DE10054059A1 - Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine - Google Patents
Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante ProteineInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine. Anwendungsgebiete dieses Verfahrens sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. DOLLAR A Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, schnell und ohne vorhergehende Aufreinigungsschritte zu überprüfen, welche Pufferbedingungen für eine Regeneration der Faltung von Proteinen am geeignetsten sind. Das Verfahren soll weiterhin mit sehr geringem Materialaufwand realisierbar und unabhängig von der biochemischen Funktion des Proteins einsetzbar sein. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß nach einer Expression erhaltene rekombinante Proteine in chaotropen Reagenzien gelöst werden und mindestens 20 Aliquote dieser Lösung mit verschiedenen Pufferlösungen versetzt werden. Danach werden die Lösungen dialysiert und auf das Zehnfache konzentriert. Anschließend wird Protease in geringer Konzentration zugesetzt, inkubiert und abschließend der Faltungszustand der Proteine festgestellt.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für
rekombinante Proteine. Anwendungsgebiete dieses Verfahrens sind die Medizin und die
pharmazeutische Industrie.
Die heterologe Produktion von Proteinen in dem prokaryotischen Wirt Escherichia coli ist
eine sowohl in der Forschung als auch in der industriellen Produktion weit verbreitete
Technik. In den meisten Fällen wird das Protein von den Ribosomen jedoch nicht in einer
löslichen, nativen Konformation freigesetzt, sondern bildet hochmolekulare Aggregate und
akkumuliert in sogenannten inclusion bodies. Daher gibt es einen Bedarf zur Entwicklung von
Methoden, die es ermöglichen, diese Proteine in Lösung zu bringen und ihre biologisch aktive
Faltung zu regenerieren1,2. Obwohl es schwierig ist, die jeweiligen Faltungsbedingungen
herauszufinden, hat der Weg über inclusion bodies im Vergleich zur cytoplasmatischen oder
periplasmatischen Akkumulation auch eine Reihe von Vorteilen. So kann das Protein in
großer Menge produziert werden, indem das entsprechende Gen unter Kontrolle eines starken
Promotors exprimiert wird. Unter diesen Bedingungen neigt das produzierte Protein außerdem
weniger zu proteolytischer Degradation und seine potentielle Toxizität für die Wirtszelle ist
erniedrigt. Zusätzlich kann das Protein schnell durch einfache Wasch- und
Zentrifugationsschritte gereinigt werden, wodurch der Gebrauch von Affinitätsmarkierungen
(affinity tags) überflüssig wird.
Die geschilderten Vorteile werden allerdings nutzlos, wenn keine geeigneten
Faltungsbedingungen gefunden werden können.
In den vergangenen Jahren wurden bei der Etablierung allgemeiner Bedingungen für die
Proteinfaltung beachtliche Fortschritte gemacht3. Dies führte in einigen Fällen zur
Entwicklung von käuflich zu erwerbenden Kits, die dem Screening von Faltungsbedingungen
dienen4,5. Die Anwendung dieser Kits wird allerdings dadurch beeinträchtigt, daß es beim
Fehlen eines für das entsprechende Protein spezifischen enzymatischen oder biologischen
Assays schwierig festzustellen ist, ob die Faltung erfolgreich war oder nicht.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, schnell und ohne
vorhergehende Aufreinigungsschritte zu überprüfen, welche Pufferbedingungen für eine
Regeneration der Faltung von Proteinen am geeignetsten sind. Das Verfahren soll weiterhin
mit sehr geringem Materialaufwand realisierbar und unabhängig von der biochemischen
Funktion des Proteins einsetzbar sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren realisiert die Ermittlung von Faltungsbedingungen für
rekombinante Proteine durch partielle Proteolyse von in chaotropen Reagenzien gelösten
Proteinen, es wird im folgenden als FSAP (folding screening assayed by proteolysis)
bezeichnet. Dazu werden die rekombinanten Proteine nach einer Expression in beispielsweise
E. coli zunächst in chaotropen Reagenzien gelöst, anschließend werden mindestens 20
Aliquote dieser Lösung mit verschiedenen Pufferlösungen versetzt. Anschließend werden die
verschiedenen Lösungen dialysiert und auf das Zehnfache konzentriert. Danach wird Protease
in geringer Konzentration zugesetzt und inkubiert. In Abhängigkeit von ihrem
Faltungszustand sind die Proteine vor dem proteolytischen Verdau in unterschiedlichem Maße
geschützt: Je vollständiger die Faltung, desto höher ist die Resistenz gegen eine Spaltung
durch die Protease. Der Grad der Intaktheit bzw. der Spaltung der Proteine läßt sich
anschließend nachweisen und ist ein indirektes Maß für deren Faltungszustand.
