JPH01222780A - ウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフォールディング方法 - Google Patents
ウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフォールディング方法Info
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- JPH01222780A JPH01222780A JP4758488A JP4758488A JPH01222780A JP H01222780 A JPH01222780 A JP H01222780A JP 4758488 A JP4758488 A JP 4758488A JP 4758488 A JP4758488 A JP 4758488A JP H01222780 A JPH01222780 A JP H01222780A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
遺伝子組換技術により、異種蛋白質を細菌や動物細胞等
を宿主として生産させることが可能になった。多くの場
合、異種蛋白質は宿主細胞内で生理活性を発現し得ない
高次構造にフォールディングされた不溶性の凝集塊とし
て析出しているためこれらの異種蛋白質はその構造を生
理活性を発現し得る形態にリフォールディングされなけ
ればならない。
を宿主として生産させることが可能になった。多くの場
合、異種蛋白質は宿主細胞内で生理活性を発現し得ない
高次構造にフォールディングされた不溶性の凝集塊とし
て析出しているためこれらの異種蛋白質はその構造を生
理活性を発現し得る形態にリフォールディングされなけ
ればならない。
ウロキナーゼ前駆体蛋白質は、プラスミノーゲン活性化
能を有する酵素ウロキナーゼの前駆体であり、血液中で
プラスミンにより分解されてプラスミノーゲン活性化能
を有する酵素ウロキナーゼに変化する。このため、近年
、は血栓溶解剤として注目されている。
能を有する酵素ウロキナーゼの前駆体であり、血液中で
プラスミンにより分解されてプラスミノーゲン活性化能
を有する酵素ウロキナーゼに変化する。このため、近年
、は血栓溶解剤として注目されている。
本発明は宿主細胞内で不溶性異種蛋白質として生産され
たウロキナーゼ前駆体様蛋白質を生理活性を発現し得る
形態にリフォールディングさせる方法に関するものであ
る。
たウロキナーゼ前駆体様蛋白質を生理活性を発現し得る
形態にリフォールディングさせる方法に関するものであ
る。
（従来の技術）
宿主細胞で生産された不溶性異種蛋白質をリフォールデ
ィングさせる方法として、例えば４〜９Ｍのグアニジン
塩酸塩等の強い蛋白質変性剤溶液中で不溶性異種蛋白質
を変性、可溶化し、テトラチオン酸ナトリウム等の温和
な酸化剤の共存下で亜硫酸分解によりジスルフィド結合
を開裂させ、還元型グルタチオン等のスルフヒドリル化
合物を接触させつつ、蛋白質変性剤濃度を低下させる方
法が知られている。しかしこの方法においては、最終的
に蛋白質変性剤の強度を低下させるための透析又は希釈
等の操作を行う必要があるため、大量の蛋白質をリフォ
ールディングするには操作性等に課題がある。
ィングさせる方法として、例えば４〜９Ｍのグアニジン
塩酸塩等の強い蛋白質変性剤溶液中で不溶性異種蛋白質
を変性、可溶化し、テトラチオン酸ナトリウム等の温和
な酸化剤の共存下で亜硫酸分解によりジスルフィド結合
を開裂させ、還元型グルタチオン等のスルフヒドリル化
合物を接触させつつ、蛋白質変性剤濃度を低下させる方
法が知られている。しかしこの方法においては、最終的
に蛋白質変性剤の強度を低下させるための透析又は希釈
等の操作を行う必要があるため、大量の蛋白質をリフォ
ールディングするには操作性等に課題がある。
この様な蛋白質変性剤を用いた不溶性異種蛋白質の変性
、可溶化の工程と蛋白質変性剤の強度の低下の工程から
なるリフォールディング方法の他にアルカリ水溶液によ
る変性、可溶化の操作とそのアルカリ溶液のｐＨの低下
の操作からなるリフォールディング方法も知られている
