CN1435486A - 人复合α干扰素改构基因及其表达和生产 - Google Patents

Abstract

本发明涉及应用重组DNA技术在甲醇酵母细胞如巴斯德毕赤酵母细胞中生产基因重组人复合α干扰素的工艺。本发明还涉及适合甲醇酵母表达的人复合α干扰素改构基因的设计与化学合成；表达载体的构建；基因组中至少稳定地整合有一个拷贝改构CIFN基因的甲醇酵母工程菌；工程菌的基因表达；用发酵罐进行高密度高生物量发酵生产CIFN等方面。本发明方法可实现CIFN的高效表达，且分离工艺简便。

Description

人复合α干扰素改构基因及其表达和生产

技术领域

本发明涉及到应用重组DNA技术在甲醇酵母细胞如巴斯德毕赤酵母细胞中生产基因重组人复合α干扰素(consensus interferon，CIFN)的工艺。本发明还涉及适合甲醇酵母表达的人复合α干扰素改构基因的设计与化学合成；表达载体的构建；在基因组中至少稳定地整合有一个拷贝的外源导入的改构CIFN基因的甲醇酵母工程菌；工程菌在实验室摇瓶上的基因表达；用发酵罐进行高密度高生物量发酵生产CIFN等。

背景技术

重组人复合α干扰素(consensus interferon，CIFN)，又名复合人白细胞干扰素(consensus human Leukocyte interferon)，是一种内含有166个氨基酸的单链无糖基化的蛋白质，分子量约为19500道尔顿。CIFN的氨基酸序列与HuIFN-α2b有89％的同源性，与HuIFN-β有30％的同源性。CIFN的一级结构内含有4个半胱氨酸，其中4个半胱氨酸以共价键方式组合成2对二硫键；CIFN的三级结构呈椭圆球状，内含有4个大的α-螺旋蛋白质结构域，4个小的α-螺旋结构域，2个长环及一些无规卷曲结构组合而成。

迄今为止已经鉴定的人α干扰素(human interferon-alpha，IFN-α)基因有近30种。目前所知，人、鼠、牛、猪、马等哺乳动物的IFN均有α、β、γ3种类型。其中，IFN-α型中又有许多亚型，可分为两大家族。第I类家族中成员相当于早期Nagata等和Goedell等所记载的人IFN-α家族成员(HuIFN-αI)，有15-20个基因成员，其中大部分都编码功能蛋白质，彼此的核酸水平和蛋白质水平上有90％同源性；人IFN的第II类α家族(HuIFN-αII)有5-6个基因成员，后者与HuIFN-αI基因有50％的同源性。牛IFN-αI有10-20个成员，而牛IFN-αII大约有30个成员。猪IFN-α也可分为两类。IFN-β基因家族的大小，不同哺乳动物有所不同。HuIFN-β基因目前公认的只有一个亚型。人类的HuIFN-α与HuIFN-β基因形成基因簇分布于第9对染色体的短臂9p21-pter上；HuIFN-γ基因座位于第12对染色体的长臂上。IFN基因结构的一个特点是HuIFN-α、β基因组基因内部无内含子；而HuIFN-γ基因组基因内部有内含子。

重组人复合α干扰素是一种氨基酸序列重组的非天然存在的人类αI型干扰素。1983年，Goedell等对当时已知13种人α干扰素的序列进行比较研究，把出现频率最高的氨基酸分配到各个相应的位置上，便得到了由166个氨基酸组成的CIFN氨基酸序列的基本框架(美国专利号：US4414150)；之后，为了增加CIFN蛋白分子的结构稳定性，1987年美国Amgen公司的Stabinsky等对CIFN的4个位点的氨基酸作了改构(即改为Arg²²，Asp⁷⁸，Glu⁷⁹和Tyr⁸⁶)；通过人工合成方法合成了适合大肠杆菌表达的偏爱密码子组成的CIFN基因，在大肠杆菌表达系统内实现了高表达(美国专利号：US4695623，US4897471，US5541293，US5661009)。

实验证明，CIFN在抗病毒活性、抗增殖反应和激活NK细胞活性是目前国际上同类的Roche公司生产的IFNα-2a、Schering公司生产的IFNα-2b的5-20倍；临床试验表明，CIFN在治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎患者不论在近期疗效还是远期疗效均优于IFNα-2a和IFNα-2b(姚光弼等：重组复合干扰素治疗慢性丙型肝炎的临床研究。中华传染病杂志2000，18(2)：101-105)；为此美国FDA于1997年10月正式批准CIFN上市(由Amgen公司申报)，用于治疗丙型肝炎(美国专利号：US5980884)。

该产品以其疗效高、毒副反应低引人瞩目。目前CIFN产品被用来尝试治疗新的适应症与途径，如与白细胞介素1受体拮抗剂联合应用治疗多发性硬化症(世界专利公开号：WO9908702A1；美国专利号：US6013253)；卡波济肉瘤相关疱疹病毒引起的肉瘤(美国专利号：US55831064)；通过腺病毒载体介导基因转移系统基因治疗用于一些肿瘤和细胞增殖性疾病，如毛细胞性白血症和卡波济肉瘤等(世界专利公开号：WO9742323A1；欧洲专利公开号：EPO918861A1；美国专利号：US5831062)。国内由深圳九先生物工程公司对CIFN的第158位氨基酸由Leu¹⁵⁸→Val¹⁵⁸，然后，将该在大肠杆菌表达，在1998年申请了相关专利(中国申请号：CN98114663)。

但大肠杆菌生产的CIFN是N-末端有带甲硫氨酸、不带甲硫氨酸和甲硫氨酸乙酰化三种混合物，给生物活性与临床应用都带来不利的影响；而本项研究通过对迄今为止发现的近30种人α干扰素的氨基酸序列进行结构比较研究，设计了二种抗蛋白酶降解的人复合α干扰素突变体【如CIFN(R164S)和CIFN(R22S，R164S)】，再用低等真核生物甲醇酵母表达系统分泌表达的CIFN和其突变体，其N-末端结构是完整均一的，且具有产量高、成本低、比活性高的特点，因此具有很强的市场竞争优势。

另一方面，重组干扰素产品的新品种开发正在向高生物活性与长效方面研究，其中应用DNA Shuffling技术和噬菌体展示技术，并通过构建大容量突变库和建立高通量筛选方法来获得高生物活性的α-干扰素方面，近年来也取得很大的进展(世界专利公开号：WO 01/25438A2)。

自从1957年Isaacs等人发现IFN以来(Issacs A，Lindemann J(1957).Proc RoyalSoc B147：258)，针对IFN的结构功能曾经在世界范围内掀起过几次研究高潮，研究工作已有40多年的历史，取得了巨大的进展。从IFN作为生物制品研制生产的角度看，可以粗略地将其分成三个阶段：1957-1967年，IFN的发现和寻找高效诱生剂的阶段，在此阶段找到了如仙台病毒、新城疫病毒、铁洛龙、PolyI：C等一系列较好的诱生剂；1968-1979年，各类IFN，包括白细胞IFN、成纤维细胞IFN、类淋巴细胞IFN和免疫细胞IFN等细胞水平的IFN大量生产都获得成功，并在临床上进行了初步的应用；1980年以来，在进一步扩大细胞水平的生产基础上，进入基因工程的研究阶段。

