ITMI20012345A1 - Procedimento per la produzione di interferone alfa di grado terapeutico - Google Patents

Procedimento per la produzione di interferone alfa di grado terapeutico Download PDF

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ITMI20012345A1
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Sergio Gabriel Tisminetzky
Francisco Ernesto Baralle
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Internat Ct For Genetic En Gin
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Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:
TITOLO: Procedimento per la produzione di interferone alfa di grado terapeutico.
CAMPO DELL'INVENZIONE
Il campo dell’invenzione è quello della rinaturazione e purificazione di citochine prodotte per via sintetica 0 ricombinante, per la produzione di molecole di grado terapeutico.
TECNICA ANTERIORE
Gli Interferoni sono delle citochine pleiotropiche prodotte e secrete da diversi tipi di cellule (cellule epiteliali, fibroblasti, linfociti, macrofagi) per induzione di una serie di stimoli (virus, batteri, cellule, tumori, e macromolecole) con una serie di funzioni antivirali, anti-proliferative ed immuno-stimulanti. In seguito alla sua produzione endogena o alla sua somministrazione, l’interferone interagisce con i recettori specifici sulla superficie cellulare ed attiva la trasduzione del segnale attraverso il citoplasma fino al nucleo, inducendo l’espressione di geni che codificano per proteine specifiche con attività antivirale ed immuno-stimolatoria. Sono descritte cinque classi principali di interferoni: interferone α, β, τ, γ, ed ω. Interferone a e β, noti come interferoni di tipo I, sono strutturalmente correlati, sono stabili a pH acido e competono per lo stesso recettore cellulare. Le proteine che costituiscono la famiglia dell'interferone alfa sono codificate da 14 geni, tutti localizzati sul cromosoma 9.
Oggi, gli interferoni alfa, beta e gamma possono essere prodotti in forma ricombinante con il duplice vantaggio di poter ottenere quantità notevolmente superiori di prodotto rispetto a quelle ottenute attraverso l'isolamento da fonti naturali (leucociti, fibroblasti, linfociti) e di poter ridurre la complessità dei processi di purificazione ed accertamento della sicurezza del prodotto.
L’Interferone alfa è stata una delle prime proteine ad essere prodotta in Escherichia coli con la tecnologia del DNA ricombinante (Derynck et al Nature 287: 193-197,1980; Nagata et al, Nature 284: 316-320, 1980). L’espressione di proteine ricombinanti in batteri è preferibile perché, al contrario di quella in cellule eucariotiche o dei prodotti naturali espressi in cellule di mammifero in coltura, quale l’interferone descritto in Yonehara S. et al, J.Biol.Chem. 256: 37703775, 1981, dà una molecola priva di contaminanti ad esempio retrovirus o contaminanti del siero di origine animale, non del tutto noti o caratterizzati, quali ad esempio l’agente della BSE, potenzialmente presente nel siero di origine bovina utilizzato per le colture cellulari. Gli stessi rischi di contaminazione sono evidentemente presenti nel caso di purificazione mediante immunoaffinità con anticorpi monoclonali o policlonali.
L'espressione in E. coli presenta tuttavia altri problemi: è stato infatti osservato che l’efficiente espressione di proteine ricombinanti in E. coli porta alla formazione di aggregati insolubili noti come corpi di inclusione (Taylor G. et al. Bio/Technol 4: 553-557, 1986; Schein C. Bio/Technol 8: 308-317, 1990).
Le proteine ottenute come inclusion bodies non sono correttamente conformate tridimensionalmente e non hanno quindi una attività biologica ottimale. Per potere ottenere tali proteine in forma nativa è necessaria dapprima una fase di denaturazione e quindi una fase di rinaturazione, ossidante, nel caso in cui debbano anche essere formati i ponti disolfuro così come nella proteina naturale.
Molti metodi di rinaturazione di proteine ricombinanti sono noti neH’arte: ogni protocollo di rinaturazione è tuttavia specifico per la proteina considerata ed ha un’efficienza che dipende dalla complessità della proteina e dalla presenza in essa di cisteine e ponti disolfuro (Rudolph R. & Lilie H. FASEB J. 10: 49-56, 1996, Lilie H. et al. Curr. Opin. Biotechnol 9: 497-501 , 1998; Misawa S and Kumagai I. Biopolymers 51 : 297-307, 1999).
I processi di ossidazione e rinaturazione non sono particolarmente efficienti: si hanno consistenti perdite di materiale e vengono generati dei sottoprodotti (forme parzialmente ridotte, molecole con ponti intramolecolari non naturali ed oligomeri dovuti alla formazione di ponti disolfuro inter-molecolari) che devono essere eliminati nelle fasi di purificazione successive.
In particolare per i prodotti di uso terapeutico la purificazione deve prevedere la rimozione non solo delle endotossine di origine batterica o dì altri contaminanti derivati dal sistema di espressione, ma anche delle molecole aventi struttura tridimensionale non corretta e quindi del tutto o parzialmente inattive.
Per gli interferoni, che pure rappresentano una famiglia poco omogenea dal punto di vista strutturale, sono stati sviluppati diversi e complessi metodi di produzione e purificazione, parte dei quali sono elencati di seguito. In: "Purification of Recombinant Human IFN-a2” Thatcher D. and Panayotatos N., Methods Enzymol 119: 166-177, 1986, l'interferone prodotto in batteri come corpi di inclusione viene sciolto utilizzando una soluzione di Guanidina-HCI 8M e dializzato in seguito con 20 volumi di acqua a 4°C. La soluzione risultante viene caricata su una colonna SP-Sepharose A-50 e le frazioni con l’Interferone sono passate attraverso un imbuto di vetro contenete DEAE-Sephadex A20. Il “flow-through” di questa colonna è sottoposto ad un ulteriore passaggio di purificazione attraverso una colonna di Sepharose 6B-Cu. Le frazioni contenenti l’Interferone sono precipitate con NH4S04 e sono caricate su una colonna di Sephacryl S-200. Le frazioni che corrispondono a proteine con peso molecolare compreso tra 40 e 60 kDa sono precipitate con NH4S04 e dializzate ulteriormente.
In EP 0110302 e US4432895 è descritto un procedimento in cui il pellet di E. coli congelati viene risospeso in acqua e alcalinizzato per favorire la flocculazione dei resti cellulari. Segue un trattamento con Guanidina-HCI. Dopo filtrazione, il lisato cellulare viene caricato in una colonna di immuno-affinità ottenuta con un anticorpo monoclonale specifico legato covalentemente alla matrice Sepharose 4B. L’Interferone eluito dalla colonna di affinità è sottoposto a due ulteriori passaggi di purificazione attraverso una colonna CM-52 ed una colonna di Sephadex G-50.
In EP 094672 viene descritto un procedimento che utilizza 3 fasi cromatografiche sequenziali. Si inizia con l’adsorbimento dell’ lnterferone-β presente nel lisato cellulare grezzo ad una colonna di vetro, dalla quale viene eluito con una soluzione di tetrametil ammonio cloruro, NaCI e propilen-glicole. Nella fase successiva, l’eluato della prima colonna viene caricato in una colonna di Sephacryl S-200. Le frazioni che corrispondono a proteine con peso molecolare compreso tra 40 e 60 kDa successivamente caricate in una colonna cromatografica contenente una resina a base di Zn<++ >chelante, alla quale l’Interferone non si attacca venendo così purificato dalle altre proteine.
In Boyer S.J et al. (J. Biol. Regul. Homeost. Agents 6: 99-102, 1992) l’interferone alfa è prodotto come proteina di fusione utilizzando un vettore di espressione della serie pGEX (Amersham-Pharmacia). Il prodotto batterico viene purificato attraverso una colonna di affinità contenente Glutathione-Sepharose 4B. La proteina di fusione viene eluita dalla colonna e l’Interferone viene rilasciato mediante taglio enzimatico con il Fattore X.
In Waine G.J. et al. “Improved production and purification of interferon alpha 4a using a T7 RNA polymerase expresision System”. Biochem Int., 1992, 28: 255-263 viene utilizzata una precipitazione con solfato di protamina, cromatografia di scambio anionico, e una colonna di immuno-affinità con un monoclonale specifico.
In “Large-scale production of recombinant proteins: human leukocyte interferon” di Khan F.R. Rai VR. Bioprocess Technol 7: 161-169, 1990, per la purificazione viene utilizzata una serie progressiva di cromatografie: una colonna di carbossimetilcellulosa; una colonna di affinità Cu-chelante; una colonna di scambio ionico e finalmente una cromatografia di gel-filtrazione.
In EP 553494 viene descritta la produzione di IFN-alfa in lievito. Il materiale solubilizzato viene purificato attraverso una serie progressiva di cromatografie: una cromatografia di scambio anionico, seguita da una cromatografìa di scambio cationico e finalmente una cromatografia in gel-filtrazione.
In US 4485038, l’IFN alfa viene espresso in batteri e purificato attraverso un primo passaggio dei lisato batterico grezzo attraverso una colonna cromatografica contenete vetro (Controlled Pore Glass) o acidi di silicio equilibrati in tampone fosfato a pH compreso tra 6 e 8. L’ eluizione si realizza con NaCI o Ammonio Cloruro combinati con Etilene-glicole e Propilene-glicole. L’eluato, il cui pH viene corretto a 4.5-6.0, viene prima passato attraverso una colonna di Carbossimetile-derivato e poi attraverso una colonna dì scambio cationico. L’eluato dell’ultima colonna viene caricato su una colonna di Fenil-Agarosio e le frazione contenenti l’Interferone sono eluite con una soluzione al 50-70% Etilene-glicole. In US 5196323 il processo descritto prevede una serie progressiva di cromatografie: si comincia con una colonna contenente cellulosa DE-52; si prosegue con una colonna di immuno-affinità con un anticorpo monoclonale IgG anti-interferone; e si conclude con una colonna di scambio cationico.
In US 4511502 è descritto un procedimento dove le proteine prodotte come corpi di inclusione sono solubilizzate per mezzo di una soluzione di Guanidina 4-9M o di Tiocianato e 0.01-2% di detergente. Il lisato batterico viene adsorbito ad una colonna di cellulosa DEAE e l’Interferone viene purificato attraverso una cromatografia di gelfiltrazione con la matrice Sephacryl S-300.
In US 4845032 è descritto un processo di isolamento di Interferone da corpi di inclusione attraverso solubilizzazione con Guanidina con successivo caricamento di questa soluzione in una colonna di interazione idrofobica contenente N-butil-TSK. Le frazioni con l’Interferone sono eluite con soluzioni saline a concentrazioni inferiori a 0.1 M.
In US 4765903 (Purification of monomeric interferon. D’Andrea M.J., Tarnowski S.J., Clark A.D.) è descritta la purificazione di interferone alfa utilizzando una colonna a fase-inversa C-4, dove le frazioni con l’Interferone sono recuperate con una soluzione costituita da 0.1 % acido trifluoroacetico e 46% CH3CN. Il materiale proviene di un precedente passaggio di purificazione utilizzando una cromatografia di immunoaffinità. Le frazione eluite dalla colonna C-4 sono ulteriormente purificate attraverso una cromatografia di scambio cationico su carbossimetilcellulosa.
In EP 679718 è descritto un processo che prevede l’estrazione dell’Interferone alfa da batteri mediante l’uso di un agente caotropico. La successiva rinaturazione viene effettuata utilizzando acqua o una soluzione tampone. L’interferone alfa e’ purificato attraverso diverse cromatografie in successione (cromatografia metal-chelante; cromatografia di scambio cationico; cromatografia di scambio anionico; cromatografia di gel-filtrazione).
Anche l’espressione in un sistema eucariotico, quale il lievito, non garantisce la corretta struttura tridimensionale del prodotto ricombinante. Come riportato ad esempio in Di Marco S. et al., J. Biotechnol. 50:63-73, 1996 l’IFN-alfa 8 prodotto in S. cerevisiae deve essere denaturato e rinaturato e purificato attraverso una cromatografia di affinità Cuchelante ed una cromatografia a scambio anionico.
In conclusione, i metodi per la produzione/preparazione di IFN alfa prevedono o purificazioni con almeno un passaggio di immunoaffinità che presenta potenziali problemi di contaminazione, o, in alternativa, procedimenti lunghi e comprendenti diversi passaggi cromatografici e quindi piuttosto laboriosi.
