CN101921216B - 模拟折叠酶功能的小分子化合物n-烷基酰胱胺、制备方法及用于辅助蛋白质氧化复性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种模拟折叠酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺、制备方法及用于辅助蛋白质氧化复性的方法；此小分子作为氧化剂使用则即使在强还原的环境下也能够促进蛋白质二硫键的形成，所以省去将强还原剂DTT从还原变性的蛋白质溶液中除去的操作步骤，从而节省复性时间和成本；采用的模拟折叠酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺可以大大提高蛋白质氧化复性的速度，同样条件下，是氧化型谷胱甘肽辅助复性速度的7至10倍；N-烷基酰胱胺，较低浓度下就可有效地辅助蛋白质氧化复性，可以大大降低氧化剂的用量；采用的N-烷基酰胱胺可以和变性还原蛋白质所携带的强还原剂耦合形成氧化还原对，从而不需要在复性液中加入还原剂，操作简单，并降低了复性成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种模拟折叠酶功能的小分子化合物和其合成方法，及其在辅助蛋白质氧化复性中的使用方法，属于生物技术中的蛋白质复性技术领域。
背景技术
蛋白质折叠复性不仅与人类的一些疾病相关，而且也是应用基因重组技术生产贵重医药蛋白质的瓶颈。因此，蛋白质折叠复性技术是目前研究的热点。很多重要的医药蛋白质都是含有二硫键的，例如人生长激素、人干扰素、肿瘤坏死因子、胰岛素、白细胞介素、组织型纤溶酶原激活剂等。这些含二硫键蛋白质的折叠复性则是蛋白质复性中的一个巨大挑战。这种含有二硫键的蛋白质的折叠过程被称作氧化复性，在此过程中蛋白质不但要形成正确的三级结构，而且多个半胱氨酸残基要准确配对形成正确的二硫键。在体内，此过程是受到氧化还原酶催化的。在真核细胞内质网上的二硫键异构酶(PDI)以及原核菌体细胞周质中的DsbA可以有效地辅助蛋白质折叠过程中二硫键的形成。这些酶不但具有特殊的共同序列CXXC(C，半胱氨酸；X，任何氨基酸残基)、较低的pKa值和合适的氧化还原势，而且与变性蛋白质具有特异的相互作用。但是，直接将PDI和DsbA作为氧化剂应用于蛋白质的氧化复性则存在价格比较昂贵、不稳定、难于分离的问题，不适宜于应用于大规模生产。所以针对实际生产，有必要开发此类折叠酶的小分子模拟物。
目前，人们基于PDI物理性质如CXXC序列、较低的pKa值和合适的氧化还原势而设计了一些巯基小分子模拟物来辅助复性，如芳香巯醇、(±)-反-1，2-二(2-乙酰巯基)环己烷(BMC)、CXXC类似多肽序列(Small-molecule catalysts of oxidative protein folding.Current Opinion in Chemical Biology，2008，12，740-745.)。这些模拟PDI功能的小分子化合物能够在一定程度上提高蛋白质氧化复性的速率和收率。但是，得到的小分子模拟物的催化效果远远低于实际折叠酶的作用，达到辅助复性的效果需要很高的浓度。另外，这些小分子不能够有效地模拟PDI和DsbA对变性蛋白质的特异性相互作用。由于这些小分子模拟物以及最为常用的氧化还原剂，氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)都不具有 蛋白质氧化特异性，很容易被强还原剂二硫苏糖醇(DTT)还原，所以，应用这些小分子辅助蛋白质复性时都需要将还原变性蛋白质中残留的还原剂二硫苏糖醇先通过凝胶过滤色谱或透析的操作除去，这样就使得复性过程操作复杂。
为了克服常用氧化剂辅助复性的不足，本发明提出了一种新型的模拟折叠酶功能的小分子化合物及其辅助蛋白质复性的方法，氧化剂用量大大减少，而且操作简单，不需要将变性剂分离的操作步骤，节省复性时间和成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种模拟折叠酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺，并建立其辅助含有二硫键蛋白质的高效氧化复性的技术方法。本方法无需对变性蛋白质进行去除还原剂的操作，直接应用所设计的N-烷基酰胱胺作为氧化剂与残留的还原剂耦合形成氧化还原对，在强还原性的溶液中高效地辅助蛋白质的复性。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。
一种模拟折叠酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺，其特征在于，N-烷基酰胱胺是胱胺分子中一端的氨基，通过酰胺化反应与脂肪酸的羧基偶联而形成，N-烷基酰胱胺结构形式表达如下：