目前IFN的生物学功能被学术界公认的有：广谱的抗病毒活性以及抗肿瘤和免疫调节三大功能；因而当前国际生物技术界将IFN广泛应用于治疗慢性乙肝、丙肝、肿瘤、白血病等多种疾病。据资料显示，IFN是被美国FDA批准上市种类最多销售额最高的生物技本产品之一，2000年世界干扰素市场销售额为20多亿美元，其中中国市场为1亿美元，是国内销售额最高的生物技术产品。据医疗部门统计，肝炎病毒在世界范围内广泛流行，目前全球乙型肝炎病毒(heptitis Bvirus，HBV)感染者3.5亿；丙型肝炎病毒(heptitis C virus，HCV)感染者1亿；亚洲和中国是肝炎病毒易感人群，其感染率尤其高得惊人，据报道中国乙肝和丙肝患者高达3000万人；而α干扰素是迄今为止治疗病毒性肝炎有肯定疗效的药物。一般一个病人治疗一个疗程，平均需要84支干扰索，从理论上计算全国每年则需要近百亿支，市场总需求量极其巨大。

目前IFN生物制品有天然的和重组的两类。人天然IFN是由周围血白细胞、类淋巴母细胞、成纤维细胞制备，其中英国的Wellcome公司应用类淋巴母细胞和600-1000L生物反应器病毒诱生生产IFN；Zoon等应用Namalva细胞病毒诱生生产IFN-α；天然IFN由于材料来源有限，操作较为繁琐且生产成本较高，这种生产方法已逐渐被基因工程方法所取代。

应用大肠杆菌表达系统表达CIFN，由于表达产物存在于细胞质形成包涵体形式，其基因工程产品需要破菌、分离包涵体、纯化和复性；再则，CIFN分子内部二硫键、三维结构复杂和多肽链主链骨架内部原子空间排布占体积大，用大肠杆菌表达容易形成折叠错误以及构象有别天然分子的重组CIFN分子；再则，大肠杆菌生产的CIFN是N-末端有带甲硫氨酸、不带甲硫氨酸和甲硫氨酸乙酰化三种混合物，给生物活性与临床应用都带来不利的影响。

用低等真核生物酵母表达系统表达外源基因，由于能将基因工程产物直接分泌到培养基内，而培养基内是氧化环境有利于二硫键形成，有利于表达出天然构象的蛋白质分子；如1982年用酿酒酵母表达大分子量蛋白乙型肝炎表面抗原(作为基因工程疫苗)获得成功(Valenzuela P，et al.1982 Nature298：347-350)，并批准上市；因而用酵母系统表达CIFN较大肠杆菌表达系统有很大的优越性。酵母表达系统的载体-宿主系统分附加体型与整合型两种表达方式。附加体型的重组质粒存在于酵母的细胞质内，重组质粒内有自主复制序列(autonomously replicatingsequence，ARS)。可在酵母细胞内自主复制，并在启动子元件调控下表达外源基因，但这种重组质粒在酵母宿主细胞芽殖分裂、世系传代中容易丢失，因而往往难以用工业化大型发酵罐来放大生产。整合型表达质粒是以线形化质粒或环形质粒形式通过同源重组方法整合到酵母的基因组内(单拷贝或多拷贝整合)，然后随着酵母宿主菌染色体的复制而复制，外源目的基因在酵母世系传代趋于稳定，不易丢失，另外目的基因在酵母启动子元件的调控下进行表达的过程同酵母菌自身基因表达的过程一样，是在细胞核内转录出hnRNA，经过修饰和加工成为mRNA，并穿越核膜到达细胞质与核糖体结合，再表达目的基因的。整合型表达方式适合用工业化大型发酵罐来进行发酵生产。因而，酵母表达系统表达CIFN一般采用分泌性整合型表达方式。另一方面，酵母作为工业微生物的重要宿主菌，在工业发酵方面已积累了大量的经验。本项研究应用的酵母宿主菌为巴期德毕赤酵母，它是一种工业酵母菌种，70年代以来被用于生产单细胞蛋白(single cellprotein，SCP)。由于它可利用甲醇作为唯一的碳源和能源，因而在工业微生物中称其为嗜甲醇酵母(Methylotrophic yeast)或直接称为甲醇酵母。甲醇酵母目前被用来作为基因工程表达系统的还有多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)等。甲醇酵母一般都有发酵密度高、蛋白质分泌能力强、外源基因表达水平高和糖基化修饰更接近高等真核生物等优点，是目前国际生物技术领域中最为理想的真核微生物表达系统。尤其是巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母几种酵母菌在大型发酵罐高细胞密度发酵培养方面已有相当成熟的生产工艺。基于以上三个方面的优势合在一起，使酵母表达系统成为目前国际上开发基因工程CIFN很有价值的表达系统。

然而，目前为止用酵母生产人复合α干扰素的效率还较低。因此，本领域迫切需要开发新高效、简便的生产人复合α干扰素的工艺。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新高效、简便的生产人复合α干扰素的工艺。

本发明的另一目的是提供用于该工艺的DNA序列、质粒和宿主细胞。

本发明的另一目的是提供用该方法获得的新的人复合α干扰素。

在本发明的第一方面，提供了一种编码人复合α干扰素的DNA序列，它含有选自下组的DNA序列：

(a)SEQ ID NO：1、3、和5中第1-522位

(b)SEQ ID NO：1、3、和5中第13-510位。

在本发明的第二方面，提供了一种人复合α干扰素，2.一种人复合α干扰素，其特征在于，它是具有选自下组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2中第1-170位；

(b)SEQ ID NO：4中第1-170位及第5-170位[即CIFN(R164S)]；

(c)SEQ ID NO：6中第1-170位及第5-170位[CIFN(R22S，R164S)]。

在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，它含有本发明上述的编码人复合α干扰素的DNA序列。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的表达载体或上述的编码人复合α干扰素的DNA序列。

在一优选例中，所述的宿主细胞是甲醇酵母细胞。

在另一优选例中，所述的酵母细胞是巴斯德毕赤酵母，在其基因组中整合有编码人复合α干扰素的DNA序列，而且

在所述的编码人复合α干扰素的DNA序列的5’端上游与巴斯德毕赤酵母菌来源的5’调控区可操作地相连，所述的5’调控区包含内含启动子元件和Kozak序列增强子元件；

所述的编码人复合α干扰素的DNA序列的3’端下游与甲醇酵母来源的3’终止序列可操作地相连。

在另一优选例中，所述的5’调控区选自以下基因的5’调控区：毕赤酵母来源的醇氧化酶(AOX1和AOX2)基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)、甲醛脱氢酶基因(FLD1)、二羟基丙酮合成酶(DAS1)基因或组氨醇脱氧酶(HIS4)基因；

