CN1186119A

CN1186119A - 一种重组人血小板生成素及其制剂的生产方法

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Publication number: CN1186119A
Application number: CN96114273A
Authority: CN
Inventors: 史江; 黄文华; 吴海燕; 吴钢; 胡云龙
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-12-25
Filing date: 1996-12-25
Publication date: 1998-07-01
Anticipated expiration: 2016-12-25
Also published as: CN1058992C

Abstract

本发明公开了一种采用基团工程的方法,大量获得人血小板生成素(rhTPO)及其制剂的生产工艺。在宿主细胞扩增培养阶段,细胞接种量为1.5×10⁴/cm²—2.5×10⁴/cm²,小牛血清含量为8—10%,细胞贴壁时间缩短至72小时以下长成单层,单层细胞停留时间延长至20—24天,使CHO细胞对TPO的分泌表达量提高,从而大大提高了TPO的得率。对培养所得物分离纯化rhTPO是按“阴离子交换层析—疏水层析—分子筛凝胶层析”三步骤进行的。简化了分离纯化工艺,缩短了分离纯化时间,避免了目的蛋白在极性条件下的作用,增加了TPO的稳定性。终产品的得率从常规方法的30%左右提高到45%左右。使用本方法生产的TPO终产品,加入适量人血清白蛋白作保护剂,再加入1%甘露醇配制成注射液,可以用于治疗各种原因引起的血小板减少症。

Description

一种重组人血小板生成素及其制剂的生产方法

本发明涉及一种采用基因工程的方法，大量获取人血小板生成素(rhTPO)的生产工艺，以及用其产品配制药品制剂的方法。

血小板是一种重要的血液成分，产生于骨髓的巨核细胞。在人体器官、组织受损伤而发生出血时，血小板是形成局部血凝块的最重要的因子。如血小板缺乏，人体受损伤的部位不能形成血凝块，或者凝血迟缓，出血不能停止而发生缺血症，甚至危及生命。血小板缺乏症的治疗方法众多，经典的，也是最有效的方法是轴血或血小板输注。这种方法的缺点是使病人面临着血源性致病原如乙型肝炎病毒、艾滋病病毒等感染的危险，其危害可能超过血小板缺乏症本身。虽然血液其它成分如红细胞、白细胞的缺乏，可以用“成分输血”的办法有效解决，而血小板输注常在输注一二次之后即发生免疫反应使治疗被迫中断。因此，刺激和促进人体自身生长血小板成为治疗血小板缺乏症的最有效手段。

本世纪60年代以来对血小板调控机制的研究证实，在调节造血的诸因子中，对血小板生成起最重要作用的是血小板生成素(Thrombopoietin，简称TPO)。外源性TPO可以有效促进动物和人生成血小板。因此，用工业化生产的方法大量获取TPO，成为近几十年来国际医药界的一项任务。

“人促巨核细胞生成素及其分离纯化和基因克隆方法及应用”(中国专利公开号CN1107891A)、“一种新的血小板生成素”(中国专利公开号CN1127785A)等专利申请公开了人促巨核细胞生成素(Megakaryopoietin，简称MPO)和血小板生成素(TPO)的cDNA序列编码等基因工程的上游技术，而对大规模生产的方法没有公开或没有充分公开。它们及国际上所公开的方法在工艺程序方面或产品效价质量方面均有待改进之处。

本发明提供一种能够用于大规模生产重组人血小板生成素的方法，特别是对宿主细胞进行大规模培养，对表达产物进行分离纯化的方法。

本发明的另一个方面是将纯化的重组人TPO作为活性成分制成药品制剂，用于治疗以血小板缺乏为特征的疾病，如血小板缺乏症、放疗、化疗所致血小板缺乏，还可用于骨髓移植的增强剂，加速骨髓移植后病人血小板的恢复等。

按工艺步骤依次对本发明的方法说明如下。

本发明生产血小板生成素的方法选用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为宿主细胞。选用pSV-dhfr表达质粒作为标志质粒与pCDB共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷(CHO-dhfr-)株，进而筛选高效稳定表达人TPO的细胞株。

一、培养工程细胞株

rhTPO-CHO-N细胞株的培养流程为：细胞复苏→预培养→检测→扩增培养→无血清培养→收获上清。

在扩增培养阶段，细胞接种量为1.5×10⁴/cm²-2.5×10⁴/cm²，小牛血清含量为8-10％。经过4-5次传代，最后一代细胞在转瓶内形成单层时，细胞密度为1.5-2.0×10⁶个细胞/cm²。以Hank′s液洗涤6次，进入无血清培养。无血清培养时细胞贴壁培养时间为20-24天。在无血清培养阶段，两次收液的间隔时间为3-5天，培养基的PH为7.3，转瓶转速为12转/小时，培养温度为37℃。

