JPH08228786A - ヒトｂｃｄｆの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトＢＣＤＦの製造方法を提供すること。 【解決手段】 ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子及び真核生物の細胞中で複製可能な
ベクターＤＮＡよりなる組み換えＤＮＡ体により形質転
換された真核生物細胞を培地中にて培養し、生産された
ヒトＢＣＤＦを採取することを含むヒトＢＣＤＦの製造
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は人について活性を有
するＢ細胞分化因子（以下「ＢＣＤＦ」と記す）の製造
法に関する。ヒトＢＣＤＦは本発明により物質としての
存在が初めて発明され、免疫不全による疾患等に汎く治
療薬として利用しうる有用な物質である。

【０００２】

【従来の技術】抗原刺激を受け活性化された成熟Ｂ細胞
は、Ｔ細胞の助けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞
が抗体産生細胞にまで最終的に分化するには、１種また
はそれ以上のＴ細胞由来の分化誘導性の物質が必須であ
ることが知られている。この物質の存在は B. W. Dutto
n ら、Transplant, Rev.23 66 (1975), A.Schimpl とE.
Weckerら、Nature N. Biol. 237 , 15 (1972) 、により
明らかにされた。彼らはマウスのリンパ球混合物培養後
の培養上清中または抗原やマイトゲンにより刺激を受け
たマウスのリンパ球培養上清が、マウスのＴ細胞を除去
されたリンパ球細胞集団やヌードマウス由来のリンパ球
のヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対する１次免疫応答を増
幅させることを見出し、そのような作用を有する活性本
体にＴリンパ球代替因子、すなわちＴＲＦという呼称を
与えた。それ以来ＴＲＦは、抗原非特異的に主要組織適
合遺伝子複合体（以下、ＭＨＣと略称する。）の一致を
必要としない様式でＢ細胞に作用し、Ｂ細胞の分裂増殖
を誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導する
液生因子であると定義されている。

【０００３】その後、このようなＢ細胞分化因子の存在
を示す機能上の証拠が蓄積されており、人においてもマ
ウス同様の分化因子の存在が示唆されている。現在では
上述のように定義されたＢ細胞を抗体産生細胞へ分化さ
せる因子をＢＣＤＦと総称するようになった。このよう
にＢＣＤＦは人の体内でＢ細胞の抗体産生機能に重要な
働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大別して３
つ考えられる。第１はＢＣＤＦによりＢＣＤＦ抗体を作
り、ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤＦのイムノ
アッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に用いること
が出来ると共に、自己免疫疾患において散見されるＢ細
胞機能異常の修復にも用いうる。第２の応用は各種疾患
の治療への応用である。例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能
低下にともなうＢ細胞抗体産生能低下による免疫不全症
患者にＢＣＤＦ単独または他のリンホカインや免疫療法
剤と共に投与することにより抗体産生機能を正常に戻す
ことが考えられる。

【０００４】さらにＢＣＤＦの応用として次のことが考
えられる。Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）（ K. Yoshizak
i ら、J. of Immunol. 130, 1241 (1983))、その他のリ
ンホカインを含むＴ細胞因子を培地に加えることにより
正常Ｂ細胞を長期培養できることが報告されている (
B. Sredniら、J. Exp. Med., 154 , 1500 (1981) 参照)
。これらの培養正常Ｂ細胞あるいはＥＢウイルスで形
質転換したＢ細胞に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用
させることにより生体外で抗体を産生させることが出来
る。特定の抗体、例えば、病原細菌、病原ウイルス、病
原原虫、癌細胞などの表面にある特定抗原を認識する抗
体を産生するＢ細胞をモノクローン化し、クローン化正
常Ｂ細胞またはＥＢウイルスで形質転換した細胞をＢＣ
ＤＦとその他のリンホカインを組み合せて培養し、有用
なモノクローナル抗体を産生させることが出来る。これ
ら抗体は感染症や癌の治療及び診断に利用できる。

【０００５】従来ＢＣＤＦを得るには、人末梢血などよ
り分離した正常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激することによ
りＢＣＤＦを産生させる方法が採られてきた。この方法
では、Ｔ細胞を十分得ることが困難である点、マイトゲ
ンを用いたため、ＢＣＤＦに有害なマイトゲンが混入
し、これを除去するのが困難である点、またＴ細胞培養
にはウシ胎児血清など血清成分を培地に添加する必要が
あり、これら添加タンパク質とＢＣＤＦを十分分離する
ことが出来ず、ＢＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣ
ＤＦが得られぬことが障害となっている点など問題が多
く、工業的にＢＣＤＦを産生することは出来なかった。
また人Ｔ細胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞を
得、これによりＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告され
ている (Okada ら、J. Exp. Med., 157, 583 (1983))。
しかし、人融合細胞は継代中、リンホカイン産生能が低
下してゆくことが多く、実用的ＢＣＤＦ産生人融合細胞
は未だない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ヒトＢＣＤＦの製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】本発明者らは、人Ｔ細胞
白血球ウイルス（以下「ＨＴＬＶ」と記す）により形質
転換された人Ｔ細胞が高い効率でＢＣＤＦを生産するこ
とをすでに見い出し、Ｂ細胞分化因子活性が５×１０⁶
単位／ｍl 以上である蛋白標品を得た。人ＢＣＤＦ産生
人Ｔ細胞株の作製は以下のように行なうことが出来る。
人の末梢血・扁桃・臍帯血などよりフィルコールパック
などを用いた密度勾配遠心法等でリンパ球を分離し、N.
Yamamoto, science 217, 737 (1982)の方法に準じてＨ
ＴＬＶを用いて人Ｔ細胞を形質転換（トランスフォーメ
ーション）する。たとえば下記の方法を用いることがで
きる。ウイルス産生細胞株ＭＴ−２をＸ線照射（１２０
００〜１４０００ラド）で不活化した細胞１×１０⁷ ／
ｍl と、上述のようにして得た人リンパ球１×１０⁷ ／
ｍl を２０％ＦＣＳ、１００μg ／ｍl カナマイシン、
２μg ／ｍl NaHCO₃、２５ mＭ Ｎ−２−hydroxyethyl
piperazine −Ｎ' −２−ethanesulfonic acid （ＨＥ
ＰＥＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を入れたプラスチ
ックシャーレ（ファルコン＃３００３）に接種し５％ C
O₂存在下３７℃で培養する。１週間に２回、半分の培地
を新鮮な培地と交換しつつ２〜３カ月培養した後、リミ
ティングダイリューション法により株化する。株化した
細胞の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定し、ＢＣＤＦ活性
を有する株を得る。