所述的3’终止序列选自以下基因的3’终止序列：巴斯德毕赤酵母来源的AOX1基因、AOX2基因、p40基因和His4基因。

在另一优选例中，在所述的编码人复合α干扰素的DNA序列与5’调控区之间，还含有酿酒酵母来源的α-交配因子基因引导肽序列的编码序列。

在另一优选例中，所述的Kozak序列增强子元件为AAACGATG。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括Mut-和Mut+表型。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括在其染色体中整合有本发明编码人复合α干扰素的DNA序列的GS115和SMD1168等菌株，例如GS115：pCIFN201S₁、GS115：pCIFN201S₂、GS115：pCIFN301S₁、GS115：pCIFN301S₂、GS115：pCIFN401S₁、GS115：pCIFN401S₂、GS115：pCIFN401S₃。SMD1168：pCIFN201S₁、SMI1168：pCIFN201S₂、SMD1168：pCIFN301S₁、SMD1168：pCIFN301S₂、SMD1168：pCIFN401S₁、SMD1168：pCIFN401S₂、SMI1168：pCIFN401S₃。

在本发明的第五方面，提供了一种生产人复合α干扰素的方法，它包括步骤：

(a)在适合表达人复合α干扰素的条件下，用生物反应器培养权利要求4所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人复合α干扰素。

在一优选例中，在步骤(a)中，培养密度为500-800个OD600，每升菌体干重为100-300克，人人复合α干扰素的表达量大于1克。

在另一优选例中，在步骤(a)中，用甲醇诱导表达4-8天。

附图说明

图1是一种酵母表达质粒pPIC9的结构图谱。

图2是本发明一种人复合α干扰素编码序列及其编码的人复合α干扰素氨基酸序列。

图3是本发明另一种人复合α干扰素编码序列及其编码的人复合α干扰素氨基酸序列。

图4是本发明另一种人复合α干扰素编码序列及其编码的人复合α干扰素氨基酸序列。

图5是化学合成人复合α干扰素DNA的示意图。

图6是重组质粒pPIC9-CIFN的构建示意图。

图7是对表达载体pPIC9-CIFN的鉴定照片，其中泳道1是DNA分子量标准；泳道2是pPIC9-CIFN经XhoI/EcoRI双酶切结果；泳道3是工程菌PCR扩增整合鉴定结果。

图8是CIFN重组转化子高表达克隆筛选结果。

图9是CIFN工程菌摇瓶表达结果。

图10是GS115/pPIC9-CIFN工程菌在5L发酵罐上的诱导表达结果。

图11是GS115/pPIC9-CIFN工程菌在50L发酵罐上的诱导表达结果。

图12是人复合α干扰素纯化样品的SDS-PAGE纯度鉴定。

图13是人复合α干扰素纯度的RP-HPLC检测结果。

图14是人复合α干扰素分子量质谱测定结果。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，根据宿主细胞的密码子偏爱性，设计并合成了人复合α干扰素的编码序列，从而实现了人复合α干扰素的高效表达。同时，还对人复合α干扰素的个别位点进行了定点诱变，以表达抗蛋白酶水解的人复合α干扰素。

此外，本发明人还进一步对表达盒中的元件进行优化，尤其是在5’端增加了酵母的内源性酶切位点，从而进一步提供了表达和分离效率。在此基础上，完成了本发明。

本发明人根据Goedell等报道的CIFN氨基酸序列和Koutz报道的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX1)基因的偏爱密码子，再结合其他一些基因设计原则综合设计了三种编码CIFN的全新基因；进而采取双链人工全合成的策略化学合成CIFN全长基因和二个突变体基因。将该化学合成的CIFN基因转化巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115(NRRY-15815)和SMD1168，转化子经筛选、摇瓶发酵试验，发现多种增加CIFN表达量的巴斯德毕赤酵母工程菌株。

本发明的发明点之一主要在于改构的CIFN的全新基因设计。至于将改构的CIFN基因插入质粒、转化酵母细胞、酵母工程菌的筛选、定点诱变、工程菌的发酵、以及产物的分离等技术基本上按本领域已知的常规方法进行(例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件)。

本发明的发明点之二是在人复合α干扰素的5’端引入了限制性内切酶XhoI和酵母内源性蛋白酶KEX-2加工位点，前者便于基因的分子克隆，后者使表达的目的产物经酵母内源性蛋白酶加工后，可以直接获得5’端无Met的人复合α干扰素，从而大大简化了后续的分离和纯化工艺。一种优选的酵母内源性酶切位点是LEKR。因此，图1-3中成熟人复合α干扰素的第一个氨基酸从第5位算起。

本发明的甲醇酵母表达载体内至少有一个上述的含有改构的CIFN结构基因的表达盒和一种可供筛选的标记基因。这种重组表达载体转化甲醇酵母宿主菌可用环状质粒形式或线性化位点特异性整合载体二种形式。本发明优先选择线性化位点特异性整合载体，并优先用原生质体转化法将重组表达载体定点整合到甲醇酵母(如巴斯德毕赤酵母等)基因组上特异性位点的基因座内(如整合到AOX1基因或HIS4基因位点)，本发明所涉及的生产CIFN的工程菌内至少稳定地整合有一个拷贝的含上述表达盒的重组载体。

另外，本发明还涉及一种用甲醇酵母工程菌大规模生产重组CIFN和抗蛋白酶的CIFN突变体的生产过程：一种至少被整合有一个拷贝的含有改构的CIFN结构基因的重组质粒的工程菌，在摇瓶或发酵罐高密度发酵条件下，CIFN结构基因在一种甲醇诱导启动子的驱动下，将重组CIFN和抗蛋白酶的CIFN突变体表达产物分泌到培养基内。

本发明人还发现，目的基因的ATG之前插入酵母来源的基因5′非编码区的脱氧核苷酸(5-11)聚脱氧寡核苷酸序列)能提高目的基因的表达量。插入的脱氧寡聚核苷酸优先选择A和T碱基。在本发明中与CIFN及突变体结构基因ATG相连接的寡聚核苷酸序列优先来自巴斯德毕赤酵母的AOX1和AOX2、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene，GAP)、甲醛脱氢酶基因(formaldehyde dehydrogenase gene，FLD1)或二羟基丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase，DAS1)基因5′端调控区序列。

几种调控序列被鉴定和证实，能用来在巴斯德毕赤酵母中表达CIFN及突变体。从巴斯德毕赤酵母基因组中克隆的醇氧化酶(AOX1和AOX2)基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)、甲醛脱氢酶基因(FLD1)、二羟基丙酮合成酶(DAS1)基因和p40基因的5′调控区(启动子元件)能用来驱动下游的CIFN及突变体结构基因表达。本发明优先选择的5′调控区，例如选择AOX1，AOX2、GAP、FLD1和DAS1等(Stroman DW，et al.US4,855,231)。本发明最优先选择的5′调控区是选择AOX1启动子序列。

3′终止序列的功能是对编码的结构基因起终止、多聚腺苷化和稳定mRNA的作用。任何本领域常用的3′终止序列都可用于本发明，例如来源于汉逊多形酵母和巴斯德毕赤酵母的3′终止序列。优先采用那些从巴斯德毕赤酵母菌来源的3′终止序列，例如AOX1基因、AOX2基因、DAS1基因、p40基因和His4基因的3′终止序列，特别优先选择AOX13′终止序列。

