CN108949870A - 一种生产重血小板源生长因子的方法 - Google Patents

一种生产重血小板源生长因子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产重血小板源生长因子的方法，属于生物技术领域。本发明方法包括：1)构建含有血小板生长因子目的基因的重组CHO细胞株，2)一级种子培养，3)二级种子培养，4)反应器连续流加培养，5)收集上清进行纯化准备。通过本发明提供的在CHO细胞中表达生产rhPDGF‑BB的方法，该方法工艺简单，可以规模化生产，有广阔的应用前景。

Description

一种生产重血小板源生长因子的方法
技术领域
本发明涉及一种生产重血小板源生长因子的方法，属于生物技术领域。
背景技术
重组血小板源生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)是贮存于血小板α颗粒中的一种碱性蛋白质，是低分子量促细胞分裂素。能刺激停滞于G0/G1期的成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞等多种细胞进入分裂增殖周期。血小板源生长因子PDGF于1974年发现的一种刺激结缔组织等组织细胞增长肽类调节因子，因其来源于血小板而得名，正常生理状态下存在于血小板的α颗粒内，当血液凝固时由崩解的血小板释放出来并且被激活，具有刺激特定细胞趋化与促进特定细胞生长的生物活性。此外，在组织受到损伤时巨噬细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、胚胎干细胞等也可以合成并释放PDGF。肝脏受损时，巨噬细胞、血小板、浸润的炎细胞、受损的内皮细胞及激活的肝星形细胞均可以分泌PDGF，以自分泌、旁分泌的方式发挥作用。
结合的PDGF是分子量为30KD的热稳定糖蛋白，是靠二硫键相连的A、B两条多肽链组合成的二聚体。常见的血小板源生因子PDGF是由两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体，其分子量为28-31KDa，可形成PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB三种异构体。在人类血小板来源中约85％-90％为AB型(分子量为22.5KDa，其中A链为13.3KDa，B链为12.2KDa)，约10％-15％为BB型。老年人的血小板也可含有多量的PDGF-BB，高达30％，而新鲜的血小板也可含有高达27％的PDGF-AA。PDGF亚型的浓度是直接与创口愈合过程相关的。本发明涉及的重组血小板源生长因子为PDGF-BB(以下简称为rhPDGF-BB)。
血小板源生长因子是平滑肌细胞、成纤维细胞以及其他间叶组织来源细胞的特异性促分裂因子和趋化因子，在肿瘤细胞自分泌促进生长过程中有调节作用，血小板源生长因子受体(PDGFR)在多种实体肿瘤上皮细胞和血管周细胞中均有表达，PDGFR的过表达、过度活化以及调控肿瘤内血管生成均会促进肿瘤生长。PDGF及其受体抑制剂靶向抑制PDGFR信号传导通路可阻滞肿瘤生长的自分泌刺激和肿瘤新生血管的生成，同时，PDGFR的活化在提高肿瘤组织间隙压上起关键作用，阻断PDGFR激活可以降低实体肿瘤组织间隙压从而增强药物传送能力。
当人体某个组织受损时，凝血块会止住出血。形成血块不能少了血小板，它聚集在出血点，形成物质屏障防止血液进一步流失。与此同时，血小板释放出几种生长因子－最主要的是血小板源生长因(PDGF)－刺激邻近的结缔组织细胞生长。这些结缔组织细胞是重建受损组织、愈合创口的先锋队。PDGF是创伤愈合过程中较早出现的生长因子之一，在创面愈合的全过程中起重要作用,主要表现在促进创面愈合方面。血小板源生长因子PDGF在重度烧伤、皮肤病患、骨骼与牙齿缺损与再生已经关节修复方面的应用也取得了巨大的进展；血小板源生长因子PDGF是祛皱抗衰的新秀，作用于真皮层的成纤维母细胞法，可以通过真皮层微介术被受体细胞真正吸收，达到很好抗衰除皱效果。
继PDGF-A链和PDGF-B链的氨基酸序列被报道后，关于PDGF的研究工作迅速开展起来。20世纪80年代初期美国就开始对PDGF展开研究，到80年代末90年代初取得了实质性进展，并申请了大量专利，形成了PDGF的核心技术。其中Chiron公司研究获得突破，通过重组DNA技术，制备了PDGF-A A，并申请了专利。此外，其他许多公司对该项目也投入了大量研究，其中有关于PDGF-BB、PDGF-AB的制备技术和PDGF药物的作用等研究工作31。据统计，美国有关PDGF的专利有46个，主要针对其载体及表达菌株的构建、相关疾病的治疗研究等方面。
关于PDGF-BB的表达生产工艺，在酵母表达载体和大肠杆菌中均有较多报导，大肠杆菌和酵母菌表达表达系统表达量较高，能有效降低生产成本，然而这两种系统二硫键和翻译后修饰等功能较弱，表达的蛋白翻译后修饰与目的蛋白会有一定的差异。PDGF-BB含有8个二硫键和2个O-糖基化位点，在大肠杆菌或酵母菌系统中表达翻译后修饰结构会与人PDGF-BB结构有显著的差异，这对于药物的安全性和有效性会有很大的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达生产重组血小板源生长因子的方法。
本发明首先提供了一种表达生产rhPDGF-BB的重组CHO细胞株，将来源于人的rhPDGF-BB基因正确置于表达载体pCHO1.0，转化CHO细胞株，经筛选建立分泌表达rhPDGF-BB的工程细胞株。所述rhPDGF-BB氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了应用所述重组CHO细胞株表达生产重组血小板源生长因子的方法，包括以下步骤：
1)一级种子培养，
2)二级种子培养，
3)反应器连续流加培养，
4)收集上清进行纯化准备。
进一步地，步骤1)一级种子培养，是用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增培养，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增3次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml。
进一步地，步骤2)二级种子的制备，是用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级种子细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增2次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml。
进一步地，步骤3)所述反应器连续流加培养，是用基础培养基将二级种子细胞按1.0×106个/ml的接种密度稀释至2L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L；搅拌转速设置为280r/min；pH设置为6.95±0.15，pH值通过碳酸氢钠溶液和CO2进行调节；溶解氧设置为40±20％，氧气气体流量为1.5～400ml/min，根据溶氧消耗情况调整氧气气体流量；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃，第5天降温至33.5±0.5℃，发酵14天结束。
进一步地，连续流加培养过程中，第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL；当葡萄糖浓度低于2.0g/L时，补加葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度增至4.0g/L。
进一步地，所述种子培养基为：CD CHO AGT 24.6g/L；所述基础培养基为：DynamisAGT 24.8g/L；所述补料培养基为：EfficientFeed C+AGT 176.4g/L；葡萄糖浓缩液为：葡萄糖200g/L；碳酸氢钠溶液为：NaHCO3 90.7g/L。
进一步地，步骤4)中，将发酵培养液经过离心处理后，先采用Q Sepharose FastFlow(GE)填料在4℃条件下，用0.5M NaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2MNaCl平衡后上样，上样，收集穿透液，用pH3.5的20mM NaAC-HAC溶液对穿透液进行稀释，稀释1倍；然后采用SP Sepharose FastFlow(GE)填料在4℃条件下，用0.5M NaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mM NaAC-HAC平衡，之后上样，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2M NaCl溶液和pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液洗出杂蛋白后，再用pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠+0.5M NaCl溶液洗脱重组血小板源生长因子，收集重组血小板源生长因子。
