CN110240642B

CN110240642B - 新型胸腺肽

Info

Publication number: CN110240642B
Application number: CN201910541745.1A
Authority: CN
Inventors: 吴建中
Original assignee: Disai Bio Pharmaceutical Co ltd Xian
Current assignee: Disai Bio Pharmaceutical Co ltd Xian
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: CN110240642A

Abstract

本发明提供了新的胸腺肽α1衍生多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。本发明还提供了包含该多肽的药物组合物，用于提高免疫力和抗肿瘤等。

Description

新型胸腺肽

技术领域

本发明属于蛋白质或多肽技术领域，具体而言，本发明涉及新的胸腺肽α1衍生多肽及其药物组合物，用于提高免疫力和抗肿瘤等。另外，本发明还涉及上述化学产品的制备方法和医药应用等。

背景技术

胸腺肽α1，即胸腺素α1(Thymosinα1)，是Goldstein等1977年首次在胸腺组织内发现。成熟的胸腺肽α1由28个氨基酸组成，其氨基酸结构为：Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。

胸腺肽α1作用于胸腺细胞成熟的早期和晚期，促进TH细胞成熟，并能在体内刺激巨噬细胞抑制因子(MIF)、干扰素(IFN)、白细胞介素-2(IL-2)及其受体的表达，增强人体NK细胞活性。因此，目前胸腺肽α1已广泛作为免疫增强剂用于临床治疗各种免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤及病毒等微生物感染疾病(如慢性病毒性肝炎等)。

胸腺肽α1的氨基酸结构自其被解析以来就很少有新的衍生结构被开发，诸如本发明人早期专利ZL200410087075等的现有技术大都是改变其末端(尤其是C端)的衍生基团。本发明人没有受现有技术的局限，开发出一种新型胸腺肽α1衍生多肽，不但保留了胸腺肽α1的提高免疫力的功能，令人意外地还提高了抗肿瘤活性。而且，该新型胸腺肽α1衍生多肽能够利用本发明人现有的表达和纯化系统，方便规模化放大。

发明内容

本发明的要解决的技术问题在于提供新的多肽及其药物组合物。另外，本发明还涉及上述化学产品的制备方法和医药应用等。

具体而言，在第一个方面，本发明提供了多肽，其氨基酸序列

(1)如SEQ ID NO：2所示；或

(2)是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。

本发明的第一个方面的多肽的氨基酸序列可以是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个(优选一个至五个，更优选一个至三个)氨基酸残基而得的氨基酸序列。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。在本发明的具体实施方式中，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的第一个方面的多肽相对于胸腺肽α1的抗肿瘤活性提高，即本发明的第一个方面的多肽比等量的胸腺肽α1的抗肿瘤活性更高。在本文中，胸腺肽α1可以同天然的胸腺肽α1互换使用，其氨基酸序列为Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。本发明的第一个方面的多肽是一种新的胸腺肽α1衍生多肽，或称新型胸腺肽α1，是以天然的胸腺肽α1的结构为基础构建的。在本发明的具体实施方式中，肿瘤是黑色素瘤。

在第二个方面，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的第一个方面的多肽。本发明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以获得编码本发明的第一个方面的多肽的核酸分子或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过培养宿主细胞进行增殖。优选本发明的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该优选序列优化了在酵母中的分泌表达。

在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二个方面所述的多核苷酸。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”或“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His,Leu,Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。本发明的载体优选为真核载体，更优选是酵母表达载体。

在第四个方面，本发明提供了细胞，其含有本发明第二个方面所述的多核苷酸。该细胞可以用本发明第三个方面所述的载体转化或转染而获得。细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。合适的转化或转染方法包括但不限于：用于细菌细胞，如氯化钙法、电穿孔法；用于酵母细胞，如电穿孔法和原生质体融合法；用于哺乳动物细胞等，如质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法。优选本发明的细胞是酵母细胞。

在第五个方面，本发明提供了制备本发明的第一个方面的多肽的方法，其包括在适合蛋白质表达的条件下培养本发明第四个方面所述的细胞，然后从培养物中分离出本发明的第一个方面的多肽。分离的方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱(又称为分子尺寸排阻色谱)，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，等电聚焦以及变性/复性处理等。

在第六个方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明的第一个方面的多肽和药学上可接受的载体。本文中所用的“药物组合物”或“药物”或“药品”，如不特别指明，指的是人用的药物组合物或药物或药品。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。本领域的技术人员可以根据治疗目的、给药途径(如注射或口服)的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如冻干剂、片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂或喷雾剂，更优选该药物组合物为口服制剂，如片剂、胶囊，优选是肠溶片。优选其中的药学上可接受的载体是微晶纤维素、乳糖、二氧化硅和/或淀粉。

在第七个方面，本发明提供了本发明的第一个方面的多肽在制备提高免疫力和/或抗肿瘤的药物中的应用。该应用可以是本发明的第一个方面的多肽单独在制备药物中的应用，也可以是联合其他活性成分在制备药物中的应用。

优选在本发明第七个方面的应用中，提高免疫力是促进T细胞的结花率的提高。

也优选在本发明第七个方面的应用中，肿瘤是黑色素瘤。

本发明取得的有益效果在于：在对胸腺肽α1的结构改造归于沉寂的现状下，本发明提供了新型的胸腺肽，不但保留了等量胸腺肽α1提高免疫力的功效，而且抗肿瘤效果显著优于等量胸腺肽α1.