Pertanto è altamente sentita nel settore l’esigenza di un metodo di purificazione dì IFN-alfa di grado terapeutico, semplice, riproducibile e che garantisca rese vantaggiose.
SOMMARIO
Oggetto principale della presente invenzione è un procedimento per la purificazione di interferone alfa in conformazione nativa e di grado terapeutico da una miscela di denaturazione che comprende un passaggio di rinaturazione ossidante ed un singolo passaggio cromatografico su resina con scambiatore cationico forte, preferibilmente scelto tra sulfopropile e metilsulfonato.
Il passaggio cromatografico avviene a pH compreso tra 5. 3-5.7, preferibilmente pH 5.5 ± 0.1.
Secondo un aspetto particolarmente preferito l’interferone è IFN alfa 2 umano, prodotto per via ricombinante. La maturazione ossidante avviene in un sistema tampone avente pH compreso tra 7.5 e 8.5, preferibilmente pH 8.0 ± 0.1 comprendente un agente labilizzante, preferibilmente L-arginina o suoi sali e derivati, in concentrazione compresa tra 0.3 e 0.6 M, una coppia redox, preferibilmente costituita da L-cisteina in concentrazione compresa tra 0.1-10 mM e suoi sali o derivati ed L-cistina e suoi sali o derivati in concentrazione compresa tra 0.005-0.5 mM, ed opzionalmente un composto chelante. Secondo una realizzazione preferita, il procedimento comprende un passaggio di desalificazione effettuata mediante uno dei seguenti metodi: dialisi, ultrafiltrazione, gel filtrazione oppure dia-filtrazione, effettuato prima del passaggio cromatografico.
Secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione riguarda qualsiasi metodo di produzione di interferone alfa di grado terapeutico, che comprenda il passaggio di rinaturazione ossidante e di cromatografia su scambiatore cationico forte, secondo l’oggetto principale dell’invenzione.
Secondo una realizzazione particolarmente preferita, la produzione di IFN alfa avviene per via ricombinante, mediante: 1) espressione intracellulare di una sequenza di DNA codificante per l’interferone alfa in un organismo preferìbilmente procariota geneticamente modificato, ancor più preferibilmente E. coli, 2) recupero dell’interferone alfa in forma non nativa, preferibilmente dai corpi di inclusione, 3) denaturazione dell’interferone alfa con agenti caotropici, per essere successivamente purificato mediante i passaggi a ) e b) del procedimento secondo l’invenzione.
Secondo un ulteriore aspetto, pertanto, l’invenzione riguarda l’interferone alfa 2 umano in conformazione nativa e di grado terapeutico, preferibilmente ricombinante, ottenibile secondo il procedimento dell’invenzione, ed avente un grado di purezza superiore al 99% come misurato mediante gel elettroforesi denaturante, attuata in accordo con le linee guida della Farmacopea Europea. Un ulteriore aspetto dell’invenzione riguarda pertanto l’uso dell’interferone secondo l'invenzione in terapia.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Elettroforesi su SDS-PAGE riducente del procedimento di produzione di interferone alfa secondo l’invenzione.
L’elettroforesi è stata eseguita su gel di poliacrilammide.
Corsia 1 : estratti batterici grezzi alla fine del processo di fermentazione: la banda della proteina maggiormente espressa è interferone alfa, comigrante con la preparazione standard di IFN-a2 presente nelle corsie 7 e 8, caricate rispettivamente con 5 e 25 pg del lotto 2 CRS Cat. No.
10320301 EDQM- European Pharmacopoeia. Corsia 2: surnatante dopo centrifugazione dei corpi di inclusione; corsia 3: lavaggi dei corpi dì inclusione; corsia 4: miscela di denaturazione dopo risospensione dei corpi di inclusione in GuHCI; corsia 5: miscela di rinaturazione; corsia 6: IFN-α purificato mediante separazione cromatografica su scambio cationico; corsie 7 e 8, rispettivamente 5 e 25 pg del lotto 2 CRS Cat. No. 10320301 EDQM- European Pharmacopoeia.
Figura 2. Profilo cromatografico della miscela di rinaturazione dopo diafiltrazione, su colonna IEC SP 2825, (Shodex Waters). Pannello a): ascisse: tempo di ritenzione, ordinate: conduttività in mSiemens/cm; pannello b) ascisse: tempo di ritenzione, ordinate: volume percentuale della soluzione B (0.5 M NaCI). La miscela di rinaturazione diafiltrata e concentrata e contenente l’IFN rinaturato fu caricata su colonna IEC SP 2825, equilibrata con acetato di sodio 50 mM, pH 5.5, ad un flusso di 8.0 ml/min. La colonna fu lavata con 3 volumi della colonna (VC=154 mi) utilizzando lo stesso tampone di equilibrazione. L’eluizione dell’IFN alfa nativo fu realizzata con un gradiente lineare 10%-40% di NaCI 0.5 M (soluzione B) in tampone di NaAc 50 mM pH 5.5 in 5 VC. Il profilo di cromatografico rivela un picco principale (C) corrispondente all’IFN-a2 in conformazione nativa, e due picchi minori (A) e (B), corrispondenti a forme monomeriche non native.
Figura 3. SDS-PAGE in condizioni non riducenti (pannello a) e riducenti (pannello b) della preparazione di interferone-alfa purificato secondo l’invenzione, in accordo con la European Pharmacopoeia, Monograph 1997:1110, p. 1031-1035, 1997.
Le proteine furono colorate con colorazione argentica. I valori di peso molecolare dei marker sono indicati a fianco del gel (Molecular Weight Markers: Cat.No.7708S, N. E. Biolabs). Corsia 1: marcatori di peso molecolare; corsia 2 e 3: preparazione di IFN-a2 purificato secondo l’invenzione, caricato rispettivamente in quantità pari a 5 e 25 pg; corsie 4-8: Interferone alfa standard (lotto 2 CRS Cat. No. 10320301, EDQM-European Pharmacopoeia), caricato rispettivamente in quantità corrispondenti a 31.25, 6.25, 1.25, 0.25, 0.05 pg per corsia. In corsia 9 e 10 sono caricati gli estratti cellulari del ceppo di E. coli utilizzato per l’espressione della proteina ricombinante trasformato con il solo plasmide. La presenza e la percentuale di contaminanti nella preparazione di IFN-oc2 purificato secondo l'invenzione, in particolare di bande di peso molecole inferiore o superiore a quella dell’IFN-a2 (corrispondente a circa 20kDa), fu valutata comparando l’intensità delle suddette bande rispetto alle diluizioni della preparazione STD di IFNoc2. Bande di peso molecolare inferiore a quello dell’IFN-a2 (presumibilmente corrispondenti a prodotti di degrazione), furono valutate nell’elettroforesi in condizioni riducenti (pannello b), mentre la presenza e l’intensità di bande di peso molecolare superiore a quello dell’IFN-a2 (e presumibilmente corrispondenti a dimeri) furono valutate nell’elettroforesi in condizioni non-riducenti (pannello a), secondo quanto descritto nell’esempio 4 ed in accordo con la European Pharmacopoeia. Figura 4. Immunoblotting della preparazione di interferone alfa2 purificato. Pannello a) sviluppato con anticorpi anti-E. coli per la rivelazione di possibili contaminanti batterici. Pannello b): Immunoblotting sviluppato con anticorpo anti-interferone per l’identificazione immunologica del prodotto purificato.
Pannello a). Corsia 1: marcatori di peso molecolare; corsia 2 e 3 preparazione di IFN-a2 secondo l’invenzione, caricata in quantità corrispondenti a 5 e 25 pg; corsie 4-7: preparazione di IFN-a2 standard (European Farmacopeia) caricate rispettivamente con 31.25, 6.25, 1.25, 0.25 e 0.05 μg; corsie 9 e 10: proteine totali di E. coli caricate rispettivamente in quantità corrispondenti a 10 e 1 pg. La concentrazione proteica negli estratti fu misurata con un kit commerciale (Sigma Cat. No. 690-A). Le proteine totali di E. coli furono ottenute da una fermentazione standard del ceppo BL21 trasformato con il solo vettore (non esprimente l’IFN), caricata come controllo positivo della reazione anticorpale. Non sono evidenziabili bande positive per l’anticorpo anti-E.coli nè nel prodotto purificato secondo l’Invenzione né nello standard della European Pharmacopoeia. Anticorpo anti-E.coli: (Cat. No. RV1001, Virostat).
Pannello b): Immunoblotting sviluppato con anticorpo anti-interferone. Corsie come in pannello a). Non sono evidenziabili come atteso, bande corrispondenti a proteine immunologicamente simili a IFNa2 negli estratti di E. coli ceppo BL21 non trasformato, mentre una banda del peso molecolare atteso per l’interferone alfa (19.3 kDa) è presente sia nella preparazione di IFNot2 secondo l’invenzione che nello standard della European Pharmacopoeia.
Anticorpo anti-interferone (Cat. No. AB1434, Chemicon Int. Ine.). Anti rabbit conjugate: Alkaline Fosfatase conjugate Cat. No. 5373B, Promega. Sistema di sviluppo: NBT-BCIP Cat. No. 169-747-1, Boheringer Mannheim. Supporto: membrana di nitrocellulosa Cat. No.
12807-41BL, Sartorious AG.
Figura 5. Isoletrofocalizzazione eseguita in accordo con la Farmacopea Europea, 1997, dell’Interferone alfa 2 preparato secondo l’invenzione, e dello standard di riferimento.
Pannello a): gel colorato con Acid Blue 83 R: Coomasie Brillant Blue R250, Cat. No. 27816, Fluka. Corsia 1: marcatori di punto isoelettrico (Broad pl-kit, pH 3.5-9.3, cat.n°17-0471-00, Amersham Pharmacia Biotech) ; corsia 2: standard di riferimento: IFNa2b, lotto 2 CRS Cat. No.
10320301, EDQM- European Pharmacopoeia (EP); corsia 3: IFNoc2 secondo l’invenzione, rinaturato in tampone RB1 (vedi esempio 3); corsia 4: IFNa2 rinaturato in tampone RB2 (vedi esempio 3); corsia 5: IFNa2 rinaturato in tampone RB3 (vedi esempio 3).
E’ possibile osservare che la banda principale delle tre diverse preparazioni dì IFNoc2 (corsie 3, 4, 5) migra in posizione corrispondente alla banda principale dello standard di riferimento (corsia 2).
Pannello b) Grafico per la interpolazione del punto isoelettrico della preparazione di IFNa2 secondo l’invenzione. In grafico, sulle ascisse, sono riportate le distanze di migrazione dei marcatori di punto isoelettrico di riferimento e sulle ordinate il loro punto isoelettrico. Sulla retta costruita con tali punti sono stati interpolati i valori del punto isoelettrico dei campioni e dello standard di riferimento (EP). I valori di pi ottenuti e la loro conformità a quanto richiesto dalla Farmacopea Europea, sono descritti nell’Esempio 4.
Figura 6. Profilo cromatografico dell’interferone secondo l’invenzione e dell’IFN standard, su cromatografia liquida in fase inversa.
Pannello a): Interferone alfa 2 secondo l’invenzione e pannello b) IFN alfa 2 standard della Farmacopea Europea. L’analisi è stata effettuata secondo le linee guida della Farmacopea Europea allo scopo di valutare la purezza della preparazione dell’IFN. Il cromatogramma, presentato nel pannello a) rivela la presenza di un picco principale avente un’area corrispondente al 98.81% dell’area totale del cromatogramma ed avente un tempo di ritenzione sulla colonna di 54.56 min. L’area del picco corrispondente alla preparazione standard di IFN-2 (vedi pannello b), risulta invece esser pari al 97.45% dell’area totale, ed ha un tempo di ritenzione molto simile (54.66 min).
Altri parametri misurati nel cromatogramma a) per il picco principale (IFN secondo l’invenzione) sono: area mAU*min=12.5709 e altezza del picco=25.969 mAU. Nel pannello b) corrispondente a preparazione di IFN standard i relativi valori sono: area mAU*min=6.4315 e altezza del picco=14.219 mAU
Materiali e reagenti: HPLC: AKTA purifier 10, Cat. No. 18-1400-00, Pharmacia. Column: Lichrospher WP300 RP-18, 4.6x250 C18, 5um, Cat. No. 50137, Merck. Acetonitrile: Hypersolve, Cat. No. 152516Q, BDH. Acido trifluoroacetico: Cat. No. 108262, Merck. IFN Standard: Interferon alfa-2b CRS Cat. No. 10330301. European Pharmacopoeia. Figura 7. Mappa triptica del’lnterferone alfa2 secondo l’invenzione e dell’IFN standard, in accordo con la European Pharmacopoeia.