本发明的有益效果：
本发明提供的重组血小板源生长因子在CHO细胞中的表达和流加培养方法，在2L反应器水平上可使目的蛋白浓度达到1.2g/L，且方法简单，蛋白糖基化程度明显优于大肠杆菌表的结果，与人血提取的结构基本一致，安全性和有效性好，具有很好地应用前景。
附图说明
图1rhPDGF-BB表达过程中活细胞数变化曲线
图2rhPDGF-BB表达过程中细胞活率变化曲线
图3rhPDGF-BB表达过程中蛋白产量累积图
具体实施方式
种子培养基：CD CHO AGT 24.6g/L；基础培养基：Dynamis AGT 24.8g/L；补料培养基：EfficientFeed C+AGT 176.4g/L；上述培养基均购自Gibco。
葡萄糖浓缩液：葡萄糖200g/L；
碳酸氢钠配置方法为：NaHCO3 90.7g/L。
实施例1重组细胞株的构建
利用常规的DNA重组技术将rhPDGF-BB基因正确置于CHO细胞表达载体，转化CHO细胞，经筛选建立分泌表达rhPDGF-BB的重组细胞株。参考书有《分子克隆技术指南》，《分子生物学指南》，《动物细胞培养》。
实施例2重组细胞株的复苏
将种子培养基放置水浴锅中，37±0.5℃预热20min以上，取一支工作库细胞，37±0.5℃水浴速融，控制融解时间120±30s内，将细胞移入8.5ml种子培养基的15ml离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，用5ml的种子培养基重悬细胞并转移到125ml摇瓶内，补充体积至30±5ml，混合均匀后取0.5ml计数，后置于36.5±0.5℃、6±1％CO2、130rpm的摇床中培养3±1天。
实施例3一级种子的制备
用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中，混匀后取样0.5ml细胞液用于计数。摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min，每次扩增培养3±1天，活细胞密度不超过6.0×106个/ml，扩增3次。
实施例4二级种子的制备
用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级种子细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中，混匀后取样0.5ml细胞液用于计数。摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min，每次扩增培养3±1天，活细胞密度不超过6.0×106个/ml，扩增2次。
实施例5反应器连续流加培养
用基础培养基将二级种子细胞按1.0×106个/ml的接种密度稀释至2L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L；设置搅拌转速为280r/min；pH设置为6.95，DeadBand设置为0.15；溶解氧设置为40％，(培养液中饱和空气的溶解氧定为100％)，根据DO消耗情况调整通气，氧气气体流量为1.5～400ml/min；前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至33.5℃；培养第14天收获。
(1)第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于2.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0g/L。培养过程中的细胞密度和活力分别如图1和图2所示，最终培养上清液中血小板源生长因子蛋白含量达到1.2g/L。
(2)第4、6、8、10、12天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于2.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0g/L。最终培养上清液中血小板源生长因子蛋白含量达到0.85g/L。
(3)第3、5、7天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于2.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0g/L。最终培养上清液中血小板源生长因子蛋白含量达到0.97g/L。
(4)第5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于2.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0g/L。培养过程中的细胞密度和活力分别如图1和图2所示，最终培养上清液中血小板源生长因子蛋白含量达到0.74g/L。
(5)第5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于2.5g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0g/L。最终培养上清液中血小板源生长因子蛋白含量达到0.97g/L。
(6)第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL，最终培养上清液中血小板源生长因子蛋白含量达到0.62g/L。
实施例6蛋白纯化
培养液经过离心处理后，采用Q Sepharose Fast Flow(GE)填料在4℃条件下，用0.5MNaOH，2MNaCl处理后，用pH3.5的20mMNaAC-HAC+0.2MNaCl平衡后上样，上样，收集穿透液，用pH3.5的20mMNaAC-HAC溶液对穿透液进行稀释，稀释1倍。
采用SP Sepharose FastFlow(GE)填料在4℃条件下，用0.5M NaOH，2M NaCl处理后，用pH3.5的20mMNaAC-HAC平衡，之后上样，用洗脱缓冲液(pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2MNaCl溶液)和pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液洗出杂蛋白后。再用洗脱缓冲液pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠+0.5MNaCl溶液洗脱目的蛋白，收集目的蛋白。
实施例7蛋白质量分析
对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，同时采用市售PDGF-BB蛋白作为对照，市售PDGF-BB有两种分别来自人血提取和大肠杆菌表达。结果如表1所示，本方法表达的PDGF-BB分子量与人血提取的一致，分子量约为31kD，均大于大肠杆菌表达的蛋白(25kD)，这表明本方法表达的PDGF-BB结构和糖基化与人血提取的基本一致。
表1PDGF-BB电泳对比结果
样品 分子量(kD)
PDGF-BB(CHO细胞表达) 31
PDGF-BB(人血提取) 31
PDGF-BB(大肠杆菌细胞表达) 25
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州锐妥欣生物技术有限公司
<120> 一种生产重血小板源生长因子的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 109
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys
1 5 10 15
Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg
20 25 30
Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln Arg
35 40 45
Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln
50 55 60
Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys
65 70 75 80
Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala
85 90 95
Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr
100 105

