ
ＦＮ−β₂溶液が得られる。【００２１】このγＩＦＮ−β₂は、ヒトＩＦＮが持つ
特性を有しており、またγＩＦＮ−β₂によりＦＳ１１
細胞中で（２′−５′）オリゴＡシンセターゼが、１Ｕ
／ｍｌの低濃度の場合でも誘導される（図６）。ＣＨＯ
ＳＩ−１５細胞により、γＩＦＮ−β₂が産生されるこ
とから、シクロヘキシミドの存在下で、（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼＣ５６及びＨＬＡを生成するため
のｍＲＮＡが、ヒトに特異的に誘導されることが証明さ
れた。またγＩＦＮ−β₂抗ウイルス活性は、抗−ＩＦ
Ｎ−β₁ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に
より中和され、抗−ＩＦＮ−αあるいは抗−ＩＦＮ−γ
抗体によっては中和されないことが分かった。またマウ
ス−ヒトハイブリドーマが、１型のＩＦＮレセプターの
遺伝子を持つ染色体２１を含んでいる場合にのみ、γＩ
ＦＮ−β₂は、このマウス−ヒトハイブリドーマに対し
て作用することが分かった。γＩＦＮ−β₂のこのよう
な生物学的特徴から、γＩＦＮ−β₂はＩＦＮとして作
用しているのであって、ＩＦＮ−β₁の誘導剤として作
用しているのではないことが証明される。【００２２】ＩＦＮ−β_2AｃＤＮＡ配列をＳＶ４０初期
プロモーターに融合して得られるＤＮＡ構築体（ｐＳＶ
ＣＩＦβ₂、図５）を、前記したと同様にＣＨＯ細胞に
ｐＳＶＤＨＦＲと共にトランスフェクションした時に、
高収率でγＩＦＮ−β₂が得られた。そして高濃度のメ
トトレキセートに対して耐性の細胞を選択することによ
って、γＩＦＮ−β₂の収量が増幅された。増幅されな
い場合であっても、ｐＳＶＣＩＦβ₂で形質転換された
ＣＨＯ細胞（例えばクローンＢ−１３２）は、ＳＩ−１
５細胞と同様のＩＦＮ−β₂活性を示した（第２表）。
しかしながら、メトトレキセートに耐性の細胞を選択し
た場合には８００Ｕ／ｍｌの高いＩＦＮ−β₂活性を示
した（第２表）。【００２３】そのような選択クローンを用いて、培地に
分泌されるＩＦＮ−β₂蛋白を免疫学的に沈澱させるこ
とができ、またこの細胞が³⁵Ｓ−メチオニンでラベルさ
れている場合には、ＩＦＮ−β₂蛋白を、ドデシルサル
フェートポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析す
ることもできる。γＩＦＮ−β₂の大きさは、２１，０
００ダルトンであることが分かった。実際の実験によれ
ば網状赤血球の溶解物中で、ＩＦＮ−β₂ＲＮＡの翻訳
により２３−２６Ｋｄの生成物が得られ、これは、犬の
パンクレアチン膜によりｉｎｖｉｔｒｏで、より短か
い２１Ｋｄの蛋白に変換されることが分かった。また誘
導化処理したヒト繊維芽細胞により、２１Ｋｄの蛋白が
産生され、この蛋白は、ＩＦＮ−β₂ＲＮＡからの生成
物である２６Ｋｄの生成物と免疫学的に同じであり、し
かしながらＩＦＮ−β₁とは異なっていた。成熟ＩＦＮ
−β₂の２１Ｋｄ蛋白のＮ−末端は同定しなかった。Ｉ
ＦＮ−β₂配列には、２つのグリコシル化部位があり
（図１）、このために、プロセッシングによって除かれ
る領域の大きさを計算するのが困難になっている。【００２４】しかしながら、この除去される領域は、Ｉ
ＦＮ−β₁の場合よりも長く、その大きさは、成熟化
〔Ｗ．Ｄｅｇｒａｖｅら、（１９８１）Ｇｅｎｅ，１
０：１１−１５〕によって増加することが示された。Ｉ
ＦＮ−β₂の２６Ｋｄポリペプチドのハイドロパシープ
ロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙｐｌｏｔ）により、Ｉ
ＦＮ−β₂の親水性及び疎水性領域と成熟ＩＦＮ−β₁
のそれらとの間には、２つの蛋白をそのＣ−末端を基準
に並べたときに、著しい共通性があることが分かった。
また、ＩＦＮ−β₂のアミノ酸配列と他のＩ型ヒトＩＦ
Ｎのアミノ酸配列には、共通配列があることも分かった
（図７）。公知のすべてのＩＦＮ−α及びβの配列に
は、３８個の共通するアミノ酸配列（図７に星印を付け