。この方法においては、ｐＨの低下を酸を添加すること
で行うことができるため、前記方法に比べ、簡便な操作
で大量の不溶性異種蛋白質をリフォールディングするこ
とが出来る。
、可溶化の工程と蛋白質変性剤の強度の低下の工程から
なるリフォールディング方法の他にアルカリ水溶液によ
る変性、可溶化の操作とそのアルカリ溶液のｐＨの低下
の操作からなるリフォールディング方法も知られている
。この方法においては、ｐＨの低下を酸を添加すること
で行うことができるため、前記方法に比べ、簡便な操作
で大量の不溶性異種蛋白質をリフォールディングするこ
とが出来る。
しかし、アルカリ水溶液によって凝集塊として発現した
異種蛋白質を可溶化させる操作を含む方法は、アルカリ
水溶液による蛋白質の変性が蛋白質変性剤による変性に
比べ穏やかであるため、−部の、特に凝集塊の内部に及
びに＜＜、従って、リフォールディング率が比較的低い
という課題があった。更にこの方法において、選択する
アルカリ性物質、ｐＨ１好ましく使用されるスルフヒド
リル化合物の種類、更には蛋白質のリフオールディング
に影響を及ぼす溶媒の性質等を微妙に変化させるための
添加物の種類等の諸条件は、目的とする不溶性異種蛋白
質により決定されなければならない。
異種蛋白質を可溶化させる操作を含む方法は、アルカリ
水溶液による蛋白質の変性が蛋白質変性剤による変性に
比べ穏やかであるため、−部の、特に凝集塊の内部に及
びに＜＜、従って、リフォールディング率が比較的低い
という課題があった。更にこの方法において、選択する
アルカリ性物質、ｐＨ１好ましく使用されるスルフヒド
リル化合物の種類、更には蛋白質のリフオールディング
に影響を及ぼす溶媒の性質等を微妙に変化させるための
添加物の種類等の諸条件は、目的とする不溶性異種蛋白
質により決定されなければならない。
本発明者らは、以上の様な課題にもとずき簡便な操作に
より効率良くウロキナーゼ前駆体様蛋白質をリフォール
ディングさせるための方法について鋭意研究した結果、
本発明を完成させるに至った。即ち本発明は、宿主細胞
内で不溶性界ＦＩｉ蛋白質として生産されたウロキナー
ゼ前駆体様蛋白質を蛋白質変性剤の存在下でアルカリ水
溶液と接触させ、次いで該溶液のｐＨを糖の存在下で酸
性物質を添加して低下させることを特徴とする不溶性異
種蛋白質のリフオールディング方法を提供するものであ
り、以下さらに詳細に説明する。
より効率良くウロキナーゼ前駆体様蛋白質をリフォール
ディングさせるための方法について鋭意研究した結果、
本発明を完成させるに至った。即ち本発明は、宿主細胞
内で不溶性界ＦＩｉ蛋白質として生産されたウロキナー
ゼ前駆体様蛋白質を蛋白質変性剤の存在下でアルカリ水
溶液と接触させ、次いで該溶液のｐＨを糖の存在下で酸
性物質を添加して低下させることを特徴とする不溶性異
種蛋白質のリフオールディング方法を提供するものであ
り、以下さらに詳細に説明する。
（発明の構成）
本発明で提供されるウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフ
オールディング方法は、少なくとも部分的に生理活性を
発現し得ない高次構造にフォールディング（折畳み）さ
れたウロキナーゼ前駆体様蛋白質をリフォールディング
（再折畳み）させる方法である。ウロキナーゼ前駆体様
蛋白質は、例えば人の腎細胞で生産される形態のものの
他、部分的に人工的変異がくわえられたものであっても
よい。また、遺伝子組換の操作の時に使用されるプラス
ミド、宿主等には何ら制限はない。
オールディング方法は、少なくとも部分的に生理活性を
発現し得ない高次構造にフォールディング（折畳み）さ
れたウロキナーゼ前駆体様蛋白質をリフォールディング
（再折畳み）させる方法である。ウロキナーゼ前駆体様
蛋白質は、例えば人の腎細胞で生産される形態のものの
他、部分的に人工的変異がくわえられたものであっても
よい。また、遺伝子組換の操作の時に使用されるプラス
ミド、宿主等には何ら制限はない。
本発明では、まず、不溶性のウロキナーゼ前駆体様蛋白
質を含む宿主細胞をホモジナイズ、超音波処理等で破壊
した菌体破壊物あるいはこの菌体破壊物から遠心分離、