在本发明中，构建好的CIFN及突变体结构基因克隆到一种合适的巴斯德毕赤酵母分泌性表达和胞内表达载体上，如pPIC9、pPIC9K、pPIC3、pPIC3K、pAO804、pAO815、pHIL-S1、pHIL-D2、pHWO10、pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pYAM7SP6等。本发明优先选择用巴斯德毕赤酵母AOX1基因偏爱密码子来编码的CIFN及突变体结构基因，并且用pPIC9与pPIC9K分泌性表达质粒作为表达载体。

将上述构建完成的重组质粒直接或经线性化后转化到巴斯德毕赤酵母宿主菌细胞，其中较成熟的转化技术有，如用氯化锂的化学转化方法(Ito，et al.1983，JBacteriol.153：163-168)；电穿孔转化方法(Bio-Rad laboratories 1991，Gene pulsertransfection apparatus operating instruction and applications guide.)；原生质体转化方法(Cregg JM，et al.1985，Mol.Cell Biol.5：3376-3385)。在本发明科研中优先选择Cregg等人提供的原生质体转化方法，重组质粒线性化和鉴定重组载体整合用Southern杂交技术。

本发明用于作为基因工程宿主菌是甲醇酵母。甲醇酵母包括假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)四个属，其中所有甲醇酵母菌株均可用来作为本发明改构的CIFN及突变体结构基因的表达的宿主菌。在本发明中优先选择巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母，尤其是优先选择营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株GS115(NRRLY-15851)，GS190(NRRLY-18014)，PPFI(NRRLY-18017)，KM71和蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株SMD1168(pep4Δhis4(Mut+his-))，这些菌株的微生物学特性已被详细地描述(U.S.patent4,818,700和U.S.patent4,812,405)。本发明人还发现，营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株还有便于筛选、重组和转化的作用。

野生型巴斯德毕赤酵母菌株如NRRLY-11430和NRRLY-11431也能直接作为本发明改构的CIFN及突变体结构基因的宿主菌，只要在表达载体上克隆一个可供筛选的标记基因(如SUC2基因和neo基因等)，这样重组载体转化野生型毕赤酵母菌株后，其中转化子便能在含蔗糖的培养基或含有G418抗生索的培养基上生长，而非转化子则不能在此类培养基上生长，这样就能方便地筛选出重组转化子。

在本发明一个优选例中，用醇氧化酶(AOX1和AOX2)基因偏爱密码子替换酿酒酵母α交配基因的信号肽序列(也可用其他酵母宿主菌来源的信号肽序列和人工合成的嵌合信号肽序列)，在CIFN基因ATG前面插入5聚脱氧寡聚核苷酸(AAACGATG)，其中内含有真核基因保守的kozak序列AXXATGG(Kozak M，1987，Nucleic Acids Res.15：8125-8148；Kozak M，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：8301-8305)；AOX1和AOX2基因偏爱密码子替换编码成熟蛋白的CIFN及突变体基因片段，在基因5′端插入酿酒酵母KEX-2蛋白酶加工位点(Leu-Glu-Lys-Arg)的基因序列，目的基因与酿酒酵母来源的α-交配因子(alpha-mating factor，α-MF)Prepro序列(编码85个氨基酸的基因序列)构成嵌合基因。这两种基因片段再与上游巴斯德毕赤酵母的AOX1基因5′调控区(pichia pastoris AOX1 5′regulationregion)相连接，在AOX1调控区内含有启动子元件和增强子元件。

在另一优选例中，本发明将适合于毕赤酵母宿主菌表达的人工合成的CIFN及突变体结构基因克隆至pPIC9表达载体等的AOX1 5′调控区和AOX1 3′终止序列的中间，校正阅读框架，在表达载体上构成一个表达盒(expression cassette)，见图6；再将这种基因重组的表达载体(可以是环状的或线性化的)通过原生质体转化法，转化毕赤酵母菌原生质体，进而将表达盒稳定地整合到宿主菌的基因组内(即染色体上)。该表达盒AOX1 5′调控区或启动子用于增强CIFN及突变体mRNA转录的速率；AOX1 3′终止序列具有终止CIFN及突变体结构基因翻译和稳定mRNA转录产物的功能和作用(如促使hnRNA加polyA尾等)。

在本发明中，为了大规模工业化生产基因重组CIFN及突变体产品，根据甲醇酵母，尤其是巴斯德毕赤酵母-整合型表达系统的微生物特性，在发酵罐上制定了三阶段、高密度和分批补料的发酵工程的操作程序(fermentation protocol)：1.第一阶段，也称为生长期，将上述筛选分离得到的最高水平表达CIFN或突变体的工程菌作为种子菌接菌在一种酵母基础培养基(10X Basal Salts+250X PTM₁+5％甘油)内，这种培养基内的碳源为一种非诱导型碳源(如甘油)。当生长于含这种碳源的培养基时，这种甲醇酵母工程菌表达外源基因被完全抑制，即只允许细胞分裂、增殖，细胞密度增加，而外源基因不被表达，在生长相培养基的pH维持在3-6。2.第二阶段，这是短暂的时期，非诱导型碳源逐渐消耗贻尽诱导型碳源(甲醇)缓慢地开始补入发酵罐，发酵罐内的细胞密度在进一步增加，甲醇反应启动子(methanol responsive promoter)的抑制状态在逐步解除。在这个阶段培养基的pH被逐步调整到生产阶段的pH值，即一般在pH3-6范围内。3.第三阶段，也称生产阶段，在这个阶段诱导型碳源甲醇开始加快补入发酵罐内，发酵罐内的细胞密度有的就不再增加(如mut^-菌株)，有的还稍有增加(如mut⁺菌株)，CIFN或突变体结构基因在甲醇反应启动子(如AOX1启动子)的调控下将基因表达产物开始源源不断地分泌发酵培养基内，这种发酵方式称为限制甲醇分批补料方式(limited methanol fed-batch mode)，在整个生产阶段发酵罐内的甲醇浓度通过甲醇电极在线检测将其控制在0.5-0.9％的浓度范围内。本发明发酵生产CIFN及突变体，在第三阶段，即生产阶段，也可采用混合补料方式(mixed feed fed-batchmode)，即非诱导型碳源甘油加诱导型碳源甲醇按一定比例(2∶1)混合后逐渐补入发酵罐内，这种发酵方式的特点是，发酵罐内的细胞密度在生产阶段还在进一步增加，含CIFN或突变体结构基因的表达盒在诱导型碳源甲醇诱导下将CIFN或突变体分泌到发酵培养基内。混合补料方式尤其适合用巴斯德毕赤酵母宿主菌作连续发酵，持续生产目的基因产物CIFN或突变体。

在本发明中，CIFN和二种抗蛋白酶降解的人复合α干扰素突变体【CIFN(R164S)和CIFN(R22S，R164S)】产品在巴斯德毕赤酵母中获得分泌性表达，表达产物直接分泌到培养基内，发酵液内分泌表达的水平高达每升2-3克，通过发酵生产工艺的优化，酵母工程菌还有进一步提高表达量的潜力。本发明产物分泌表达的水平达到了大规模生产CIFN及突变体的水平(每升发酵液2-3克的水平)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克降：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验例