【０００７】この方法により株化した細胞としてたとえ
ばＶＴ−１と標識された人Ｔ細胞株を用いることができ
る。ＶＴ−１を増殖させるための特別な条件はなく、一
般に用いられている培養条件を適宜採用して行なえばよ
い。また、ＢＣＤＦの産生も一般的な方法で行なえばよ
いが、好ましくはタンパク質を含まない培地を用いて行
なうべきである。ＶＴ−１の細胞数を増やすのに最適な
培地として、例えば１〜３０％、好ましくは２０％のＦ
ＣＳを添加した培地を用いる。ＢＣＤＦ産生のための最
適な培地としては、ＦＣＳを添加しない上述の培地でよ
い。ＦＣＳを添加しない完全合成培地中で４８時間培養
後もＶＴ−１の生存率は７０％以上が保持されている。
Ｔ細胞よりＢＣＤＦを生産する場合、従来は培地にＦＣ
Ｓのようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であった（T. Teranishiら、J. o
f Immunol. 128, 1093 (1982), A. Muraguchi ら、J. o
f Immunol. 127, 412 (1981)参照）。これに対してＶＴ
−１を使用してＢＣＤＦを生産する場合、培地にＦＣＳ
のような血清、血液中のタンパク質成分、その他タンパ
ク質成分を加える必要がなく、また通常用いられている
Ｔ細胞またはＢ細胞に対するマイトゲンも加える必要が
ないことは特筆に値する。そのため高価なＦＣＳを用い
ないで安価にＢＣＤＦを生産することが出来るばかりで
なく、人体に有害な異種タンパク質やマイトゲンを含ま
ない安全なＢＣＤＦを容易に得ることが出来る。ＶＴ−
１を用いてＢＣＤＦを生産する上記方法は種々の環境的
条件で行なわれる。しかし、好ましくはＶＴ−１培養物
は約３５〜３８℃の温度範囲において約５〜１０％の炭
酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべきである。ま
た、理想的には培地の pＨは約7.０〜7.４と僅かにアル
カリ性の条件下に保持すべきである。ＶＴ−１は平底ミ
クロプレートなど種々のタイプの培養器に１００μl 単
位などの種々の容量で接種される。ファルコン・ラブウ
ェア・ディヴィジョン、ベクトン・ディッキンソン・エ
ンド・コーポレーション (Falcon Labware Div. Becto
n, Dickinson and Co.)から市販されているフラスコNo.
３０１３または３０２４のような組織培養フラスコも
使用できる。別法として上記ファルコン・ラブウェアか
ら市販されているボトルNo. ３０２７のような回転びん
も培養容器として使用できる。

【０００８】ＶＴ−１を培養して細胞数を増やすための
最適条件として、細胞の当初密度は培地１ｍl あたり１
×１０⁴ 細胞ないし５×１０⁵ 細胞、好ましくは２×１
０⁵細胞である。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、
通常２〜７日で培地１ｍl 当り５×１０⁵ 細胞から２×
１０⁶ 細胞程度まで細胞密度が増加するので、再び新し
い培地を加えて培地１ｍl 当り１×１０⁴ 〜５×１０⁵
細胞にまで細胞密度を下げ、再び培養を続ける。このよ
うにして目的とする細胞数になるまでＶＴ−１の培養を
続けた後、細胞を遠心分離等で分離する。細胞をタンパ
ク質を含まぬ完全合成培地で洗ってから新しい完全合成
培地に接種する。この時の細胞の当初密度は培地１ｍl
あたり約１×１０⁴ 細胞ないし１×１０⁷ 細胞であるこ
とが好ましく、理想的には培地１ｍl あたり１×１０⁶
細胞である。ＶＴ−１を培養することによって生産され
るＢＣＤＦ量は経時的に変化する。例えば１ｍl 当り１
×１０⁶ 初発細胞密度でＶＴ−１をＲＰＭＩ１６４０培
地（１ｍl 当りペニシリン１００単位、ストレプトマイ
シン１００μｇ、ゲンタマイシン１０μg 及び NaHCO₃
１６ mＭを含む）で培養すると、ＢＣＤＦ活性は４８時
間後にピークレベルに達する。さらに、次の２４時間に
存在するＢＣＤＦ活性は僅かに減少する。このようにＲ
ＰＭＩ１６４０培地中のＶＴ−１でＢＣＤＦを生産する
至適培養時間は約２４〜７８時間である。

【０００９】ＢＣＤＦは塩折、真空透析、限外濾過、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフ
ォーカシング、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動
およびゲル電気泳動等の種々の方法によって上述の培養
物上清から濃縮して精製できる。次にＢＣＤＦ活性測定
法であるが以下のような方法がある。人ＢＣＤＦに反応
して１ｇＭを産生する人Ｂ細胞株ＣＬ４ (T. Hirano
ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 5490, 1985) を用い
てＢＣＤＦ活性を測定する。ＢＣＤＦ活性を測定する検
液と６×１０³ 個のＣＬ４を２００μl の１０％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１ml当りペニシリン１０
０単位、ストレプトマイシン１００μg 、ゲンタマイシ
ン１０μg 及び NaHCO₃ １６ mＭを含む）に入れる。こ
の混合物を９６穴マイクロプレート中で３日間、５％ C
O₂存在下、３７℃で培養し、培養上清のＩｇＭ量を酵素
免疫測定法により、測定する。この条件において最大Ｉ
ｇＭ生産量（最高のＣＬ４の反応）の５０％を示すＢＣ
ＤＦの活性を１Ｕ／mlとした。