其中：R为含有4～7个碳原子的烷基链；
上述的脂肪酸选自戊酸、己酸、庚酸和辛酸。
本发明的一种N-烷基酰胱胺的制备方法，步骤如下：
1)将胱胺二盐酸盐用去离子水溶解，得到0.05-1mol/L胱胺溶液后，加入含有5-8个碳原子的脂肪酸，脂肪酸的摩尔浓度为胱胺摩尔浓度的0.02-0.5倍，混合后，用NaOH将其pH调至5.5-6.5；
2)向上述制得的液体中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐固体粉末，使固体粉末摩尔浓度为脂肪酸摩尔浓度的5-100倍；
3)将上述反应体系置于15-30℃恒温水浴摇床，反应3-6小时，得到N-烷基酰胱胺粗产物；
4)将粗产物首先用0.45μm的水系微孔滤膜过滤，然后用C18反相色谱柱进行分离，收集的组分经冷冻干燥得到N-烷基酰胱胺。
用N-烷基酰胱胺辅助蛋白质氧化复性的方法，经含DTT的变性液还原变性的蛋白质或包含体溶液，用不含DTT的变性液稀释5-25倍后稀释于或直接稀释于由20-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0-3.0mmol/L乙二胺四乙酸四钠(EDTA)、0-2mol/L尿素或0-1mol/L盐酸胍及N-烷基酰胱胺组成的pH为7.5-9.0的复性液中，使得稀释后溶液中N-烷基酰胱胺浓度为DTT摩尔浓度的0.25-1.3倍。
所述的N-烷基酰胱胺，当其为N-辛基酰胱胺时，其摩尔浓度为体系中变性还原蛋白质摩尔浓度的40倍及以下。
本发明的N-烷基酰胱胺辅助蛋白质复性的方法应用于变性还原蛋白质复性中，变性失活并且含有二硫键被断开的蛋白质样品使用本发明的方法进行复性可以保证较高的复性收率。含有二硫键的蛋白质均可使用本专利的复性方法进行复性。
本发明的关键技术有五点：首先，模拟折叠酶功能的小分子化合物结构的设计，在活性位点二硫键周围修饰疏水性基团从而增强小分子和变性蛋白质之间的亲和性，同时保证了小分子的水溶性，分子只是一端修饰的N-烷基酰胱胺而不是N，N’-双烷基酰胱胺，因为N，N’-双烷基酰胱胺的水溶性较差；其次是合成过程中胱胺较容易两端均修饰脂肪酸，得到N，N’-双烷基酰胱胺副产物，本发明的反应体系中采用的脂肪酸量远低于胱胺的量，从而保证了主产物为N-烷基酰胱胺；关键之三合成反应条件的选择，适当的温度及反应时间可有效地降低副产物含量，提高主产物的合成量；关键之四需要根据N-烷基酰胱胺分子中酰基含有的碳链长度确定复性液中需要加入的N-烷基酰胱胺的量，主要是控制酰基含有的碳链与蛋白质之间的疏水相互作用的强度，因为过强的疏水相互作用会抑制蛋白质的折叠；最后是变性蛋白质溶液中残留的DTT的处理，应用其它的小分子氧化剂辅助复性时需要将其中的DTT通过凝胶过滤色谱或24h透析的方法除去，而本发明的复性方法不需要进行此操作，直接将DTT作为还原剂来辅助复性。
本发明所介绍的N-烷基酰胱胺辅助蛋白质氧化复性的方法与其它的氧化剂辅助蛋白质氧化复性方法相比有如下优点：第一，本发明所采用氧化剂即使在强还原的环境下也能够促进蛋白质二硫键的形成，所以可以省去将强还原剂DTT从还原变性的蛋白质溶液中除去的操作步骤，从而节省复性时间和成本；第二，本发明所采用的模拟折叠酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺可以大大提高蛋白质氧化复性的速度，同样条件下，是氧化型谷胱甘肽辅助复性速度的7至10倍；第三，本发明介绍的N-烷基酰胱胺，较低浓度下就可有 效地辅助蛋白质氧化复性，可以大大降低氧化剂的用量；第四，本发明采用的N-烷基酰胱胺可以和变性还原蛋白质所携带的强还原剂耦合形成氧化还原对，从而不需要在复性液中加入还原剂，操作简单，并降低了复性成本。
附图说明
图1：实施例1中所制备的N-辛基酰胱胺(0.1mmol/L)辅助还原变性溶菌酶的复性。
图2：实施例1中所制备的N-辛基酰胱胺(0.2mmol/L)辅助还原变性溶菌酶的复性
图3：实施例3中所制备的N-庚基酰胱胺辅助还原变性的核糖核酸酶A的复性。
图4：实施例4中所制备的N-戊基酰胱胺辅助还原变性的溶菌酶的复性。
图5：实施例5中所制备的N-己基酰胱胺辅助还原变性溶菌酶的复性，其中(●)表示复性体系中加入0.2mmol/LN-己基酰胱胺；(▲)表示复性体系中加入0.2mmol/L胱胺。
图6：实施例5中所制备的N-己基酰胱胺辅助14μmol/L还原变性溶菌酶的复性，其中(●)表示复性体系中加入0.9mmol/L胱胺； 
表示复性体系中加入0.6mmol/L N-己基酰胱胺。
图7：实施例5中所制备的N-己基酰胱胺辅助14μmol/L还原变性溶菌酶的复性，复性体系中含有1.53mmol/L N-己基酰胱胺。