材料和方法

一.菌种：

1.巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115 his4(Mut+his-)NRRLY-15851；KM71aox1Δ∷SARG4his4arg4(Mut^sHis⁺)；SMD1168pep4Δhis4(Mut+his-)。

2.大肠杆菌宿主菌：

E.coliTop1OF′{proAB，lacI^q，lacZΔM15，Tn10(Tet^R)}mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ801acZΔM15，ΔLacX74，deoR，recA1，araD139，Δ(ara-leu)7697，galU，galK，epsL(str^R)，endA1，nupGλ；

E.coli JM109F′[(recA1，supE44endA1 hsdR17gyrA96relA1 thiΔ(1ac-proAB)F′[traD36 proAB⁺lacI^qlacZΔM15])；

E.coliHB101(supE44 hsd S20(rB-mB-)recA₁₃ara-14proA₂lac Y₁galK₂rpsL₂₀xy1-5mt1-1)。

二.主要试剂

1.DNA限制性内切酶、T₄DNA连接酶、聚合酶等分别购自GIBCO-BRL、Pharmacia、Bio-Labs及华美生物工程有限公司

2.酪蛋白水解物                           (德国MERK公司产品)

3.Bacto-酵母抽提物                       (美国Difco公司产品)

4.PCR扩增试剂盒                          (瑞典Pharmacia公司产品)

5.DNA序列分析试剂盒                      (美国USB公司产品)

6.同位素α-p³²-dATP与γ-P³²-dATP       (英国Amersham公司产品)

7.酵母菌原生质体转化法的一些溶液配制

1.SED：1M山梨醇，25mM EDTA，50mM DTT，pH8.0

2.SCE：9.1g山梨醇，1.47g柠檬酸钠，0.168gEDTA，pH5.8

3.CaS：1M山梨醇，10mM CaCl₂

4.SOS：1M山梨醇，0.3X YPD，10mM CaCl₂

5.CaT：20mM Tris-HCl，pH7.5，20mM CaCl₂

6.PEG：20％PEG-3350，10mM CaCl₂，10mM Tris-HCl(pH7.4)

7. 1M PBS buffer：132ml 1M K₂HPO₄，868ml 1M KH₂PO₄，pH6.0。

实施例1

适合巴斯德毕赤酵母宿主菌表达的

人复合α干扰素改构基因的设计

本发明涉及化学合成CIFN改构基因三个基因片段，其长度分别为522bp，是采用化学全合成的功能基因。

本发明的设计思想为：利用目前国际上最为理想的微生物表达系统-巴斯德毕赤酵母-整合型表达系统作为本发明目的基因的表达系统；进而利用巴斯德毕赤酵母宿主菌强大的启动子醇氧化酶基因(AOX1和AOX2)启动子作为驱动本发明目的基因的启动子元件；进而将CIFN及突变体结构基因的密码子用醇氧化酶基因(AOX1和AOX2)的高表达极端偏爱性用法的偏爱密码子来替换。

本发明涉及对CIFN及突变体基因进行具体全新地设计，设计时采用了分子生物学三大核心数据库：1.国际核酸序列数据库(Gen Bank/EMBL/DDBJ)；2.瑞士蛋白质序列及注解数据库(Swiss-PROT)；3.美国Brookhaven国家实验室提供的蛋白质及生物分子三维结构数据库(Protein Data Bank，PDB)。再采用多种计算机软件包(包括美国威斯康星大学Genetic Computer Group编制的GENESIS和PROSIS软件包、美国加州理工学院编制的Caltec软件包、瑞典Pharmacia公司提供的DNASIS和PROSIS软件包以及其它程序)进行多方面的辅助分析，在计算机图形工作站(SGI R4400)上进行CIFN及突变体基因全新地设计，并考虑如下原则：1.CIFN合成基因尽可能选用巴斯德毕赤酵母醇氧化酶(AOXl)基因偏爱的偏爱密码子，降低该基因罕用的密码子的比例，其中该基因偏爱密码子占编码的CIFN合成基因密码子总数98％以上；2.消除CIFN及突变体合成基因内部出现的复杂的二级结构(包括重复结构、互补结构、发夹结构及大片段的反向回文结构)等；3.消除了CIFN及突变体合成基因内部不适宜基因操作的部分限制性内切酶位点；4.在CIFN合成基因内部尽量减少连续的G-C配对，增加较多毕赤酵母偏爱的A-T配对；5.根据巴斯德毕赤酵母表达系统，重新设计了CIFN及突变体基因的阅读框架，其中CIFN及突变体基因将5’端的限制性内切酶BamH I位点插入到AOX1基因5’调控区域(启动子区域)，后接AAACG5个脱氧寡聚核苷酸(内含真核基因的Kozak序列)，再与后面的CIFN基因的起始密码子ATG相连，成熟CIFN基因在5’端插入BamH I、Xho工酶切位点，在这二个酶切位点之后插入赖氨酸和精氨酸两个双碱性氨基酸密码子，用于酵母内源性的KEX-2蛋白酶加工剪切；在CIFN合成基因的3’端采用了双重终止密码子TAATAG，加强翻译的终止信号，防止基因表达时发生通读，末端再加上一个EcoRI酶切位点；6.CIFN及突变体全长基因在构成表达盒时采用酿酒酵母α-交配因子引导肽序列融合在巴斯德毕赤酵母AOX1启动子下游，来引导CIFN及突变体结构基因进行分泌性表达；CIFN及突变体基因5’端插入XhoI酶切位点和酵母菌KEX-2蛋白酶双碱性氨基酸(-Lys-Arg-)的编码序列，将它与上游的酵母α-交配子引导肽(85个氨基酸组成)序列相融合，将此嵌合基因克隆在巴斯德毕赤酵母AOX1启动子下游，在AOX1启动子的驱动下来进行CIFN或突变体基因的分泌性表达。

综上所述，本发明设计的CIFN及二种抗蛋白酶突变体基因见图2-4和SEQ IDNO：1、3、和5。它们编码的蛋白分别具有SEQ ID NO：2、4。6所述的氨基酸序列，其中第1-4位为酵母内源性蛋白酶切位点，因此成熟的人复合α干扰素为第5-170位，共166个氨基酸。

经计算，本发明所设计CIFN基因和CIFN突变体基因的密码子偏爱指数分别达到99.4％和98.7％。

经计算，本发明所设计CIFN基因密码子适合指数为99.8％，二种抗蛋白酶突变体基因的计算结果基本相同。

实施例2

适合巴斯德毕赤酵母宿主菌表达的

人复合α干扰素改构基因的化学合成

本发明涉及将实施例1设计的1个CIFN基因和2个CIFN突变体基因采用人工全合成的战略：先化学合成9个寡聚核苷酸片段(CAG45F1、CAG45F2、CAG45F3、CAG45F4、CAG45F5、CAG45R1、CAG45R1、CAG45R3和CAG45R4，见图5)，根据寡聚核苷酸片段重叠末端退火后进行PCR扩增，获得CIFN全长基因；将这个合成基因克隆至pBluescriptSK载体相当的位点上，重组载体转化大肠杆菌JM109宿主菌；抽提质粒DNA，进行酶切鉴定；将大小正确者进行DNA序列测定；将测序正确的这个基因到表达载体pPIC9(图1)上，再进行转化、抽提质粒DNA、酶切鉴定和DNA序列测定，验证化学合成的基因与设计方案是否完全一致。然后采用以合成的CIFN全长基因为模板，再结合突变引物介导的PCR方法获得2个CIFN突变体基因(SEQ ID NO：3和5)。

