DE10054059A1 - Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine - Google Patents

Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine. Anwendungsgebiete dieses Verfahrens sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. DOLLAR A Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, schnell und ohne vorhergehende Aufreinigungsschritte zu überprüfen, welche Pufferbedingungen für eine Regeneration der Faltung von Proteinen am geeignetsten sind. Das Verfahren soll weiterhin mit sehr geringem Materialaufwand realisierbar und unabhängig von der biochemischen Funktion des Proteins einsetzbar sein. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß nach einer Expression erhaltene rekombinante Proteine in chaotropen Reagenzien gelöst werden und mindestens 20 Aliquote dieser Lösung mit verschiedenen Pufferlösungen versetzt werden. Danach werden die Lösungen dialysiert und auf das Zehnfache konzentriert. Anschließend wird Protease in geringer Konzentration zugesetzt, inkubiert und abschließend der Faltungszustand der Proteine festgestellt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine. Anwendungsgebiete dieses Verfahrens sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Die heterologe Produktion von Proteinen in dem prokaryotischen Wirt Escherichia coli ist eine sowohl in der Forschung als auch in der industriellen Produktion weit verbreitete Technik. In den meisten Fällen wird das Protein von den Ribosomen jedoch nicht in einer löslichen, nativen Konformation freigesetzt, sondern bildet hochmolekulare Aggregate und akkumuliert in sogenannten inclusion bodies. Daher gibt es einen Bedarf zur Entwicklung von Methoden, die es ermöglichen, diese Proteine in Lösung zu bringen und ihre biologisch aktive Faltung zu regenerieren1,2. Obwohl es schwierig ist, die jeweiligen Faltungsbedingungen herauszufinden, hat der Weg über inclusion bodies im Vergleich zur cytoplasmatischen oder periplasmatischen Akkumulation auch eine Reihe von Vorteilen. So kann das Protein in großer Menge produziert werden, indem das entsprechende Gen unter Kontrolle eines starken Promotors exprimiert wird. Unter diesen Bedingungen neigt das produzierte Protein außerdem weniger zu proteolytischer Degradation und seine potentielle Toxizität für die Wirtszelle ist erniedrigt. Zusätzlich kann das Protein schnell durch einfache Wasch- und Zentrifugationsschritte gereinigt werden, wodurch der Gebrauch von Affinitätsmarkierungen (affinity tags) überflüssig wird.
Die geschilderten Vorteile werden allerdings nutzlos, wenn keine geeigneten Faltungsbedingungen gefunden werden können.
In den vergangenen Jahren wurden bei der Etablierung allgemeiner Bedingungen für die Proteinfaltung beachtliche Fortschritte gemacht3. Dies führte in einigen Fällen zur Entwicklung von käuflich zu erwerbenden Kits, die dem Screening von Faltungsbedingungen dienen4,5. Die Anwendung dieser Kits wird allerdings dadurch beeinträchtigt, daß es beim Fehlen eines für das entsprechende Protein spezifischen enzymatischen oder biologischen Assays schwierig festzustellen ist, ob die Faltung erfolgreich war oder nicht.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, schnell und ohne vorhergehende Aufreinigungsschritte zu überprüfen, welche Pufferbedingungen für eine Regeneration der Faltung von Proteinen am geeignetsten sind. Das Verfahren soll weiterhin mit sehr geringem Materialaufwand realisierbar und unabhängig von der biochemischen Funktion des Proteins einsetzbar sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren realisiert die Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine durch partielle Proteolyse von in chaotropen Reagenzien gelösten Proteinen, es wird im folgenden als FSAP (folding screening assayed by proteolysis) bezeichnet. Dazu werden die rekombinanten Proteine nach einer Expression in beispielsweise E. coli zunächst in chaotropen Reagenzien gelöst, anschließend werden mindestens 20 Aliquote dieser Lösung mit verschiedenen Pufferlösungen versetzt. Anschließend werden die verschiedenen Lösungen dialysiert und auf das Zehnfache konzentriert. Danach wird Protease in geringer Konzentration zugesetzt und inkubiert. In Abhängigkeit von ihrem Faltungszustand sind die Proteine vor dem proteolytischen Verdau in unterschiedlichem Maße geschützt: Je vollständiger die Faltung, desto höher ist die Resistenz gegen eine Spaltung durch die Protease. Der Grad der Intaktheit bzw. der Spaltung der Proteine läßt sich anschließend nachweisen und ist ein indirektes Maß für deren Faltungszustand.