【００１０】また人ＢＣＤＦに反応してIgＭを産生する
人Ｂ細胞株ＣＬ４（O. SAIKIら、Eur. J. Immunol 13,
31 (1983))を用いたリバースＰＦＣ法でもＢＣＤＦ活性
を測定しうる。ＢＣＤＦ活性を測定する検液と１×１０
⁴ 個のＣＬ４を２００μl の１０％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地（添加物は前記と同じ）に入れる。この
混合物を９６穴マイクロプレート中で３日間、５％ CO₂
存在下、３７℃で培養する。培養細胞・補体・抗ヒトIg
Ｍ抗体プロテインＡ結合緬羊保存血をHANKS 液に溶解し
たアガロースに混合して、シャーレ上に拡げ固め、３７
℃、５％ CO₂存在下一晩培養した後の溶血斑数をもって
ＢＣＤＦの作用にて人IgＭ産生細胞に分化した細胞数を
測定する。ヒトＢＣＤＦをコードする遺伝子を同定・採
取するためには、前述のＢＣＤＦ産生至適条件で培養さ
れたＶＴ−１細胞よりＲＮＡを抽出し、採取し、 cＤＮ
Ａライブラリーを作成し、同ライブラリーよりＢＣＤＦ
をコードする cＤＮＡをクローニングする。このために
本発明者らは実施例に示すようにＶＴ−１細胞の産生す
るヒトＢＣＤＦを完全に精製し、そのＮ末のアミノ酸部
分配列および同ＢＣＤＦをリシルエンドペプチダーゼを
作用させて限定分解し、得られるフラグメントペプチド
のアミノ酸配列を決定し、各々のペプチドに対応するオ
リゴヌクレオチドを合成し、本合成オリゴヌクレオチド
プローブを用いて上述の cＤＮＡライブラリーより複数
の合成プローブと相補的にハイブリダイズするクローン
を採取することによりＢＣＤＦ cＤＮＡを同定した。こ
こで得られた cＤＮＡの塩基配列を常法により決定し、
ＢＣＤＦをコードする遺伝子の本体を物質的に確定し、
本遺伝子配列よりヒトＢＣＤＦが１８４個のアミノ酸よ
り構成されるポリペプチドであることを見出した。と同
時にここに得られた cＤＮＡを真核生物の細胞で発現す
べく発現ベクターに連結したのちに、同細胞に遺伝子導
入し、本細胞の培養により、上清にＢＣＤＦを生産さ
せ、精製操作により純化ヒトＢＣＤＦを同定・採取し、
ＢＣＤＦの遺伝子構造に対応するリコンビナントヒトＢ
ＣＤＦを製造し、かつ本ＢＣＤＦがＶＴ−１細胞や他の
ヒト細胞より得られるヒトＢＣＤＦと同じ理化学的、生
物学的性状を有することを明らかにした。このことによ
り同定された遺伝子が確かにヒトＢＣＤＦ蛋白をコード
するものであることが最終的に立証された。

【００１１】一方ヒトＢＣＤＦは原核生物においても製
造できる。すなわちヒトＢＣＤＦをコードする遺伝子を
発現可能なようにベクターＤＮＡに導入して得られた組
み換え体ＤＮＡを原核生物宿主に導入し、得られた形質
転換微生物を培養すればよい。ＢＣＤＦをコードする遺
伝子はアミノ酸配列（II) もしくはその部分構造に対応
する塩基配列を少くも有するものである。組み換え体Ｄ
ＮＡが導入される原核生物宿主細胞はエッシェリヒア・
コリ、バチルス・ズブチリス、その他の微生物があり、
現在の遺伝子工学的生産の分野において当該業者の容易
になしうるところのものである。

【化１】 アミノ酸配列（II) PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL ALA ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE ARG TYR ILE LEU ASP GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU THR CYS ASN LYS SER ASN MET CYS GLU SER SER LYS GLU ALA LEU ALA GLU ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS MET ALA GLU LYS ASP GLY CYS PHE GLN SER GLY PHE ASN GLU GLU THR CYS LEU VAL LYS ILE ILE THR GLY LEU LEU GLU PHE GLU VAL TYR LEU GLU TYR LEU GLN ASN ARG PHE GLU SER SER GLU GLU GLN ALA ARG ALA VAL GLN MET SER THR LYS VAL LEU ILE GLN PHE LEU GLN LYS LYS ALA LYS ASN LEU ASP ALA ILE THR THR PRO ASP PRO THR THR ASN ALA SER LEU LEU THR LYS LEU GLN ALA GLN ASN GLN TRP LEU GLN ASP MET THR THR HIS LEU ILE LEU ARG SER PHE LYS GLU PHE LEU GLN SER SER LEU ARG ALA LEU ARG GLN MET

【００１２】形質転換された微生物( 原核生物) を培養
する培地および培養方法は通常の培地、方法でよい。形
質転換された微生物細胞中にヒトＢＣＤＦが蓄積されて
いる場合には、ＢＣＤＦは、当該分野の業者の容易にな
しうる方法で回収、精製する。簡単に記すと以下の通り
である。培養後、遠心で菌体を集め、リゾチームを含む
溶液や他のdetergent を含む液に細胞を懸濁し、反応
後、凍結・融解を繰り返し、細胞抽出液を採取し、以下
前述の精製法及び／又は抗ＢＣＤＦ抗体固定化カラムを
用いるアフィニティクロマトグラフィーで簡便に精製す
る。