图8：实施例5中所制备的N-己基酰胱胺辅助还原变性的核糖核酸酶A样品复性，其中(●)表示复性体系中加入0.4mmol/L N-己基酰胱胺；(○)表示复性体系中加入0.4mmol/L胱胺。
具体实施方式
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
实施例1：N-辛基酰胱胺的合成及应用于辅助还原变性溶菌酶的复性
称0.225g胱胺二盐酸盐用10mL去离子水溶解，得到0.1mol/L胱胺溶液，然后滴入3.18μL正辛酸，使其浓度为0.002mol/L，混合均匀，用2mol/L NaOH将溶液的pH调至6.3，而后向其中加入0.384g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐使其终浓度为0.2mol/L，迅速混合均匀。将反应体系置于25℃恒温水浴摇床，反应4小时，得到粗产物。粗产物经过0.45μm的水系微孔滤膜过滤，然后应用C18反相柱高效液相色谱分离，流动相A是含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水相，B是含有0.1％TFA的乙腈。流速：1mL/min。洗脱梯度：应用在18min内流动相B由10％升至到100％的线性梯度进行洗脱分离。 收集8.2min处产物峰，冷冻干燥得到N-辛基酰胱胺。
将如上制备的N-辛基酰胱胺用于辅助还原变性溶菌酶的复性。14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中，混合均匀并于40℃还原变性3小时；变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行20倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、1.2mol/L尿素、1mmol/L EDTA和0.105mmol/L N-辛基酰胱胺、氧化性谷胱甘肽或胱胺组成，溶液pH为8.5。用复性液将变性蛋白质样品稀释10倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为5μmol/L，DTT为0.42mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性60min取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，不同小分子氧化剂辅助复性效果对比如图1所示。由图可知，在DTT浓度远远高于氧化剂浓度的复性条件下，氧化型谷胱甘肽和胱胺都无法辅助蛋白质复性，而N-辛基酰胱胺却仍然能够辅助蛋白质复性。
实施例2：实施例1合成的N-辛基酰胱胺辅助还原变性溶菌酶的复性
将实施例1所制备的N-辛基酰胱胺用于辅助还原变性溶菌酶的复性。14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中，混合均匀并于40℃还原变性3小时；变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行5倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、2mol/L尿素、1mmol/L EDTA和0.2mmol/LN-辛基酰胱胺或胱胺组成，溶液pH为8.5。用复性液将变性蛋白质样品稀释40倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为5μmol/L，DTT为0.42mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性36min取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，N-辛基酰 胱胺和胱胺辅助复性效果对比如图2所示。由图可知，在DTT浓度高于氧化剂浓度的复性条件下，0.2mM的胱胺几乎无法辅助蛋白质复性，而0.2mM N-辛基酰胱胺却能够辅助蛋白质复性。
实施例3：N-庚基酰胱胺的合成及用于辅助还原变性核糖核酸酶A的复性
称2.25g胱胺二盐酸盐用10mL去离子水溶解，得到1mol/L胱胺溶液，然后滴入28.6μL正庚酸，使其浓度为0.02mol/L，混合均匀，用5mol/LNaOH将溶液的pH调至6.5，而后向其中加入0.192g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐使其终浓度为0.1mol/L，迅速混合均匀。将反应体系置于15℃恒温水浴摇床，反应6小时，得到粗产物。粗产物经过0.45μm的水系微孔滤膜过滤，然后应用C18反相柱高效液相色谱分离，流动相A是含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水相，B是含有0.1％TFA的乙腈。流速：1mL/min。洗脱梯度：应用在18min内流动相B由10％升至到100％的线性梯度进行洗脱分离。