对于合成的3种CIFN基因，经测序验证，与设计的完全相符。

实施例3

表达载体pCIFN201、pCIFN301、pCIFN401的构建

将实施例2内化学合成的人复合α干扰素基因(522bp)和2个CIFN突变体基因(522bp)用BamHI-EcoRI双酶切从pBluescript SK克隆载体上切下；编码CIFN基因或突变体基因(522bp)用XhoI-EcoRI双酶切从pBluescript SK克隆载体上切下，片段经1％Agarose琼脂糖凝胶电泳，切下相应大小的胶条，分别用DNA回收kit回收目的基因的片段。将CIFN BamHI-EcoRI片段与CIFN突变体XhoI-EcoRI片段分别克隆到用相应酶切的巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9上，构建成pCIFN201(含CIFN BamHI-EcoRI片段)、pCIFN301(含CIFN XhoI-EcoRI突变体1片段)和pCIFN401(含CIFN XhoI-EcoRI突变体2片段)，重组载体连接反应体系为：

         CIFN DNA片段(60ng)                 4ml

         pPIC9载体(240ng)                   5ml

         5X连接酶缓冲液             4ml

         T₄DNA连接酶(2U)           1ml

         ddH₂O                     6ml

在20ml反应体系内，16℃连接过夜。

将上述含重组质粒pCIFN201、pCIFN301或pCIFN401的连接液分别加4ml和8ml二个浓度转化感受态大肠杆菌JM109宿主菌，涂布于LB(含氨苄青霉素20mg/ml)平板上，37℃培养箱培养过夜。然后，将含有重组质粒pCIFN201、pCIFN301或pCIFN401的转化菌落随机挑取其中18个菌落，分别接菌于2ml LB(含氨苄青霉素20mg/ml)，在摇床上振荡6-8小时，用碱变性法快速抽提质粒双链DNA，再分别用BamHI-EcoRI或XhoI-EcoRI酶切，1％agarose琼脂糖凝胶电泳，鉴定出符合相应大小的含CIFN及突变体基因的重组子，其中鉴定出含CIFNBamHI-EcoRI片段的4个克隆，含CIFN突变体1XhoI-EcoRI片段的3个克隆，含CIFN突变体2 XhoI-EcoRI片段的5个克隆。再从上述鉴定出来的含pCIFN201、pCIFN301或pCIFN401重组质粒的大肠杆菌宿主菌内接菌，按大规模质粒抽提法抽提大量的含pCIFN201、pCIFN301或pCIFN401重组质粒，用于转化巴斯德毕赤酵母宿主菌或长期保存。供转化巴斯德毕赤酵母菌的重组质粒应用限制性内切酶Bgl II线性化，方法为取重组质粒pCIFN201、pCIFN301或pCIFN401各20mg，用10X低盐浓度缓冲液，再加入Bgl II限制性内切酶2U，37℃保温2小时，使之完全线性化，再将酶裂解反应液75℃保温10min，使Bgl II内切酶灭活，供用原生质体转化方法转化巴斯德毕赤酵母宿主菌之用。其中重组载体构建流程图见图6，重组质粒pCIFN201的酶切鉴定结果见图7。

实施例4

用酵母原生质体转化方法转化重组质粒pCIFN201、pCIFN301、pCIFN401至巴斯德毕赤酵母宿主菌

巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115(NRRLY-15851)和SMD1168生长在YPD培养板上，挑取单克隆GS115和SMD1168菌落至5ml YPD液体培养基内，30℃振荡过夜。取20μl菌液至100ml YPD液体培养基内，30℃振荡过夜。将100ml菌液在室温用1500g离心10min，弃上清；用20ml灭菌水悬浮酵母细胞，在室温用1500g离心10min，弃上清；用10ml SED悬浮酵母细胞，在室温用1500g离心5min，弃上清；用10ml山梨醇悬浮酵母细胞，在室温用1500g离心5min，弃上清；用10ml SCE悬浮酵母细胞，加入3μl Zymolgase(蜗牛酶，Sigma公司产品，3mg/ml)，在30℃孵育30-45min，使酵母宿主菌约70％左右形成原生质体为佳；在室温将酵母菌原生质体用750g离心10min，弃上清；加入5ml 1M山梨醇悬浮酵母原生质体，在室温用750g离心10min，弃上清；加入5ml CaS悬浮酵母菌原生质体，在室温用750g离心10min，弃上清，再加0.6-1ml CaS悬浮酵母菌原生质体(在30min内供转化使用)。

取上述巴斯德毕赤酵母菌原生质体液100μl分别加入实施例3中用BgI II限制性内切酶线性化的重组质粒pCIFN201、pCIFN301、pCIFN401或pPIC9空载载体(作为目的基因表达的对照之用)，各10μl(含5μg线性化DNA片段)，在室温孵育10min；每管加入1ml新鲜配制PEG/CaT(1∶1)溶液，混匀后室温孵育10min；在室温用750g离心10min，弃上清，用吸水纸吸干Eppendorf管内所有的液体；再在每管内加入150μ1 SOS溶液，室温孵育20min；，再在每管内加入850μl山梨醇溶液，充分混匀后，再从每管内各取100-300μl转化液加至10ml溶化后保温在45℃的RD内，快速混匀后，铺于RDB板上，在30℃培养箱内倒置培养4-6天。在RDB培养板上可长出许多单克隆的含有重组质粒阳性菌落。

实施例5

人复合α干扰素改构基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将实施例4中用原生质体转化法转化的含有线性化位点特异性整合载体的重组质粒pCIFN201、pCIFN301、pCIFN401或pPIC9空载载体表达盒的阳性转化子从RDB培养板上分别随机挑取24个克隆，接种于4ml GMMY培养液中，在30℃摇床振摇36-48小时，5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，样品被分别进行15％SDS-PAGE电泳鉴定，用pPIC9空载载体表达物作对照，鉴定出高表达克隆，其中含pCIFN201重组质粒的筛选出4个克隆，含pCIFN301重组质粒的筛选出3个克隆，含pCIFN401重组质粒的筛选出5个克隆(即GS115：pCIFN201S₁、GS115：pCIFN201S₂、GS115：pCIFN301S₁、GS115：pCIFN301S₂、GS115：pCIFN401S₁、GS115：pCIFN401S₂、GS115：pCIFN401S₃。SMD1168：pCIFN201S₁、SMD1168：pCIFN201S₂、SMD1168：pCIFN301S₁、SMD1168：pCIFN301S₂、SMD1168：pCIFN401S₁、SMD1168：pCIFN401S₂、SMD1168：pCIFN401S₃)。然后将这些筛选出来的高表达克隆分别用15％甘油低温保菌、斜面培养，用于作为进一步表达的工程菌或做Southern杂交和甲醇利用表型等鉴定之用。