た）がある。ＩＦＮ−β₂を同様にＣ−末端を基準にし
て並べたとき、すべてのＩ型ヒトＩＦＮに共通の３８個
のアミノ酸のうち、１８個のアミノ酸がＩＦＮ−β₂に
おいても見られる（図７）。ＩＦＮ−β₂と他のＩ型Ｉ
ＦＮとの間には約２０％の相同性がある。【００２５】ＩＦＮ−β₁アミノ酸配列とＩＦＮ−β₂
アミノ酸配列との間の相同性は低いが、ＩＦＮ−β₁と
ＩＦＮ−β₂の抗ウイルス活性は、例えば抗−ＩＦＮ−
β₁モノクローナル抗体〔Ｄ．Ｎｏｖｉｃｋら、（１９
８３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：９０５−９１
０〕などの同一の抗体による交叉反応により中和される
ことから、これらＩＦＮ−β₁とＩＦＮ−β₂の活性部
位には何らかの相同性があることが考えられる。ＩＦＮ
−β₂の活性は、抗−ＩＦＮ−α又は−γ抗体によって
は中和されないことから、この考えが支持される。ＩＦ
Ｎ−β₂をコードする遺伝子は、染色体９〔Ｕ．Ｎｉ
ｒ，（１９８４）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｗｅｉｚｍ
ａｎｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，
Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ〕中にはなく、イントロ
ンの存在によりクラスター構造を取っている染色体９の
Ｉ型ＩＦＮ遺伝子とも異なる。ＩＦＡ−２遺伝子は染色
体７〔Ｐ．Ｂ．Ｓｅｈｇａｌら、（１９８６）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｕ．，ＵＳＡ〕にあること
が分かった。アミノ酸配列において相同性が検出される
ことから、ＩＦＮ−β₂遺伝子は、クラスター構造を取
るＩ型のＩＦＮ遺伝子の基礎となる遺伝子と関連してい
ると考えられる。【００２６】ＩＦＮ−β₂ｃＤＮＡとハイブリダイズす
る、もう１つの他のゲノミックＤＮＡクローンＩＦＡ−
１１は、ＩＦＡ−２とは異なる制限酵素地図を有してい
る（図８）。転写地図及びその配列から、ＩＦＡ−２の
３′−末端のエクソンと、ＩＦＡ−１１（Ｈｂａｌ−Ｈ
ｉｎｄ₁₁₁セグメント）とは共通している（９９％の相
同配列）ことが分かり、他方５′末端のエクソンと交叉
ハイブリダイズする領域はない。ＩＦＡ−１１ゲノミッ
ククローン（１９ｋｂ）を、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子〔Ｆ．
Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、（１９８１）Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１−１４〕とともにＬ−
ＴＫ−細胞にトランスフェクションし、安定な形質転換
体を得た。第１表に示した如く、ヒトＩＦＡ−１１遺伝
子を含むＬ細胞クローンＬＩ−３９は、ポリ（γＩ）
（γＣ）及びシクロヘキシミドで誘導化処理を行なった
場合には、ヒトＩＦＮ活性を示し、他方Ｌ−ＴＫ⁺細胞
はそのような活性を示さなかった。【００２７】ＩＦＡ−１１遺伝子を含むＣＨＯクローン
ＩＣ４０も、ヒトＩＦＮ活性を示した（第１表）。誘導
化処理を行なわないＬＩ−３９あるいはＩＣ４０細胞
は、何んらの活性も示さなかった。誘導化処理後にＩＦ
Ａ−１１の形質転換体が示すＩＦＮ活性は、ＩＦＡ−２
遺伝子の場合に比べて、有意に高かった。ＩＦＡ−１１
遺伝子の発現により産生されるγＩＦＮ−β_2Bは、ＩＦ
Ａ−２遺伝子の生成物と同様に、抗−ＩＦＮ−β₁抗体
によってその活性が中和される。ＩＦＡ−１１に特異的
なＤＮＡプローブは、ＩＦＮ−２ＤＮＡプローブと同
様に、誘導化処理したヒト繊維芽細胞から得られるＲＮ
Ａとハイブリダイズし、このことから、両者の遺伝子は
ヒト細胞において活性を示すことが分かる。【００２８】ＩＦＮ−β₂遺伝子の機能は、他のＩＦＮ