收集7.6min处产物峰，冷冻干燥得到N-庚基酰胱胺。
将如上制备的N-庚基酰胱胺用于辅助还原变性核糖核酸酶A的复性。14.0mg核糖核酸酶A溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L Tris-HCl和1mmol/LEDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中于40℃还原变性1小时。变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为94mmol/L。复性缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、0.35mmol/L N-庚基酰胱胺、氧化型谷胱甘肽或胱胺和1mmol/L EDTA组成，溶液pH为7.5。用复性液将变性蛋白质样品稀释72.4倍，稀释后溶液中核糖核酸酶A的浓度为14μmol/L，DTT为1.3mmol/L。稀释后的溶液置于25℃的恒温水浴中开始复性。核糖核酸酶A的活性检测以胞苷-2′，3′-环磷酸(cCMP)为底物，1.00mL 0.25mg/mL底物的pH 6.0的100mmol/L Tris-HCl缓冲液与0.10mL蛋白质复性样品充分混合，测定反应液在284nm下的吸光度变化。活性测定温度：25℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算活性收率。采用本专利所述方法复性，不除掉变性还原蛋白质中的DTT，而直接稀释复性。在复性5小时后取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，N-庚基酰胱胺、氧化性谷胱甘肽和胱胺辅助溶菌酶复性效果对比如图3所示。由图可知，N-庚基酰胱胺能够加快变性还原的核糖核酸酶A复性的速度并提高复性收率。同样的复性条件下，较低的N-庚基酰胱胺能起到很好的复性效果，用0.35mmol/L N-庚基酰胱胺作为氧化剂，复性5小时之后收率可达85％，而此时在胱胺或氧化型谷胱甘肽的辅助下复性收率接近于0。
实施例4：N-戊基酰胱胺的合成及用于辅助还原变性溶菌酶的复性
称0.113g胱胺二盐酸盐用10mL去离子水溶解，得到0.05mol/L胱胺溶液，然后滴入27.25μL正戊酸，使其浓度为0.025mol/L，混合均匀，用0.5mol/L NaOH将溶液的pH调至5.5，而后向其中加入0.384g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐使其终浓度为0.2mol/L，迅速混合均匀。将反应体系置于30℃恒温水浴摇床，反应3小时，得到粗产物。粗产物经过0.45μm的水系微孔滤膜过滤，然后应用C18反相柱高效液相色谱分离，流动相A是含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水相，B是含有0.1％TFA的乙腈。流速：1mL/min。洗脱梯度：应用在18min内流动相B由10％升至到100％的线性梯度进行洗脱分离。收集5min处产物峰，冷冻干燥得到N-戊基酰胱胺。
将如上制备的N-戊基酰胱胺用于辅助14μmol/L还原变性溶菌酶的复性。14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有6mol/L盐酸胍，100mmol/L DTT，20mmol/L Tris-HCl和1mmol/LEDTA，pH 7.5的变性缓冲溶液中于40℃还原变性4小时。变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行5倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由20mmol/L Tris-HCl、1mol/L盐酸胍、0.8mmol/L N-戊基酰胱胺或胱胺和3mmol/L EDTA组成，溶液pH为8.5。用复性液将变性蛋白质样品稀释14.3倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为14μmol/L，DTT为1.18mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性45min后取样测定活性。其它复性条件相同，N-戊基酰胱胺和胱胺辅助溶菌酶复性效果对比如图4所示。由图可知，在辅助还原变性溶菌酶的复性时，N-戊基酰胱胺能够提高复性收率。同样的复性条件下，0.8mmol/L N-戊基酰胱胺能使得复性收率达到92％，而用同浓度的胱胺作为氧化剂则收率只有15％。