挑取上述工程化的高表达克隆(含pCIFN201、pCIFN301或pCIFN401重组质粒)的菌落接种于4ml GMGY液体培养基中，30℃摇床振荡过夜。取1ml酵母菌液转接于50ml BMGY培养液内，继续振摇18-24小时，再按4％接菌量接40ml种子菌入1000ml GMGY培养基内，在30℃摇床继续振荡24-30小时，将培养液用5000rpm离心5min，弃上清，然后这二种工程菌分别用200ml BMMY诱导表达培养基悬浮菌体，放置在30℃摇床继续振荡3-4天，每隔24小时补加(用100％甲醇加至终浓度为0.5％)。这时巴斯德毕赤酵母工程菌的细胞密度一般已达到18-20个OD₆₀₀，基因表达的外源蛋白大多数分泌到液体培养基内。发酵培养基在4℃10000rpm离心20min，弃菌体，含大量CIFN及突变体表达产物的上清液，样品可用于SDS-PAGE电泳鉴定，见图8-9。

实施例6

甲醇酵母工程菌在5L和50L发酵罐上的高密度发酵试验一重组人复合α干扰素及突变体蛋白的大规模生产

在本实施例中用巴斯德用毕赤酵母工程菌在5L和50L发酵罐上用补料-分批发酵方式(Fed-bach-fermentation)进行高细胞密度培养发酵试验，目的在于探索大规模生产基因重组人复合α干扰素及突变体的途径。

巴斯德毕赤酵母工程菌菌株GS115：pCIFN201或GS115：pCIFN301、GS115：pCIFN401生长在YPD平板上，挑取单克隆菌落接种于BMGY液体培养基中，在摇床上振荡24小时。将50ml种子菌转接于2L BMGY液体培养基中，在摇床上继续振荡24小时。将这2L种子菌转接于50L发酵罐内的25L基础培养基内。基础培养基由10X基础盐+250XPTM₁+5％(w/v)甘油组成。分批生长条件包括：pH＝3-6(由50％氢氧化铵溶液控制)；发酵温度T为25-30℃；发酵罐内的溶氧量(DO)大于20％空气饱和度。

发酵罐内的甲醇酵母工程菌生长24小时左右，基础培养基内作为碳源的甘油基本上完全耗竭。然后一种限制的甘油补料通过蠕动泵开始输入发酵罐内，补料液内含50％(w/v)甘油+12ml/L PTM₁，补料时间为17-24小时，补料速度为250-350ml/小时。限制性的甘油补料结束后，一种缓慢的甲醇补料开始进行，补料液内含100％甲醇+12ml/L PTM₁，开始时补料速度仅为20-40ml/小时，经过几个小时的缓慢补料，直到罐内工程菌对甲醇限制的培养物反应出现。这种培养物反应表现为突然地溶氧量增加与甲醇补料的短暂停顿。之后，甲醇补料速度开始加快，罐内的甲醇浓度在此后的整个诱导表达时期被在线监视，补料速度由计算机编程过程控制自动地调整，维持罐内培养基内的甲醇浓度在0.5-0.9％之间。甲醇酵母工程菌诱导表达时间为60-150小时。

本发明涉及对重组人复合α干扰素及突变体甲醇酵母工程菌在5L或50L发酵罐内进行了20批次高密度高表达发酵试验研究，通过过程优化与控制，特别对pH和温度进行了优化，使工程菌生物量达到每升菌体干重100-150g/L，菌密度在400-800个OD₆₀₀，发酵液上清目的蛋白表达量达到2-3g/L以上。然后发酵上清液用疏水层析法、亲和层析法和凝聚过滤层析法分离获得纯化的重组产品。发酵样品进行SDS-PAGE电泳，然后用考马斯亮蓝进行染色，其中巴斯德用毕赤酵母工程菌在5L和50L发酵罐上实验结果见图10-11；并用考马斯亮蓝染色法和Lowry法进行对发酵罐内生产的重组CIFN或CIFN突变体的表达量作定量分析，一些发酵指标如下表1所示。

       表1用高密度发酵技术生产基因重组人复合α干扰素

批次	菌株	pH	甲醇诱导时间(小时)	细胞干重(g/L)	CIFN表达量(g/L)
						1	GS115：pCIFN201S1	4.90	101	79	0.65
2	GS115：pCIFN201S2	4.00	236	102	1.95
						3	GS115：pCIFN301S1	4.30	265	139	2.78
4	GS115：pCIFN301S2	4.50	258	119	2.67
						5	GS115：pCIFN401S1	4.70	102	118	2.45
6	GS115：pCIFN401S2	4.20	238	105	2.63
						7	GS115：pCIFN501S	4.80	256	115	2.58

进而，对每批罐发酵液进行了中试纯化工艺方面的研究：发酵液先进行离心5000g X20min，弃菌体，上清液经Hiprep疏水层析、Blue Sepharose FF亲和层析、Superdex75凝胶过滤层析纯化后，CIFN、CIFN(R164S)或CIFN(R22S，R164S)的纯度大于98％。分离纯化后样品的纯度鉴定见图12-13，纯度为96％；进一步对重组CIFN样品进行了N-末端15个氨基酸残基分析，结果与理论预测相一致；样品通过WISH-VSV生物活性测定，CIFN比活达5.7×10⁸IU/mg以上；CIFN(R164S)比活达5.6×10⁸IU/mg以上；表明本项发明用毕赤酵母表达CIFN与美国Amgen公司采用大肠杆菌表达的同类CIFN产品比较具有更高的生物活性，结果见下表2。

表2CIFN及其突变体生物活性测定结果

样品	比活性(u/mg)
		干复津(Infergen)	5.3×108
CIFN	5.7×108
		CIFN(R164S)	5.6×108

CIFN重组产品的飞行时间质谱鉴定方面的结果见图14，结果表明CIFN的分子量与理论预测相一致，说明本发明的毕赤酵母工程菌表达的重组人复合α干扰素N-末端不带有甲硫氨酸，与CIFN设计完全一致。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                     序列表<110>上海贸基生物工程科技有限公司<120>人复合α干扰素改构基因及其表达和生产<130>020269<160>6<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>522<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>人复合α干扰素的编码序列<220><221>CDS<222>(1)..(510)<400>1ctc gag aaa aga tgt gac ttg cca caa act cac tct ttg ggt aac aga    48Leu Glu Lys Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg1               5                  10                  15aga gct ttg att ttg ttg get caa atg aga aga att tct cca ttc tct    96Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser

        20                 25                  30tgt ttg aag gac aga cac gac ttc ggt ttc cca caa gag gag ttc gac    144Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp

    35                  40                 45ggt aac caa ttc caa aag gct caa gct att tct gtt ttg cac gag atg    192Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met

50                  55                  60att caa caa act ttc aac ttg ttc tct act aag gac tct tct gct gct    240Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala65                  70                  75                  80tgg gac gag tct ttg ttg gag aag ttc tac act gag ttg tac caa caa    288Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln

            85                  90                  95ttg aac gac ttg gag gct tgt gtt att caa gag gtt ggt gtt gag gag    336Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu

        100                 105                 110act cca ttg atg aac gtt gac tct att ttg gct gtt aag aag tac ttc    384Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe

    115                 120                 125caa aga att act ttg tac ttg act gag aag aag tac tct cca tgt gct     432Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala

130                 135                140tgg gag gtt gtt aga gct gag att atg aga tcc ttc tct ttg tct act     480Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr145                 150                 155                 160aac gtt caa gag aga ttg aga aga aag gag taataggaat tc               522Asn Val Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

            165                 170<210>2<211>170<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>人复合α干扰素的氨基酸序列<400>2Leu Glu Lys Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg1               5                   10                  15Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser

        20                  25                  30Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp

    35                  40                  45Gly Ash Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met

50                  55                  60Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala65                  70                  75                  80Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln

            85                  90                  95Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu

        100                 105                 110Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe

    115                 120                 125Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala

130                 135                140Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr145                 150                155                 160Asn Val Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

            165                 170<210>3<211>522<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>人复合α干扰素的编码序列<220><221>CDS<222>(1)..(510)<400>3ctc gag aaa aga tgt gac ttg cca caa act cac tct ttg ggt aac aga    48Leu Glu Lys Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg1               5                   10                  15aga gct ttg att ttg ttg gct caa atg aga aga att tct cca ttc tct    96Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser

        20                  25                  30tgt ttg aag gac aga cac gac ttc ggt ttc cca caa gag gag ttc gac    144Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp

    35                  40                  45ggt aac caa ttc caa aag gct caa gct att tct gtt ttg cac gag atg    192Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met

50                  55                  60att caa caa act ttc aac ttg ttc tct act aag gac tct tct gct gct    240Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala65                  70                  75                  80tgg gac gag tct ttg ttg gag aag ttc tac act gag ttg tac caa caa    288Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln

            85                  90                  95ttg aac gac ttg gag gct tgt gtt att caa gag gtt ggt gtt gag gag    336Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu

        100                 105                 110act cca ttg atg aac gtt gac tct att ttg gct gtt aag aag tac ttc    384Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe

    115                 120                 125caa aga att act ttg tac ttg act gag aag aag tac tct cca tgt gct    432Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala

130                 135                 140tgg gag gtt gtt aga gct gag att atg aga tcc ttc tct ttg tct act    480Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr145                 150                 155                 160aac gtt caa gag aga ttg aga tcc aag gag taataggaat tc              522Asn Val Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Glu

            165                 170<210>4<211>170<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>人复合α干扰素的氨基酸序列<400>4Leu Glu Lys Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg1               5                   10                  15Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser

        20                  25                  30Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp

    35                  40                  45Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met

50                  55                  60Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala65                  70                  75                  80Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln

            85                  90                  95Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu

        100                 105                 110Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe

    115                 120                 125Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala

130                 135                 140Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr145                 150                 155                 160Asn Val Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Glu

            165                 170<210>5<211>522<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>人复合α干扰素的编码序列<220><221>CDS<222>(1)..(510)<400>5ctc gag aaa aga tgt gac ttg cca caa act cac tct ttg ggt aac aga    48Leu Glu Lys Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ash Argl               5                   10                  15aga gct ttg att ttg ttg gct caa atg tct aga att tct cca ttc tct    96Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Phe Ser

        20                  25                  30tgt ttg aag gac aga cac gac ttc ggt ttc cca caa gag gag ttc gac    144Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp

    35                  40                  45ggt aac caa ttc caa aag gct caa gct att tct gtt ttg cac gag atg    192Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met

50                  55                  60att caa caa act ttc aac ttg ttc tct act aag gac tct tct gct gct    240Ile Gln Gln Thr Phe Ash Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala65                  70                  75                  80tgg gac gag tct ttg ttg gag aag ttc tac act gag ttg tac caa caa    288Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln

            85                  90                  95ttg aac gac ttg gag gct tgt gtt att caa gag gtt ggt gtt gag gag    336Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu

        100                 105                 110act cca ttg atg aac gtt gac tct att ttg gct gtt aag aag tac ttc    384Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe

    115                 120                 125caa aga att act ttg tac ttg act gag aag aag tac tct cca tgt gct    432Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala

130                 135                 140tgg gag gtt gtt aga gct gag att atg aga tcc ttc tct ttg tct act    480Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr145                 150                155                 160aac gtt caa gag aga ttg aga tcc aag gag taataggaat tc              522Ash Val Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Glu

            165                 170<210>6<211>170<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>人复合α干扰素的氨基酸序列<400>6Leu Glu Lys Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg1               5                   10                  15Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Phe Ser

        20                  25                  30Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp

    35                  40                  45Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met

50                  55                  60Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala65                  70                  75                  80Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln

            85                  90                  95Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu

        100                 105                 110Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe

    115                 120                 125Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala

130                 135                 140Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr145                 150                 155                 160Asn Val Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Glu

            165                 170

Claims (14)

1.一种编码人复合α干扰素的DNA序列，其特征在于，它含有选自下组的DNA序列：

(a)SEQ ID NO：1、3、和5中第1-522位

(b)SEQ ID NO：1、3、和5中第13-510位。

2.一种人复合α干扰素，其特征在于，它是具有选自下组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2中第1-70位；

(b)SEQ ID NO：4中第1-70位及第5-170位；

(c)SEQ ID NO：6中第1-70位及第5-170位。

3.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的表达载体或权利要求1所述的编码人复合α干扰素的DNA序列。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是甲醇酵母细胞。

6.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的酵母细胞是巴斯德毕赤酵母，在其基因组中整合有编码人复合α干扰素的DNA序列，而且

在所述的编码人复合α干扰素的DNA序列的5’端上游与巴斯德毕赤酵母菌来源的5’调控区可操作地相连，所述的5’调控区包含内含启动子元件和Kozak序列增强子元件；

所述的编码人复合α干扰素的DNA序列的3’端下游与甲醇酵母来源的3’终止序列可操作地相连。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的5’调控区选自以下基因的5’调控区：毕赤酵母来源的醇氧化酶(AOX1和AOX2)基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)、甲醛脱氢酶基因(FLD1)、二羟基丙酮合成酶(DAS1)基因或组氨醇脱氧酶(HIS4)基因；

所述的3’终止序列选自以下基因的3’终止序列：巴斯德毕赤酵母来源的AOX1基因、AOX2基因、p40基因和His4基因。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，在所述的编码人复合α干扰素的DNA序列与5’调控区之间，还含有酿酒酵母来源的α-交配因子基因引导肽序列的编码序列。

9.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的Kozak序列增强子元件为AAACGATG。

10.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括Mut^-和Mut⁺表型。

11.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括GS115：pCIFN201S₁、GS115：pCIFN201S₂、GS115：pCIFN301S₁、GS115：pCIFN301S₂、GS115：pCIFN401S₁、GS115：pCIFN401S₂、GS115：pCIFN401S₃。

12.一种生产人复合α干扰素的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)在适合表达人复合α干扰素的条件下，用生物反应器培养权利要求4所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人复合α干扰素。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，培养密度为500-800个OD600，每升菌体干重为100-300克，人复合α干扰素的表达量大于1克。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，用甲醇诱导表达4-8天。

Images