【００１３】

【実施例】

実施例１ ２リットル容プラスチックローラー培養器（ファルコン
＃３０２７）（以下ローラーと称する）中の１リットル
の２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２mＭグル
タミン、５×１０^-5Ｍ ２ＭＥ、１００単位／mlペニシ
リン、１００μg ／mlストレプトマイシン、２０μg ／
mlゲンタマイシン及び１６ mＭ NaHCO₃を含有）に、２
×１０⁵ ／ml細胞数になるようＶＴ−１を接種し、ロー
ラーを８rpm で回転させつつ３日間、３７℃で培養し
た。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集めＲＰＭＩ
１６４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を２リットル
容ローラー中１リットルのＲＰＭＩ１６４０培地に１×
１０⁶ ／ml細胞濃度になるよう懸濁した。ローラーを８
rpm で回転させつつ２日間、３７℃で培養する。培養後
培養物を遠心分離して、培養上清を得た。上述のように
してＶＴ−１を培養して得たＢＣＤＦを含む培養上清よ
り、ＢＣＤＦを以下の方法で精製した。無細胞上清１０
リットルを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、アミコン
・コーポレーション、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を装
着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セル２０００
型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッツ、
ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４kg／cm² の圧力をか
け濾過した。濾過膜上部に残った１００mlの濃縮液をさ
らに限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装着した限外
濾過装置（アミコン、スタンダードセル５２型）を用
い、窒素ガスにより４kg／cm² の圧力をかけて濾過し
た。濾過膜上部に残った５mlの濃縮液を採取した。

【００１４】上述の濃縮した上清をＡｃＡ−３４ゲル濾
過カラム（LKB Produker, Sweden,2.６×９０cm）で処
理した。なお、ゲル濾過カラムはあらかじめＰＢＳ（ホ
スフェート・バッファードセイライン、0.１５Ｍ食塩を
含む0.０１Ｍホスフェート・バッファー、 pＨ7.０）で
平衡化した。濃縮上清をＰＢＳで溶出し、溶出液を５ml
ずつ分取し、分取液のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤ
Ｆ活性を有する画分は分子量3.５±0.５×１０⁴ ダルト
ンに相当するフラクションに含まれていることがわかっ
た。ゲル濾過カラムは以下に示すファルマシア・ファイ
ンケミカルス（スウェーデン）社製の分子量マーカーで
検定した。即ち、ブルーデキストラン２０００ ２×１
０⁶ 、フェリチン4.５×１０⁵ 、アルドラーゼ1.５８×
１０⁵ 、オブアルブミン4.５×１０⁴ 、キモトリプシノ
ーゲン2.５×１０⁴ 及びチトクロームＣ1.１７×１
０⁴ 。また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、限外
濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装置した限外濾過装置
を用いて２５ mＭピペラジン−塩酸緩衝液（ pＨ6.３）
に置換した。

【００１５】ＡｃＡ−３４カラムクロマトグラフィーで
分画されたＢＣＤＦ画分をあらかじめ２５ mＭピペラジ
ン−塩酸緩衝液（ pＨ6.３）で平衡化したMonoＰカラム
（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）
に通した。このカラムを２５mＭピペラジン−塩酸緩衝
液で洗った後、塩酸で pＨ4.５に調整した４０mlの１／
１０希釈ポリバッファー７４（ファルマシア・ファイン
ケミカルス、スウェーデン）で溶出した。カラム操作は
ファースト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフィ
ー、ＦＰＬＣ（ファルマシア・ファインケミカルス、ス
ウェーデン）を用い、流速は毎分0.５mlで行なった。溶
出液を１mlずつ分取し、ＢＣＤＦ活性とpＨを測定し
た。ＢＣＤＦ活性は pＨ4.９〜5.１の位置に溶出され
た。MonoＰカラムより得たＢＣＤＦ活性画分を0.１％Ｔ
ＦＡ（トリフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化した逆相クロ
マトグラフィー用カラム Synchropak RP-P（Ｃ₁₈）（２
５０×４、１mm、Synchrom）を用いた高速液体クロマト
グラフィーにかけ、溶出液0.１％ＴＦＡ中のアセトニト
リル濃度を０から６０％まで直線的に増加させＢＣＤＦ
を溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で溶出され
る。O.D.₂₈₀ のピークは他のO.D.₂₈₀ のピークとは完全
に分離しており、このピークに対応してＢＣＤＦ活性が
検出された。このピークを凍結乾燥してＢＣＤＦ標品を
得た。この標品を還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル（１２％ゲル）電気泳動を行なった。分子量２
１０００に相当するゲル区分を切り出し、エッペンドル
フチューブ中0.０５％ＳＤＳ、１０ mＭ NH₄HCO₃ で３
７℃、一晩、振盪し抽出した。

【００１６】この溶出液を再び直接逆相クロマトグラフ
用カラム Synchropak RP-P（Ｃ₁₈）（２５０×４、１m
m、Synchrom）を用いたＨＰＬＣにかけ、溶出液0.１％
ＴＦＡ中のアセトニトリル濃度を０から６０％まで直線
的に増加させてＢＣＤＦを溶出した。アセトニトリル５
０〜５５％で溶出される 0.D.₂₈₀のピークは他の 0.D.
₂₈₀ピークとは完全に分離しており、このピークに対応
してＢＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍結乾燥
して精製ＢＣＤＦを得た。ＢＣＤＦ蛋白のアミノ酸配列
を決定するために前述のようにして得られた６μg の精
製ＢＣＤＦをプロテイン・シークェンサー (Applied Bi
osystem Co., Calf., Model 470A) に導入した。アミノ
酸配列の決定方法は J. Biol. Chem., 193, 265 〜275
(1951)に記載されている方法により行なった。Ｎ末端か
らのアミノ酸配列は以下のとおりであった。