限外濾過、ゲル濾過等の通常の方法により得られたウロ
キナーゼ前駆体様蛋白質含有物さらには菌体から放出さ
れたウロキナーゼ前駆体様蛋白質物を蛋白質変性剤の存
在下でアルカリ水溶液と接触させる。蛋白質変性剤とし
ては、例えば、グアニジン塩酸塩、尿素、界面活性剤、
チオシアン酸塩等の公知の変性剤を用いることが出来る
が、生体への影響が少なく、廃棄処理が簡便な尿素が好
ましい。蛋白質変性剤の濃度は、ウロキナーゼ前駆体様
蛋白質が溶液中に分散する程度の濃度以上・であれば良
い。高濃度の変性剤を使用した場合には最終的に変性剤
の濃度を低下させるための操作が必要となる。従って、
ウロキナーゼ前駆体様蛋白質が変性しない濃度の蛋白質
変性剤を使用するか、又は、高濃度の変性剤を使用した
場合にはアルカリ水溶液と接触させた段階で蛋白質が変
性しない濃度に成る様に使用することが好ましい。例え
ば、ウロキナーゼ前駆体様蛋白質の一尿素による変性は
約２Ｍで起こるので、尿素を使用する場合では２Ｍ以下
でウロキナーゼ前駆体様蛋白質と接触させるか、又は、
２Ｍ以上で接触させた後、アルカリ水溶液を添加して２
Ｍ以下にすることが好ましい。
質を含む宿主細胞をホモジナイズ、超音波処理等で破壊
した菌体破壊物あるいはこの菌体破壊物から遠心分離、
限外濾過、ゲル濾過等の通常の方法により得られたウロ
キナーゼ前駆体様蛋白質含有物さらには菌体から放出さ
れたウロキナーゼ前駆体様蛋白質物を蛋白質変性剤の存
在下でアルカリ水溶液と接触させる。蛋白質変性剤とし
ては、例えば、グアニジン塩酸塩、尿素、界面活性剤、
チオシアン酸塩等の公知の変性剤を用いることが出来る
が、生体への影響が少なく、廃棄処理が簡便な尿素が好
ましい。蛋白質変性剤の濃度は、ウロキナーゼ前駆体様
蛋白質が溶液中に分散する程度の濃度以上・であれば良
い。高濃度の変性剤を使用した場合には最終的に変性剤
の濃度を低下させるための操作が必要となる。従って、
ウロキナーゼ前駆体様蛋白質が変性しない濃度の蛋白質
変性剤を使用するか、又は、高濃度の変性剤を使用した
場合にはアルカリ水溶液と接触させた段階で蛋白質が変
性しない濃度に成る様に使用することが好ましい。例え
ば、ウロキナーゼ前駆体様蛋白質の一尿素による変性は
約２Ｍで起こるので、尿素を使用する場合では２Ｍ以下
でウロキナーゼ前駆体様蛋白質と接触させるか、又は、
２Ｍ以上で接触させた後、アルカリ水溶液を添加して２
Ｍ以下にすることが好ましい。
蛋白質変性剤はアルカリ水溶液中に溶解しておくか、ア
ルカリ水溶液中での変性、可溶化に先立ってウロキナー
ゼ前駆体様蛋白質に共存させても良い。しかし、変性、
可溶化に先立ってウロキナーゼ前駆体様蛋白質と共存さ
せた方が使用する変性剤の量を減少させることができ好
ましい。この様に、本発明において蛋白質変性剤を用い
てウロキナーゼ前駆体様蛋白質を分散させることで１ウ
ロキナ一ゼ前駆体様蛋白質凝集塊の内部にもアルカリ水
溶液が接触し易くなり、リフォールディング率を高めら
れると考えられる。蛋白質変性剤をウロキナーゼ前駆体
様蛋白質と共存させた後、例えば撹拌等の操作を行って
も良い。
ルカリ水溶液中での変性、可溶化に先立ってウロキナー
ゼ前駆体様蛋白質に共存させても良い。しかし、変性、
可溶化に先立ってウロキナーゼ前駆体様蛋白質と共存さ
せた方が使用する変性剤の量を減少させることができ好
ましい。この様に、本発明において蛋白質変性剤を用い
てウロキナーゼ前駆体様蛋白質を分散させることで１ウ
ロキナ一ゼ前駆体様蛋白質凝集塊の内部にもアルカリ水
溶液が接触し易くなり、リフォールディング率を高めら
れると考えられる。蛋白質変性剤をウロキナーゼ前駆体
様蛋白質と共存させた後、例えば撹拌等の操作を行って
も良い。
アルカリ水溶液としては、例えば、水酸化ナトリウム、
炭酸ナトリウム等の通常のアルカリ性物質を使用するこ
とが出来るが、弱アルカリ性物質である、例えばアンモ
ニア、トリエチルアミン等の有機塩基の水溶液を使用す
ることが前記アルカリ性物質を使用した場合に比べ高い
リフォールディング率を得ることが出来るため好ましい
。更に好ましくはモノエタノールアミン、ジエチレント
リアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペ
ンタミンの中からえらばれる少なくとも１種の有機塩基
の水溶液を用いることでより高いリフォールディング率
を得ることができる。有機塩基の水溶液が高い割合いで
ウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフオールディングを引
起こす理由は明らかではないが、有機塩基が水のカオト
ロピックな性質を乱さないためだと考えられる。有機塩
基の中でも前記した更に好ましい有機塩基（モノエタノ
ールアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテト
ラミン、テトラエチレンペンタミン）がウロキナーゼ前
駆体様蛋白質のリフオールディングを高率で引起こすメ
カニズムは定かではないが、恐らくそれらの直鎖構造が
関係しているものと考えられる。
炭酸ナトリウム等の通常のアルカリ性物質を使用するこ
とが出来るが、弱アルカリ性物質である、例えばアンモ
ニア、トリエチルアミン等の有機塩基の水溶液を使用す
ることが前記アルカリ性物質を使用した場合に比べ高い
リフォールディング率を得ることが出来るため好ましい
。更に好ましくはモノエタノールアミン、ジエチレント
リアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペ
ンタミンの中からえらばれる少なくとも１種の有機塩基
の水溶液を用いることでより高いリフォールディング率
を得ることができる。有機塩基の水溶液が高い割合いで
ウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフオールディングを引
起こす理由は明らかではないが、有機塩基が水のカオト
ロピックな性質を乱さないためだと考えられる。有機塩
基の中でも前記した更に好ましい有機塩基（モノエタノ
ールアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテト
ラミン、テトラエチレンペンタミン）がウロキナーゼ前
駆体様蛋白質のリフオールディングを高率で引起こすメ
カニズムは定かではないが、恐らくそれらの直鎖構造が
関係しているものと考えられる。
変性、可溶化を行うアルカリ水溶液は、そのｐＨが１０
よりも低いとウロキナーゼ前駆体様蛋白質の変性が十分
に起こらず、逆に、１３よりも高いと不可逆的な変性が
起り易いため１０〜１３の範囲内のｐＨであることが好
ましいが、更には１１〜１２の範囲のｐＨリフォールデ
ィング率の向上のためには良い。これは、ウロキナーゼ
前駆体様蛋白質の変性の度合いがリフォールディングの
時に微妙に影響するためであると考えられる。
よりも低いとウロキナーゼ前駆体様蛋白質の変性が十分
に起こらず、逆に、１３よりも高いと不可逆的な変性が
起り易いため１０〜１３の範囲内のｐＨであることが好
ましいが、更には１１〜１２の範囲のｐＨリフォールデ
ィング率の向上のためには良い。これは、ウロキナーゼ
前駆体様蛋白質の変性の度合いがリフォールディングの
時に微妙に影響するためであると考えられる。
続いて可溶化したウロキナーゼ前駆体様蛋白質をリフォ
ールディングさせるが、ウロキナーゼ前駆体様蛋白質溶
液が菌体破片等を含んでいる場合には、この操作に先立
って溶液から挟雑物質を除去しておくことが後の精製の
操作等のために好ましい。挟雑物質の除去は、例えば遠
心分離、限外濾過、ゲル濾過等の通常の方法を用いれば
良い。
ールディングさせるが、ウロキナーゼ前駆体様蛋白質溶
液が菌体破片等を含んでいる場合には、この操作に先立
って溶液から挟雑物質を除去しておくことが後の精製の
操作等のために好ましい。挟雑物質の除去は、例えば遠
心分離、限外濾過、ゲル濾過等の通常の方法を用いれば
良い。
次に、ウロキナーゼ前駆体様蛋白質を含むアルカリ水溶
液のｐＨを糖の共存下で酸性物質を添加して低下させる
。糖は単独、又は酸性物質と同時に添加しても良い。添
加する糖の量に格別の制限はないが、１０〜１５ｆｆｒ
量％程度の添加が溶液の粘土の上昇もおこさず良い。使
