CN1050632C - 抗肿瘤的新型人α型干扰素及其突变体的制法和用途 - Google Patents

Abstract

采用DNA重组技术研制成一类高效的抗病毒、抗肿瘤药物：人干扰素α1/114Ala与国外投放市场的人干扰素α2a和2b比较，治疗乙型、丙型肝炎具有疗效高、临床副作用小的优点；人干扰素α1/86ASp的生物学活性比其母体有明显提高；甲硫氨酸脑啡肽人α型干扰素融合蛋白的镇痛作用和抑瘤作用均比母体分子有明显提高。

Description

抗肿瘤的新型人α型干扰素及其突变体的制法和用途

本发明涉及一类新型、高效的抗肿瘤、抗病毒和免疫调节药物—新型人α型干扰素和它们的衍生物制作技术及其用途。这类新型干扰素与现有干扰素比较，具有活性高或特异性强或副反应小的优点。

干扰素是一类重要的细胞素，它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节等多种生物学活性。经10多年临床应用研究表明，它是一种重要的抗病毒、抗肿瘤治疗药物。

迄今所知，人、小鼠、牛、马等哺乳动物的干扰素均有α、β、γ等三个型别。其中α型中又有许多亚型，可分为两大家族。人干扰素的第I类家族(HuIFN-αI)有15～20个基因成员，其中大部分都编码功能蛋白，彼此在核苷酸水平上有大约90％的同源性；而人干扰素的第II类α家族(HuIFN-αII)有5-6个成员，后者与αI家族有50％的同源性，其中大部分是伪基因，但其中ω型干扰素具有生物学活性；人的β型干扰素(HuIFN-β)和γ型干扰素(HuIFN-γ)公认的只有一个亚型。人的α、β干扰素结构基因位于第9对染色体的短臂上，而人γ干扰素基因位于第12对染色体的长臂上。

1986年美国FDA首先批准基因工程α2a干扰素(Roche公司)和α2b干扰素(Schering公司)投放市场；基因工程β、γ干扰素也相继于1990年、1993年获准投放市场。目前有57个国家批准上市干扰素治疗约30多种疾病。

现有的α干扰素制剂，包括干扰素α2a、2b、自然白细胞干扰素和由类淋巴母细胞产生的Namalwa干扰素均不具备针对肿瘤细胞的特异性，效疗尚不理想，大剂量时有不良反应等缺点。

人α1型干扰素基因的变异与分类

根据人α1和α型干扰素基因的保守序列所设计的上游引物为：5′TCTGGCCTGTGATCTCCCTG 3′；下游引物为3′TTCCTTATTGTAGACCTAGGTGT～5′。以上述引物，采用PCR技术，从正常中国人胎肝细胞DNA中克隆出一种IFN-α1的新变种，IFN-α1/158Val，即与Nagata等克隆的IFN-α1cDNA序列比较，在第541位核苷酸为G，而不是T，从而导至第158位氨基酸为Val，而不是Leu。分别克隆2次，均证明序列相同。

采用PCR技术，检查20份正常中国人周围血细胞DNA中编码α干扰素的等位基因中第158位为Val的占59％，而为Leu的占41％。

以2.1.的同一引物，采用PCR技术，从正常中国人外周血细胞DNA中克隆出另一个α型干扰素的新变种，IFN-α1/31Val/56Ala/158Val，即与Nagata等克隆的IFN-α1 cDNA序列比较，分别在第95,171,476位有3处变异，导致第31位氨基酸为Val，而不是Met，第56位氨基酸为Ala，而不是Val；第158为氨基酸为Val，而不是Leu。分别克隆2次，均证明序列相同。

根据我们发现的人α1型干扰素等位基因的变异，我们将由Goeddel等从KGI细胞克隆的IFN-αD，Nagata等从正常人白细胞克隆的IFN-α1以及我们从正常中国人克隆的IFN-α1/158Val和IFN-α1/31Val/56Ala/158Val分别命名为IFN-α1a，1b，1c，1d。(表1)

                 表1α1和α2型干扰素的等位基因等位基因                  核苷酸序列*                       氨基酸序列#

                 91      167     341     472      31      56     114     1581a                   A        T       T       T       Met     Val    Val     Leu1b                   A        T       C       T       Met     Val    Ala     Leu1c                   A        T       C       G       Met     Val    Ala     Val1d                   G        C       C       G       Val     Ala    Ala     Val