Nella parte superiore della figura è mostrato il cromatogramma ottenuto mediante cromatografia liquida dopo digestione con tripsina della preparazione di interferone purificato secondo l’invenzione; nella parte inferiore è mostrato quello dello standard EP.
I due cromatogrammi, facilmente comparabili visivamente per specularità, risultano essere qualitativamente simili, come richiesto dalla Farmacopea Europea.
Figura 8. Spettroscopia di massa del’lnterferone alfa 2B secondo l’invenzione e dell’IFN alfa-2B standard realizzata mediante lonSpray (PE SCIEX, API 150EX, Perkin Elmer). Nel pannello a) sono mostrati i valori di massa ottenuti con l’IFN-alfa purificato secondo l’invenzione, mentre nel pannello b) sono mostrati quelli corrispondenti alla preparazione standard.
I campioni furono introdotti mediante infusione diretta con “positive mode” , sull’intervallo m/z 400-3000. La deconvoluzione dello spettro è stata effettuata con il software Biotoolbox (Applied Biosystem).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
L’efficiente espressione di IFN ricombinante, quale quella ottenuta in organismi procarioti, è spesso ottenuta a scapito di un ripiegamento ( folding ) corretto della proteina. Aggregati insolubili, noti come corpi di inclusione ( inclusion bodies), si formano a livello intracellulare in E. coli per la precipitazione di forme denaturate della proteina eterologa, che arriva a costituire in tal modo anche il 30% delle proteine totali del batterio. Nei corpi di inclusione, la proteina pur trovandosi vantaggiosamente in forma semi-pura, ha una conformazione non nativa. Al fine dì ottenere la proteina in forma nativa, i corpi di inclusione devono essere solubilizzati mediante denaturazione con un agente caotropico e quindi sottoposti ad un passaggio di maturazione in vitro, che consente il corretto ripiegamento ( folding ) della proteina e, nel caso in cui ci siano, la formazione dei corretti ponti disolfuro.
Per forma nativa di una proteina ricombinante è intesa una proteina avente non solo la sequenza amminoacidica, ma anche conformazione tridimensionale uguale a quella della proteina naturale.
Numerosi sono i protocolli di rinaturazione in vitro a partire da miscele dove la proteina è presente in forma parzialmente o completamente denaturata. I protocolli di rinaturazione e le relative rese sono molto variabili e dipendono dalle caratteristiche della particolare proteina di interesse, dal numero di ponti disolfuro presenti nella proteina naturale, dalla sua naturale tendenza ad aggregare, etc.
Oggetto della presente invenzione è un procedimento per la purificazione di IFN alfa in conformazione nativa e di grado terapeutico, da una miscela di denaturazione che comprende essenzialmente un passaggio a) di rinaturazione ossidante ed un unico passaggio di cromatografia su scambiatore cationico, passaggio b, e la relativa eluizione. Per interferone alfa in conformazione nativa è intesa la proteina IFN-alfa matura (quale quella identificata in SwissProt con i numeri P01563, e P01562, P32881 e in GenBank con il numero NM-000605) in forma monomerica, non glicosilata, ed avente due ponti disolfuro.
Secondo una realizzazione preferita l’IFN alfa è di origine ricombinante, ma può essere prodotto anche per sintesi chimica e con i gruppi sulfidrilici in forma ridotta.
Ai fini della presente invenzione, per miscela di denaturazione si intende una qualsiasi soluzione acquosa contenente interferone alfa ad concentrazione proteica non superiore a 15 mg/ml, meglio se compresa tra 6-14 mg/ml, ancor più preferibilmente compresa tra 8-12 mg/ml e dove l’interferone è in forma denaturata grazie alla presenza di un agente caotropico, quale urea o guanidina in concentrazione compresa tra 4 e 8M in un sistema tampone a pH compreso tra 7 e 9, preferibilmente pH 8.0 ± 0.2, ancor più preferibilmente pH 8.0 ±0.1 e dove la proteina ha i gruppi sulfidrilici in forma ridotta.
La miscela di denaturazione può comprendere eventualmente anche un agente riducente, quale ad esempio DTT (ditiotreitolo) o βmercaptoetanolo, in concentrazione non superiore a 10 mM.
L’agente caotropico è preferibilmente costituito da GuHCI in concentrazione compresa tra 5 e 7M, preferibilmente 6M, in un sistema tampone quale Tris a concentrazione 50-150 mM e a pH compreso tra 7.5 e 8.5, preferibilmente pH 8.0 ± 0.2, ancor più preferibilmente pH 8.0 ± 0.1 , e può inoltre comprendere un agente chelante, quale EDTA, preferibilmente in concentrazione compresa tra 0.1 e 5 mM, ancor più preferibilmente tra 1 e 3, o preferibilmente 2 mM.
In queste condizioni gli aggregati proteici sottoposti ad agitazione meccanica, ad esempio con un agitatore magnetico a 200 rpm, si dissolvono completamente. L’eventuale presenza di materiale particolato, dovuta ad una incompleta dissoluzione degli aggregati proteici può essere eliminata, ad esempio mediante centrifugazione, prima della fase di rinaturazione.
La rinaturazione ossidante, corrispondente alla fase a) del procedimento, avviene per lenta aggiunta della miscela di denaturazione, ad esempio mediante gocciolamento, ad una soluzione di rinaturazione, fino a raggiungere una concentrazione finale di proteine totali (costituite per la maggior parte o quasi completamente di IFN-alfa) compresa tra 50 e 300 μg/nnl, ancor più preferibilmente 100-250 pg/ml. La soluzione di rinaturazione comprende un agente labilizzante ed una coppia redox, ed è tamponata, ad un pH compreso tra 7.5 e 8.5, preferibilmente pH 8.0 ± 0.2, ancor più preferibilmente pH 8.0 ± 0.1 , ad esempio con Tris. Opzionalmente, può essere presente anche un agente chelante, quale EDTA, preferibilmente in concentrazione compresa tra 0.1 e 5 mM, ancor più preferibilmente tra 1 e 3, o preferibilmente 2 mM.
Per agente labilizzante si intende una molecola o un composto in grado di sfavorire in soluzione acquosa la formazione di aggregati macromolecolari di natura proteica, mantenendo le proteine in forma monomerica e di favorire la formazione di una conformazione nativa, anche attraverso un’azione stabilizzante/solubilizzante degli intermedi di rinaturazione, azione ipotizzata per l’arginina (Lilie H. et al. Curr. Opin. Biotechnol. 9:497-501 , 1998). In tal senso anche soluzioni lievemente denaturanti, quali ad esempio guanidina in concentrazione compresa tra 0.3-1 M, sono labilizzanti; per coppia redox si intende invece un sistema avente gruppi funzionali in grado di essere reversìbilmente ridotti e ossidati in un sistema biologico.
Tra gli agenti labilizzanti, il preferito è L-arginina o suoi sali o derivati, in concentrazione compresa tra 0.3 e 0.6M, preferibilmente tra 0.4 e 0.55 M, ancor più preferibilmente 0.5 M.
Nella soluzione di rinaturazione è inoltre presente una coppia redox, costituita preferibilmente da reagenti tiolici a basso peso molecolare in forma ossidata ed in forma ridotta, quali: glutatione in forma ridotta ed in forma ossidata (GSS/GSSH), la coppia cistina/cisteina, la coppia cistamina/cisteamina, la coppia idrossietil-sulfossido/2-mercaptoetanolo. Particolarmente preferita è la coppia redox cisteina/cistina o i loro sali e derivati, presenti rispettivamente in una concentrazione compresa per: L-cisteina tra 0.1-10 mM e per L-cistina e/o suoi sali o derivati tra 0.005-0.5 mM. Ancor più preferibilmente tali concentrazioni sono comprese per L-cisteina o i suoi sali e derivati tra. 0.5-2 mM e per L-cistina tra 0.03-0.07 mM.
Dopo aggiunta della miscela di denaturazione alla soluzione rinaturante, il pH della miscela di rinaturazione è mantenuto ad un valore compreso tra 7.5 e 8.5, preferibilmente 8.0 ± 0.2, ancor più preferibilmente 8.0 ± 0.1. La rinaturazione ossidante dell’IFN-oc nella miscela di rinaturazione avviene ad una temperatura compresa tra 5-25°C, preferibilmente tra 16°C-24°C, ancor più preferibilmente 22°C, preferibilmente per un tempo compreso tra 18 e 50 ore, preferibilmente 40 ore.
La quantità di prodotto rinaturato in conformazione nativa, può essere monitorata nel tempo durante la fase di rinaturazione, ad esempio mediante HPLC a fase inversa o mediante altri metodi noti al tecnico del ramo.
Secondo una realizzazione particolarmente preferita, la fase di rinaturazione ossidativa, corrispondente alla fase a) del procedimento, è seguita da una fase di desalificazione che può essere effettuata ad esempio mediante dialisi, secondo metodi noti al tecnico del ramo, oppure mediante ultra-filtrazione, gel filtrazione, dia-filtrazione mediante ultrafiltrazione, al fine di rimuovere l’agente labilizzante/denaturante, ed abbassare la concentrazione ionica della miscela di rinaturazione. Opzionalmente, ed in aggiunta a tale trattamento, viene effettuata una gel filtrazione ed il materiale proteico può essere concentrato prima del passaggio cromatografico b).
La miscela di rinaturazione, desalificata, contenente sia l’IFN-alfa rinaturato, (ossia in conformazione nativa), che quello non rinaturato (in conformazione non nativa, quale ad esempio quello in forma dimerica, oppure in forma non completamente ossidata), è quindi portata ad un pH compreso tra 5.3-5.7, preferibilmente pH 5.5±0.1 con un acido concentrato, preferibilmente acido acetico glaciale. Opzionalmente la soluzione può essere filtrata su filtri 0.45 μιτι, oppure centrifugata, per rimuovere eventuali precipitati dovuti all'acidificazione.
Successivamente, la soluzione di rinaturazione desalificata, opzionalmente concentrata, ed acidificata, è caricata su una colonna cromatografica avente quale gruppo funzionale uno scambiatore cationico forte, in accordo con la fase b) del procedimento. Per la colonna cromatografica si utilizzano resine commercialmente disponibili aventi le seguenti caratteristiche: il gruppo funzionale deve essere uno scambiatore cationico forte scelto tra il gruppo sulfopropile o metilsulfonato, preferibilmente su matrice con particelle di dimensioni inferiori a 25μ. Particolarmente preferita è la colonna IEC-SP 2825 (Shodex, Waters), che utilizza una matrice di poliidrossimetacrilato con gruppo funzionale sulfopropile. In alternativa viene utilizzata la resina Source 15 S, a matrice di polistirene, reticolata con divinilbenzene (Pharmacia cat. N. 17 — 0944-01), avente come gruppo funzionale il metilsulfonato.
La separazione cromatografica avviene in soluzioni tampone aventi pH compreso tra 5.3-5. 7, preferibilmente pH 5.5±0.1. La soluzione tampone è preferibilmente tampone acetato, in concentrazione compresa tra 10-80 mM, preferibilmente 50 mM. La colonna cromatografica è preferibilmente equilibrata prima del caricamento del campione con lo stesso tampone di caricamento di pH compreso tra 5.3-5. 7, ancor più preferibilmente pH 5.5±0.1. Altre soluzioni tampone possono comunque essere utilizzate, secondo quanto noto nel settore, a condizione che sia mantenuto un valore di pH compreso nell'intervallo tra 5.3-5. 7, preferibilmente pH 5.5±0.1. Dopo il caricamento del campione, la colonna viene trattata per eliminare leganti aspecifici ad esempio mediante lavaggio con diversi volumi dello stesso tampone di caricamento, come noto nel settore.