用する糖としては、例えばグルコース、フルクトース、
ショ糖等である。この糖の共存がリフォールディングに
与える効果は定かではないが、恐らく水の構造に影響を
与え、ウロキナーゼ前駆体様蛋白質と水分子を水素結合
し易くするのではないかと考えられる。例えばグルコー
ス、フルクトース等は還元力を有する還元糖であること
が知られているが、本発明における糖の効果がこの還元
力のみによるものでないことは、ショ糖を用いても高い
リフォールディレグ率が得られることから明白である。
液のｐＨを糖の共存下で酸性物質を添加して低下させる
。糖は単独、又は酸性物質と同時に添加しても良い。添
加する糖の量に格別の制限はないが、１０〜１５ｆｆｒ
量％程度の添加が溶液の粘土の上昇もおこさず良い。使
用する糖としては、例えばグルコース、フルクトース、
ショ糖等である。この糖の共存がリフォールディングに
与える効果は定かではないが、恐らく水の構造に影響を
与え、ウロキナーゼ前駆体様蛋白質と水分子を水素結合
し易くするのではないかと考えられる。例えばグルコー
ス、フルクトース等は還元力を有する還元糖であること
が知られているが、本発明における糖の効果がこの還元
力のみによるものでないことは、ショ糖を用いても高い
リフォールディレグ率が得られることから明白である。
ｐＨの：Ｊ３整は、例えば、塩酸、チオシアン酸、ヨウ
化水素臭化水素等の無機酸あるいは酢酸、グリシン等の
有機酸等の通常の酸性物質を添加して行えば良い。溶液
のｐＨは、変性、可溶化の際のｐＨに比較して低下して
いれば良いが、高いリフォールディング率を得るために
は最終的に８〜９の範囲に調整することが好ましい。
化水素臭化水素等の無機酸あるいは酢酸、グリシン等の
有機酸等の通常の酸性物質を添加して行えば良い。溶液
のｐＨは、変性、可溶化の際のｐＨに比較して低下して
いれば良いが、高いリフォールディング率を得るために
は最終的に８〜９の範囲に調整することが好ましい。
この溶液のｐＨを低下させる操作に先立って、例えば還
元型グルタチオン、システィン、２−メルカプトエタノ
ール、ジチオトレイトール等のスルフヒドリル化合物を
添加しておくことでウロキナーゼ前駆体様蛋白質中のジ
スルフィド結合が誤って形成されるのを防止することが
でき、より高い率でリフォールディングさせるためには
好ましい。
元型グルタチオン、システィン、２−メルカプトエタノ
ール、ジチオトレイトール等のスルフヒドリル化合物を
添加しておくことでウロキナーゼ前駆体様蛋白質中のジ
スルフィド結合が誤って形成されるのを防止することが
でき、より高い率でリフォールディングさせるためには
好ましい。
本発明で、高濃度の蛋白質変性剤を使用し、リフォール
ディング後の溶液中にウロキナーゼ前駆体様蛋白質を変
性させる濃度以上の変性剤が含まれている場合には、必
要に応じて透析、希釈等の操作を行って蛋白質変性剤の
強度を低下させれば良い。
ディング後の溶液中にウロキナーゼ前駆体様蛋白質を変
性させる濃度以上の変性剤が含まれている場合には、必
要に応じて透析、希釈等の操作を行って蛋白質変性剤の
強度を低下させれば良い。
（発明の効果）
本発明では、例えばウロキナーゼ前駆体様蛋白質を変性
させない濃度の蛋白質変性剤を使用することで、簡便な
操作により大腸菌等を宿主として不溶性具Ｆｌ蛋白質の
形態で生産されたウロキナーゼ前駆体様蛋白質をリフォ
ールディングさせることが出来る。蛋白質変性剤として
尿素を使用した場合には、リフォールディング後の廃液
の処理を塩酸グアニジンを使用した場合に比べ、簡単に
行うことが出来る。また、モノエタノールアミン、ジエ
チレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエ
チレンペンタミンの中から選ばれるアルカリ性物質を使
用した場合には、高いリフォールディング率を得ること
が出来る。また、この時、スルフヒドリル化合物を存在
させておくことでより高いリフォールディング率を得る
ことが出来る。
させない濃度の蛋白質変性剤を使用することで、簡便な
操作により大腸菌等を宿主として不溶性具Ｆｌ蛋白質の
形態で生産されたウロキナーゼ前駆体様蛋白質をリフォ