二、分离纯化rhTPO

本发明是按“阴离子交换层析—疏水层析—分子筛凝胶过滤层析”三步骤分离纯化rhTPO的。

1.浓缩和脱盐

选用横流超滤浓缩，截留分子量为10,000-100,000，浓缩倍数为30-50倍。超滤过程中进行冰浴冷却，以减少在超滤过程中发生脱糖链、变性等引起TPO失活。此工序纯化产物总活性回收率在80％左右。

2.DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析

DEAE-Sepharose F.F子柱预先用10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液平衡三个柱体积，将rhTPO浓缩液以15-40ml/min的流速进样，进样完毕后用2.5-5.0倍柱体积的5mM醋酸，1mM甘氨酸，6M尿素，pH3.5-4.5缓冲液洗涤。经上述步骤洗涤后，用20-25mM NaCl/10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液将柱洗至中性并同时去除尿素，最后用100-150mM NaCl/10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液洗脱TPO蛋白峰。此步骤活性回收率为35-50％。

3.Butyl-Sepharose F.F疏水层析

Butyl-Sepharose F..F柱用0.5-1.5M(NH₄)₂SO₄/10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液平衡三个柱体积后，将含有1M(NH₄)₂SO₄的的上述TPO洗脱峰以15-25ml/min的流速上样，进样完毕后以0.5-1.0M(NH₄)₂SO₄/10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液洗柱至A280nm曲线回至基线，用10-30mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液解洗TPO蛋白。此步骤活性回收率为85-95％。

4.Sephacryl S-200 H.R凝胶过滤层析

Sephacryl S-200 H.R柱用柠檬酸盐缓冲液(含100mM NaCl，pH6.8-7.0)平衡后，将疏水层析解吸下来的TPO蛋白峰，以0.5-1.5ml/min的流速上样，用上述柠檬酸盐缓冲液进行洗脱，收集单一的TPO活性峰。用0.22um微孔滤膜过滤除菌，置于4℃或-70℃冰箱保存。经PAGE、HPLC检测证明，终产品纯度达99％以上。此步骤活性回收率为90％以上。

三、质量控制方法

与本发明工业化生产相配套，建立了如下质量控制方法：

(1)同一性检查：对rhTPO进行肽图、SDS-PAGE、HPLC、Western blot和氨基酸分试验，结果应与标准品一致。rhTPO的N末端氨基酸序列应与TPO天然序列完全一致。

(2)蛋白浓度检测：通过Lowry法、UV法测定rhTPO浓度。

(3)纯度检测：还原或非还原子SDS-PAGE、HPLC测定，其纯度应≥98％。

(4)热原检查：按药典规定进行兔法检测。

(5)核酸污染检测试验：DNA残留量应＜10pg/剂。

(6)蛋白质污染试验：小牛血清残留量应＜0.01％(w/w)；CHO细胞蛋白残留量应＜0.5％(w/w)。

(7)微生物污染试验：无菌试验应无菌生长；支原体检查应无支原体污染。

(8)效价测定：包括ELISA法(体外效价测定)、多血小鼠法(体内效价测定)。

(9)稳定性试验：通过不同存放条件下的稳定性试验，确定成品的有效期为一年半。

按本发明的方法生产TPO，在细胞扩增培养阶段，使细胞贴壁时间缩短至72小时以下长成单层，单层细胞停留时间延长至20-24天，使CHO细胞对TPO的分泌表达量提高，从而大大提高了TPO的得率。使用本发明的三步法对培养细胞所得上清液进行分离纯化，则简化了分离纯化工艺，缩短了分离纯化时间，避免了目的蛋白在极性条件下的作用，增加了TPO稳定性。终产品的得率从常规方法的30％左右提高到45％左右，即提高终产品产量50％左右。

使用本发明的方法生产的TPO终产品，加入适量人血清白蛋白作保护剂，再加入1％甘露醇配制成注射液，可以用于治疗各种原因引起的血小板减少症。

以下通过实施例对本发明的内容作进一步的说明。

实施例1 TPO在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中的克隆及表达

在CHO细胞中的表达载体有如下特点：

(1)有氨苄青霉素(Amp)抗性基因；

(2)E.coli.复制起始；

(3)CMV-RSV启动子，后跟BamHI及PvuII克隆位点，一个SV40内含子及聚腺苷酸化位点；

(4)小鼠二氢叶酸还原酶(mDHFR)基因，该基因表现氨甲蝶呤(MTX)抗性。DHFR基因转录在SV40启动子控制下。

编码TPO的DNA序列由T1克隆的DNA经PCR反应得到，5′-端引物为：

5′-CCCAGATCTGCCAGAATGGAGCTGAC-3′含BglII位点。3′-端引物为：

5′-AAAGATATCTTACCCTTCCTGAGACAG-3′含EcoRV位点及终止密码子的互补序列。PCR产物经BglII及EcoRV滑化，载体经BamHI及PvuII消化，然后连接。连接混合物用于转化大肠杆菌(E.coli.)系XLI Blue。转化液涂于氨苄青霉素(Amp)盘上。