实施例5：N-己基酰胱胺的合成及辅助还原变性溶菌酶的复性
称0.225g胱胺二盐酸盐用10mL去离子水溶解，得到0.1mol/L胱胺溶液，然后滴入25μL正己酸，使其浓度为0.02mol/L，混合均匀，用1mol/LNaOH将溶液的pH调至6.0，而后向其中加入0.384g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐使其终浓度为0.2 mol/L，迅速混合均匀。将反应体系置于25℃恒温水浴摇床，反应4小时，得到粗产物。粗产物经过0.45μm的水系微孔滤膜过滤，然后应用C18反相柱高效液相色谱分离，流动相A是含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水相，B是含有0.1％TFA的乙腈。流速：1mL/min。洗脱梯度：应用在18min内流动相B由10％升至到100％的线性梯度进行洗脱分离。收集6.4min处产物峰，冷冻干燥得到N-己基酰胱胺。
将如上合成的N-己酰胱胺用于辅助5μmol/L还原变性溶菌酶的复性。14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DT T，50mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA，pH 9.0的变性缓冲溶液中于40℃还原变性2.6小时；变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为80mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行25倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由50mmol/L Tris-HCl、1.0mol/L尿素和0.2mmol/L N-己基酰胱胺或胱胺组成，溶液pH为9.0。用复性液将变性蛋白质样品稀释8倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为5μmol/L，DTT为0.40mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性不同时间取样测定蛋白质的活性随时间的变化。其它复性条件相同，N-己基酰胱胺和胱胺辅助溶菌酶复性效果对比如图5所示。由图可知，N-己基酰胱胺作为氧化剂能够加快蛋白质复性的速度提高复性收率，在30min就能够使复性收率达到80％以上，而此时胱胺的辅助复性收率才只有5％。
实施例6：实施例5合成的N-己基酰胱胺辅助14μmol/L还原变性溶菌酶的复性
N-己基酰胱胺的合成如实施例5所示。14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中于40℃还原变性3小时。变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行7倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、0.8mol/L盐酸胍、0.6mmol/L N-己基酰胱胺或 0.9mmol/L胱胺和1mmol/L EDTA组成，溶液pH为8.5。用复性液将变性蛋白质样品稀释10.2倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为14μmol/L，DTT为1.18mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性不同时间取样测定蛋白质的活性随时间的变化。其它复性条件相同，N-己基酰胱胺和胱胺辅助溶菌酶复性效果对比如图6所示。由图可知，即使在辅助相对较高还原变性溶菌酶的复性时，N-己基酰胱胺也能够加快蛋白质复性的速度并提高复性收率。同样的复性条件下，较低浓度的N-己基酰胱胺能起到很好的复性效果，用0.9mmol/L胱胺作为氧化剂20min收率只有不到40％，而此时0.6mmol/L的N-己基酰胱胺可以使得收率达到90％。可见，用N-己基酰胱胺辅助复性可以大大降低氧化剂的加入量。
实施例7：实施例5合成的N-己基酰胱胺辅助14μmol/L还原变性溶菌酶的复性