Als chaotropes Reagenz kann eine 7,5 M Harnstofflösung oder eine 6 M Guanidin/HCl-
Lösung (20 mM Tris/HCl-Puffer; pH 8,0; 6 M Guanidin/HCl; 5 mM EDTA; 4 mM DTT)
eingesetzt werden. Die verschiedenen Pufferlösungen werden variiert mit
- - unterschiedlichen Stabilisierungszusätzen wie Salzen, Zuckern oder chaotropen Reagenzien wie Arginin,
- - unterschiedlichen zweiwertigen Kationen wie Mg2+, Ca2+ oder Cu2+,
- - unterschiedlichen Redoxzusätzen wie GSSG, GSH und DTT und
- - unterschiedlichen pH-Werten.
Die Wahl der Protease ist gemäß der Erfindung nicht limitiert. Neben der in den Beispielen
aufgeführten Verwendung von Subtilisin sind auch andere für partielle Proteolyse
gebräuchliche Proteasen wie Thermolysin, Chymotrypsin, Trypsin und SV8-Protease
anwendbar. Protease und Substrat werden bevorzugt in einem Verhältnis von 1 : 50 bis 1 : 1000
bei einer Inkubationszeit von bevorzugt 50 bis 150 min eingesetzt. Als besonders günstig
haben sich ein Verhältnis Protease zu Substrat von 1 : 100 und eine 100minütige Inkubation
erwiesen. Die Proteolyse wird durch Zugabe von beispielsweise PMSF oder Pefabloc®
gestoppt. Der Grad der Spaltung der Proteine wird schließlich durch SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) in Kombination mit einer Silberfärbung
nachgewiesen. Alternativ sind andere Methoden zur Proteindetektion möglich wie z. B.
Kapillarelektrophorese oder Massenspektroskopie.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es zum ersten Mal gelungen, die partielle
Proteolyse erfolgreich einzusetzen, um die Faltungsbedingungen für neue Proteine schnell
abzuleiten.
Ein Hauptvorteil des Verfahrens liegt in der Tatsache, daß sie eine schnelle Screeningmethode
bereit stellt, die zwischen falsch gefaltetem und einem dem nativen Protein ähnlichen
Faltungszustand unterscheidet, ohne daß zuvor ein spezifischer biologischer Assay zur
Überprüfung der Proteinfunktion etabliert werden muß. Im Gegensatz zu biophysikalischen
Methoden, wie der dynamischen Lichtstreuung (dynamic light scattering) und
Zirkulardichroismusmessungen (circular dichroism measurements), die herkömmlicherweise
benutzt werden, um den Faltungszustand von Proteinen zu bestätigen, ist die FSAP-Methode
nicht von einer konformellen Einheitlichkeit der Lösung abhängig und kann auch auf
Gemische von dem nativen Protein ähnlichen und falsch gefaltetem Proteinen angewandt
werden. Besonders vorteilhaft ist die geringe Menge an Protein, die für das Screening benötigt
wird (ca. 10 µg zum Testen einer Pufferbedingung), die es erlaubt, beliebig viele
Rückfaltungspuffer zu testen. Zusätzlich bietet die Methode die Möglichkeit einer leichten
Automatisierbarkeit. Zu diesem Zweck können sowohl die Screeningmethoden zum
Faltungszustand als auch der proteolytische Assay in großem Maß variiert werden.
Beispielsweise kann leicht das Ziel verfolgt werden, Multititerplatten für die Renaturierung
des Proteins in Kombination mit seriellen Dialyseeinheiten einzusetzen und eine online-
Detektion der Produkte durch Kapillarelektrophorese oder Massenspektroskopie
vorzunehmen. Durch dieses hohe Automatisierungspotential könnte die FSAP-Methode von
besonderem Interesse für Projekte aus dem Bereich Siructural Genomics sein. Für diese ist
eine systematische Produktion der Proteine eine unabdingbare Voraussetzung, da über die
biologischen Funktionen und biophysikalischen Eigenschaften der individuellen Proteine nur
begrenzte Kenntnisse zur Verfügung stehen.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. Hierfür
wurden der angiogene Wachstumsfaktors VEGF (vascular endothelial growth factor)
ausgewählt. VEGF ist ein homodimeres Protein und enthält als Strukturmotiv einen durch
Disulfidbrücken gekennzeichneten Cysteinknoten6. Da VEGF ein ausgedehnter hydrophober
Kern fehlt, nimmt man an, daß der Cysteinknoten wesentlich für die Stabilität des Proteins
verantwortlich ist. Daher sollte es besonders schwierig sein, Bedingungen für die Rückfaltung
von Mutanten von VEGF zu finden, in denen dieser Knoten partiell oder vollständig zerstört
ist.