L’IFN-alfa in conformazione nativa viene eluito dalla resina a scambio cationico mediante caricamento di un tampone di eluizione contenente un gradiente salino lineare da 0 a 1M di un sale monovalente, ancor più preferibilmente NaCI in concentrazione compresa tra 0 e 500 mM. Il tampone di eluizione è preferibilmente tampone acetato con le stesse caratteristiche di quello utilizzato per caricare il campione e per equilibrare la colonna.
In accordo con questa realizzazione preferita, il gradiente salino lineare è formato mediante miscelazione di una soluzione di tampone acetato, preferibilmente sodio acetato in concentrazione compresa tra 10-80 mM, preferibilmente 50 mM, avente pH compreso tra 5.3-5. 7, preferibilmente pH 5.5±0.1 , con una soluzione identica, comprendente inoltre il sale monovalente, preferibilmente sodio cloruro, in concentrazione 1 M, o più preferibilmente compresa tra 0.4-0.6M, ancor meglio se 0.5 M, nello stesso tampone acetato.
L’eluizione dell’IFN alfa nativo avviene mediante caricamento su colonna di un gradiente lineare 10%-40% di un sale monovalente, preferibilmente NaCI 0.5 M, in una soluzione tampone a pH 5.5±0.1 , preferibilmente costituita da NaAcetato 50 mM in un volume compreso tra 4 e 12 volumi della colonna, ancor più preferibilmente compreso tra 5-10 VC (VC=volumi della colonna), ad una concentrazione ionica corrispondente ad un valore di conduttività compreso tra 14 e 16 mSiemens/cm. Il profilo cromatografico ottenuto e mostrato in figura 2 rivela un picco principale (c) corrispondente all’IFN-a2 in conformazione nativa, e due picchi minori (a) e (b), corrispondenti a forme monomeriche non native.
In queste condizioni, il picco principale della cromatografia, corrispondente a IFN-α monomerico in conformazione nativa, può eluire in concentrazione compresa tra 0.3 e 0.6 mg/ml, ed essere direttamente sterilizzato per filtrazione.
Alternativamente, l’eluizione dell’interferone-alfa nativo si ottiene isocraticamente con una soluzione salina avente una conduttività compresa tra 5 e 7 milliSiemens/cm, preferibilmente 6 milliSiemens/cm, corrispondente al 4% di una soluzione 0.5 M di NaCI in tampone acetato. Il picco principale, corrispondente alla preparazione di interferone alfa in conformazione nativa, eluisce tra 18 e 26 volumi di colonna.
Opzionalmente, il procedimento di purificazione comprende successivamente ai passaggi a) e b), un passaggio c) di cromatografia per esclusione molecolare o gel-filtrazione, attraverso il quale l’IFN-alfa in conformazione nativa, può essere concentrato nel tampone più adatto alle formulazioni successive. Questo passaggio avviene su matrici cromatografiche commercialmente disponibili, quali ad esempio la resina Sephacril S-75 o Superdex 75 (Pharmacia Biotech), preventivamente equilibrate con il tampone più adatto. Il picco eluito dalla colonna di gelfiltrazione può essere successivamente trattato secondo l’uso, ad esempio filtrato sterilmente e concentrato.
Il procedimento secondo la presente invenzione, è particolarmente vantaggioso in quanto comprende un solo passaggio cromatografico, corrispondente al punto b) del procedimento, per la purificazione dell’IFN-alfa in conformazione nativa e di grado terapeutico.
La completa separazione cromatografica delle forme non native dell'interferone alfa, e quindi la sua estrema purezza, è resa possibile dall’estrema efficienza del passaggio di rinaturazione ossidativa a) che è, nel passaggio a) del procedimento secondo l'invenzione superiore al 50%, ancor più preferibilmente superiore al 55% dell’interferone totale presente nella miscela di rinaturazione, e dalle caratteristiche della colonna cromatografica.
Secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione si estende pertanto al prodotto IFN alfa di grado terapeutico, in accordo con la definizione ed i requisiti della Farmacopea Europea, ottenuto con il procedimento comprendente i passaggi a) e b) della presente invenzione. Preferibilmente tale interferone alfa è ricombinante e umano, ancor più preferibilmente di tipo 2 (a e b) ed ha un grado di purezza superiore al 98%, ancor più preferibilmente superiore o uguale al 99%, secondo le analisi eseguite in accordo con la Monografia su “Interferon alfa-2 concentrated solution" 1110: 1031-1035, 1997 (alla quale si fa riferimento per tutte le misurazioni effettuate in accordo con essa e spesso per brevità citata come Monografia su Interferone alfa), in particolare secondo l’analisi elettroforetica su gel di poliacrilammide denaturante (SDS-PAGE) in condizioni riducenti e non riducenti, colorato con colorazione argentica.
Le analisi di identità, purezza ed attività eseguite secondo le linee guida della “European Pharmacopoeia” dimostrano una perfetta sovrapponibilità del prodotto ottenibile con il procedimento secondo l’invenzione, con gli standard di riferimento: Interferone alfa 2 CRS (IFN-alfa 2a, lotto 1, cat. N° 10320300 e IFN-alfa 2b, lotto n° 2, cat n° 10320301).
Le analisi chimico-fisiche previste dalla Farmcopea Europea (Monografia su “Interferone alfa-2 concentrated solution” 1110: 1031-1035, 1997), comprendono: una elettroforesi denaturante in condizioni riducenti e non riducenti, la determinazione del punto isoelettrico mediante isoelettrofocalizzazione, la mappa peptidica dopo digestione triptica, HPLC in fase inversa, la determinazione della potenza biologica e del contenuto di endotossine, in confronto con uno o più standard di riferimento, sono descritte per esteso nell’Esempio 4.
Le caratteristiche che rendono il prodotto secondo l’invenzione di grado terapeutico dopo un passaggio di rinaturazione ossidante ed un solo passaggio cromatografico, sono ottenuti nei metodi deH’arte nota solo con procedimenti lunghi e complessi che comprendono diversi passaggi cromatografici. Molto spesso le rese del procedimento dì purificazione sono aumentate, secondo l’arte nota, mediante l’utilizzo dì colonne di immunoaffinità, che presentano però gli svantaggi legati all’uso di anticorpi ed alla possibilità di contaminazione del prodotto finale.
Pertanto il procedimento secondo l’invenzione costituisce un notevole avanzamento nel settore, perché unisce la semplicità di esecuzione, legata ad un solo passaggio cromatografico, ad una resa superiore a 60 mg di IFN-alfa in conformazione nativa e di grado terapeutico, per litro di coltura batterica e ad una estrema purezza del prodotto finale, superiore al 98%, preferibilmente al 99%, per l’utilizzo in terapia.
L’attività biologica del prodotto secondo l’invenzione risulta essere molto alta e comunque non inferiore a 2.5 x 108 lU/mg, ancor più preferibilmente superiore a 3 x 108 lU/mg.
Anche il contenuto di endotossine dell’IFN-alfa eluito dalla colonna di gel-filtrazione secondo il procedimento della presente invenzione, risulta corrispondere ai valori richiesti dalla European Pharmacopoeia. I valori misurati risultano essere addirittura inferiori al valore minimo di 25 lU nel volume che contiene un mg di proteina, ben al di sotto del limite consentito secondo la European Pharmacopoeia (Monografia su Interferon alfa-2 concentrated solution 1110: 1031-1035, 1997) che è stato stabilito in 100 IU endotossina per il volume che contiene 1 mg di proteina.
L’IFN-alfa ottenuto secondo il procedimento dell’invenzione risulta stabile per almeno un anno, anche in assenza di formulazioni particolari, senza alterazioni evidenti delle caratteristiche di omogeneità e di attività biologica come evidenziato mediante saggi biochimici (HPLC ed SDS-PAGE) e biologici.
Particolarmente preferito è l’IFN alfa umano, ancor più preferibilmente di tipo 2 (a e b), ivi comprese le sue varianti alleliche o mutazioni, indipendentemente da come viene prodotto, anche se esso è preferìbilmente ottenuto per via ricombinante.
Pertanto secondo un ulteriore aspetto l’invenzione si estende a qualsiasi procedimento di produzione di interferone alfa in forma nativa, dove l’IFN alfa, preferibilmente umano, viene prodotto mediante espressione come proteina ricombinante, denaturato secondo metodi noti nello stato deH’arte e, successivamente rinaturato secondo il passaggio a) del procedimento dell’invenzione e quindi purificato mediante cromatografia per scambio cationico, come descritto per il passaggio b) del procedimento secondo l'invenzione.
Nella realizzazione preferita, relativa all’espressione della proteina in sistemi ricombinanti, la produzione di IFN-alfa avviene attraverso un procedimento che comprende i seguenti passaggi, attuati preliminarmente ai passaggi a ) e b):
1 ) espressione intracellulare di una sequenza di DNA codificante per l'IFN alfa in un organismo procariota o in un eucariota semplice 2) recupero dell’interferone-a in forma inattiva o parzialmente attiva 3) trattamento dell’interferone alfa in forma inattiva con soluzioni concentrate di agenti caotropici.
Al punto 1), la sequenza di IFN alfa è preferibilmente di tipo 2.
Attraverso i passaggi 1-3 si ottiene una miscela di IFN-alfa ricombinante in forma denaturata o parzialmente denaturata pronta per la rinaturazione ossidante secondo il punto a) del procedimento dell’invenzione.
L’espressione di interferone alfa ricombinante in organismi unicellulari modificati geneticamente è effettuata secondo metodi noti nell’arte per la produzione di proteine eterologhe. Si possono utilizzare microorganismi batterici ad esempio E. coli, B. subtilis, oppure lieviti quali S. cerevisiae, P. pastoris, K. Lactis, etc. Particolarmente preferito è il batterio E. coli trasformato con un vettore di espressione contenente un promotore forte a monte della sequenza codificante per l’IFN-alfa. Promotori forti di utilizzo nei batteri sono noti neN’arte: alcuni esempi sono il promotore trp, lac, tac, tre, PL o della T7 polimerasi (vedi: Molecular Cloning ”A Laboratory Manual” 2<nd >.Edition, Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Attraverso di essi si può ottenere un’espressione costitutiva o inducibile della proteina di interesse a livelli che possono arrivare a costituire il 50% delle proteine totali del batterio.
Il ceppo di E. coli è preferibilmente proteasi negativo ad esempio omp (outer membrane protease) o lon negativo, ed è ancor più preferibilmente il ceppo BL21 (J. Grodberg e Dunn J.J. J. Bacteriol 170:12451253, 1988). L’espressione della proteina ricombinante può essere inducibile o costitutiva. I vettori di espressione utilizzabili per l’espressione intracellulare in E. coli sono noti nel settore ed utilizzabili nella presente invenzione a patto che determino l’espressione della proteina eterologa in quantità superiore al 30% delle proteine totali di E. coli e che la loro presenza sia selezionabile.
Le sequenze codificanti per l’IFN alfa di varie specie mammifere sono note in letteratura e sono raccolte in basi di dati di sequenze nucleotidiche, ad esempio in GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). Esse possono essere ottimizzate secondo l’uso preferenziale dei codoni ( codon usage) dell’organismo in cui avviene l’espressione. Particolarmente preferita è la sequenza codificante per l’interferone alfa umano, in particolare del tipo 2, ancor più preferibilmente IFN alfa 2 (a e b), identificata in banca dati con il numero NM_000605, ottimizzata secondo il codon usage di E. coli, ossia in accordo con i codoni più frequentemente usati in questo organismo. Questa realizzazione preferita è attuata secondo le indicazioni di J. Michael Cherry e mediante utilizzo del programma GCG “Codon Frequency”
(ftp://ftp.es.embnet.orq/pub/databases/codonusaqe/eco.cod). La sequenza nucleotidica codificante per l’IFN alfa 2b, corrispondente alla forma matura della proteina umana, ottimizzata secondo il codon usage di E. coli, è presentata nell’allegato "Listato sequenze” come seq IDN 1, posto in calce alla domanda di brevetto. Dal numero identificativo in GenBank e secondo il programma di ottimizzazione per E. coli, può essere derivata ed espressa la sequenza codificante per TIFISI alfa 2a, che presenta, rispetto all’interferone 2b, una lisina in posizione 23 al posto di una arginina, oppure per l’interferone 2c, che presenta una arginina in posizione 23 così come in posizione 34, al posto di una istidina presente sia nell’IFN alfa 2a che 2b e per tutte le loro varianti allelìche e mutazioni conservative (numerazione amminoacidica riferita al prodotto maturo). Ai fini della produzione di IFN ricombinante possono essere comunque utilizzate tutte le sequenza di DNA codificanti per l’interferone alfa, sia di origine sintetica che di origine naturale.