遺伝子が発現されないような条件下でＩＦＮ−β₂遺伝
子が発現されることに起因していると考えられる。我々
は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）あるいはリンフォカインＩ
Ｌ−１に繊維芽細胞をさらしたときに、ＩＦＮ−β₂蛋
白が産生されることを見出した。また、抗体によってＩ
ＦＮ−βが中和され、その結果、細胞の増殖が促進され
ることも他の人々によって見出されており〔Ｍ．Ｋｏｈ
ａｓｅら、（１９８６）Ｃｅｌｌ投稿中：Ｒｅｓｎｉｔ
ｚｋｙら、（１９８６）Ｃｅｌｌ投稿中〕。このことか
ら、ＩＦＮ−β ₂は、成長因子に応答して細胞の成長を
抑制するように作用することが分かる。このことは、Ｉ
ＦＮ−γｍＲＮＡと共にＰＨＡの如きマイトージエンに
よって誘導化処理された末梢血単核細胞において、ＩＦ
Ｎ−β₂ｃＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡが検出さ
れた事実からも支持される。【００２９】また、ＩＬ−１等のリンフォカインが、２
倍体繊維芽細胞及び他のヒトセルラインにおいて、ＩＦ
Ｎ−β₂ｃＤＮＡとハイブリダイズするＲＮＡを、強く
誘導することが報告されている〔Ｊ．Ｃｏｎｔｅｎｔ
ら、（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５
２：２５３−２５７〕。ＩＦＡ−２遺伝子のプロモータ
ー領域は、２つのＴＡＴＡボックス及び２つのＲＮＡ開
始点を含んでいる（図１及び図３）。このＩＦＮ−β₂
プロモーターは、ポリ（γＩ）（γＣ）あるいはシクロ
ヘキシミドのいずれかに応答することが示されている
〔Ｙ．Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙら（１９８４），ＤＮ
Ａ，３：２９４−３０８〕。Ｉｎｖｉｖｏで、２つの
ＩＦＮ−β₂遺伝子プロモーターが異なる誘導剤（ｄｓ
ＲＮＡ、蛋白合成インヒビター、ＩＬ−１，ＰＨＡ）に
よって活性化される。各種の細胞が、成長阻止あるいは
分化において、少量のオートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎ
ｅ）ＩＦＮ−βを産生することが見出されている〔Ｍ．
Ｒｅｖｅｌ（１９８３）Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，５，ｐ
ｐ．２０５−２３９，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄ
ｏｎ〕。ＩＦＮ−β₂は、自動調節された細胞の成長に
応じて産生される少数のＩＦＮ種に属するものであり、
他方Ｉ型のＩＦＮは、ウイルス感染に対して特異的に産
生されるＩＦＮ種である。【００３０】ＩＦＮ−β₂の生物学的に重要な点は、Ｉ
ＦＮ−β₁が誘導されないような条件、例えば代謝機構
が抑制されるような条件下〔Ａ．Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉ
ｎら、（１９８５）ＴｈｅＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳ
ｙｓｔｅｍ，ＳｅｒｏｎｏＳｙｍｐｏｓｉａＲａｖｅ
ｎＰｒｅｓｓ，ｐｐ．７３−８３〕で、ＩＦＮ−β₂
が誘導されるということである。そして最も重要な点
は、ＴＮＦが、繊維芽細胞においてＩＦＮ−β₂を誘導
し、ＴＮＦによって促進される繊維芽細胞の増殖が、抗
−ＩＦＮ−β抗体を添加することによって更に促進され
るということである。多くのヒトセルラインが、分化の
際に、オートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）ＩＦＮ−β
を産生することが分かっており、これらのＩＦＮによっ
て、細胞中でＨＬＡ抗原が誘導される〔Ａ．Ｙａｒｄｅ
ｎら（１９８４）Ｅｍｂｏ．Ｊ．，３；９６９−９７
３〕。【００３１】ＣＳＦ−１によって分化誘導されたマウス
脊髄白血病セルラインで、末期の分化に特徴的な細胞の