Zur Rückfaltung wurden vier Cystein-Deletionsmutanten hergestellt, in denen jeweils zwei
Cysteinreste, die im VEGF-Protein des Wildtyps eine Disulfidbrücke bilden, durch Alanin
ausgetauscht wurden. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens war es
möglich, die Faltungsbedingungen für drei dieser vier möglichen Cystein-Deletionsmutanten
von VEGF zu bestimmen (s. Abb. 1). Die so bestimmten Protokolle für die Rückfaltung der
Proteine weichen vom VEGF-Wildtypprotokoll ab und können ohne zusätzliche Anpassungen
für die Proteinproduktion im Milligramm-Bereich verwendet werden.
Es wurde ein pET-3d Vektor, in den das für die Aminosäuren 14 bis 108 codierenden Gen
von humanem VEGF insertiert war, von der Firma Jerini Biotools GmbH (Adlershof) zur
Verfügung gestellt. Die Punktmutationen für die vier verschiedenen Cystein-Deletions
mutanten wurden unter Verwendung des QuikChange mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla)
nach den Angaben des Herstellers generiert. Die das VEGF-Wildtypprotein enthaltenden
inclusion bodies wurden in BL21 (DE3) Zellen (Novagen) produziert, während die Mutanten
in größeren Ausbeuten in B834(DE3) Zellen in Coexpression mit GroES/GroEL in einem
pREP4-Vektor hergestellt werden konnten, ohne daß während der Zellzucht spezifisch auf
diesen Vektor selektiert wurde. Für jedes Konstrukt wurden jeweils sechs Liter LB-Medium
(100 µg/ml Ampicillin enthaltend) mit der entsprechenden Übernachtkultur angeimpft und
nach 3 Stunden Wachstum bei 37°C bis zu einer OD600 von ca 0,6 durch Zusatz von 1 mM
IPTG induziert. Nach weiteren 4 Stunden bei 37°C wurden die Zellen abzentrifugiert (20 min.,
5000 × g, 4°C) in 40 ml Tris-Puffer pH 7,5 mit 5 mM EDTA-Zusatz resuspendiert und
mittels French Press aufgeschlossen (2 × 1000 bar). Die freigesetzten inclusion bodies wurden
durch Zentrifugation (60 min., 12000 × g, 4°C) von Zelllysat abgetrennt und grob gereinigt
(dreimal jeweils resuspendiert in obigen Aufschlusspuffer und erneut 30 min. abzentrifugiert).
Für die weitere Aufarbeitung der Mutanten wurden die so gereinigten Pellets in 20 ml
Denaturierungs-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8,0; 6 M Guanidinium HCl; 5 mM EDTA; 4 mM
DTT) aufgelöst und für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend wurden
nicht gelöste Bestandteile abzentrifugiert (30 min., 46 000 × g, 4°C) und der Überstand bei
-20°C gelagert. Für den Wildtyp wurde im Denaturierungspuffer statt 6 M Guanidinium HCl
7,5 M Harnstoff zum Auflösen des Pellets verwendet.
Für die Rückfaltungsversuche wurden 24 unterschiedliche Lösungen verwendet, von den 16
von einem Screen abgeleitet waren, der ursprünglich 1997 von Chen und Gouaux4
vorgeschlagen wurde (s. Tabelle). Diese 16 Lösungen wurden durch acht Variationen der für
den VEGF-Wildtyp erfolgreichen Bedingung ergänzt.
Die aufgelösten inclusion bodies jeder Mutante wurden durch Verdünnen im Denaturierungs
puffer auf eine Konzentration von ca. 1 mg/ml Protein (bestimmt über UV-Absorption bei 280 nm)
eingestellt. Von dieser Lösung wurde jeweils ein 10 µl-Aliquot in 990 µl jeder der 24
Screen-Lösungen verdünnt, heftig geschüttelt und bei 4°C über Nacht inkubiert.