*以去信号肽编码区计算；#成熟干扰素第一个氨基酸计算。

人α1a，1b，1c，1d干扰素基因全序列如下：1a TGTGATCTCC CTGAGACCCA CAGCCTGGAT AACAGGAGGA CCTTGATGCT CCTGGCACAA1b .......... .......... .......... .......... .......... ..........1c .......... .......... .......... .......... .......... ..........1d .......... .......... .......... .......... .......... ..........61 ATGAGCAGAA TCTCTCCTTC CTCCTGTCTG ATGGACAGAC ATGACTTTGG ATTTCCCCAG.......... .......... .......... A......... .......... .................... .......... .......... A......... .......... ..........

.......... .......... .......... G......... .......... ..........121 GAGGAGTTTG ATGGCAACCA GTTCCAGAAG GCTCCAGCCA TCTCTGTCCT CCATGAGCTG

.......... .......... .......... .......... ......T... ..........

.......... .......... .......... .......... ......T... ..........

.......... .......... .......... .......... ......C... ..........181 ATCCAGCAGA TCTTCAACCT CTTTACCACA AAAGATTCAT CTGCTGCTTG GGATGAGGAC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

.......... .......... .......... .......... .......... ..........241 CTCCTAGACA AATTCTGCAC CGAACTCTAC CAGCAGCTGA ATGACTTGGA AGCCTGTGCG

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

.......... .......... .......... .......... .......... ..........301 ATGCAGGAGG AGAGGGTGGG AGAAACTCCC CTGATGAATG TGGACTCCAT CTTGGCTGTG

.......... .......... .......... .......... C......... ..........

.......... .......... .......... .......... C......... ..........

.......... .......... .......... .......... C......... ..........361 AAGAAATACT TCCGAAGAAT CACTCTCTAT CTGACAGAGA AGAAATACAG CCCTTGTGCC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

.......... .......... .......... .......... .......... ..........421 TGGGAGGTTG TCAGAGCAGA AATCATGAGA TCCCTCTCTT TATCAACAAA CTTGCAAGAA

.......... .......... .......... .......... .......... .T........

.......... .......... .......... .......... .......... .G........

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.......... .......... .

.......... .......... .

.......... .......... .

人α1a，1b，1c，1d的氨基酸序列

        5        10        15        20        25        301a  C D L P E T H S L D N R R T L M L L A Q M S R I S P S S C L1b  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1c  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1d  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31  M D R H D F G F P Q E E F D G N Q F Q K A P A I S V L H E L

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IFN-α1/114Ala，/158Val抗病毒活性的特点

HuIFN-α1/114Ala、/158Val在MDBK细胞上的抗病毒活性比WISH高20～30倍左右，而HuIFN-α2a则无差别。

HuIFN-α1/114Ala抑制出血热病毒繁殖的能力比IFN-α2a高15倍，对其他病毒的敏感性也有差别。

IFN-α1/11Ala的临床治疗效果与副反应

用人α1/114Ala干扰素治疗慢性活动性肝炎，每次20微克，头3个月，每日1次，肌肉注射，后3个月，每周2次，肌肉注射，在干扰素治疗后6个月，大月有40％患者有临床反应。主要表现在HBV DNA，HBVe抗原的阴转和e抗体的阳转。

用IFN α1/114Ala治疗毛细胞性白血病，有40％患者完全缓解或部分缓解。

采用α1/114Ala型干扰素治疗丙型肝炎，每次20微克，每周3次，治疗6个月后，40-50％的患者肝功恢复正常。

我们证明，慢性宫颈炎与人乳头瘤病毒感染有关，特别是第16型，此外，II型疱疹病毒、巨细胞病毒和沙眼衣原体感染也有关。采用人α1/114Ala型干扰素治疗后有十分明显的疗效。治疗方案是，1MU，局部贴敷，每周三次，持续二周，60％以上有显效，疗效可维持一年以上。治疗后不仅临床症状有明显改善，II型疱疹病毒和16型人乳头瘤病毒的检出率也大幅度降低。