成長停止が、抗−ＩＦＮ−β抗体によってなくなる。Ｉ
Ｌ−１は、いくつかの型の細胞の成長を促進し、成長因
子ＰＤＧＦはマウス細胞中でＩＦＮ−β ＲＮＡを誘導
することが分かっている〔Ｊ．Ｎ．Ｚｕｌｌｏら、（１
９８５）Ｃｅｌｌ４３：７９３−８００〕。多くのＩ
ＦＮ−βがあるが〔Ｐ．Ｂ．Ｓｅｈｇａｌ，（９１８
２），Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ４，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１２２，及びＭ．Ｒｅｖｅｌ（１９
８３）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ５，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２０５−２３９〕、ＩＦＮ−β₂
は、成長因子に応答して生起する細胞成長のオートクリ
ン自動調節物質の１つであると考えられる。オートクリ
ンＩＦＮ−βを産生する細胞は、低い抗ウイルス活性の
みを示す〔Ｍ．Ｒｅｖｅｌ（１９８３），Ｉｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎ５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ｐｐ．
２０５−２３９〕ことから、上記の考えは、ＩＦＮ−β
₂の低い比活性（抗ウイルス活性は、イムノアッセイに
よる測定の結果、ＩＦＮ−β₁の１／５０−１／１００
である）と符号する。【００３２】またＩＦＮ−β₂ｃＤＮＡを発現するハム
スター細胞が、ヒトＩＦＮ−β₁遺伝子を保持するハム
スターＣＨＯ細胞〔Ｙ．Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙら，
（１９８４），ＤＮＡ３：２９７−３０８〕よりも低い
ＩＦＮ活性を示す理由を、上記の考え方で説明すること
ができる。また興味深いことに、ＩＦＮ−α１（Ｄ）
は、白血病ＩＦＮの多くの割合を占めている〔Ｃ．Ｗｅ
ｉｓｓｍａｎｎ（１９８１），Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
３，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．ｐｐ．１
０１−１３４〕にもかかわらず、ＩＦＮ−α１（Ｄ）
も、他のＩＦＮ−αの１／１００の低い比活性を示す
〔Ｔ．Ｇｏｒｅｎら，（１９８３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１３０：２７３−２８０〕。しかしながら、ＩＦＮ−
β₂によって、多くのＩＦＮの機能のうちのいくつか
は、抗−ウイルス活性の場合よりも、より効果的に発現
されるということも見逃せない。低濃度にもかかわら
ず、成長調節物質ＩＦＮ−βは、ＨＬＡ及び（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼをより強力に誘導し、また
それらを産生する細胞の成長をより長く強力に抑制す
る。ＩＬ−１及びＴＮＦによってＩＦＮ−β₂が誘導さ
れることから、ＩＦＮ−β₂が、細胞の増殖を調節する
のみならず、炎症及び急性相応答におけるこれらサイト
カインのオートクリンメディエイターの役割をはたして
いることが示唆される。【００３３】ＩＦＮ−β₁ｃＤＮＡではなくＩＦＮ−β
₂ｃＤＮＡのプローブにハイブリダイズするｍＲＮＡ
が、ヒトセルラインをインターロイキン−１（ＩＬ−
Ｉ）〔Ｊ．Ｃｏｎｔｅｎｔら（１９８５），Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５２：２５３−２５７〕及び
ＴＮＦ−αにさらしたときに、誘導されることが観察さ
れた。Ｒ−抗体を用いたＩＦＮ−β₂に特異的な免疫競
合アッセイ法（ｉｍｍｕｎｏ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ
ａｓｓａｙ）により、これら２つのサイトカインに応
答して、ヒト繊維芽ＦＳ１１細胞が、実際にＩＦＮ−β
₂蛋白を分泌するかどうかを調べた（図９）。γＩＬ−
αとＴＮＦ−αの両者は、ＩＦＮ−β₂蛋白の合成と分
泌を誘導し、イムノアッセイにより、１０−２０Ｕ／ｍ
ｌのＩＦＮ−β ₂が分泌された。γＩＬ−１αの濃度が
４Ｕ／ｍｌ（０．１３ｎｇ／ｍｌ）の時に、ＩＦＮ−β
₂の最適誘導が観察され、この濃度は、プロスタグラジ
ンＥ₂、コラゲナーゼあるいはヒアルロン酸をヒト繊維
芽細胞中で誘導せしめるに要するＩＬ−１の濃度〔Ｊ．
Ｈ．Ｋｏｒｎ（１９８５），ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈ
ｅｕｍ．，２８：３１５−３２２〕と同じであった。【００３４】またＩＦＮ−β₂誘導（４００Ｕ／ｍｌ；
４０ｎｇ／ｎｌ）のためのＴＮＦ−αの最適濃度は、感
受性細胞を溶解するのに要する濃度〔０．１ｎｇ／ｍ
ｌ；Ａ．Ｍ．Ｗａｎｇら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２２８：１４９−１５４〕よりも高く、また２倍体繊維
芽細胞の最適成長促進に要する濃度（２ｎｇ／ｍｌ）よ
りも高い。ＩＦＮ−β₂の分泌の開始は、ＴＮＦ−αに
より早められ、約６時間で分泌量の最大値の半分の値に
達する。他方、ＩＬ−１の場合には８−１２時間で半分
の値に達する。今までに記述した部分で引用した文献
は、本発明の記述を完全にするために、本明細書中に組
み込まれる。本発明の範囲を逸脱することなく、本発明
を修正し変えることは、当業者にとって自明であろう。
また本発明は、明細書の記述、図面に限定されるもので
もない。【００３５】【表１】【００３６】【表２】【００３７】図１は、ＩＦＮ−β_2AｃＤＮＡの制限酵素
地図及びヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配
列は、Ｅ４７４ｃＤＮＡクローンとＡ３４１ｃＤＮＡク
ローン〔Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈら，（１９８０），Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：
７１５２−７１５６〕とのＸｂａ−１部位での融合によ
り形成されるクローンＡＥ２０から決定された。その
５′−末端配列は、図２に示すゲノミッククローンＩＦ
Ａ−２から明らかにされた。また番号は、図３及び図４
のＳ−１を１として始まる。ＩＦＮ−β₂のアミノ酸配
列は、演繹法により決定した。【００３８】図２は、ＩＦＮ−β_2A遺伝子を含むゲノミ
ッククローンＩＦＡ−２の構造を示す。Ａ１３２は、Ｉ
ＦＡ−２のＥｃｏＲＩセグメントをｐＢＲ３２２でクロ
ーン化したサブクローンである。点が散在している部分
は、ｃＤＮＡクローンＡ３４１及びＥ４７４〔Ｗｅｉｓ
ｓｅｎｂａｃｈら，（１９８０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，７７：７１５２−
７１５６〕にハイブリダイズする領域を示している。Ｒ
ＮＡの２つの開始点（キャップ１及び２）及びＴＡＴＡ
ボックスが示されている。ＲＮＡにおいて、２１２個の
アミノ酸（図１）のオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）は黒い太線で示されている。Ｍ．Ｃ．は第２のＡ
ＴＧを示しており、ＩＦＮ−β_2AｃＤＮＡにおいては、
他のＯＲＦは見出されなかった。【００３９】図３は、ＩＦＮ−β₂ＲＮＡの５′−末端
部分のＳ１ヌクレアーゼ分析を示す。ＩＦＡ−２遺伝子
（図２）のサブクローンＡ１３２のフラグメントであ
り、ＢｓｔＮ１部位をラベル化したＤＮＡプローブを、
以下の方法で処理した２倍体繊維芽細胞から得られる全
ＲＮＡとハイブリダイズした。処理方法は、ＩＦＮ−β
₁２００Ｕ／ｍｌで１６時間の前処理；同様の前処理及
びポリ（γＩ）（γＣ）（ｐＩＣ）５０μｇ／ｍｌ、