Secondo questa realizzazione preferita, il ceppo di E. coli trasformato con il vettore contenente la sequenza nucleotidica codificante per l’IFN-alfa maturo, è cresciuto in un terreno di coltura, quale LB (Luria-Broth) o TB (Terrific-Broth) contenente un antibiotico la cui resistenza sia codificata dal vettore di espressione, preferibilmente kanamicina, per un periodo compreso tra le 6-8 e le 20 ore, secondo metodiche note al tecnico del ramo (Molecular Cloning ”A Laboratory Manual” 2<nd >.Edition, Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Alla fine della fermentazione, i batteri sono recuperati ad esempio mediante centrifugazione a 2600xg, lavati ad esempio con H2O 0 con una soluzione acquosa e risospesi in H20, 0 in una soluzione acquosa, in rapporto di circa 10-20, preferibilmente 15 g di peso umido di batteri per 100 mi di acqua, e lisati o rotti ad esempio mediante sonicazione o mediante trattamento ad alta pressione, o con altri mezzi idonei al recupero dei corpi di inclusione noti al tecnico del ramo. I corpi di inclusione sono recuperati mediante centrifugazione (20000-22.000xg) opzionalmente lavati con e risospesi in uno stesso volume di acqua. In alcuni casi può essere aggiunto alla soluzione acquosa un agente riducente, quale ad esempio β-Me o DTT in concentrazione non superiore a 10 mM
La frazione proteica insolubile è quindi risospesa ad una concentrazione proteica finale compresa tra 6 e 14 mg/ml, in una soluzione acquosa denaturante comprendente un agente caotropico, quale ad es. urea o guanidina, in alta concentrazione, ad esempio compresa tra 4 e 10 M. Tra gli agenti caotropici è particolarmente preferita la guanidina o i suoi sali, in concentrazione compresa tra 5 e 8 M, ancor più preferibilmente 6M. La soluzione denaturante comprende un sistema tampone, quale ad esempio Tris in concentrazione compresa tra 10 e 150 mM, preferibilmente 50 mM e avente pH compreso tra 7.0 e 9.0, preferibilmente pH 8.0 ± 0.1. E’ opzionalmente presente un agente chelante, quale EDTA, in concentrazione compresa tra 0.01 e 5 mM, preferibilmente 2 mM.
In genere, una concentrazione proteica ottimale nella soluzione di denaturazione, cioè compresa tra 6-14 mg/ml, viene ottenuta aggiungendo da 15 a 25 mi di soluzione denaturante per g umido di corpi inclusi o di frazione insolubile. La soluzione viene lasciata in agitazione per almeno 15’, preferibilmente almeno 30' o fino a quando la frazione insolubile non si è disciolta, a temperatura ambiente.
Il particolato non completamente risospeso può essere allontanato alla fine del trattamento di denaturazione ad esempio mediante centrifugazione, e quindi la soluzione di denaturazione contenente l’interferone alfa in forma non nativa (denaturata) è sottoposto ad un procedimento di purificazione che comprende un trattamento di rinaturazione corrispondente al passaggio a) del procedimento e successivamente, ad un passaggio cromatografico, corrispondente al passaggio b) del procedimento dell'invenzione.
L’invenzione viene di seguito esemplificata negli esempi sperimentali che seguono, che non hanno tuttavia alcuno scopo limitativo della portata dell’invenzione.
PARTE SPERIMENTALE
Esempio 1. Clonaggio del gene codificante per l’interferone alfa 2b umano.
La sequenza di DNA codificante per l’Interferone alfa 2b umano fu isolato da DNA umano ottenuto a partire da linfociti purificati da sangue periferico secondo la procedura descritta in (Molecular Cloning .A Laboratory Manual 2<nd >Edition, Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), lievemente modificata. In breve, i linfociti furono risospesi in 0.5 mi di un tampone di lisi (10mM Tris-HCI pH 8, 10mM EDTA, 50mM NaCI, 2% SDS), a cui fu aggiunta Proteinasi K alla concentrazione finale di 0.3 mg/ml (15pl di una soluzione 10 mg/ml). La soluzione fu incubata 1h a 56°C, e vennero quindi aggiunti 0.5 mi di una soluzione di Fenolo-Cloroformio-Alcol Isoamilico (25:24:1) saturata con 50 mM Tris-HCI pH 8 e si mescola per 1 min. Si centrifuga a 13000xg per 5 min. e la fase acquosa viene trasferita in un tubo pulito ripetendo l’estrazione con la soluzione di Fenolo-Cloroformio-Alcol Isoamilico finché la fase acquosa non appare chiara.
Al termine, le tracce di fenolo residue nella fase acquosa furono rimosse mediante lavaggio con 1 volume di n-Butanolo e recuperando ancora la fase acquosa. La quantità di DNA umano purificato fu misurata spettrofotometricamente (usando il seguente valore di conversione: l’assorbanza a 260 nm di una soluzione di DNA con concentrazione pari a 50 pg/ml è 1 OD).
Usando come stampo il DNA genomico così purificato, il DNA codificante per l’Interferone 2b maturo fu amplificato mediante l’uso della Taq DNA polimerasi termoresistente e di oligonucleotidi specifici per il gene dell’Interferone (PCR) secondo la seguente procedura.
In un tubo Eppendorf da 0.5ml furono miscelati i seguenti reagenti:
• 50 pi di una soluzione contenente 100 ng di DNA genomico umano purificato e
• 50 pi della seguente miscela di reazione contenente: 0.2 mM dei 4 deossinucleotidi trifosfati (dNTP Set 100mM Solutions [dATP, dCTP, dGTP, dTTP Cat. No. 27-2035-01, Amersham-Pharmacia), 200 ng di ogni oligonucleotide, 0.5 U di Taq DNA Polimerase e 10 μΙ di tampone di reazione 10x (Cat. No. 1-146-165 Boehringer Mannheim).
Le sequenze degli oligonucleotidi utilizzati, corrispondenti rispettivamente agli estremi 5’ e 3’ del gene dell’Interferone alfa 2b umano maturo, secondo la sequenza pubblicata in banca dati con il numero NM_000605, furono i seguenti:
che introducono rispettivamente un sito Ndel ed un sito BamHI (sottolineati) per il successivo clonaggio nel vettore.
Con questa miscela si procede aH’amplificazione PCR del gene dell’interferone alfa 2b umano mediante 35 cicli di amplificazione alle seguenti condizioni : 1 min a 94°C, 1min a 56°C, 1 min a72°C.
Il DNA amplificato corrisponde, come atteso, ad un frammento di 518 nucleotidi, codificante per l’Interferone alfa 2b maturo (165 aa), con la aggiunta dei siti di restrizione Nde I e BamHI, necessari per il suo successivo clonaggio nel vettore di espressione.
Il frammento di DNA così amplificato fu:
• purificato mediante apposite microcolonne (Jet Quick, PCR Purification Spin Column Kit 50 Cat. No. 410050, Genomed, Germania), secondo le indicazioni del fabbricante;
• digerito con gli enzimi di restrizione Nde I e BamHI (Cat. No. 111-L e 136-L, New England Biolabs) secondo le indicazioni del fabbricante; • purificato attraverso un gel all’1 % di agarosio usando apposite microcolonne (Jet Quick, Gel Extraction Spin Kit 50, Cat. No.420050, Genomed), secondo le indicazioni del fabbricante;
• clonato nel plasmide pET9 (Cat. No. 69431-3, Novagen) predigerito con i sopracitati enzimi e purificato da gel di agarosio in maniera analoga a quanto fatto per il frammento di DNA amplificato. Il plasmide pET9 è stato lìgato al frammento purificato e digerito con le stessi enzimi, utilizzando la T4-DNA ligasi (T4 DNA Ligase Cat. No. 202-L, New England Biolabs, USA), secondo le indicazioni del fabbricante.
I vettore contiene un gene per la resistenza all’antibiotico kanamicina per la selezione delle cellule che contengono il plasmide. Infatti, per l’espressione di proteine ricombinanti, la resistenza alla kanamicina è preferibile rispetto alla resistenza all’ampicillina usata più comunemente in laboratorio. La kanamicina infatti non è degradata come succede con l’ampicillina, cosa che può comportare la conseguente perdita di resistenza del ceppo, ed il suo uso è preferibile secondo gli standard GMP (Good Manufacturing Practice).
Con il prodotto della ligazione furono trasformate cellule competenti DH5oc (Max Efficiency DH5a Competent Cells Cat. No. 18258-012, Life Technology) secondo le indicazioni del fabbricante. I batteri trasformati furono seminati in piastre di LB-Agar contenenti Kanamicina 50pg/ml. Delle colonie ottenute sono stati analizzate 18 colonie resistenti alla kanamicina, crescendole in 10 mi di terreno LB contenete Kanamicina 50 pg/ml fino ad una OD60Q = 1 .5.
Il DNA plasmidico di queste colonie è stato purificato mediante l’uso di un kit commerciale (Jet Quick Plasmid Miniprep Spin Quick Kit, Cat. No.
400250, Genomed). La presenza del gene dell’Interferone alfa nel plasmide pET9 è stata verificata mediante digestione con gli enzimi di restrizione Ndel-BamHI ed analisi su gel di agarosio come descritto precedentemente.
Cinque cloni risultati positivi all’analisi di restrizione furono sequenziati per verificare l’assenza di mutazioni dovute alla procedura di amplificazione, utilizzando un sequenziatore automatico (CEQ 2000, Beckman-Coulter) con i seguenti oligonucleotidì sintetici :
La sequenza nucleotidica dei cloni isolati fu confermata codificare per l’espressione della proteina corrispondente all’Interferone alfa-2 umano maturo, come nota in letteratura e pubblicata in banca dati con il numero NM_000605.
Esempio 2. Ottimizzazione della sequenza nucleotidica codificante per l’IFN alfa 2b per l’espressione in E.coli.
La sequenza dell’IFN alfa 2B umano fu modificata secondo il codice genetico preferenziale dei batteri, per ottimizzarne l’espressione in E. coli.
Le modificazioni nella sequenza nucleotidica dell’l’IFN umano secondo il “codon usage" di E. coli furono realizzate secondo le indicazioni di J. Michael Cherry usando il programma GCG “Codon Frequency” (ftp://ftp.es.embnet.orq/pub/databases/codonusaqe/eco.cod).
La procedura comprende la riamplificazione mediante PCR del frammento già isolato da cellule umane con l’oligonucleotide:
a) che si appaia con il 5’ della sequenza di IFN (seq. IDN2):
e che inserisce un sito Nde I (sottolineato) e le sostituzioni indicate in grassetto e sottolineate (in corsivo il codone iniziale ATG) e
b) che si appaia con il 3’ della sequenza di IFN (seq IDN3):
Tali primer determinano la sostituzione dei nucleotidi in posizione 12, 34, 36, 37, 39 della sequenza codificante per l’IFN umano maturo (numerazione in accordo con la numerazione di seq IDN1).
Le sequenze actg all'inizio di ogni primer furono aggiunte per facilitare le procedure di taglio con gli enzimi di restrizione del prodotto amplificato e la sua successiva inserzione nel vettore di espressione.
Le condizione ed i reagenti utilizzati per la riamplificazione del gene dell’interferone alfa 2b sono le stesse descritte nell’esempio 1 con la differenza che al posto del DNA umano, nella miscela di reazione di amplificazione furono usati 10 ng di DNA del plasmide contenente l’Interferone alfa 2b già amplificato e purificato secondo quanto descritto nell’esempio 1. Il frammento, modificato secondo il codon usage di E. coli fu clonato nel vettore di espressione pET9 di 5.5 kilobasi, derivato dal plasmide pBR322, con il gene dell’Interferone alfa sotto il controllo trascrizionale del promotore T 7 derivato dell’omonimo batteriofago. Il vettore include un terminatore della trascrizione per assicurare la precisa terminazione del trascritto del gene del Interferone alfa-2 umano e segnali di terminazione della traduzione per tutte e tre le cornici di lettura possibili. Il vettore risultante contenente il gene dell'interferone, fu quindi utilizzato per la trasformazione in cellule competenti DH5ot ed il suo sequenziamento, realizzati come descritto nell’esempio 1.