【化２】 Ｐro Ｖal Ｐro Ｐro Ｇly Ｇlu Ａsp Ｓer Ｌys Ａsp Ｖal Ａla Ａla

【００１７】実施例２ 実施例１に記した方法により調製した精製ＢＣＤＦ標品
２０μg を５ mＭ Tris−HCl, pＨ9.５のバッファーに
溶解し、、リシルエンドペプチデース (Lysylendopepti
dase)（和光）（ Lysyl Endopeptidase：ＢＣＤＦ標品
＝１：２００、モル比）を加え、３７℃、６時間反応さ
せ、ＢＣＤＦをフラグメント化した。反応液を逆相クロ
マトグラフィー用カラムμBondo Pack（0.２１×３０c
m）を用いたＨＰＬＣにかけ、溶出後、0.０６％ＴＦＡ
中のアセトニトリル濃度を０から６０％まで直線的に増
加させてフラグメントを分離溶出した。この結果ＨＰＬ
Ｃの溶出ピーク１〜９を得た。各ピーク部分の溶出液を
凍結乾燥し、プロテイン・シークエンサー（Applied Bi
osystem Co., Calf., Model 4704）に導入した。アミノ
酸配列の決定は、J. Biol. Chem., 193 , 265 〜275 (1
951)に記載されている方法により行なった。アミノ酸配
列を確認出来たフラグメントとアミノ酸配列を記す。フ
ラグメント３

【００１８】

【化３】Ｌys−Ｇlu−Ａla−Ｌeu−Ａla−Ｇlu フラグメント８ Ｌys−Ｌeu−Ｘ−Ａla−Ｇln−Ａsn−Ｇln−Ｔrp−Ｌeu
−Ｇln−Ｙ−Ｍet フラグメント2 Ｐro−Ｖal−Ｐro−Ｐro−Ｇly−Ｇlu−Ｘ−Ｙ−Ｌys フラグメント６ Ａsp−Ｖal−Ａla−Ａla−Ｐro−Ｘ 尚、Ｘ及びＹは同定できなかったアミノ酸 フラグメント２、６は実施例１のＮ末端配列と一致し
た。

【００１９】実施例３ 実施例１及び２で得たＢＣＤＦのアミノ酸配列をコード
するオリゴヌクレオチドを、下記のように合成した。オ
リゴヌクレオチドの合成はアプライドバイオシステム社
製ＤＮＡシンセサイザー・モデル３８０Ａを用い、シリ
カゲルを固相担体とし、亜リン酸トリエステル法を用い
てヌクレオチド結合反応を行った。常法により保護基を
除去した後、Ｃ₁₈逆相カラムＨＰＬＣにてアセトニトリ
ルグラジエントを用いて、目的のオリゴヌクレオチドを
精製した。

【００２０】

【化４】

【００２１】

【化５】

【００２２】実施例４ （イ）２リットル容プラスチックローラー培養器（ファ
ルコン＃３０２７) （以下ローラーと称する）中の１リ
ットルの２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２ m
Ｍグルタミン、５×１０^-5Ｍ ２ＭＥ、１００単位／ml
ペニシリン、１００μg ／mlストレプトマイシン、２０
μg ／mlゲンタマイシン、１６ mＭ NaHCO ₃ を含有）に
２×１０⁵ ／ml細胞数にＶＴ−１を接種し、８rpm で回
転させつつ３日間、３７℃で培養した。培養後、培養物
を遠心分離して細胞を集めＰＢＳで２回細胞を洗った後
細胞（1.８×１０⁹ 細胞）をＰＢＳ溶液８００mlに懸濁
し、細胞を遠心によって２度洗浄してから、ヌクレアー
ゼ阻害剤である Ribonucleosides-Vanadyl complex（１
０ mＭ）を含んだＲＳＢ溶液（１０ mＭ Tris −HCl,p
Ｈ7.５, １０ mＭ NaCl, 1.5 mＭ MgCl₂）８００mlに懸
濁した。次に、ＮＰ−４０を0.０５％になるように加え
た後ゆるやかに攪拌後、３０００rpm で５分遠心して核
を含む細胞 debris を除去し、その上清液にＳＤＳ（最
終濃度0.５％）とＥＤＴＡ（最終濃度５ mＭ）を加えた
後、直ちにフェノールを等量加え、細胞質ＲＮＡを抽出
した。合計３回フェノール抽出を繰り返してから、２容
エタノールでＲＮＡを沈殿し、遠心でこの沈殿を集め、
１０ mＭ Tris −HCl, pＨ7.5 で溶解した。このように
してＶＴ−１細胞から得られたＲＮＡ量は３０mgであっ
た。

【００２３】次にこのＲＮＡから mＲＮＡを取得するた
めにオリゴ（ｄＴ）−セルロース（P. L. Biochemical
s, Type 7) を用い、カラムクロマトグラフィーを行な
った。吸着は２０ mＭ Tris−HCl, pＨ7.5, 0.５Ｍ N
aCl, 1 mＭ ＥＤＴＡ，0.５％ＳＤＳ溶液にＲＮＡを溶
解して行ない、緩衝液（２０ mＭ Tris−HCl, pＨ7.5,
0.5 Ｍ NaCl,１ mＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、溶出は水と
１０ mＭ Tris−HCl (pＨ7.５）で交互に mＲＮＡを溶
出することにより行なった。この結果溶出されたmＲＮ
Ａ量は５７６μg であった。 （ロ）（イ）で調製した mＲＮＡ５μg を用いて二重鎖
cＤＮＡを作製した。GUBLER, U とHOFFMAN, B.J., ( G
ene 25, 263, 1983)の方法に従い、 cＤＮＡ合成キット
( アマシャム) を用いアマシャムのプロトコールによっ
て二重鎖 cＤＮＡを作製した。すなわち、 mＲＮＡより
逆転写酵素によりシングルストランド cＤＮＡを合成
し、 mＲＮＡと cＤＮＡのハイブリッドを基質として、
大腸菌リボヌクレアーゼＨを利用してＲＮＡ鎖にニック
とギャプを形成した。さらに大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉによって、ニックトランスレーションタイプの反応に
より mＲＮＡをＤＮＡに置き換え二重鎖ＤＮＡを作製し
た。この３’末端にある小さなオーバーハングをＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて除去し、二重鎖 cＤＮＡを作
製した。最終的に得た二重鎖 cＤＮＡは1.０８μg であ
った。