Claims (9)

1.一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，将来源于人的rhPDGF-BB基因置于表达载体pCHO1.0中，转化CHO细胞株，获得分泌表达rhPDGF-BB的工程细胞株，培养该工程细胞株使之生产重组血小板源生长因子，包括以下步骤：
1)一级种子培养，
2)二级种子培养，
3)反应器连续流加培养，用基础培养基将二级种子细胞按1.0×106个/ml的接种密度稀释至2L细胞培养反应器中，得到1L的二级种子细胞与基础培养基混合物；搅拌转速设置为280r/min；pH设置为6.95±0.15，pH值通过碳酸氢钠溶液和CO2进行调节；溶解氧设置为40±20％，氧气气体流量为1.5～400ml/min，根据溶氧消耗情况调整氧气气体流量；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃，第5天降温至33.5±0.5℃，发酵14天结束；连续流加培养过程中，第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL；当葡萄糖浓度低于2.0g/L时，补加葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度增至4.0g/L。
2.根据权利要求1所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，步骤1)一级种子培养，是用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增培养，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增3次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，步骤2)二级种子的制备，是用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级种子细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增2次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml。
4.根据权利要求2或3所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，所述种子培养基为：CD CHO AGT 24.6g/L。
5.根据权利要求1所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，所述基础培养基为：Dynamis AGT 24.8g/L；所述补料培养基为：EfficientFeed C+AGT176.4g/L；葡萄糖浓缩液为：葡萄糖200g/L。
6.根据权利要求2所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，步骤4)中，将发酵培养液经过离心处理后，先采用Q Sepharose Fast Flow填料在4℃条件下，用0.5M NaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2M NaCl平衡后上样，上样，收集穿透液，用pH3.5的20mM NaAC-HAC溶液对穿透液进行稀释，稀释1倍；然后采用SPSepharose FastFlow填料在4℃条件下，用0.5M NaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mMNaAC-HAC平衡，之后上样，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2M NaCl溶液和pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液洗出杂蛋白后，再用pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠+0.5M NaCl溶液洗脱重组血小板源生长因子，收集重组血小板源生长因子。
7.根据权利要求1所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，所述rhPDGF-BB氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.一种表达生产rhPDGF-BB的重组CHO细胞株，其特征在于，将来源于人的rhPDGF-BB基因正确置于表达载体pCHO1.0，转化CHO细胞株，经筛选建立分泌表达rhPDGF-BB的工程细胞株。
9.根据权利要求8所述的一种表达生产rhPDGF-BB的重组CHO细胞株，其特征在于，所述rhPDGF-BB氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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