Als chaotropes Reagenz kann eine 7,5 M Harnstofflösung oder eine 6 M Guanidin/HCl- Lösung (20 mM Tris/HCl-Puffer; pH 8,0; 6 M Guanidin/HCl; 5 mM EDTA; 4 mM DTT) eingesetzt werden. Die verschiedenen Pufferlösungen werden variiert mit
  • - unterschiedlichen Stabilisierungszusätzen wie Salzen, Zuckern oder chaotropen Reagenzien wie Arginin,
  • - unterschiedlichen zweiwertigen Kationen wie Mg2+, Ca2+ oder Cu2+,
  • - unterschiedlichen Redoxzusätzen wie GSSG, GSH und DTT und
  • - unterschiedlichen pH-Werten.
Die Wahl der Protease ist gemäß der Erfindung nicht limitiert. Neben der in den Beispielen aufgeführten Verwendung von Subtilisin sind auch andere für partielle Proteolyse gebräuchliche Proteasen wie Thermolysin, Chymotrypsin, Trypsin und SV8-Protease anwendbar. Protease und Substrat werden bevorzugt in einem Verhältnis von 1 : 50 bis 1 : 1000 bei einer Inkubationszeit von bevorzugt 50 bis 150 min eingesetzt. Als besonders günstig haben sich ein Verhältnis Protease zu Substrat von 1 : 100 und eine 100minütige Inkubation erwiesen. Die Proteolyse wird durch Zugabe von beispielsweise PMSF oder Pefabloc® gestoppt. Der Grad der Spaltung der Proteine wird schließlich durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) in Kombination mit einer Silberfärbung nachgewiesen. Alternativ sind andere Methoden zur Proteindetektion möglich wie z. B. Kapillarelektrophorese oder Massenspektroskopie.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es zum ersten Mal gelungen, die partielle Proteolyse erfolgreich einzusetzen, um die Faltungsbedingungen für neue Proteine schnell abzuleiten.
Ein Hauptvorteil des Verfahrens liegt in der Tatsache, daß sie eine schnelle Screeningmethode bereit stellt, die zwischen falsch gefaltetem und einem dem nativen Protein ähnlichen Faltungszustand unterscheidet, ohne daß zuvor ein spezifischer biologischer Assay zur Überprüfung der Proteinfunktion etabliert werden muß. Im Gegensatz zu biophysikalischen Methoden, wie der dynamischen Lichtstreuung (dynamic light scattering) und Zirkulardichroismusmessungen (circular dichroism measurements), die herkömmlicherweise benutzt werden, um den Faltungszustand von Proteinen zu bestätigen, ist die FSAP-Methode nicht von einer konformellen Einheitlichkeit der Lösung abhängig und kann auch auf Gemische von dem nativen Protein ähnlichen und falsch gefaltetem Proteinen angewandt werden. Besonders vorteilhaft ist die geringe Menge an Protein, die für das Screening benötigt wird (ca. 10 µg zum Testen einer Pufferbedingung), die es erlaubt, beliebig viele Rückfaltungspuffer zu testen. Zusätzlich bietet die Methode die Möglichkeit einer leichten Automatisierbarkeit. Zu diesem Zweck können sowohl die Screeningmethoden zum Faltungszustand als auch der proteolytische Assay in großem Maß variiert werden. Beispielsweise kann leicht das Ziel verfolgt werden, Multititerplatten für die Renaturierung des Proteins in Kombination mit seriellen Dialyseeinheiten einzusetzen und eine online- Detektion der Produkte durch Kapillarelektrophorese oder Massenspektroskopie vorzunehmen. Durch dieses hohe Automatisierungspotential könnte die FSAP-Methode von besonderem Interesse für Projekte aus dem Bereich Siructural Genomics sein. Für diese ist eine systematische Produktion der Proteine eine unabdingbare Voraussetzung, da über die biologischen Funktionen und biophysikalischen Eigenschaften der individuellen Proteine nur begrenzte Kenntnisse zur Verfügung stehen.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. Hierfür wurden der angiogene Wachstumsfaktors VEGF (vascular endothelial growth factor) ausgewählt. VEGF ist ein homodimeres Protein und enthält als Strukturmotiv einen durch Disulfidbrücken gekennzeichneten Cysteinknoten6. Da VEGF ein ausgedehnter hydrophober Kern fehlt, nimmt man an, daß der Cysteinknoten wesentlich für die Stabilität des Proteins verantwortlich ist. Daher sollte es besonders schwierig sein, Bedingungen für die Rückfaltung von Mutanten von VEGF zu finden, in denen dieser Knoten partiell oder vollständig zerstört ist.