【００２４】（ハ）得られた二本鎖 cＤＮＡ1.０８μg
を蔗糖密度勾配遠心法（５０ mＭ Tris−ＨCl, １ mＭ
ＥＤＴＡ、 pＨ7.５を含む溶液中で蔗糖密度勾配５〜
２５％、４0,０００rpm 、４℃下で１３時間）により分
画し、その１部をアガロースゲル電気泳動法によるオー
トラジオグラムにより解析し、二本鎖 cＤＮＡのサイズ
が５００ bp 以上の画分を集めてエタノール沈殿法で回
収した。回収した二本鎖cＤＮＡは約0.６μg であっ
た。 （ニ）0.１Ｍカコジル酸カリウム（トリスBaseで pＨを
7.２にしたもの）１０ mＭ ＤＴＴ，２ mＭ CoCl₂、0.
５ mＭ ³²p-dCTP （比活性１×１０⁶ cpm ／ｎ mole
）、 0.６μg 二本鎖 cＤＮＡおよび５０単位のデオ
キシヌクレオチジルタ−ミナルトランスフェラーゼ（Ｂ
ＲＬ）を混合し、２４℃、２０分間インキュベートした
後、フェノール処理を行い、セファデックスＧ−５０カ
ラムを通して cＤＮＡ画分を集め、エタノール沈殿物と
して0.２４μg の dＣ−テイルした cＤＮＡを得た。こ
の cＤＮＡは約１３個の dＣＭＰ残基が３’両末端に付
加されていた。

【００２５】（ホ）一方、図１に示したようにサル細胞
（ＣＯＳ細胞）での cＤＮＡ発現ベクターｐＱを pＣＥ
ＩＬ−２（Nature, 302, 305 (1983))から構築した。ｐ
Ｑは cＤＮＡを両向きのＳＶ４０初期プロモーターには
さみこみができ、 cＤＮＡがどちらの方向に挿入されて
もＣＯＳ細胞中で cＤＮＡにコードされるペプチド蛋白
を発現させることができる。また、Ｅ．coli中でも複製
可能で、テトラサイクリン耐性として選択することがで
きる。このｐＱをＰstＩで切断し、先程の dｓ− cＤＮ
Ａの３’端の両端に dＣ tail をつけたのと全く同じよ
うに dＧ tail を１３個前後付与した。次にこの dＧ−
tailed ｐＱ１００ｎg と dＣ−tailed dｓ− cＤＮＡ
２０ｎg を５０ mＭ Tris−ＨCl, pＨ7.5、 0.１Ｍ N
aCl 、１ mＭ ＥＤＴＡの溶液に混合し、まず６５℃で
２分間、ついで４５℃で６０分間、３７℃で６０分間、
そして室温で６０分間インキュベートした。そしてこの
アニーリングしたＤＮＡをコンピテントなＥ．coli Ｍ
Ｃ１０６１に導入した。次にＭＣ１０６１のコンピテン
ト細胞の作り方、導入法を以下に示す。

【００２６】Ｅ．coli ＭＣ１０６１を１００mlのΨ培
地（２％トリプトン、0.５％酵母エキス、0.５％ MgSO₄
・７H₂0, pＨ7.６）に接種し、培養液の吸光度が５５０
nｍで0.３〜0.５付近になるまで３７℃で振盪培養し
た。培養終了後、培養液を５分間、０℃に保持し、菌体
を遠心分離により集め、ＴfbＩ（３０ mＭ酢酸カリウ
ム、１００ mＭ RbCl、１０ mＭ CaCl₂ 、５０ mＭ M
nCl₂、１５％グリセリン、pＨ5.８）の４０mlに懸濁
し、０℃に５分間静置した。再び菌体を遠心分離により
集め、Ｔfb II （１０ mＭ MOPS or PIPES, ７５ mＭ C
aCl₂、１０ mＭ RbCl 、１０％グリセリン、 pＨ6.5)の
４０mlに懸濁し、０℃で１５分間静置した。この懸濁液
を分注して−７０℃に保存した。次にこのように調製し
たコンピテント細胞の１００μl を１５分間、０℃に保
持し、この中に先程 dＧ−tailed ｐＱ vector と dＣ
−tailed cＤＮＡとをアニールした標品１０μl および
５０ mＭ MgCl₂,１０ mＭ CaCl₂の溶液９０μlとを混
合し、０℃で２０分間静置する。ついで３７℃で６０秒
間熱処理後、１〜２分間、０℃に保持し、これにΨ培地
１mlを加え、３７℃で６０分間振とう培養した。この培
養液を１５μg ／mlのテトラサイクリンと２５μg ／ml
のストレプトマイシンを含むＬ培地（１％トリプトン、
0.５％酵母エキス、0.５％ NaCl ）の寒天プレートに塗
抹し、３７℃で一晩インキュベートするとコロニーが出
現した。