La sequenza codificante per l’IFN-alfa 2B umano maturo, ottimizzata secondo il codon usage di E. coli è presentata nel listato sequenze come seq IDN° 1.
La sequenza di DNA proveniente da 5 cloni diversi è la stessa ed include le modificazioni introdotte dagli oligonucleotidi sintetici MUT-S/IFN nella sequenza originale del gene del’IFN alfa 2b umano. Le modificazione introdotte sono sottolineate nella sequenza della figura precedente. Il cambio osservato nel codone 6 del gene in tutti i cloni analizzati (ACC t ACT), non cambia raminoacido risultante ed è quindi accettato.
Il DNA dei cloni analizzati fu utilizzato per trasformare cellule competenti BL21 DE3 (Cat. No. 69450-4, Novagen) e provare i livelli di espressione. Le colonie ottenute nelle piastre di LB-agar contenenti 50 pg/ml di kanamicina, sono state cresciute in terreno LB liquido contenente 50 pg/ml di kanamicina per un periodo di 15 h a 37°C in un agitatore termostatato a 250 rpm.
Il ceppo di Escherichia coli utilizzato per l’espressione dell’Interferone alfa-2, contiene nel suo cromosoma una copia del gene della RNA polimerasi derivata del batteriofago T7. Questo ceppo di E. coli è lisogeno del batteriofago DE3, un fago lambda derivato che possiede la regione immune del fago 21 e porta un frammento di DNA che codifica per la T7 RNA polimerasi (Studier and Moffatt 1986, J. Mol. Biol. 189: 113). L’espressione della sequenza codificante per l’interferone è costitutiva e non deve essere indotta con IPTG quando le cellule sono cresciute in un terreno tipo LB o TB a 37°C.
Un’aliquota di 100 pi di ciascuna di queste culture fu analizzata in un gel di SDS-PAGE al 15% di poliacrilamide. Le proteine nel gel furono visualizzate attraverso colorazione con il colorante Coomassie Blue R-250.
In tutti i 5 cloni analizzati fu osservata dopo espressione, una banda di peso molecolare apparente di 18.4 kDa, corrispondente al peso molecolare teorico dell’interferone ed avente la stessa mobilità elettroforetica dello Standard Internazionale dell’interferone alfa 2 (Interferone alfa-2b CRS, cat. N° 320301 , lotto 2, ed Interferone alfa-2a CRS, cat. N° 320300, lotto 1 , European Pharmacopoeia).
L’identità di questa banda fu confermata anche mediante l’uso di anticorpi specifici anti-lnterferone alfa 2b commerciali (IFN-alfa, clone F18, Cat. No. MON 5067, Monosan), mediante Western-blot.
Esempio 3. Produzione di interferone alfa in E. coli.
Questo esempio descrive l’espressione in E. coli di una sequenza di DNA codificante per Interferone alfa 2b umano maturo, come ottenuta nell’esempio 2. La sequenza impiegata è dunque parzialmente sintetica e parzialmente derivata da DNA genomico: il gene per l’interferone non contiene introni ed è quindi uguale alla sequenza del cDNA; sinteticamente, cioè mediante amplificazione con primers sintetici, fu aggiunta una metionina iniziale contenuta nel sito Ndel, introdotta per consentire la sintesi della proteina matura, priva del peptide segnale e della parte corrispondente al precursore proteico.
Un’aliquota di cellule competenti del ceppo di E.coli, BL21 DE3 (Cat. No.
69451-4, Novagen) fu trasformata con 5 ng del plasmide pET9-IFN-alfa-2b (vedi esempio 2) usando piastre di LB-agar contenenti kanamicina (50pg/ml). Il risultato della trasformazione è stato verificato basandosi sul marcatore per la resistenza alla kanamicina. I batteri furono fatti crescere in 1L di terreno LB, contenente kanamicina (50pg/ml) a 37°C fino a una OD6oo=2.
Il livello di espressione dell’Interferone nei batteri trasformati, senza necessità dell’aggiunta di induttore IPTG, fu stimato in una quantità pari a circa il 10-15% del totale delle proteine batteriche, secondo quanto osservato in gel di SDS-poliacrilammide colorato con Coomassie Blu R250 (vedi figura 1 , corsia 1 ).
Le cellule furono concentrate per centrifugazione a 2600xg in un rotore Sorvall-GSA. Il pellet di batteri fu poi risospeso in 50 mi di acqua, corrispondente a non più di 15 gr peso umido di batteri/100 mi e sonicato con una punta di 9 mm (Soniprep-150 (MSE, UK.) a una potenza di 20μ, per 5 cicli di 60 sec. ciascuno.
Il materiale sonicato fu recuperato per centrifugazione utilizzando un rotore GSA-Sorvall (30 min., 22.000xg a 4°C). Il pellet fu risospeso in 50 mi di acqua e centrifugato come sopra.
Il pellet di corpi di inclusione così ottenuto, fu sciolto in 30 mi di una soluzione contenente 6M Guanidina-HCI, 100 mM Tris-HCI pH8, 2 mM EDTA, con una concentrazione proteica non superiore a 10 mg/ml. La soluzione fu agitata per 30 min a temperatura ambiente e fu quindi centrifugata per eliminare l’eventuale particolato non risospeso a 22.000xg, 4°C per 30 min.
Il sopranatante ottenuto dopo la centrifugazione fu diluito in circa 2 litri di un tampone costituito da 0.5M Arginina-HCI, 100mM Tris-HCI pH8, 0.1 mM EDTA, 1mM Cisteina, 0.05 mM Cistina, aggiustando il pH a 8 con una soluzione di NaOH 0.1 M, fino ad una concentrazione proteica di 200 pg/ml.
La miscela di maturazione fu sottoposta a lenta agitazione (200 rpm, su un agitatore magnetico) a 22°C per 24-36 ore.
La miscela di rinaturazione fu quindi diafiltrata contro un tampone costituito da 20 mM Tris-HCI pH 8 fino ad un valore di diluizione di 1:1250, utilizzando una cartuccia a spirale Amicon S1Y10, taglio molecolare 10000 d, 0.09 m2 Cat. N° 540630, con un concentratore a spirale CH2PRS (cat. N° 54131, Amicon-Millipore). In alcuni esperimenti, al posto della diafiltrazione o in aggiunta ad essa, venne effettuata una dialisi oppure una desalificazione mediante gel filtrazione su resina G-25.
Il diafiltrato fu quindi portato a pH 5.5 con acido acetico glaciale, eliminando il precipitato attraverso filtrazione (0.45pm) e caricata su una colonna cromatografica. IEC-SP 2825 (Shodex, Waters), che utilizza una matrice di poliidrossimetacrilato con gruppo funzionale sulfopropile, previamente equilibrata con Acetato di Sodio 50 mM, pH 5.5 ad un flusso di 8.0 ml/min. Dopo il caricamento del campione, la colonna fu lavata con un volume corrispondente a 3 volumi della colonna (dove il volume della colonna è di 154 mi) utilizzando lo stesso tampone acetato. L’eluizione dell’IFN alfa nativo, che corrispondente al picco principale C) di figura 2, fu eseguita usando un gradiente salino lineare 10%-40% di NaCI 0.5 M in tampone di Na acetato 50 mM pH 5.5 in 5 volumi di colonna. I picchi minori a) e b) risolti dalla cromatografia, e corrispondenti a forme non native della proteina, sono indicati in figura 2 La conduttività della soluzione di eluizione fu misurata e fu trovata corrispondere a 14 milliSiemens/cm.
L’eluito (interferone alfa 2 in conformazione nativa) risultò avere una concentrazione di 0.5 mg/ml. Questa soluzione concentrata fu quindi sterilizzata mediante filtrazione su filtri da 0.22 micron ed utilizzata per le analisi di qualità.
In una serie di altri esperimenti fu utilizzata una colonna contenente la resina Source 15 S, a matrice di polistirene reticolata con divinilbenzene, (Pharmacia cat. N. 17 — 0944-01), avente come gruppo funzionale il metilsulfonato, preventivamente equilibrata con un tampone costituito da 50 mM sodio acetato pH 5.5, ottenendo rese del tutto comparabili.
Le analisi del prodotto eluito dalla cromatografia su scambio cationico, effettuate in accordo con le indicazione della Farmacopea Europea, sono riportate negli esempi 4 e 5.
Nelle tabella 1-3 sono riportate le rese del procedimento di rinaturazione e purificazione nel suo complesso, ottenute a partire da tre diverse condizioni di rinaturazione dei corpi di inclusione.
(1) - Proteina totale:misurata con il metodo di Bradford
(2) - Quantità di interferone: calcolate con le aree percentuali, rilevate in HPLC, [RP -colonna C18 Zorbax (0,25<*>4,6)] - in base al tempo di ritenzione dell'interferone nativo
(3) - % Ifn vs proteina totale: rapporto tra la quantità di interferone, in ogni sua fase di purificazione, e la quantità iniziale di proteina.
In tabella 2 e 3 sono riportate le rese delle varie fasi del procedimento di rinaturazione e purificazione, a partire da condizioni di rinaturazione diverse: in tabella 2 quelle corrispondenti alla rinaturazione in tampone RB2 (Tris 100mM, pH 8 , EDTA 2 mM, Arginina 0.5M), ma in assenza della coppia redox, oppure in assenza anche di arginina (risultati in tabella 3) corrispondenti alla rinaturazione in tampone RB3: Tris 100mM pH8, EDTA 2 mM.
I valori in tabella corrispondono alla media di 3 repliche effettuate su tre batch diversi di rinaturazione in assenza della coppia redox. (1), (2) e (3) come in tabella 1.
I dati presentati nelle tabelle 1-3, dimostrano che nelle condizioni di rinaturazione e purificazione secondo la presente invenzione, corrispondenti alle condizioni di rinaturazione del tampone RB1 , la resa finale di prodotto aumenta in modo considerevole (più di 3 volte) rispetto alle condizioni di rinaturazione del tampone RB1 , o anche RB2. La notevole differenza è relativa non solo alle rese, ma anche all’attività biologica e alla purezza del prodotto, come descritto nell'esempio 4. Esempio 4: Analisi di identità e purezza dell’IFN alfa 2 ricombinante secondo l’invenzione, effettuate in accordo con le linee guida della Farmacopea Europea.
Le linee guida della “European Pharmacopoeia” (Interferon alfa-2 concentrated solution, 1110 (1031-1035), 1997) prevedono le seguenti procedure analitiche: SDS-PAGE; isoelettrofocalizzazione; mappa peptidica dopo digestione triptica; HPLC in fase inversa (vedi Figure da 2 a 8), determinazione della potenza biologica, determinazione del contenuto di endotossine. Ulteriori analisi furono eseguite in aggiunta. I risultati ottenuti nelle diverse prove mostrano che TIFISI alfa 2 prodotto secondo l'invenzione è qualitativamente comparabile, se non in alcuni saggi superiore, a quello utilizzato come standard di riferimento ottenuto dal “Council of Europe”, European Pharmacopoeia Commission, Biological Standardisation, Strasbourg, Interferone Alfa-2b CRS (Batch No. 2), cat. N° I 320301 e Interferone Alfa-2a CRS (Batch No. 1), cat. N° I 320300. Pertanto dove non esplicitato, per interferone standard si intende l’una o l’altra delle due preparazioni standard, e con linee guida della Farmacopea Europea si intende la monografia sull’interferone alfa pubblicata su: “European Pharmacopoeia” Interferon alfa-2 concentrated solution, 1110 (1031-1035), 1997.
In figura 1 è mostrata l’elettroforesi su SDS-PAGE in condizioni riducenti (colorata con Coomassie) delle varie fasi del procedimento di preparazione di IFN. Risulta evidente il vantaggio, secondo la realizzazione preferita del procedimento dell’invenzione, di lavorare con i corpi di inclusione: infatti, come si può osservare nella corsia 4 della figura 1, il contenuto di IFN ricombinante, anche se in configurazione non nativa, arriva a costituire circa il 90% delle proteine totali. Questo grado di purezza è raggiunto in solo due passaggi: la rottura delle cellule batteriche mediante sonicazione in acqua, ed una successiva centrifugazione, in assenza di detergenti o reagenti particolari.