ールディングさせることが出来る。蛋白質変性剤として
尿素を使用した場合には、リフォールディング後の廃液
の処理を塩酸グアニジンを使用した場合に比べ、簡単に
行うことが出来る。また、モノエタノールアミン、ジエ
チレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエ
チレンペンタミンの中から選ばれるアルカリ性物質を使
用した場合には、高いリフォールディング率を得ること
が出来る。また、この時、スルフヒドリル化合物を存在
させておくことでより高いリフォールディング率を得る
ことが出来る。
（実施例）
以下本発明をさらに詳細に説明するため実施例を示すが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
特開昭６２−１４３６８６号に示された方法に従って作
製したプラスミドで形質転換した大腸菌を通常の方法で
培養し、不溶性のウロキナーゼ前駆体様蛋白質を生産さ
せた。得られたウロキナーゼ前駆体様蛋白質を含有する
大腸菌を、ゴーリンホモジナイザーにより破砕し、限外
濾過膜（東ソー株式会社製、商品名ＴＳ−３０００）に
より不溶性画分スラリーと可溶性画分スラリーに分画し
、以下の実施例において使用した。
製したプラスミドで形質転換した大腸菌を通常の方法で
培養し、不溶性のウロキナーゼ前駆体様蛋白質を生産さ
せた。得られたウロキナーゼ前駆体様蛋白質を含有する
大腸菌を、ゴーリンホモジナイザーにより破砕し、限外
濾過膜（東ソー株式会社製、商品名ＴＳ−３０００）に
より不溶性画分スラリーと可溶性画分スラリーに分画し
、以下の実施例において使用した。
このウロキナーゼ前駆体様蛋白質は、分子量約４６００
０でジスルフィド結合１２個を有し、Ｎ末端側から数え
て第１３５番目のアミノ酸残基が天然のリジンからグル
タミンに変異したものであった。
０でジスルフィド結合１２個を有し、Ｎ末端側から数え
て第１３５番目のアミノ酸残基が天然のリジンからグル
タミンに変異したものであった。
実施例２
実施例１の様にして得た不溶性画分スラリー１０ｇ（Ｉ
ｇ湿菌体相当）に８Ｍ尿素１０ｍ１を添加し、３０分間
放置した後、２０ｍ１の１０％トリエチレンテトラミン
溶液を添加して溶液のｐＨをおよそ１１．５とし、更に
３０分間放置した。
ｇ湿菌体相当）に８Ｍ尿素１０ｍ１を添加し、３０分間
放置した後、２０ｍ１の１０％トリエチレンテトラミン
溶液を添加して溶液のｐＨをおよそ１１．５とし、更に
３０分間放置した。
続いて５ｇのグルコースを添加し、３０分間放置した後
、塩酸でｐＨを９に調整してリフォールディングを行っ
た。尚、反応は室温で行った。
、塩酸でｐＨを９に調整してリフォールディングを行っ
た。尚、反応は室温で行った。
リフォールディングしたウロキナーゼ前駆体様蛋白質に
ついてプラスシン処理を行い、ウロキナーゼに変化させ
た後、ウロキナーゼの特異的基質として知られる、ピロ
グルタミル・グリシル・アルギニル・パラニトロアニリ
ド塩酸塩の分解活性を測定した。結果を表１に示す。
ついてプラスシン処理を行い、ウロキナーゼに変化させ
た後、ウロキナーゼの特異的基質として知られる、ピロ
グルタミル・グリシル・アルギニル・パラニトロアニリ
ド塩酸塩の分解活性を測定した。結果を表１に示す。
実施例３
糖として５ｇのショ糖を用いた以外は、実施例６と同様
に行った。結集を表１に示す。
に行った。結集を表１に示す。
実施例４
実施例１の様にして得た不溶性画分スラリー１Ｏｇ（Ｉ
ｇ湿菌体相当）に８Ｍ尿素１０ｍ１を添加し、３０分間
放置した後、２０ｍ１の１０％トリエチレンテトラミン
溶液を添加して溶液のｐＨをおよそ１１．５とし、更に
３０分間放置した。
ｇ湿菌体相当）に８Ｍ尿素１０ｍ１を添加し、３０分間
放置した後、２０ｍ１の１０％トリエチレンテトラミン
溶液を添加して溶液のｐＨをおよそ１１．５とし、更に
３０分間放置した。
続いて１ｍＭとなる様に還元型グルタチオンを添加し、
６０分間放置した後、５ｇのグルコースを添加して３０
分間放置し、塩酸でｐＨを９に調整してリフォールディ
ングを行った。尚、反応は室温で行った。
６０分間放置した後、５ｇのグルコースを添加して３０