【００２７】（ヘ）得られた形質転換株約１５0,０００
クローンに対し、プローブ８−１、および８−２を用い
てGrunstein, Mら Methods in Engymology, 68, 379 (1
979)の方法でコロニーハイブリダイゼーションを行った
ところ、８−１とハイブリダイズする株が１０クローン
認められた。さらにこれらの１０クローンに対してプロ
ーブ３−１〜３−６を用いて、同様の方法でコロニーハ
イブリダイゼーションを行ったところプローブ３−２と
ハイブリダイズする株１クローンを得た。本クローンが
保持するプラスミドＤＮＡを粗抽出精製し、制限酵素Ｐ
stＩで切断後、 cＤＮＡインサートをアガロース電気泳
動にてｐＱベクターと分離した。プローブ８−１、プロ
ーブ３−２、プローブＮ−２またはプローブＮ−５を用
いてサザンハイブリダイゼーション分析を行ったところ
いずれのプローブともハイブリダイズした。その他のプ
ローブとはハイブリダイズしなかった。このプラスミド
ＤＮＡを pＢＳＦ２−３８と名づけた。すなわち本 pＢ
ＳＦ２−３８のもつ cＤＮＡインサートはＢＣＤＦ活性
をもつ蛋白の明らかにされた部分アミノ酸配列に相当す
る遺伝子配列を有することが明らかであり、本 cＤＮＡ
はＢＣＤＦ遺伝子であると同定した。

【００２８】実施例５ （イ） pＢＳＦ２−３８プラスミドＤＮＡを大量調製す
るために本 pＢＳＦ２−３８を保持するＭＣ１０６１を
２０μg ／mlのテトラサイクリンと２５μg ／mlのスト
レプトマイシンを含むΨ培地１００mlに接種し、３７℃
で５〜７時間振盪培養した。次に最終濃度１７０μg ／
mlとなるようにクロラムフェニコールを含む新たなΨ培
地１００mlを加え、さらに一晩振盪培養した。このよう
にして増幅されたプラスミドＤＮＡを以下のように精製
した。培養液を遠心分離により菌体のみ集め、５０ mＭ
Tris−ＨCl， pＨ7.５の５mlに懸濁し−８０℃に凍結
後、融解して次にリゾチーム（最終濃度、２mg／ml）を
加えて０℃で１０分間静置し、さらにＥＤＴＡ（最終濃
度0.１Ｍ）を加え、０℃で１０分間静置する。その後、
Triton X-100 （最終濃度0.１％）を加えて０℃で６０
分間静置する。ついで３0,０００rpm 、３０分間遠心分
離し、その上清液を等量の水飽和フェノールで処理す
る。その水層をさらに等量のクロロホルムで処理し、そ
の水層を抽出し、これに最終濃度２０μg ／mlとなるよ
うにＲＮase を加え、３７℃で６０分間インキュベート
した。その後0.２容の５Ｍ NaCl と1/3 容のポリエチレ
ングリコールを加え、0 ℃に６０分間静置後、１0,００
０rpm ２０分間、遠心分離によりＤＮＡ沈殿を回収す
る。

【００２９】次にこの沈殿を3.８mlの水に溶解し、４ｇ
の CsCl を加えて溶解後、１０mg／mlの EtBr の２００
μl を加えて４0,０００rpm 、１６時間、２０℃で超遠
心分画を行う。遠心終了後、plasmid ＤＮＡ画分を抽出
し、水飽和ｎ−ブタノールの１〜２容で４回抽出操作を
行って EtBr を除く。その後 H₂0中で透析を行って CsC
l を除去後、３Ｍ酢酸ソーダ pＨ5.６の１／１０容を加
え、さらに２容の冷エタノールを加えて、−２０℃で一
晩静置する。このエタノール沈殿を遠心分離で集めて８
０％エタノール水溶液で洗浄後、よく乾燥し、この沈殿
物を１０ mＭ Tris−ＨCl， pＨ7.５の５０μl に溶解
しサル細胞トランスフェクションためのサンプルとし
た。 （ロ）サルＣＯＳ−７細胞へのプラスミドの感染法 ＣＯＳ−７細胞を１×１０⁵ ／mlになる様に１０％牛胎
児血清含有ＲＰＭＩに懸濁し、この３ml分を６cmシャー
レにて５％炭酸ガスインキュベーター内３７℃で一夜培
養した。培養上清を除去し、新しい１０％牛胎児血清含
有ＲＰＭＩ３mlを加え、３７℃、５％炭酸ガスインキュ
ベーター内で２時間培養した。培養後、上清を除去し、
ＴＢＳ（２５ mＭ Tris−ＨCl， pＨ7.５、１３０ mＭ
NaCl 、５ mＭ KCl、0.6 mＭ Na₂HPO₄)2.５mlにて１
回洗浄した。

【００３０】プラスミド混合物（ＴＢＳ（＋）（ＴＢＳ
に0.７ mＭ CaCl₂、0.５ mＭ MgCl₂を加えたもの）1.０
ml、プラスミドＤＮＡ２μg および１０mg／ml DEAE-de
xtran ５０μl を加え、３７℃、５％炭酸ガスインキュ
ベーター内で４時間インキュベート、上清を除去後、Ｔ
ＢＳ2.５mlで洗浄除去し、１５０μM クロロキン含有１
０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ2.５mlを加えた。３７℃、
５％炭酸ガスインキュベーター内で５時間インキュベー
ト後上清を除去し、ＴＢＳ2.５mlで２回洗浄した。１０
％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ３mlを加え、３７℃、５％炭
酸ガスインキュベーター内で一夜培養した。上清を除去
後同ＲＰＭＩ３mlを加え、３７℃５％炭酸ガスインキュ
ベーター内で２日培養した。そしてこの培養上清を遠沈
後その上清をＢＣＤＦ活性測定用サンプルとした。^- Ｃ
ＯＳ培養上清をＣＬ４を用いてＢＣＤＦ活性を測定した
結果を図２および図３に示す。 pＢＳＦ２−３８プラス
ミドＤＮＡを導入したＣＯＳは対照に比べ明らかなＢＣ
ＤＦ活性を示した。