In Figura 2 è mostrato il profilo cromatografico dell’Interferone alfa 2 nella cromatografia a scambio ionico (colonna Shodex 2825). E’ da notarsi la risoluzione del picco c) corrispondente alla forma nativa dell’IFN alfa, nei confronti sia del picco a) che del picco b), corrispondenti invece a configurazioni non native di IFN alfa 2. Tale risoluzione è ottenuta attraverso un singolo passaggio cromatografico. La purezza del materiale eluito e corrispondente al picco c) di figura 2, fu analizzata mediante elettroforesi su SDS-PAGE in condizioni non riducenti (figura 3a) e riducenti (figura 3b), sviluppata con colorazione argentìca, in accordo con quanto stabilito nelle linee guide della Farmacopea Europea, Monografia sull’Interferone già citate, per evidenziare l’eventuale presenza di impurezze di peso molecolare diverso da quelle dell’IFN alfa 2 nativo, tra cui i dimeri di IFN alfa. Nelle elettroforesi mostrate in figura 3a e 3b furono caricate due diluizioni della preparazione di interferone secondo l’invenzione e cinque diluizioni di IFN standard della Farmacopea Europea (STD EP), come descritto nella legenda corrispondente.
In condizioni non riducenti (figura 3a) è possibile evidenziare il grado di purezza relativamente al contenuto di dimeri di IFN alfa (corrispondenti a forme non native della proteina). L’intensità della banda di peso molecolare superiore al peso molecolare della banda principale, presente nella corsia 3 (dove furono caricati 25 pg della preparazione di IFN secondo l’invenzione) è comparabile alla penultima diluizione dello standard (250 ng) che corrisponde all’1% della quantità del campione secondo l’invenzione, caricato in corsia 3). Pertanto la purezza della preparazione di IFN rispetto al contenuto di dimeri e calcolata in base alle linee guida della Farmacopea Europea, (Interferon alfa-2 concentrated solution, 1110 (1031-1035), 1997) risulta essere di almeno il 99%.
In figura 3b), corrispondente all’elettroforesi in condizioni riducenti, non sono evidenziabili bande di peso molecolare inferiore a quello della banda principale, costituita da IFN alfa monomerico di 19.3 kDa, ed eventualmente riferibili a prodotti di degradazione dell’IFN.
La sensibilità del metodo permette di osservare l’ultima diluizione della preparazione di IFN STD-EP, corrispondente a 50 ng, e pari allo 0.2% della banda di IFN secondo l’invenzione, 25 pg, caricati in corsia 3. Pertanto secondo questo metodo analitico il grado di purezza della preparazione di IFN secondo l’invenzione, verso impurezze di peso molecolare inferiore, risulta essere del 99.8%.
In figura 4a) il Western-Blot della preparazione di interferone purificato sviluppato con anticorpo anti-E. coli per la rivelazione di possibili contaminanti batterici, dimostra che nella preparazione di IFN secondo l’invenzione non sono presenti contaminanti batterici rilevabili ed in figura 4b), che l’interferone prodotto è riconosciuto da un anticorpo anti-IFN-alfa.
In figura 5a) è presentato il gel di isolettrofocalìzzazione eseguito in accordo con la Farmacopea Europea, dell’Interferone alfa 2b secondo l’invenzione e dello standard di riferimento. Il punto isoelettrico, calcolato mettendo in grafico (figura 5b) le distanze di migrazione degli standard di riferimento ed interpolando il valore corrispondente allo standard di riferimento, risulta essere di 5.92, identico a quello dello standard. Il gel è stato corso in accordo con le indicazioni della Farmacopea Europea per l’IFN alfa e utilizzando i seguenti reagenti: Electrophoresis equipment: Multiphor II Electrophoresis Unii, Cat. No. 18-1018-06, Pharmacia. Power supply: EPS 3500, Cat. No. 19-3500-00, Pharmacia. Refrigerated Water Bath: Multi Temp III Thermostatic Circulator: Cat. No. 18-1102-78, Pharmacia, pi. Markers: Broad pl-Kit pH 3.5-9.3, Cat. No. 17-0471-01 , Pharmacia. IEF-Gel: Ampholine PAGplate IEF pH 3.5-9.5, Cat. No. 80-1031-60, Pharmacia. IFN-Standard: Interferon aifa-2b.Cat.No. 10330301. EDQM-European Pharmacopoeia. Soluzione anodica: acido fosforico 1 M Cat. No. 100563, Merck. Soluzione catodica: 1 M NaOH, Cat. No. 109956.0001 , Merck. Applicatori: Sample Application pieces, Cat. No. 80-1129-46, Pharmacia. Acido Acetico glaciale: Cat. No. 10015N, AnalaR, BDH Etanolo: Cat. No. 10107, AnalaR, BDH. Acido tricloroacetico: Cat. No. 91234, Fluka. Sulphosalicilic acid: 2-Hidroxy-5-sulfobenzoic acid, Cat. No. 86193, Fluka.
In tabella 4 è mostrato il punto isoelettrico, calcolato per interpolazione sul grafico mostrato in figura 5b, dell’interferone ottenuto secondo l’invenzione nelle tre condizioni di maturazione (tampone RB1 , 2 e 3) e dello standard EP. Il punto isoelettrico calcolato per i tre campioni e per lo standard risulta essere di 5.92
2357 PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
In figura 6 è mostrata la cromatografia in fase inversa dell’Interferone alfa 2b e dell’IFN alfa 2b standard. L'area corrispondente al picco dell’IFN-alfa 2b ottenuto secondo la presente invenzione è corrispondente al 98.81% dell’area totale del cromatogramma, con un tempo di ritenzione di 54.56 minuti. L’area del picco corrispondente all’IFN alfa 2 standard EP risulta essere il 97.45% dell’area totale (inferiore a quello della preparazione secondo l'invenzione), con un tempo di ritenzione molto simile (54.66 min).
In figura 7 è mostrata la mappa triptica dell’Interferone alfa 2b ottenuto secondo l’invenzione, (pannello a) parte superiore della figura), e della preparazione di IFN standard (pannello b), parte inferiore. La mappa è stata ottenuta secondo quanto richiesto dalla Farmacopea Europea “Monografia su Interferone” utilizzando i seguenti reagenti: Materiali e Reagenti: HPLC equipment: AKTA purifier 10, Cat. No. 18-1400-00, Pharmacia. Column: Sephasyl Peptide C18, 5um, 4.6/100 mm, Cat. No.
17-6000-26, Pharmacia. Trypsin (Sequencing grade, Cat. No. 8658.
Sigma). Potassium dihydrogen phosphate: Cat. No. 60219, Fluka. Sodium hydroxide: Cat. No. 71690, Fluka. Guanidine hydrochloride: Cat. No. 50935, Fluka. Dithiothreitol: Cat. No. D-5545, Sigma. Acetonitrile: Hipersolve, Cat. No. 152516Q, BDH. Trifluoracetic acid: Cat. No.
108262, Merck. Reference Interferon: Interferone alfa-2b CRS (Batch No.1, Council of Europe, European Pharmacopoeia Commission, Biological Standardisation).
E’ possibile osservare che la mappa triptica è qualitativamente simile a quella dello standard di riferimento presente nella parte inferiore, indicando che i peptidi originati dalla digestione con tripsina nel prodotto e nello standard EP sono qualitativamente e quantitativamente gli stessi, e che quindi non ci sono alterazioni post-traduzionali o relative al procedimento di purificazione nel prodotto finale, ottenuto secondo l’invenzione, rispetto allo standard di controllo.
In aggiunta a quanto richiesto dalla Farmacopea Europea, l’IFN prodotto con il procedimento dell'invenzione, fu sottoposto a Spettroscopia di massa mediante lonSpray-PE SCIEX, API 150EX, Perkin Elmer (figura 8).
In Figura 8 sono mostrati i valori di massa molecolare ottenuti mediante lon Spray che confermano ulteriormente l'identità strutturale dell’IFN alfa 2b secondo l’invenzione rispetto allo standard internazionale di IFN alfa 2. La differenza di massa molecolare osservata tra i due prodotti (19262.79 verso 19262.82, inferiore a 0.03 unità di massa) rientra nell’intervallo di errore sperimentale dell’apparecchio. Questo dato conferma che l’IFN alfa 2b prodotto secondo l’invenzione corrisponde all’IFN maturo ed è assolutamente equivalente a livello molecolare allo standard della Farmacopea Europea.
Esempio 5. Determinazione della potenza biologica e del contenuto di endotossine dell’interferone alfa preparato secondo il procedimento dell’invenzione.
Determinazione della potenza biologica.
La determinazione della potenza biologica dell'IFN-alfa prodotto fu determinata, in accordo con la “European Pharmacopeia", su cellule MDBK (NBL-1 , Madin Darby Bovine Kidney cells) ATCC Cat n° CCL-22, infettate con il Vescicular Stomatitis Virus, secondo la procedura descritta in Rubinstein S. et al., J. Virai., 1981 , 37:755-758 ed in Meager A. (1987) 129-147 in “Lymphokines and Interferons”. Clemens M.J. Morris A.G. and Gearing A.J.H. eds IRL Press USA. Brevemente, il saggio è stato eseguito utilizzando micropiastre da 96 pozzetti contenenti 3x1 0<4 >cellule per pozzetto, incubate a 37°C 5%C02 per 18 ore. Le cellule furono pretrattate con i campioni di IFN alfa secondo l’invenzione, ottenuti nelle tre diverse condizioni di rinaturazione, a diverse diluizioni, e con lo standard della Farmacopea Europea, per 22 ore prima dell’infezione con il virus VSV (5x1 0<4 >pfu/ml, quantità necessaria per lisare cellule non protette dall’IFN-alfa entro 24 ore dall’infezione). La quantificazione dell’effetto citopatico residuo fu effettuata mediante colorazione con rosso neutro e lettura spettrofotometrica con un lettore di piastre Spectracount Cat. BS10001 , Packard Instrument.
Il trattamento statistico dei dati fu effettuato come previsto dalla Farmacopea Europea e descritto in “Statistica! analysis of results of biological assays and tests” European Pharmacopoeia 1997, 299-336. I dati sono riportati in tabella 5, dalla quale si evince che nella preparazione di interferone alfa 2 secondo l’invenzione, la potenza stimata non è mai né inferiore all’80% (89%) né superiore al 125% (122%) della potenza misurata. I limiti fiduciari di misurazione a p=0.95 sono compresi tra il 64% ed il 156% della potenza misurata e sono quindi compresi entro i limiti previsti dalla farmacopea europea. L’attività biologica del campione preparato secondo l’invenzione, che corrisponde al campione RB1 , è compresa tra 2.85 e 3.07 x10<8 >lU/mg di proteina a fronte di un’attività biologica dello standard di riferimento di 2.4x1 0<8>IU/mg proteina. Lo standard di riferimento, al fine della valutazione dell’attività biologica era costituito da "1<st >International Standard - Recombinant human interferon alpha 2b (82/576) NIBSC (National Institute for biological standards and control, Bianche Lane, South/mimms, Potters Bar, Eng 3QG, UK) e fu ottenuto mediante risospensione di una aliquota corrispondente a 17.000 lU in un volume adeguato.
Dai dati di tabella 5 è inoltre possìbile osservare che le condizioni di rinaturazione nella soluzione di rinaturazione RB1 (presenza di una coppia redox quale la coppia cisteina-cistina rispetto alla soluzione di rinaturazione RB2 ed inoltre di un agente labilizzante, quale l’arginina, rispetto alla soluzione RB3) consente non solo una maggiore resa di prodotto finale, come evidenziato nelle tabelle 1-3, ma anche una migliore qualità dell’interferone prodotto. Pertanto il tampone di rinaturazione RB1 costituisce il tampone di rinaturazione ottimale.
Determinazione del contenuto di endotossine.
La determinazione del contenuto di endotossine fu determinata sulle tre preparazioni di IFN (RB1 , RB2, RB3 secondo quanto descritto nell’esempio 3) mediante il saggio basato sul LAL (Limulus Amoebocyte Lysate, “Guideline on Validation of Limulus Amoebocyte Lysate for Human and Animai parenteral Drugs”. Biological Products and Medicai Devices, December, 1987) del kit Endosafe (Charles River, Ltd) e seguendo le istruzioni del produttore. I reagenti utilizzati furono: Gel dot reagent, sensitivity 0,125 EU/ml, (Charles River, Cat. No. AE040) Standard endotoxin CSE e.Coli (055:B5) (Charles River, Cat. No. AE075) Acqua apirogena 50ml, (Cat. No. AE089) Provette in borosilicato 13*100mm (Cat. No. AE112).