３．５時間処理；同様の前処理及びシクロヘキシミド
（ＣＨＸ）５０μｇ／ｍｌ、３．５時間処理；同様の前
処理及びｐＩＣとＣＨＸで３．５時間処理；同様の前処
理及びＣＨＸで６．５時間処理；ｐＩＣで３．５時間の
処理のみ；ＣＨＸで３．５時間の処理のみ；ｐＩＣとＣ
ＨＸで３．５時間の処理のみ、である。Ｓ−１及びＳ−
２は、図２に示す２つのＲＮＡの開始点を示す記号であ
る。図４は、ＩＦＮ−β_2AをコードするＩＦＡ−２遺伝
子のプロモーター領域を示す。サブクローンＡ１３２
（図２）の部分の配列は、ＩＦＮ−β₂ｃＤＮＡとして
示した。Ｓ−１及びＳ−２は、図３で示した２つのＲＮ
Ａの開始点を示す。イニシェーターＡＴＧはＸで示され
る。最初のイントロンはｉｎｔγｌで開始する。【００４０】図５は、ＩＦＮ−β_2AｃＤＮＡとＳＶ４０
の初期プロモーターの融合を示したものである。ＩＦＡ
−２遺伝子（図２の５．５ｋｂから７．５ｋｂ）の５′
−末端のＸｈｏ₁−ＢａｍＨ₁（Ｘｈ−Ｂ）セグメント
を、２６ｂｐのＣｌａ₁−Ｘｈｏ₁合成アダプター
（５′末端のｃＤＮＡ配列を復元している）を用いて、
Ｃｌａ₁及びＢａｍＨ₁で切断したｐＢＲプラスミドに
融合し、これをサブクローニングして、プラスミドｐＳ
ＶＩＦＡ−ＩＩを構築した。Ｈｉｎｄ₁₁₁及びＢａｍＨ
₁で切断したｐＢＲプラスミド中でサブクローン化した
３′末端のＢａｍＨ ₁−Ｈｉｎｄ₁₁₁（Ｂ−Ｈ）遺伝子
セグメント（図２の７．５ｋｂから１０．５ｋｂ）を、
ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ₁₁₁部位に隣接したＣｌａ₁部
位で切り取り、前記５′−末端セグメントに連結し、完
全なＩＦＡ−２遺伝子を得た。【００４１】Ｈｉｎｄ₁₁₁で切断されたｐＳＶＥ３ベク
ター〔Ｙ．Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙら（１９８４）Ｄ
ＮＡ，３：２９４−３０８〕を、Ｃｌａ₁リンカーを用
いて再連結し（ｐＳＶＣｌａを形成する）、次いで前記
ＩＦＡ−２遺伝子をｐＳＶＣｌａのＣｌａ₁部位に、ｐ
ＳＶＩＦＡ２−ＩＩを形成するＳＶ４０初期プロモータ
ーと同じ方向で導入した。ＩＦＡ−２のＸｈｏ₁部位
を、ｐＳＶＥ３に導入する前にｐＢＲのＣｌａ₁部位に
直接融合させた以外は、同様にしてプラスミドｐＳＶＩ
ＦＡ２−Ｉを構築した。ＳＶ４０プロモーターに融合し
たＩＦＮ−β_2AｃＤＮＡを含むｐＶＣＩＦβ₂プラスミ
ドを得るために、前記ｐＳＶＩＦＡ２−ＩＩＤＮＡを、
Ｘｂ₁で切断し、次いでＸｍｎ₁で部分切断して、ＩＦ
Ｎ−β₂ｃＤＮＡ配列のＸｈｏ₁部位から６０ｂｐ下流
にあるＸｍｎ₁部位（図１）を開き、そしてベクターの
ａｍｐ遺伝子にあるＸｍｎ₁部位は開かなかった。この
構築物に、ＩＦＮ−β₂ｃＤＮＡクローンＡＥ２０のＸ
ｍｎ₁−Ｘｂａ₁セグメント（図１の９２−５６６に対
応する）を連結し、図に示す如き、完全なＩＦＮ−β _2A
ｃＤＮＡ配列を復元した。【００４２】ＥＥＳはＳＶ−４０Ｔ−ａｇ遺伝子のＲＮ
Ａ開始点、ＡＴＧはＩＦＮ−β₂の開始コドン、ｐＡは
ＩＦＮ−β₂及びＳＶ４０のポリアデニル化部位を示
す。ｐＳＶＣＩＦβ₂ＤＮＡを、ｐＤＨＥＲプラスミド
と共に、ＣＨＯ−Ｋ₁ＤＨＦＲ ^-細胞にトランスフェク
ションし〔Ｙ．Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙら（１９８
４），ＤＮＡ，３：２９４−３０８〕、得られるクロー
ンについて、ＶｅｓｉｃｕｌａｒＳｔｏｍａｔｉｔｉ
ｓＶｉｒｕｓ（ＶＳＶ）を用いてＦＳ１１細胞におけ
るヒトＩＦＮ抗ウイルス活性を調べた。メトトレキセー
ト（ＭＴＸ）耐性のＣＨＯクローンを選択することによ
って遺伝子の増幅が達成された。２５０ｎＭのＭＴＸに
耐性のＣＨＯ−ＳＶＣＩＦβ₂Ｂ１３２−５Ｍ細胞の培
養培地のアッセイが、図の下に示されている。ＶＳＶの
細胞変性効果が現われた後、マイクロプレート中の細胞
をメチレンブルーで染色した。一連の培地２倍希釈物が