【００３１】このように真核生物細胞ＣＯＳ−７で生産
されたリコンビナントヒトＢＣＤＦは培養液を抗ＢＣＤ
Ｆ抗体固定化カラムを通し、次いで前出の逆相ＨＰＬＣ
（シンクロンＣ₁₈）を用いて精製された。本ＢＣＤＦは
cＤＮＡ構造にＮ−グリコシレーション位置のあること
より糖鎖を含有するものであり、その理化学的性質は実
施例１の方法にてＶＴ−１培養上清により精製された純
化ＢＣＤＦのそれに一致した。すなわち 分子量：3.５±0.５×１0⁴ダルトン（ゲル濾過法） 2.２±0.２×１0⁴ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法) 等電点： pＨ4.９〜5.１ であった。

【００３２】実施例６ 実施例５（イ）により調製した pＢＳＦ２−３８より制
限酵素ＢamＨＩで切り出したＢＣＤＦ cＤＮＡ inser
t をプローブとしてＢＣＤＦ mＲＮＡサイズ、分子種、
ＢＣＤＦ mＲＮＡ産生株の評価を行なった。用いた mＲ
ＮＡは本ＢＣＤＦを産生するＶＴ−１細胞をはじめとし
て他にＢＣＤＦを産生すると考えられるＣＥＳＳ，ＲＰ
ＭＩ１７８８とＢＣＤＦ活性の認められないＣＬ−４、
Jurkat,ＣＥＭ細胞から実施例４の（イ）と同じ方法で
調製したものである。各々 mＲＮＡ１０μg ／3.６μl
、５×ＭＯＰＳ緩衝液（0.１Ｍ ＭＯＰＳ（pＨ7.０）
７５ mＭ NaOAc、５ mＭ ＥＤＴＡ）6.０μl 、ホルム
アルデヒド5.４μl およびホルムアミド１5.０μl を６
０℃１５分間インキュベートし、これに色素液（0.０５
％ブロモフェノールブルーおよび0.０５％キシレンシア
ノール含有８０％グリセロール液）３μl を加えたもの
を調整サンプルとした。本サンプルを１×ＭＯＰＳ緩衝
液、1.８％ホルムアルデヒド含有1.６％アガロースゲル
にて電気泳動し、その後、常法によりニトロセルロース
フィルターにブロッティングした。そして本フィルター
を８０℃３時間ベークした。この様に調製したフィルタ
ーを0.１％ＳＤＳ含有３×ＳＳＣに浸漬後、１×デンハ
ルト溶液、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２５０μ
g ／mlニシンＤＮＡ含有５０ mＭナトリウムリン酸緩衝
液（ pＨ6.５）にて４２％で一夜プレハイブリダイズし
た。そして、１×デンハルト溶液、５０％ホルムアミ
ド、５×ＳＳＣ、２５０μg ／mlニシンＤＮＡ含有５０
mＭナトリウムリン酸緩衝液（ pＨ6.５）中にて³²Ｐラ
ベル化 _PＢＳＦ２−３８のＢamＨＩ cＤＮＡインサート
をプローブとして４２℃一夜ハイブリダイズした。

【００３３】ハイブリダイズしたフィルターを室温で0.
２％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣにて５分間４回、５０℃で0.
２％ＳＤＳ含有0.１×ＳＳＣにて３０分間２回洗浄し、
風乾後、オートラジオグラムを作成した。その結果、Ｖ
Ｔ−１、ＣＥＳＳ（ＢＣＤＦ産生株）、ＲＰＭＩ１７８
８由来のmＲＮＡには pＢＳＦ２−３８の cＤＮＡプロ
ーブはハイブリダイズした。ＢＣＤＦを産生しないと思
われるＣＬ−４、Jurkat, ＣＥＭおよびＢＣＤＦ非産生
ＣＥＳＳ由来の mＲＮＡにはハイブリダイズしなかっ
た。また pＢＳＦ２−３８のcＤＮＡプローブとハイブ
リダイズする mＲＮＡのsizeはほぼ１５〜１６Ｓと推定
された。１部を図４に示す。

【００３４】実施例７ pＢＳＦ２−３８を保持するＭＣ１０６１より実施例５
の（イ）に記した通りプラスミドＤＮＡを得、制限酵素
ＢamＨＩで切り出すことによりＢＣＤＦ cＤＮＡを調製
した。そして制限酵素地図と塩基配列を決定した。塩基
配列はMaxam-Gilbert の化学法 (Meth. Enzym. 65, 499
('80)) およびＭ１３ファージ（Ｊ．Ｍessing et a
l., Gene, 19, 269 ('82))を使ったジデオキシヌクレオ
チド鎖集結法 (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., U.S.A.74, 5463 ('77)の方法により決定した。決
定された塩基配列および制限酵素地図を図５に示す。こ
こに決定されたヒトＢＣＤＦ塩基配列は実施例１、２で
開示されたアミノ酸部分配列構造を全て正確に含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】サル細胞発現用組み換えＤＮＡの構築法を示
す。

【図２】Elisa 法で測定した pＢＳＦ２−３８ＤＮＡを
遺伝子導入したサル細胞ＣＯＳ−７の培養上清のＢＣＤ
Ｆ活性を示す。

【図３】リバース・プラーク法により測定した pＢＳＦ
２−３８ cＤＮＡを遺伝子導入したサル細胞ＣＯＳ−７
の培養上清のＢＣＤＦ活性を示す。

【図４】pＢＳＦ２−３８ cＤＮＡインサートをプロー
ブとするノーザンブロッティング分析を示す。

【図５】ＢＣＤＦの塩基配列を示す。

【図６】ＢＣＤＦの制限酵素地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 松井 裕 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 高原 義之 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチド
   をコードする遺伝子及び真核生物の細胞中で複製可能な
   ベクターＤＮＡよりなる組み換えＤＮＡ体により形質転
   換された真核生物細胞を培地中にて培養し、生産された
   ヒトＢＣＤＦを採取することを特徴とするヒトＢＣＤＦ
   の製造法。
2. 【請求項２】 真核生物がサッカロミセス属に属するも
   のである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 真核生物の細胞が大型Ｔ抗原を構成的に
   発現するＳＶ−４０で形質転換されたサル細胞である請
   求項１記載の方法。