以脂质体转染法导入CHO细胞，并在含0.02μM-0.1μMd的MTX的无核苷酸培养基中选择培养。挑出MTX性细胞在MTX浓度不断增加的培养基中选择和扩增。挑出产量最高的细胞，有限稀释进行亚克隆，最后得到理想的克隆细胞。

实施例2 rhTPO-CHO细胞的扩增培养

在扩增培养阶段，细胞接种量为2×10⁴/cm²，小牛血清含量为8％。经过15天有血清扩增培养(4-5次传代)，最后一代细胞在转瓶内形成单层(细胞密度为1.5-2.0×10⁶个细胞/cm²)时，以Hank′s液洗涤6次，改用无血清培养基(DMEM/F₁₂1∶1)培养。无血清培养时细胞贴壁培养时间为20-24天，每隔5天收取上清液一次，加液量为120ml/瓶(780cm²)，培养基pH为7.3，转瓶转速为12转/小时，培养温度为37℃。连续收获4次。rhTPO的效价在1200u/ml左右。

实施例3分离纯化rhTPO

按以下三步骤分离纯化rhTPO：

1.浓缩和脱盐：选用Millipore公司生产的横流超滤浓缩，截留分子量为10,000，浓缩倍数为30倍。超滤过程中进行冰浴冷却。

2.DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析：DEAE-Sepharose F.F离子柱预先用10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液平衡三个柱体积，将rhTPO浓缩液以35ml/min的流速进样，进样完毕后用3倍柱体积的5mM醋酸，1mM甘氨酸，6M尿素，pH4.5缓冲液洗涤。洗涤后用25mM NaCl/10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液将柱洗至中性并同时去除尿素，最后用100mM NaCl/10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液洗脱TPO蛋白峰。

3.Butyl-Sepharose F.F疏水层析：Butyl-Sepharose F.F柱用1M(NH₄)₂SO₄/10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液平衡三个柱体积后，将含有1M(NH₄)₂SO₄的上述步骤2所获取的TPO洗脱峰以15ml/min的流速上样，进样完毕后以1M(NH₄)₂SO₄/10mMTris-HCl，pH7.0缓冲液洗柱至A280nm曲线回至基线，用10mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液解洗TPO蛋白。

4.Sephacryl S-200 H.R凝胶过滤层析：Sephacryl S-200 H.R柱用柠檬酸盐缓冲液(含100mM NaCl，pH6.8-7.0)平衡后，将疏水层析解吸下来的TPO蛋白峰，以1.5ml/min的流速上样，用上述柠檬酸盐缓冲液进行洗脱，收集单一的TPO活性峰。用0.22um微孔滤膜过滤除菌，即为半成品，置于4℃或-70℃冰箱保存。

经PAGE、HPLC检测，终产品纯度可达99％以上。

实施例4配制药品制剂

使用按实施例2的方法生产的TPO终产品作活性成分，加入适量人血清白蛋白作保护剂，再加入1％甘露醇，按常规方法配制成注射液，可以用于治疗各种原因引起的血小板减少症。

Claims

1.一种应用基因工程技术生产重组人血小板生成素(TPO)的方法，包括培养工程细胞株的“宿主细胞复苏—预培养—扩增培养—无血清培养—收获上清液”的工序和对培养所得物的分离纯化工艺，其特征在于，

(a)在对宿主细胞进行大规模扩增培养阶段，细胞接种量为1.5×10⁴/cm²-2.5×10⁴/cm²，小牛血清含量为8-10％，无血清培养时细胞贴壁培养时间为20-24天；

(b)对培养所得物的分离纯化rhTPO是按“阴离子交换层析—疏水层析—分子筛凝胶层析”三步骤进行的。

2.根据权利要求1的方法所生产出的产物，加入适量人血清白蛋白作保护剂，再加入1％甘露醇按常规方法配制成注射液，用于治疗各种原因引起的血小板减少症，和与其它造血因子合并使用，治疗各种造血因子缺失所致的疾病。