为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。

以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

具体实施方式

以下实施例将具体描述本发明，其中如有未详尽之处，可参见《分子克隆实验指南》、《细胞实验指南》等实验手册所述的方法进行，或者根据实验中具体用到的试剂、仪器的厂商所提供的说明书或手册来进行。

实施例1本发明的多肽的制备

经长期研究，本发明人研发了本发明的多肽及其在酵母中的优化表达基因列，其中，该基因的核苷酸如SEQ ID NO：1所示，其编码的本发明的多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。简而言之，用如SEQ ID NO：3和4所示的上下游引物以委托合成的该基因为模板，进行PCR扩增，扩增产物经EcoR I和Xba I双酶切后连接到pPICZαA(可购自Invitrogen公司)的EcoR I和Xba I的多克隆位点之间，经测序确认正确后，将阳性质粒转化入酵母GS115株(可购自Invitrogen公司)中，以Zeocin筛选出阳性酵母细胞。

将构建好的阳性酵母细胞接种于25ml种子培养基，于30℃、220rpm震荡培养，直至OD600达到4.5，其中种子培养基的配方为：2％(W/W)蛋白胨、1％(W/W)酵母提取物、1.34％(W/W)YNB(无氨基酵母氮源)、4*10^-5％(W/W)生物素、和0.05M pH7.2磷酸缓冲液。然后，将25ml种子培养产物接种入100ml发酵培养基中，于30℃、200rpm震荡培养，每12小时补加甲醇至0.5％(V/V)，培养48小时，其中发酵培养基的配方为：2％(W/W)蛋白胨、1％(W/W)酵母提取物、1.34％(V/V)YNB(无氨基酵母氮源)、4*10^-5％(W/W)生物素、0.5％(V/V)甲醇和0.05M pH7.2磷酸缓冲液。然后，于4℃、1500rpm离心发酵培养产物，保留上清液，上样于Sephadex G-50层析柱，以0.05MpH7.2磷酸缓冲液进行洗脱，收集280nm紫外检测出的最大洗脱峰，经SDS-PAGE检测，其分子量约为4.4kDa，归一计算其表达量为5.3g/L。然后将收集的洗脱峰冷冻干燥，于-20℃保存，即制备出本发明的多肽。

另外，取胸腺肽α1，并委托合成了Tyr-Gly-Gly-Phe-Met五肽，作为对照多肽。

实施例2免疫活性的测定

参照中国专利ZL200410087075所述的脱E受体法，分别检测一定浓度的本发明的多肽(A)、胸腺肽α1(B)和Tyr-Gly-Gly-Phe-Met五肽(C)对T细胞的E玫瑰花结数的影响。其中，空白对照是Hank’s液，每个浓度样品重复三次。结果如表1所示。

表1

由表1可见，与空白对照相比，五肽在中低浓度下对T细胞的结花率的促进作用并不显著，甚至在高浓度下都具有并不显著的抑制作用；本发明的多肽和胸腺肽α1都能以剂量依赖方式促进T细胞的结花率的提高，两者在相同浓度下地促进作用相当。结果表明，本发明的多肽保留了胸腺肽α1的提高免疫力的作用，尽管其功效与等量的胸腺肽α1相当，但是考虑到其中还包括了对提高免疫力作用不显著的五肽部分，其中的胸腺肽α1部分的占比比天然的胸腺肽α1小，因此本发明的多肽的提高免疫力的效果超出了其中五肽部分和胸腺肽α1部分的加和效果，实际取得了协同增效的效果。

实施例3抗肿瘤活性的测定

本实施例研究一定浓度的本发明的多肽(A)、胸腺肽α1(B)和Tyr-Gly-Gly-Phe-Met五肽(C)对黑色素瘤细胞B16F10(可购自上海美轩生物科技有限公司)增殖的抑制作用。具体而言，收集对数生长期的B16F10细胞，重悬于含0.25％的RPMI 1640完全培养基中，并用该培养基稀释至5*10⁵个细胞/mL，接种于96孔板上，每孔0.1mL，于37℃培养8小时，然后每孔分别加入A、B和C达到一定浓度，空白对照则加入上述培养基，36小时后通过MTT法测量细胞数量，计算细胞增殖的相对抑制率((空白对照的吸光度-实验组的吸光度)/空白对照的吸光度*100％)。每个浓度样品重复三次。结果如表2所示。

表2

由表2可见，本发明的多肽、胸腺肽α1和五肽在不同浓度下均以剂量依赖方式抑制B16F10细胞的增殖，其中本发明的多肽的抑制效果显著优于相同浓度下的胸腺肽α1和五肽。结果表明，以本发明的方式构建的多肽在抗肿瘤方面能取得协同增效的效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 西安迪赛生物药业有限责任公司

<120> 新型胸腺肽

<130> CN

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 新型胸腺肽基因

<400> 1

atgtatggcg gctttatggg cggcagcgat gcggcggtgg ataccagcag cgaaattacc 60

accaaagatc tgaaagaaaa aaaagaagtg gtggaagaag cggaaaacta tggcggcttt 120

atgtaa 126

<210> 2

<211> 41

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 新型胸腺肽

<400> 2

Met Tyr Gly Gly Phe Met Gly Gly Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser

1 5 10 15

Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu

20 25 30

Glu Ala Glu Asn Tyr Gly Gly Phe Met

35 40

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 3

cggaattcga tgtatggcgg c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 4

gctctagatt acataaagcc g 21

Claims

1.多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。

3.权利要求2所述的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.载体，其包含权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.细胞，其包含权利要求2或3所述的多核苷酸。

6.制备权利要求1所述的多肽的方法，其包括在适合蛋白质表达的条件下培养权利要求5所述的细胞，然后从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

7.药物组合物，其包括权利要求1所述的多肽和药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的多肽在制备提高免疫力的药物中的应用。

9.权利要求1所述的多肽在制备抗肿瘤的药物中的应用。