左から右に並べてある。ＩＦＮスタンダード（ＳＴ）及
び非導入ＣＨＯ細胞と比較することにより、３００Ｕ／
ｍｌのγＩＦＮ−β₂の力価を計算した。【００４３】図６は、下に示す細胞の培地に１６時間あ
らかじめさらしたヒトＦＳ１１繊維芽細胞について、Ｎ
Ｐ４０抽出物に境界をつけるポリ（γＩ）（γＣ）−ア
ガロース〔Ｍ．Ｒｅｖｅｌら，（１９８１）Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍｏｌ．７９：１４９−１６１〕を用いた、
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼのアッセイの結果
を示す。すなわち（ａ）ｐＳＶＩＦＡ２−ＩＩＤＮＡ
（図５）を導入してから２日後のＣｏｓ７細胞（この時
のアッセイの結果は、図６の最も左側の４列で示されて
いる）、（ｂ）図５のｐＳＶＩＦＡ２−ＩＤＮＡで安定
に形質転換されたハムスターＣＨＯＳＩ−１５細胞（次
の４列）、（ｃ）ＩＦＮ−β₁遺伝子を発現するＣＨＯ
ＭＥＩＦ−５細胞〔Ｙ．Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ
ら，（１９８４），ＤＮＡ，３：２９４−３０８〕（次
の２列）、（ｄ）ＤＨＦＲ遺伝子での形質転換されたＣ
ＨＯ細胞（次の１列）、及び（ｅ）新鮮な培地のみ（な
し）である。ＦＳ１１細胞に加えた培地１ｍｌ当りのＩ
ＦＮ抗ウイルス活性の測定結果が示されている。リン酸
化された３２Ｐ−α−ＡＴＰラベル化（２′−５′）オ
リゴＡ生成物の電気泳動の結果が示されている。【００４４】図７は、Ｉ型ヒトＩＦＮのアミノ酸配列を
比較したものである。ＩＦＮ−β₁と各種のＩＦＮ−α
（α−Ｅを除く、α−Ａ，α−Ｃで示されるＩＦＮ−
α、及びＩＦＮ−αクラスＩＩ）とに共通するアミノ酸
が、ＩＦＮ−β₁配列の上に星印でマークされている。
またＩＦＮ−β₂に共通するアミノ酸は、もしそれがす
べてのＩ型ＩＦＮと共通する場合には星印で、もしいく
つかのＩＦＮと共通する場合には四角印でマークされて
いるＩＦＮ−β_2Aは、ハイドロパーシプロット（ｈｙｄ
ｒｏｐａｔｈｙｐｌｏｔｓ）を比較することによって
並べ、また予想されるプロセッシング部位から番号を付
けた。【００４５】図８は、けっ歯類の細胞で発現される２つ
の異なるヒトＩＦＮ−β₂の制限酵素地図を示す。ＩＦ
Ｎ−１１ＤＮＡ（ＩＦＮ−β_2B遺伝子）はＣＨＯあるい
はＬ細胞のいずれかにトランスフェクションされ、ＩＦ
Ｎ−β活性を発現した。図９は、Ｒ−抗体を用いたＩＦ
Ｎ−β₂に特異的な免疫競合アッセイ法を示したもので
あり、ヒト繊維芽ＦＳ１１細胞は、２つのサイトカイ
ン、インターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）及び腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ−α）に応答して、ＩＦＮ−β ₂蛋白を分泌
することが示されている。両者のサイトカインは、低レ
ベル、すなわち１０−２０Ｕ／ｍｌＩＦＮ−β₂の最
適誘導はγＩＬ−１αの濃度が４Ｕ／ｍｌ（０．１３ｎ
ｇ／ｍｌ）の時に見られる。ＩＦＮ−β₂誘導のための
ＴＮＦ−αの最適濃度（４００Ｕ／ｍｌ；４０ｎｇ／ｍ
ｌ）は、感受性細胞の細胞変性の効果のために要する濃
度（０．１ｎｇ／ｍｌ）よりも高く、また２倍体繊維芽
細胞の最適成長促進に要する濃度（２ｎｇ／ｍｌ）より
も高い。

【図面の簡単な説明】【図１Ａ】ＩＦＮ−β_2AｃＤＮＡの制限酵素地図を示
す。【図１Ｂ】ＩＦＮ−β_2AｃＤＮＡのヌクレオチド配列を
示す。【図１Ｃ】ＩＦＮ−β_2AｃＤＮＡのヌクレオチド配列を
示す。【図２】ＩＦＮ−β_2A遺伝子を含むゲノミッククローン
ＩＦＡ−２の構造を示す。【図３】ＩＦＮ−β₂ＲＮＡの５′−末端部分のＳ１ヌ
クレアーゼ分析を示す。【図４】ＩＦＮ−β_2AをコードするＩＦＡ−２遺伝子の
プロモーター領域を示す。【図５】ＩＦＮ−β_2AｃＤＮＡとＳＶ４０の初期プロモ