Zur Rückfaltung wurden vier Cystein-Deletionsmutanten hergestellt, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im VEGF-Protein des Wildtyps eine Disulfidbrücke bilden, durch Alanin ausgetauscht wurden. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens war es möglich, die Faltungsbedingungen für drei dieser vier möglichen Cystein-Deletionsmutanten von VEGF zu bestimmen (s. Abb. 1). Die so bestimmten Protokolle für die Rückfaltung der Proteine weichen vom VEGF-Wildtypprotokoll ab und können ohne zusätzliche Anpassungen für die Proteinproduktion im Milligramm-Bereich verwendet werden.
Herkunft der verwendeten Proteine
Es wurde ein pET-3d Vektor, in den das für die Aminosäuren 14 bis 108 codierenden Gen von humanem VEGF insertiert war, von der Firma Jerini Biotools GmbH (Adlershof) zur Verfügung gestellt. Die Punktmutationen für die vier verschiedenen Cystein-Deletions­ mutanten wurden unter Verwendung des QuikChange mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla) nach den Angaben des Herstellers generiert. Die das VEGF-Wildtypprotein enthaltenden inclusion bodies wurden in BL21 (DE3) Zellen (Novagen) produziert, während die Mutanten in größeren Ausbeuten in B834(DE3) Zellen in Coexpression mit GroES/GroEL in einem pREP4-Vektor hergestellt werden konnten, ohne daß während der Zellzucht spezifisch auf diesen Vektor selektiert wurde. Für jedes Konstrukt wurden jeweils sechs Liter LB-Medium (100 µg/ml Ampicillin enthaltend) mit der entsprechenden Übernachtkultur angeimpft und nach 3 Stunden Wachstum bei 37°C bis zu einer OD600 von ca 0,6 durch Zusatz von 1 mM IPTG induziert. Nach weiteren 4 Stunden bei 37°C wurden die Zellen abzentrifugiert (20 min., 5000 × g, 4°C) in 40 ml Tris-Puffer pH 7,5 mit 5 mM EDTA-Zusatz resuspendiert und mittels French Press aufgeschlossen (2 × 1000 bar). Die freigesetzten inclusion bodies wurden durch Zentrifugation (60 min., 12000 × g, 4°C) von Zelllysat abgetrennt und grob gereinigt (dreimal jeweils resuspendiert in obigen Aufschlusspuffer und erneut 30 min. abzentrifugiert).
Für die weitere Aufarbeitung der Mutanten wurden die so gereinigten Pellets in 20 ml Denaturierungs-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8,0; 6 M Guanidinium HCl; 5 mM EDTA; 4 mM DTT) aufgelöst und für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend wurden nicht gelöste Bestandteile abzentrifugiert (30 min., 46 000 × g, 4°C) und der Überstand bei -20°C gelagert. Für den Wildtyp wurde im Denaturierungspuffer statt 6 M Guanidinium HCl 7,5 M Harnstoff zum Auflösen des Pellets verwendet.