分間放置し、塩酸でｐＨを９に調整してリフォールディ
ングを行った。尚、反応は室温で行った。
リフォールディングしたウロキナーゼ前駆体様蛋白質に
ついて実施例２と同様の処理を行い、ウロキナーゼに変
化させ、その活性を測定した。結果を表１に示す。
ついて実施例２と同様の処理を行い、ウロキナーゼに変
化させ、その活性を測定した。結果を表１に示す。
実施例５
糖として５ｇのショ糖を用いた以外は、実施例４と同様
に行った。結果を表１に示す。
に行った。結果を表１に示す。
表１
Claims (5)
- （１）宿主細胞内で不溶性異種蛋白質として生産された
ウロキナーゼ前駆体様蛋白質を蛋白質変性剤の存在下で
アルカリ水溶液と接触させ、次いで該溶液のｐＨを糖の
存在下で酸性物質を添加して低下させることを特徴とす
るウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフオールディング方
法。 - （２）宿主細胞内で不溶性異種蛋白質として生産された
ウロキナーゼ前駆体様蛋白質を蛋白質変性剤の存在下で
アルカリ水溶液と接触させ、次いで該溶液のｐＨを糖及
びスルフヒドリル化合物の存在下で酸性物質を添加して
低下させることを特徴とするウロキナーゼ前駆体様蛋白
質のリフオールディング方法。 - （３）アルカリ水溶液としてモノエタノールアミン、ジ
エチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラ
エチレンペンタミンから選ばれる少なくとも１種の有機
塩基の水溶液を用いることを特徴とする請求項１又は２
の方法。 - （４）糖としてグルコース、フルクトース、ショ糖から
選ばれる少なくとも１種の糖を用いることを特徴とする
請求項１又は２の方法。 - （５）蛋白質変性剤が２Ｍ以下の尿素であることを特徴
とする請求項１又は２の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4758488A JPH01222780A (ja) | 1988-03-02 | 1988-03-02 | ウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフォールディング方法 |
| EP19890302042 EP0331464A3 (en) | 1988-03-02 | 1989-03-01 | Method of refolding urokinase precursor-like protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4758488A JPH01222780A (ja) | 1988-03-02 | 1988-03-02 | ウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフォールディング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01222780A true JPH01222780A (ja) | 1989-09-06 |
Family
ID=12779302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4758488A Pending JPH01222780A (ja) | 1988-03-02 | 1988-03-02 | ウロキナーゼ前駆体様蛋白質のリフォールディング方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0331464A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01222780A (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU770896C (en) | 1998-09-29 | 2006-09-07 | Gamida Cell Ltd. | Methods of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells |
| ES2391055T3 (es) * | 1998-02-17 | 2012-11-21 | Gamida Cell Ltd. | Procedimiento para controlar la proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras |
| JP4239412B2 (ja) * | 1998-12-28 | 2009-03-18 | 味の素株式会社 | トランスグルタミナーゼの製造方法 |
| US6316240B1 (en) | 1999-01-25 | 2001-11-13 | Novozymes A/S | Recovery of a glycosidase or peptidase from a culture broth at high pH |
| KR100419448B1 (ko) * | 2001-03-09 | 2004-02-19 | 주)녹십자 | 고정화 유로키나아제 칼럼의 재생방법 |
| IL152904A0 (en) | 2002-01-24 | 2003-06-24 | Gamida Cell Ltd | Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations |
| WO2003062404A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-07-31 | Gamida-Cell Ltd. | Methods of expanding stem and progenitor cells and expanded cell populations obtained thereby |
| WO2006030442A2 (en) | 2004-09-16 | 2006-03-23 | Gamida-Cell Ltd. | Methods of ex vivo progenitor and stem cell expansion by co-culture with mesenchymal cells |
| US8846393B2 (en) | 2005-11-29 | 2014-09-30 | Gamida-Cell Ltd. | Methods of improving stem cell homing and engraftment |
| EP2814951B1 (en) | 2012-02-13 | 2019-04-03 | Gamida-Cell Ltd. | Culturing of mesenchymal stem cells |
| US9175266B2 (en) | 2012-07-23 | 2015-11-03 | Gamida Cell Ltd. | Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity |
| US9567569B2 (en) | 2012-07-23 | 2017-02-14 | Gamida Cell Ltd. | Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984003711A1 (en) * | 1983-03-25 | 1984-09-27 | Celltech Ltd | A process for the production of a protein |
-
1988
- 1988-03-02 JP JP4758488A patent/JPH01222780A/ja active Pending
-
1989
- 1989-03-01 EP EP19890302042 patent/EP0331464A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0331464A3 (en) | 1991-06-26 |
| EP0331464A2 (en) | 1989-09-06 |
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