N-己基酰胱胺的合成如实施例5所示。14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中于40℃还原变性3小时。变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行7倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、1.2mol/L尿素、1.53mmol/L N-己基酰胱胺和1mmol/L EDTA组成，溶液pH为8.5。用复性液将变性蛋白质样品稀释10.2倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为14μmol/L，DTT为1.18mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性不同时间取样测定蛋白质的活性随时间的变化。复性结果如图7所示。由图可知，当N-己基酰胱胺的浓度为DTT浓度的1.3倍时，N-己基酰胱胺能很好的辅助复性，在20min之内就可以使得收率达到90％以上。
实施例8：实施例5合成的N-己酰胱胺辅助还原变性的核糖核酸酶A样品复性
N-己基酰胱胺的合成如实施例5所示。14.0mg核糖核酸酶A溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中于40℃还原变性1小时。变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为94mmol/L。复性缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、0.4mmol/L N-己基酰胱胺或胱胺和1mmol/L EDTA组成，溶液pH为8.0。用复性液将变性蛋白质样品稀释72.4倍，稀释后溶液中核糖核酸酶A的浓度为14μmol/L，DTT为1.3mmol/L。稀释后的溶液置于25℃的恒温水浴中开始复性。核糖核酸酶A的活性检测以胞苷-2′，3′-环磷酸(cCMP)为底物，1.00mL 0.25mg/mL底物的pH 6.0的100mmol/L Tris-HCl缓冲液与0.10mL蛋白质复性样品充分混合，测定反应液在284nm下的吸光度变化。活性测定温度：25℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算活性收率。采用本专利所述方法复性，不除掉变性还原蛋白质中的DTT，而直接稀释复性。在复性不同时间取样测定蛋白质的活性随时间的变化。其它复性条件相同，N-己基酰胱胺和胱胺辅助溶菌酶复性效果对比如图8所示。由图可知，N-己基酰胱胺也能够加快变性还原的核糖核酸酶A复性的速度并提高复性收率。同样的复性条件下，较低的N-己基酰胱胺能起到很好的复性效果，用0.4mmol/L N-己基酰胱胺作为氧化剂4h时复性达到平衡，收率可达90％以上，而此时0.4mmol/L的胱胺的辅助下复性收率却几乎为0。
本发明提出的折叠酶小分子模拟物N-烷基酰胱胺，并将其用于变性蛋白质样品的复性，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
Claims (4)
1.一种模拟折叠酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺，其特征在于，N-烷基酰胱胺是胱胺分子中一端的氨基，通过酰胺化反应与脂肪酸的羧基偶联而形成，N-烷基酰胱胺结构形式表达如下：
其中：R为含有4～7个碳原子的烷基链；
上述的脂肪酸选自戊酸、己酸、庚酸和辛酸。
2.一种N-烷基酰胱胺的制备方法，其特征在于：
1）将胱胺二盐酸盐用去离子水溶解，得到0.05-1mol/L胱胺溶液后，加入含有5-8个碳原子的脂肪酸，脂肪酸的摩尔浓度为胱胺摩尔浓度的0.02-0.5倍，混合后，用NaOH将其pH调至5.5-6.5；
2）向上述制得的液体中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐固体粉末，使固体粉末摩尔浓度为脂肪酸摩尔浓度的5-100倍；
3）将上述反应体系置于15-30℃恒温水浴摇床，反应3-6小时，得到N-烷基酰胱胺粗产物；
4）将粗产物首先用0.45μm的水系微孔滤膜过滤，然后用C18反相色谱柱进行分离，收集的组分经冷冻干燥得到N-烷基酰胱胺。
3.采用权利要求1的N-烷基酰胱胺辅助蛋白质氧化复性的方法，其特征在于：经含DTT的变性液还原变性的蛋白质或包含体溶液，用不含DTT的变性液稀释5-25倍后稀释于或直接稀释于由20-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷、0-3.0mmol/L乙二胺四乙酸四钠、0-2mol/L尿素或0-1mol/L盐酸胍及N-烷基酰胱胺组成的pH为7.5-9.0的复性液中，使得稀释后溶液中N-烷基酰胱胺浓度为DTT摩尔浓度的0.25-1.3倍。
4.如权利要求3所述的氧化复性的方法，其特征在于所述的N-烷基酰胱胺，当其为N-辛基酰胱胺时，其摩尔浓度为体系中变性还原蛋白质摩尔浓度的40倍及以下。
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