Am nächsten Tag wurden alle 24 Rückfaltungsansätze der einzelnen Mutanten 6 Stunden
gegen 100 ml Proteolyse-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8.0) dialysiert und jede Probe auf ein
Volumen von 100 µl konzentriert (Millipore Ultrafree Centrifugal Devices, MWCO 3,5 kDa,
Millipore, Bedford). Zu den konzentrierten Ansätzen wurden jeweils 0,1 µg Subtilisin
zugefügt (2 µl einer 0,05 mg/ml Lösung, Boehringer Mannheim, Mannheim), was einem
Verhältnis von Protease zu Protein von 1 : 100 entspricht. Die Verdauansätze wurden 100 min
bei Raumtemperatur inkubiert, der Abbruch erfolgte durch Inaktivierung der Protease mittels
Zusatz von 1 µl einer 10 mM PMSF-Lösung. Anschließend wurden die Proben vakuum
getrocknet, in Standard SDS-Ladepuffer gelöst und nach SDS-PAGE und Silberfärbung
analysiert.
Der VEGF-Wildtyp wurde nach einem bekannten Protokoll zurückgefaltet: Die inclusion
bodies wurden in 7,5 M Harnstoff aufgelöst und dann 1 : 10 in einer Lösung von 20 mM
Tris/HCl pH 8,4 und 7 µM CuCl2 verdünnt. Diese ca 1 mg/ml Protein enthaltende Lösung
wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und das Protein anschließend mittels
Ionenaustauscher-, hydrophober Interaktions- und Größenausschlußchromatographie weiter
gereinigt. Bei dem Versuch, dasselbe Protokoll auf die Mutante Cys26Ala/Cys68Ala
anzuwenden, wurde bei dem Rückfaltungsschritt ein lösliches Produkt erhalten, das sich nicht
weiter aufreinigen ließ: Während der Ionenaustauscherchromatographie wurde die Mutante
bei ungewöhnlich hohen Salzkonzentrationen eluiert und erschien verteilt über einen großen
Bereich des Gradienten. Versuche, dieses Produkt über eine hydrophobe Wechselwirkung
weiter zu reinigen, scheiterten völlig. In den weiteren Versuchen wurde dieses Produkt als
Referenz für ungefaltetes lösliches Protein verwendet.
Um die Sensitivität dieser Methode zu überprüfen, wurden verschiedene Testmischungen aus
gefaltetem Wildtypprotein und Protein der oben beschriebenen ungefalteten Mutante
hergestellt, die einem Anteil von 0,5 oder 100% an gefaltetem Protein an der Mischung
entsprachen. In allen drei Fällen wurden 100 µg Gesamtprotein in einem Volumen von 100 µl
20 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0 dem proteolytischen Verdau durch 1,0 µg Subtilisin
ausgesetzt, wobei zu unterschiedlichen Zeiten 10 µl Aliquots entnommen wurden und nach
kurzem Aufkochen mittels SDS-PAGE analysiert wurden.
Es wurde für drei unterschiedliche Proteinkonzentrationen die Effizienz der Rückfaltung der
Mutante Cys61Ala/Cys104Ala bei Verdünnen von 10 µl gelösten inclusion bodies in
Rückfaltungspuffer Nr. 10 (s. Tabelle) untersucht. Als Konzentrationen wurden 0,01, sowie
0,1 und 1,0 mg/ml gewählt, wobei in den ersten beiden Fällen die Konzentration an
Guanidinium HCl im Rückfaltungsansatz 0,06 M, im letzten Fall jedoch aus praktischen
Gründen 0,6 M war. Nach der Rückfaltung wurden jeweils gleiche Mengen an Protein (10 µg)
entnommen, der Puffer ausgetauscht und die Probevolumina auf 100 µl aufkonzentriert, bevor
die Proben dem proteolytischen Verdau mit Subtilisin ausgesetzt und anschließend mittels
SDS-PAGE analysiert wurden.