Zusammensetzung des Rückfaltungsscreens und Identifizierung geeigneter Bedingungen mittels limitierter Proteolyse
Für die Rückfaltungsversuche wurden 24 unterschiedliche Lösungen verwendet, von den 16 von einem Screen abgeleitet waren, der ursprünglich 1997 von Chen und Gouaux4 vorgeschlagen wurde (s. Tabelle). Diese 16 Lösungen wurden durch acht Variationen der für den VEGF-Wildtyp erfolgreichen Bedingung ergänzt.
Die aufgelösten inclusion bodies jeder Mutante wurden durch Verdünnen im Denaturierungs­ puffer auf eine Konzentration von ca. 1 mg/ml Protein (bestimmt über UV-Absorption bei 280 nm) eingestellt. Von dieser Lösung wurde jeweils ein 10 µl-Aliquot in 990 µl jeder der 24 Screen-Lösungen verdünnt, heftig geschüttelt und bei 4°C über Nacht inkubiert.
Am nächsten Tag wurden alle 24 Rückfaltungsansätze der einzelnen Mutanten 6 Stunden gegen 100 ml Proteolyse-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8.0) dialysiert und jede Probe auf ein Volumen von 100 µl konzentriert (Millipore Ultrafree Centrifugal Devices, MWCO 3,5 kDa, Millipore, Bedford). Zu den konzentrierten Ansätzen wurden jeweils 0,1 µg Subtilisin zugefügt (2 µl einer 0,05 mg/ml Lösung, Boehringer Mannheim, Mannheim), was einem Verhältnis von Protease zu Protein von 1 : 100 entspricht. Die Verdauansätze wurden 100 min bei Raumtemperatur inkubiert, der Abbruch erfolgte durch Inaktivierung der Protease mittels Zusatz von 1 µl einer 10 mM PMSF-Lösung. Anschließend wurden die Proben vakuum­ getrocknet, in Standard SDS-Ladepuffer gelöst und nach SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert.
VEGF-Wildtyp und die lösliche, mißgefaltete Mutante Cys26Ala/Cys68Ala als Referenz- Proteine
Der VEGF-Wildtyp wurde nach einem bekannten Protokoll zurückgefaltet: Die inclusion bodies wurden in 7,5 M Harnstoff aufgelöst und dann 1 : 10 in einer Lösung von 20 mM Tris/HCl pH 8,4 und 7 µM CuCl2 verdünnt. Diese ca 1 mg/ml Protein enthaltende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und das Protein anschließend mittels Ionenaustauscher-, hydrophober Interaktions- und Größenausschlußchromatographie weiter gereinigt. Bei dem Versuch, dasselbe Protokoll auf die Mutante Cys26Ala/Cys68Ala anzuwenden, wurde bei dem Rückfaltungsschritt ein lösliches Produkt erhalten, das sich nicht weiter aufreinigen ließ: Während der Ionenaustauscherchromatographie wurde die Mutante bei ungewöhnlich hohen Salzkonzentrationen eluiert und erschien verteilt über einen großen Bereich des Gradienten. Versuche, dieses Produkt über eine hydrophobe Wechselwirkung weiter zu reinigen, scheiterten völlig. In den weiteren Versuchen wurde dieses Produkt als Referenz für ungefaltetes lösliches Protein verwendet.
Nachweisgrenze der Methode
Um die Sensitivität dieser Methode zu überprüfen, wurden verschiedene Testmischungen aus gefaltetem Wildtypprotein und Protein der oben beschriebenen ungefalteten Mutante hergestellt, die einem Anteil von 0,5 oder 100% an gefaltetem Protein an der Mischung entsprachen. In allen drei Fällen wurden 100 µg Gesamtprotein in einem Volumen von 100 µl 20 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0 dem proteolytischen Verdau durch 1,0 µg Subtilisin ausgesetzt, wobei zu unterschiedlichen Zeiten 10 µl Aliquots entnommen wurden und nach kurzem Aufkochen mittels SDS-PAGE analysiert wurden.