人α1/114Ala型基因工程干扰素还能有效地防止宫颈人乳头瘤病毒的母婴传播。

人α1/114Ala型干扰素治疗单纯疱疹性角膜炎，每日3-4次，每次1-2滴，浓度为10ug/ml，疗程1周，治愈率达90％以上。

与人α2a或2b干扰素相比，在相同剂量和获得相同疗效的情况下α1/114Ala型干扰素的副反应明显较低，发烧率一般为40％左右，并低于38度。

新型人α1型干扰素--HuIFN-α1/86Asp

HuIFN-α1/86Asp突变体的构建

人α型干扰素有166个氨基酸，其中1和99位Cys，29和133位Cys之间形成二硫键，后者对维持干扰素的生物学活性是重要的。但是，人αI型干扰素在第86位存在第5个Cys，这与该分子易于形成二聚体，与温度不稳定有关。我们采用定位突变技术，将其中编码第86位Cys的TGC改为编码Asp的GAC。为此，设计了20bp的寡核苷酸引物，它与亲本干扰素基因的匹配情况如下：

亲本干扰素模板：5′CTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTAC 3′

  寡核苷酸引物：3′      CTGTTTAAGCTGTGGCTTGA     5′

其中原有的TGC(Cys)，将改变为GAC(Asp)。方法是先将IFN-α1cDNA的EcoRI片段克隆到M13mp8载体中，提出单链作为模板。同时，以EcoRI酶切M13mp8 RF使之也成为线性双链分子，将单链模板与改线性双链分子退火，形成缺口双链分子，再加入提纯的合成引物，退火后，在KIenow及T4DNA连接酶作用下，延伸引物并连接，形成异源双链DNA分子，室温作用4小时后，转化致敏的JM103细胞，再以合成引物为探针，筛选转化产生的白色噬菌斑，在非严条件下，58℃(T℃＝2(A+T)+4(G+C)-3)进行杂交，选出阳性斑。突变体及其母体的核苷酸序列进行了测定，结果证明与原设计完全一致，由于突变体中改变了2个核苷酸，引进了一个Taq I切点(TCGA)，经酶切也获得证明。突变体与母体分子的部分序列如下：

变异前：nt：5′...GAC AAA TTC TGC ACC GAA CTC...3′

        aa：      Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu

变异后：nt：5′...GAC AAA TTC GAC ACC GAA CTC...3′

        aa：      Asp Lys Phe Asp Thr Glu Leu  ～

HuIFN-α1/86Asp突变体分子量测定

采用HuIFN-α1单克隆抗体亲和层析对突变体和母体分子进行纯化。SDS-PAGE表明，突变体和母体分子的分子量均为20000D。

HuIFN-α1/86Asp突变体的抗病毒活性

我们采用pBV220表达载体分别构建了pBV220/HuIFN-α1/86Cys和pBV220/HuIFN-α1/86Asp。以WISH细胞-VSV系统进行抗病毒活性的测定，5次实验结果表明，每毫升培养液的干扰素抗病毒活性单位为：86Cys平均为6709单位；86Asp平均为17151单位(P＜0.001)。

HuIFN-α1/86Asp突变体在4℃的稳定性

突变体和其母体干扰素的滴度均为1∶16000；在4℃放置1个月后，3次实验表明，86Cys的抗病毒活性平均为1∶4458；而86Asp突变体则平均为1∶14532；说明86Asp突变体的抗病毒活性基本不变；而86Cys母体分子的抗病毒活性却只有原来的1/3。

HuIFN-α1/86Asp突变体对不同病毒的抗病毒活性

在Vero细胞上，分别用86Cys和86Asp处理，以如下6种病毒进行攻击：滤泡性口腔炎病毒，CoxBI病毒，Sindbis病毒，3型腺病毒，麻疹病毒，I型单纯疱疹病毒等，以比较突变体和母体干扰素的抗病毒活性。结果表明，突变体干扰素和其母体干扰素对上述6种人类常见病毒的繁殖抑制作用是相近的，这说明，突变体干扰素的抗病毒敏感性与母体干扰素无明显差别。

HuIFN-α1/86Asp突变体的抗细胞分裂活性

突变体干扰素和母体干扰素分别处理Raji细胞，通过H(3)-TdR摄入量的降低来反映细胞分裂受抑制的程度，结果表明，当干扰素的脓度为1000IU/ml，100IU/ml，10IU/ml，1IU/ml时，86Cys的Raji细胞分裂抑制率分别为：20.0±3.1，17.7±2.8，8.2±6.1，3.7±3.3％；而86Asp的Raji细胞分裂抑制率则分别为：36.7±5.3，28.0±5.1，26.7±7.9，19.2±5.6；这说明，突变体干扰素的抗Raji细胞分裂活性比其母体干扰素平均提高2.5倍。