Dem Rückfaltungsschritt vorgeschaltet wurde eine erste Reinigung der aufgelösten inclusion
bodies mittels Größenausschlusschromatographie unter denaturierenden Bedingungen (20 mM
Tris/HCl pH 7,5; 6 M Guanidinium HCl; 4 mM DTT) über eine Sephacryl S200-Säule
(Pharmacia, Uppsala), 20 ml der vereinigten Fraktionen (Proteinkonzentration ca. 1 mg/ml)
wurden in 2 l Rückfaltungspuffer (50 mM Tris/HCl pH 8,2; 10,5 mM NaCl; 0,44 mM KCl,
1 mM EDTA; 0,3 mM Lauryl-Maltosid, 440 mM Sucrose, 1 mM GSH; 0,1 mM GSSG)
verdünnt und über Nacht bei 4°C gerührt. Anschließend wurde die Lösung zweimal für 6
Stunden gegen 35 l eines 20 mM Tris/HCl Puffers pH 8,0 dialysiert und durch einen 0,2 µm-
Filter filtriert. Das Protein wurde auf einer Q-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufkonzentriert
und in einem NaCl-Gradienten von 0-1 M in 20 mM Tris/HCl pH 8,0 eluiert. Die
entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und auf ein Volumen von 1 ml aufkonzentriert
welches abschließend durch Größenauschlußchromatographie über eine Superdex 75 Säule
(Pharmacia) gereinigt wurde.
Kristalle der drei Mutanten, für die eine Rückfaltungsbedingung gefunden werden konnte,
wuchsen bei 20°C am hängenden Tropfen. 1 µl Proteinlösung (12 mg/ml Protein, 20 mM
Tris/HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl) wurde mit 1 µl Reservoir-Lösung gemischt und das
Dampfdruckgleichgewicht gegen 700 µl dieser Lösung eingestellt. Im Falle der Mutanten
Cys51Ala/Cys60Ala und Cys61Ala/Cys104Ala bestand die Reservoir-Lösung aus 28% PEG
4000 (m/v), 12% Isopropanol (v/v) 100 mM Na-Citrat pH 5,6 und im Falle der Mutante
Cys57Ala/Cys102Ala aus 2,0 M Na-Format und 0,1 M Na-Acetat pH 4,6.
1. Lilie H et al. (1998) Curr Opin Biotechnol 9: 497-501.
2. Rudolph R und Lilie H (1996) FASEB J 10: 49-56.
3. Rudolph R et al. (1997) in Protein function, a practical approach (Hrsg. Creighton T E, IRL Press, Oxford) 57-99.
4. Chen G Q und Gouaux E (1997) PNAS 94: 13431-13436.
5. Armstrong N et al. (1999) Protein Sci 8: 1475-1483.
6. Muller Y A et al. (1997) Structure 5: 1325-1338.
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4. Chen G Q und Gouaux E (1997) PNAS 94: 13431-13436.
5. Armstrong N et al. (1999) Protein Sci 8: 1475-1483.
6. Muller Y A et al. (1997) Structure 5: 1325-1338.
Skizze des VEGF-Dimeren, mit hervorgehobenem Cystein-Knoten. Die zwei Monomere, die
das über Disulfidbrücken verknüpfte Homodimer bilden, sind in hell- und dunkelgrau
dargestellt. Die mutierten Cysteine sind markiert. (Darstellung mit Hilfe der Programme
MOLSCRIPT und RASTER3D)
Faltungsbedingungen nach Tabelle 1 wurden mittels limitierter Proteolyse durchmustert und
auf SDS-Gelen analysiert. Für die Mutante Cys51Ala-Cys60Ala können auf diese Weise
mehrere positive Bedingungen identifiziert werden, während für die Mutanten
Cys61Ala-Cys104Ala und Cys57Ala-Cys102Ala nur die Bedingungen Nr. 8 und Nr. 10 erfolgreich
waren.
Nachweisgrenze der Methode: Zeitaufgelöster Verdau mit einem Anfangsgehalt von 100, 95
und 0% mißgefaltetem Protein. Die Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, Faltungsbedin
gungen zu identifizieren, selbst wenn die Rückfaltungsquote bei nur 5% des
Ausgangsproteins liegt.
Einfluß der Proteinkonzentration auf den Ertrag der Rückfaltung: Gleiche Mengen an Protein,
die bei unterschiedlichen Konzentration in derselben Rückfaltungslösung renaturiert wurden,
wurden nach limitierter Proteolyse mittels SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß
mit steigender Konzentration des Proteins die Rückfaltungseffizienz abnimmt.
Größenausschlußchromatographie der Mutante Cys61Ala-Cys104Ala, rechts oben ein
Einkristall derselben Mutante.