Rückfaltungseffizienz in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration
Es wurde für drei unterschiedliche Proteinkonzentrationen die Effizienz der Rückfaltung der Mutante Cys61Ala/Cys104Ala bei Verdünnen von 10 µl gelösten inclusion bodies in Rückfaltungspuffer Nr. 10 (s. Tabelle) untersucht. Als Konzentrationen wurden 0,01, sowie 0,1 und 1,0 mg/ml gewählt, wobei in den ersten beiden Fällen die Konzentration an Guanidinium HCl im Rückfaltungsansatz 0,06 M, im letzten Fall jedoch aus praktischen Gründen 0,6 M war. Nach der Rückfaltung wurden jeweils gleiche Mengen an Protein (10 µg) entnommen, der Puffer ausgetauscht und die Probevolumina auf 100 µl aufkonzentriert, bevor die Proben dem proteolytischen Verdau mit Subtilisin ausgesetzt und anschließend mittels SDS-PAGE analysiert wurden.
Proteinproduktion und Reinigung im Milligramm-Maßstab
Dem Rückfaltungsschritt vorgeschaltet wurde eine erste Reinigung der aufgelösten inclusion bodies mittels Größenausschlusschromatographie unter denaturierenden Bedingungen (20 mM Tris/HCl pH 7,5; 6 M Guanidinium HCl; 4 mM DTT) über eine Sephacryl S200-Säule (Pharmacia, Uppsala), 20 ml der vereinigten Fraktionen (Proteinkonzentration ca. 1 mg/ml) wurden in 2 l Rückfaltungspuffer (50 mM Tris/HCl pH 8,2; 10,5 mM NaCl; 0,44 mM KCl, 1 mM EDTA; 0,3 mM Lauryl-Maltosid, 440 mM Sucrose, 1 mM GSH; 0,1 mM GSSG) verdünnt und über Nacht bei 4°C gerührt. Anschließend wurde die Lösung zweimal für 6 Stunden gegen 35 l eines 20 mM Tris/HCl Puffers pH 8,0 dialysiert und durch einen 0,2 µm- Filter filtriert. Das Protein wurde auf einer Q-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufkonzentriert und in einem NaCl-Gradienten von 0-1 M in 20 mM Tris/HCl pH 8,0 eluiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und auf ein Volumen von 1 ml aufkonzentriert welches abschließend durch Größenauschlußchromatographie über eine Superdex 75 Säule (Pharmacia) gereinigt wurde.
Kristallisation
Kristalle der drei Mutanten, für die eine Rückfaltungsbedingung gefunden werden konnte, wuchsen bei 20°C am hängenden Tropfen. 1 µl Proteinlösung (12 mg/ml Protein, 20 mM Tris/HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl) wurde mit 1 µl Reservoir-Lösung gemischt und das Dampfdruckgleichgewicht gegen 700 µl dieser Lösung eingestellt. Im Falle der Mutanten Cys51Ala/Cys60Ala und Cys61Ala/Cys104Ala bestand die Reservoir-Lösung aus 28% PEG 4000 (m/v), 12% Isopropanol (v/v) 100 mM Na-Citrat pH 5,6 und im Falle der Mutante Cys57Ala/Cys102Ala aus 2,0 M Na-Format und 0,1 M Na-Acetat pH 4,6.