HuIFN-α1/86Asp突变体的NK细胞杀伤活性

采用乳酸脱氢酶(LDH)摄放法测定了突变体及其母体干扰素对NK细胞的杀伤活性。结果说明，突变体干扰素的NK细胞激活活性比其母体干扰素高1.86倍(27.2±4.4对14.6±3.5)。

HuIFN-α1/86Asp突变体质粒的稳定性

pBV220/HuIFN-α1/86Asp传100代后，干扰素表达水平基本不变。

HuIFN-α1/86Asp突变体不仅提高了对温度的稳定性，而且也提高了干扰素的生物学活性。

脑啡肽干扰素融合蛋白(Enk-HuIFN-α1/86Asp)

在干扰素治疗带状疱疹的过程中，病人在干扰素注射后1小时内，神经疼痛明显缓解，说明干扰素有一定镇痛作用。另一方面，脑啡肽(Enk)是存在于动物体内的多肽类生理物质，参与体内神经、免疫、内分泌等生理功能过程的调节；已有证据表明，一些肿瘤细胞，如神经胶质母细胞瘤、小细胞肺癌和结直肠癌等，其胞膜富含δ型阿片受体。我们构建脑啡肽干扰素突变体(Enk-HuIFN-α1/86Asp)在细胞水平和在动物水平证明有较高的抗肿瘤活性和镇痛作用。

Enk-IFN α1/86Asp突变体基因的构建

采用DNA合成技术人工合成Met脑啡肽，与人α1/86Asp型干扰素cDNA的N端连接，两者之间有一3肽作为连接肽。突变体的部分序列如下：

    Tyr Gly Glp Phe Met   Ser Gly Ser   Cys Asp LeuC ATG TAC GCT GGC TTT ATG   TCC GGA TCC   TGC GAC CTG C...EcoRI                               BamHI                 Dde

    (脑啡肽序列)          (连接肽序列) (干扰素序列)

脑啡肽干扰素(Enk-IFN α1/86Asp)基因全序列测定

                          ATG TAC GCT GGC TTT ATG TCC GGA TCC

                          Met Tyr Gly Gly Phe Met Ser Gly SerTGT GAT CTC CCT GAG ACC CAC AGC CTG GAT AAC AGG AGG ACC TTG ATGCys Asp Leu pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu MetCTC CTG GCA CAA ATG AGC AGA ATC TCT CCT TCC TCC TGT CTG ATG GACLeu leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys leu Met AspAGA CAT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG TTT GAT GGC AAC CAG TTCArg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln PheCAG AAG GCT CCA GCC ATC TCT GTC CTC CAT GAG CTG ATC CAG CAG ATCGln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln IleTTC AAC CTC TTT ACC ACA AAA GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG GACPhe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu AspCTC CTA GAC AAA TTC GAC ACC GAA CTC TAC CAG CAG CTG AAT GAC TTGLeu Leu Asp Lys Phe Asp Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp LeuGAA GCC TGT GCG ATG CAG GAG GAG AGG GTG GGA GAA ACT CCC CTG ATGGlu Ala Cyc Ala Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu MetAAT GCG GAC TCC ATC TTG GCT GTG AAG AAA TAC TTC CGA AGA ATC ACTAsn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile ThrCTC TAT CTG ACA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTCLeu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val ValAGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC CTC TCT TTA TCA ACA AAC TTG CAA GAAArg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln GluAGA TTA AGG AGG AAG GAA TAAArg Leu Arg Arg Lys Glu  *

Enk-HuIFN-α1/86Asp表达质粒的构建

利用pBV220表达载体，使脑啡肽干扰素融合蛋白基因置于PRPL启动子的控制下表达。

突变体干扰素的纯化与N端测序。经温度诱导表达Enk-IFN-α1/86Asp，经干扰素单克隆抗体亲和层析后，在SDS-PAGE上呈单一条带。N端测序结果表明，N端15个氨基酸序列无误。

Enk-IFN-α1/86Asp的抗病毒活性

4次实验结果表明，融合蛋白的比活性为：98MU/mg，70MU/mg，85MU/mg和75MU/mg，平均为82MU/mg；与HuIFN-α1/86Cys的比活性无明显差别。