Claims (21)
1. Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine, dadurch
gekennzeichnet, daß
nach einer Expression erhaltene rekombinante Proteine in chaotropen Reagenzien gelöst werden,
mindestens 20 Aliquote dieser Lösung mit verschiedenen Pufferlösungen versetzt werden,
danach die Lösungen dialysiert und auf das Zehnfache konzentriert werden,
anschließend Protease in geringer Konzentration zugesetzt und inkubiert wird,
abschließend der Faltungszustand der Proteine festgestellt wird.
nach einer Expression erhaltene rekombinante Proteine in chaotropen Reagenzien gelöst werden,
mindestens 20 Aliquote dieser Lösung mit verschiedenen Pufferlösungen versetzt werden,
danach die Lösungen dialysiert und auf das Zehnfache konzentriert werden,
anschließend Protease in geringer Konzentration zugesetzt und inkubiert wird,
abschließend der Faltungszustand der Proteine festgestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotropes Reagenz eine 7,5
M Harnstofflösung (20 mM Tris/HCl, pH 7,5; 7,5 M Harnstoff; 4 mM DTT) eingesetzt
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotropes Reagenz eine 6
M Guanidin/HCl-Lösung (20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0; 6 M Guanidin/HCl; 5 mM
EDTA; 4 mM DTT) eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Pufferlösungen die
Lösungen 1 bis 24 gemäß der Tabelle zur Zusammensetzung der Rückfaltungspuffer bzw.
weitere Kombinationen mit den aufgeführten Parametern eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Subtilisin zugesetzt
wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Thermolysin
zugesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Chymotrypsin
zugesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Trypsin zugesetzt
wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease SV8-Protease
zugesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Protease und Substrat in einem
Verhältnis von 1 : 50 bis 1 : 1000 eingesetzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Protease und Substrat in einem
Verhältnis von 1 : 100 eingesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit der Protease
50 bis 150 min durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit der Protease
100 min durchgeführt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteolyse durch Zugabe
von PMSF gestoppt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteolyse durch Zugabe
von Pefabloc® gestoppt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Faltungszustand durch
SDS-PAGE-Gele festgestellt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die SDS-PAGE-Gele durch
eine Silberfärbung angefärbt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Faltungszustand durch
Kapillarelektrophorese festgestellt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Faltungszustand durch
Massenspektroskopie festgestellt wird.
20. Testkit bestehend aus
20-100 Pufferlösungen
einer entsprechenden Anzahl von Reaktionsgefäßen
einer entsprechenden Anzahl von Dialyseeinheiten
ausgewählten Proteasen
SDS-PAGE-Gele
Laufpuffer für die Gelelektrophorese.
20-100 Pufferlösungen
einer entsprechenden Anzahl von Reaktionsgefäßen
einer entsprechenden Anzahl von Dialyseeinheiten
ausgewählten Proteasen
SDS-PAGE-Gele
Laufpuffer für die Gelelektrophorese.
21. Vorrichtung zur Durchführung eines automatisierten Verfahrens umfassend
Pipettierroboter
Multititerplatten
seriellen Dialyseeinheiten
Chips für die Kapillarelektrophorese.
Pipettierroboter
Multititerplatten
seriellen Dialyseeinheiten
Chips für die Kapillarelektrophorese.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000154059 DE10054059A1 (de) | 2000-10-31 | 2000-10-31 | Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine |
| AU2002215827A AU2002215827A1 (en) | 2000-10-31 | 2001-10-31 | Method for determining folding conditions for recombinant proteins |
| PCT/DE2001/004077 WO2002037116A1 (de) | 2000-10-31 | 2001-10-31 | Verfahren zur ermittlung von faltungsbedingungen für rekombinante proteine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000154059 DE10054059A1 (de) | 2000-10-31 | 2000-10-31 | Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10054059A1 true DE10054059A1 (de) | 2002-05-08 |
Family
ID=7661739
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE2000154059 Withdrawn DE10054059A1 (de) | 2000-10-31 | 2000-10-31 | Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine |
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU741049B2 (en) * | 1996-05-09 | 2001-11-22 | Life Technologies Corporation | Microplate thermal shift assay and apparatus for ligand development and multi-variable protein chemistry optimization |
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- 2000-10-31 DE DE2000154059 patent/DE10054059A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-10-31 WO PCT/DE2001/004077 patent/WO2002037116A1/de active Application Filing
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002037116A1 (de) | 2002-05-10 |
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