Come si vede dai risultati presentati in tabella 6, in tutti e tre i batch di produzione corrispondenti alle tre diverse condizioni di rinaturazione, il contenuto di endotossine risultò essere compreso tra 2.5 e 25 lU nel volume contenente 1 mg di proteina. Il valore misurato risulta essere quindi inferiore al valore di 100 lU nel volume contenente 1 mg di proteina previsto secondo la Farmacopea Europea per l’interferone alfa dì grado terapeutico.
Tabella 6. Contenuto di endotossine nella preparazione di interferone purificato derivanti dalle tre miscele di rinaturazione RB1, RB23 ed RB3 (definizione di RB1,2,3, come in tabelle 1-3) .
I dati presentati in tabella 6, mostrano che indipendentemente dal tipo di soluzione di rinaturazione utilizzata per ottenere interferone alfa in conformazione nativa, il procedimento di purificazione dà un contenuto di endotossine inferiore a quanto stabilito dalla Farmacopea Europea.
Listato sequenze
Seq IDN.l
Sequenza IFN-alfa 2B maturo ottimizzata secondo l'uso preferenziale dei codoni di E.coli:
Seq IDN 2
Oligonucleotide utilizzato per l'amplificazione del 5' dell'IFN alfa 2 modificato secondo l'uso preferenziale dei codoni di E.coli (modificazione dei nucleotidi 12,34,36,37,39 numerazione in accordo con seq idnl)
AgctCATATG TGTGATCTGC CGCAAACCCA CAGCCTGGGT AGCCGTCGT Seq IDN 3
Oligonucleotide utilizzato per l'amplificazione del 3' dell'IFN alfa 2.

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI. 1 . Procedimento per la purificazione di interferone alfa in conformazione nativa e di grado terapeutico da una miscela di denaturazione, che comprende i seguenti passaggi: a) rinaturazione ossidante b) cromatografia su uno scambiatore cationico forte ed eluizione 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 dove tale IFN-alfa è ricombinante 3. Procedimento secondo la rivendicazione 2 dove tale IFN-alfa ricombinante è umano 4. Procedimento secondo la rivendicazione 3 dove tale IFN-alfa è IFN-alfa 2. 5. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-4 dove la rinaturazione ossidante avviene per lenta diluizione della miscela di denaturazione in una soluzione rinaturante. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, dove la concentrazione finale dell’IFN-alfa dopo diluizione è compresa tra 50 e 300 pg/ml 7. Procedimento secondo la rivendicazione 5 dove tale soluzione rinaturante è un sistema tampone avente pH compreso tra 7.5 e 8.5, preferibilmente pH 8.0 ±0.1 comprendente un agente labilizzante, una coppia redox, ed opzionalmente un composto chelante. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7 dove l’agente labilizzante è L-arginina o suoi sali e derivati. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8 dove la L-arginina o i suoi sali e derivati, è in concentrazione compresa tra 0.3 e 0.6 M. 10. Procedimento secondo la rivendicazione 9 dove la concentrazione è compresa tra 0.45 e 0.55 M 11. Procedimento secondo la rivendicazione 7 dove la coppia redox è scelta tra: glutatione in forma ossidata e ridotta, cistina e cisteina, cistamina e cisteamina, idrossietil-sulfossido e 2-mercaptoetanolo. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 11 dove la coppia redox è L-cisteina in concentrazione compresa tra 0.1-10 mM e suoi sali o derivati ed L-cistina e suoi sali o derivati in concentrazione compresa tra 0.005-0.5 mM. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, dove la L-cisteina è in concentrazione compresa tra 0.5-2 mM e la L-cistina è in concentrazione compresa tra 0.03-0.07 mM. 14. Procedimento secondo le rivendicazioni 7-13, dove la rinaturazione ossidante avviene ad un pH delia miscela di rinaturazione compreso tra 7.5-8.5, preferibilmente pH 8.0 ± 0.1 e ad una temperatura compresa tra 5°C e 25°C. 15. Procedimento secondo la rivendicazione 14 dove la rinaturazione ossidante avviene per un periodo compreso tra le 18 e le 50 ore. 16. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-15 caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un passaggio di desalificazione della miscela di rinaturazione ed opzionalmente un passaggio di concentrazione. 17. Procedimento secondo la rivendicazione 16 dove la desalificazione è effettuata prima del passaggio b) di cromatografia 18. Procedimento secondo le rivendicazioni 16 dove la desalificazione avviene secondo uno dei seguenti metodi: dialisi, ultra-filtrazione, gel filtrazione, dia-filtrazione. 19. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-18 dove la miscela di rinaturazione, risultante dalla fase a) del procedimento, è portata a pH compreso tra 5.3-5.7, preferibilmente pH 5.5 ± 0.1 prima della fase b) del procedimento, e quindi opzionalmente centrifugata o filtrata. 20. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-18 dove la cromatografia di cui al passaggio b) del procedimento, avviene su una matrice in cui il gruppo funzionale è scelto tra: sulfopropile, metilsulfonato. 21. Procedimento secondo la rivendicazioni 20 dove la cromatografia avviene a pH compreso tra 5.3-5.7, preferibilmente pH 5.5 ± 0.1. 22. Procedimento secondo la rivendicazione 21 dove la cromatografia avviene in tampone acetato. 23. Procedimento secondo le rivendicazioni 20-22 dove l’eluizione dell’IFN-alfa dalla colonna cromatografica avviene mediante applicazione di un gradiente salino lineare di una sale monovalente, in concentrazione compresa tra 0.001-1 M. 24. Procedimento secondo la rivendicazione 23 dove tale sale è NaCI e dove tale gradiente va da 0.001 a 0.5 M. 25. Procedimento secondo le rivendicazioni 20-22 dove l’eluizione dell’IFN-alfa avviene con una soluzione isocratica di un tampone acetato comprendente un sale monovalente, preferibilmente NaCI. 26. Procedimento secondo le rivendicazioni 22-25 dove il tampone acetato è Na-acetato. 27. Procedimento per la produzione di interferone alfa di grado terapeutico caratterizzato dal fatto di comprendere il procedimento di purificazione di cui alle rivendicazioni 1-26. 28. Procedimento secondo la rivendicazione 27 caratterizzato dal fatto di comprendere i seguenti passaggi preliminari: 1) espressione intracellulare di una sequenza di DNA codificante per l’interferone alfa in un organismo procariota o in un eucariota semplice, geneticamente modificato 2) recupero di interferone alfa in forma non nativa 3) trattamento dell’interferone alfa con agenti caotropici 29. Procedimento secondo la rivendicazione 28 dove tale organismo procariota è scelto tra: E. coli, B. subtilis. 30. Procedimento secondo la rivendicazione 29 dove tale procariota è E. coli. 31. Procedimento secondo la rivendicazione 28 dove tale organismo eucariota è scelto tra: S. cerevisiae, P. pastoris, K. Lactis. 32. Procedimento secondo le rivendicazioni 28-30 dove il recupero dell’interferone in forma non nativa è ottenuto mediante centrifugazione della coltura batterica, lisi dei batteri in una soluzione acquosa e centrifugazione dei corpi di inclusione. 33. Procedimento secondo la rivendicazione 32 dove la lisi dei batteri è ottenuta mediante sonicazione. 34. Procedimento per la preparazione di IFN-alfa 2 umano ricombinante comprendente essenzialmente i seguenti passaggi: i) espressione di una sequenza codificante per l’IFN alfa 2 umano in E. coli, ii) lisi dei batteri e recupero dei corpi di inclusione in una soluzione acquosa, iii) trattamento dei corpi di inclusione con una soluzione concentrata di un agente caotropico in concentrazione compresa tra 5-7 M, tamponata a pH compreso tra 7.5-8-5 iv) diluizione della soluzione di denaturazione in una soluzione di rinaturazione comprendente L-arginina o i suoi sali o derivati in concentrazione compresa tra 0.45 M e 0.55, la coppia redox L-cisteina/cistina o i loro sali o derivati, rispettivamente in concentrazione compresa tra 0.5-2 mM (L-cisteina o i suoi sali e derivati) e tra 0.03-0.07 (L-cistina o i suoi sali e derivati), e avente dopo diluizione una concentrazione proteica finale compresa tra 100-250 4g/ml ed un pH finale di 8.0 ± 0.1 ; v) cromatografia in tampone acetato a pH compreso tra 5.3-5.7, preferibilmente pH 5.5 ± 0.1 , su matrice con gruppo funzionale a scambio cationico forte scelto tra sulfopropile e metilsulfonato; vi) eluizione in gradiente salino lineare 0-500 mM di NaCI in tampone acetato a pH compreso tra 5.3-5J, preferibilmente pH 5.5 ± 0.1. 35. Procedimento secondo la rivendicazione 34 dove al punto vi) l’eluizione avviene isocraticamente con una soluzione salina avente conduttività compresa tra 5 e 7 milliSiemens/cm, preferibilmente 6 milliSiemens/cm 36. Procedimento secondo le rivendicazioni 34-35, dove la sequenza codificante per l’IFN alfa 2 è la sequenza identificata in banca dati con il numero NM_000605, ottimizzata secondo l’uso dei codoni preferenziali di E. coli 37. Procedimento secondo la rivendicazione 36 dove tale sequenza è la sequenza IDN1 allegata nel listato sequenze. 38. Procedimento secondo le rivendicazioni 34-37 dove tale agente caotropico è GuHCI in concentrazione compresa tra 5 e 7M, preferibilmente 6M, e dove le proteine hanno una concentrazione finale compresa tra 6-14 mg/ml. 39. Interferone alfa in conformazione nativa e di grado terapeutico ottenibile in accordo con il procedimento di cui alla rivendicazione 27. 40. Interferone alfa 2 ricombinante in conformazione nativa e di grado terapeutico ottenibile in accordo con il procedimento di cui alle rivendicazioni 34-38. 41. Interferone-alfa 2 secondo la rivendicazione 40 caratterizzato dal fatto di avere un grado di purezza superiore al 99% mediante SDS-PAGE. 42. Interferone-alfa 2 secondo le rivendicazioni 40-41 caratterizzato dal fatto di avere attività biologica non inferiore a 2.5 x10<8>IU/mg, preferibilmente non inferiore a 3 x10<8>IU/mg. 43. Interferone alfa 2 secondo le rivendicazioni 40-42 caratterizzato dal fatto di avere un contenuto di endotossine inferiore a 25 lU/ml. 44. Interferone alfa 2 secondo le rivendicazioni 40-43 per uso terapeutico 45. Uso dell’interferone alfa 2 secondo la rivendicazione 44 per la preparazione di farmaci antivirali. 46. Uso dell’interferone alfa 2 secondo la rivendicazione 44 per la preparazione di farmaci antitumorali.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA020621B1 (ru) 2009-06-22 2014-12-30 Амген Инк. Рефолдинг белков с использованием химически контролируемого окислительно-восстановительного состояния
EP3660032A1 (en) 2009-06-25 2020-06-03 Amgen, Inc Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system
EP2532734B1 (en) 2010-02-01 2017-03-15 Proyecto de Biomedicina CIMA, S.L. Process for the production of interferon alpha 5
CN101921216B (zh) * 2010-09-08 2013-03-13 天津大学 模拟折叠酶功能的小分子化合物n-烷基酰胱胺、制备方法及用于辅助蛋白质氧化复性的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5489011A (en) * 1977-12-24 1979-07-14 Green Cross Corp:The Preparation of interferon
US4485038A (en) * 1982-10-19 1984-11-27 Health Research (Roswell Park Division) Method for the production and purification of human leukocyte interferon
US4432895A (en) * 1982-11-24 1984-02-21 Hoffmann-La Roche Inc. Monomeric interferons
US4765903A (en) * 1987-10-06 1988-08-23 Interferon Sciences, Inc. Purification of monomeric interferon
EP0679718B1 (en) * 1994-04-09 2001-09-05 F. Hoffmann-La Roche AG Process for producing alpha-interferon

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