Literatur
1. Lilie H et al. (1998) Curr Opin Biotechnol 9: 497-501.
2. Rudolph R und Lilie H (1996) FASEB J 10: 49-56.
3. Rudolph R et al. (1997) in Protein function, a practical approach (Hrsg. Creighton T E, IRL Press, Oxford) 57-99.
4. Chen G Q und Gouaux E (1997) PNAS 94: 13431-13436.
5. Armstrong N et al. (1999) Protein Sci 8: 1475-1483.
6. Muller Y A et al. (1997) Structure 5: 1325-1338.
Legenden Abb. 1
Skizze des VEGF-Dimeren, mit hervorgehobenem Cystein-Knoten. Die zwei Monomere, die das über Disulfidbrücken verknüpfte Homodimer bilden, sind in hell- und dunkelgrau dargestellt. Die mutierten Cysteine sind markiert. (Darstellung mit Hilfe der Programme MOLSCRIPT und RASTER3D)
Abb. 2
Faltungsbedingungen nach Tabelle 1 wurden mittels limitierter Proteolyse durchmustert und auf SDS-Gelen analysiert. Für die Mutante Cys51Ala-Cys60Ala können auf diese Weise mehrere positive Bedingungen identifiziert werden, während für die Mutanten Cys61Ala-Cys104Ala und Cys57Ala-Cys102Ala nur die Bedingungen Nr. 8 und Nr. 10 erfolgreich waren.
Abb. 3
Nachweisgrenze der Methode: Zeitaufgelöster Verdau mit einem Anfangsgehalt von 100, 95 und 0% mißgefaltetem Protein. Die Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, Faltungsbedin­ gungen zu identifizieren, selbst wenn die Rückfaltungsquote bei nur 5% des Ausgangsproteins liegt.
Abb. 4
Einfluß der Proteinkonzentration auf den Ertrag der Rückfaltung: Gleiche Mengen an Protein, die bei unterschiedlichen Konzentration in derselben Rückfaltungslösung renaturiert wurden, wurden nach limitierter Proteolyse mittels SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß mit steigender Konzentration des Proteins die Rückfaltungseffizienz abnimmt.
Abb. 5
Größenausschlußchromatographie der Mutante Cys61Ala-Cys104Ala, rechts oben ein Einkristall derselben Mutante.
Tabelle zur Zusammensetzung der Rückfaltungspuffer

Claims (21)

1. Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß
nach einer Expression erhaltene rekombinante Proteine in chaotropen Reagenzien gelöst werden,
mindestens 20 Aliquote dieser Lösung mit verschiedenen Pufferlösungen versetzt werden,
danach die Lösungen dialysiert und auf das Zehnfache konzentriert werden,
anschließend Protease in geringer Konzentration zugesetzt und inkubiert wird,
abschließend der Faltungszustand der Proteine festgestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotropes Reagenz eine 7,5 M Harnstofflösung (20 mM Tris/HCl, pH 7,5; 7,5 M Harnstoff; 4 mM DTT) eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotropes Reagenz eine 6 M Guanidin/HCl-Lösung (20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0; 6 M Guanidin/HCl; 5 mM EDTA; 4 mM DTT) eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Pufferlösungen die Lösungen 1 bis 24 gemäß der Tabelle zur Zusammensetzung der Rückfaltungspuffer bzw. weitere Kombinationen mit den aufgeführten Parametern eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Subtilisin zugesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Thermolysin zugesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Chymotrypsin zugesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Trypsin zugesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease SV8-Protease zugesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Protease und Substrat in einem Verhältnis von 1 : 50 bis 1 : 1000 eingesetzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Protease und Substrat in einem Verhältnis von 1 : 100 eingesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit der Protease 50 bis 150 min durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit der Protease 100 min durchgeführt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteolyse durch Zugabe von PMSF gestoppt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteolyse durch Zugabe von Pefabloc® gestoppt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Faltungszustand durch SDS-PAGE-Gele festgestellt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die SDS-PAGE-Gele durch eine Silberfärbung angefärbt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Faltungszustand durch Kapillarelektrophorese festgestellt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Faltungszustand durch Massenspektroskopie festgestellt wird.
20. Testkit bestehend aus
20-100 Pufferlösungen
einer entsprechenden Anzahl von Reaktionsgefäßen
einer entsprechenden Anzahl von Dialyseeinheiten
ausgewählten Proteasen
SDS-PAGE-Gele
Laufpuffer für die Gelelektrophorese.
21. Vorrichtung zur Durchführung eines automatisierten Verfahrens umfassend
Pipettierroboter
Multititerplatten
seriellen Dialyseeinheiten
Chips für die Kapillarelektrophorese.
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