ーターの融合を示したものである。【図６】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼのアッセ
イの結果を示す。【図７】Ｉ型ヒトＩＦＮのアミノ酸配列を比較したもの
である。【図８】２つの異なるヒトＩＦＮ−β₂の制限酵素地図
を示す。【図９】電気泳動の結果を示す写真であり、より具体的
にはＲ−抗体を用いたＩＦＮ−β₂の免疫競合アッセイ
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (54)【発明の名称】ヒトインターフェロン−β２Ａ及びヒトインターフェロン−β２Ｂ、該インターフェロンをコードする遺伝子を含むベクター、該インターフェロンを産生するセルライン及び該インターフェロンの医薬品としての用途

Claims

(57)【特許請求の範囲】１．以下に示した２１２個のアミノ酸配列を有するヒト
インターフェロン−β_２Ａをコードするヌクレオチド配
列からなるＤＮＡ：【化１】２．以下に示したｃＤＮＡからなる請求項１のＤＮＡ：【化２】３．以下に示した２１２個のアミノ酸配列を有するヒト
インターフェロン−β_２Ａをコードするヌクレオチド配
列からなるＤＮＡを含む組換えベクター：【化３】４．ヒトインターフェロン−β_２Ａの発現が可能なよう
な位置におかれた調節領域を更に含む請求項３の組換え
ベクター。５．ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項４の組換えベク
ター。６．ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項４の組換えベクタ
ー。７．ｃＤＮＡ配列が、以下に示した配列である請求項６
の組換えベクター：【化４】８．調節領域が、プロモーター、好ましくはＳＶ４０初
期プロモーターを含む請求項４から７のいずれかの組換
えベクター。９．組換えベクターが、インターフェロン−β_２Ａをコ
ードする遺伝子の２ｋｂＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片及
び３ｋｂＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片であってプ
ラスミドｐＳＶＥ３に挿入されたこれら断片を含むプラ
スミドｐＳＶＩＦＡ２−Ｉである請求項４から７のいず
れかの組換えベクター。１０．組換えベクターが、請求項９のベクターに加えて
５′ｃＤＮＡ配列を保持した２６ｂｐ合成Ｃｌａ１−Ｘ
ｈｏＩオリゴヌクレオチドを含むプラスミドｐＳＶＩＦ
Ａ２−ＩＩである請求項４から７のいずれかの組換えベ
クター。１１．組換えベクターが、以下に示したプラスミドｐＳ
ＶＣＩＦβ_２である請求項７の組換えベクター：【化５】１２．以下に示した２１２個のアミノ酸配列を有するヒ
トインターフェロン−β_２Ａをコードするヌクレオチド
配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換さ
れたセルライン：【化６】１３．セルラインが真核細胞である請求項１２のセルラ
イン。１４．ハムスターセルラインである請求項１３のセルラ
イン。１５．ＣＨＯセルラインである請求項１３のセルライ
ン。１６．Ｌ−ＴＫセルラインである請求項１３のセルライ
ン。１７．インターフェロン−β_２Ａを産生することのでき
る請求項１２から１６のいずれかのセルライン。１８．形質転換に用いた組換えベクターがプラスミドｐ
ＳＶＣＩＦβ_２であり、セルラインはプラスミドｐＳＶ
ＤＨＦＲで同時形質導入されメトトレキセート誘導増幅
に付されたものである請求項１５のセルライン。１９．以下に示した２１２個のアミノ酸配列を有するヒ
トインターフェロン−β_２Ａをコードするヌクレオチド
配列からなるＤＮＡの使用方法であって、上記ＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換されたセル
ラインを培養し；次いで、発現されたヒトインターフェロン−β_２Ａを単
離・回収することからなる、上記ＤＮＡの使用方法：【化７】