Enk-IFN-α1/86Asp的抑制肿瘤细胞增殖活性

采用H(3)-TdR掺入法测定不同浓度Enk-HuIFN-α1/86Asp对BT325细胞(多形胶质母细胞瘤细胞系)抑制活性。

当干扰素为10，100，1000单位时，Enk-IFN-α1/86Asp的抗肿瘤细胞增殖活性分别为31.6，39.7，47.1；而IFN-α1/86Asp则分别为7.6，13.9，20.1(P＜0.01)。

采用H(3)-TdR掺入法测定不同浓度Enk-HuIFN-α1/86Asp对HCT-8细胞(人结肠腺癌细胞系)的抑制活性。当干扰素为10，100，1000单位时，Enk-IFN-α1/86Asp的抗肿瘤细胞增殖活性分别为39.7，46.5，56.1；而IFN-α1/86Asp则分别为16.1，22.9，33.6(P＜0.01)。

上述结果说明，Enk-IFN-α1/86Asp的抗肿瘤细胞增殖活性比其母体干扰素有明显提高。

Enk-IFN-α1/86Asp的小鼠镇痛作用

采用小鼠在高温铜板上脚爪舔吃潜伏期(Paw Licking Latency，PLL)来测定干扰素对小鼠的镇痛作用，其潜伏期时间愈长，说明镇痛作用愈强。

当干扰素剂量分别为65，125和350IU时，Enk-IFN-α1/86Asp的PLL值分别为18.8±4.37，44.4±5.86，46.2±4.54秒；当干扰素剂量分别为65，125，350和500IU时，母体干扰素的PLL值分别为19.7±2.4，22.0±2.57，27.7±5.43，43.3±8.18秒。

结果说明，HuIFN-α1/86Asp在小鼠的镇痛作用强于其母体干扰素。

μ和/或δ受体阻断剂对HuIFN-α1/86Asp和Enk-HuIFN-α1/86ASP镇痛作用的影响。

IFN-α1/86Asp本身也有镇痛作用，这一镇痛作用可为μ和δ受体阻断剂—盐酸烯丙基吗啡酮(Naloxone hydrochloride，C19H21NO4HCl)所抑制。当IFN-α1/86Asp为500IU时，同时用生理盐水，ic，于给药后5，10和20分钟后，测定其PLL值各为47.3±8.4，40.7±9.2，38.7±8.5秒；当IFN-α1/86Asp为500IU时，同时用Naloxone，5mg/kg，ip，于给药后5，10和20分钟后，测定其PLL值各为25.1±6.0，19.1±4.78，14.5±2.41秒；而单纯盐水则为：20.4±2.1，16.5±1.7，16.5±1.7秒。

当Enk-IFN-α1/86Asp为125IU时，同时用生理盐水，ic，于给药后5，10和20分钟后，测定其PLL值各为49.0±7.3，48.0±7.7，27.2±7.3秒；当Enk-IFN-α1/86Asp为125IU时，同时用Naloxone，5mg/kg，ip，于给药后5，10和20分钟后，测定其PLL值各为22.9±4.6，31.3±6.5，18.7±2.5秒。

当Enk-IFN-α1/86Asp为125IU时，同时用Naltrindole，2mg/kg，ip，于给药后5，10和20分钟后，测定其PLL值各为28.5±4.9，20.4±3.9，20.4±4.1；而单纯盐水则为：20.4±2.1，16.5±1.7，16.5±1.7。

上述结果说明，Enk-IFN α1/86Asp的镇痛作用可被δ和μ受体阻断剂所阻断。

Claims (3)

1.人α1b型干扰素，即(HuIFNα1/114Ala)用于制备治疗慢性活动性肝炎、丙型肝炎、慢性宫颈炎、疱疹性角膜炎、毛细胞性白血病等病毒性疾病与恶性肿瘤的药物的用途。

2.脑啡肽—人干扰素融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是脑啡肽的C端和干扰素的N端通过序列为Ser GlySer的3肽相连；人干扰素包括人α型干扰素的各亚型及其突变体，脑啡肽为甲硫氨酸脑啡肽(Try GlyGly Phe Met)。

3.脑啡肽—人干扰素融合蛋白用于制备兼具抗肿瘤和镇痛作用的药物的用途。