DE19940012A1 - Neues Mittel aus mindestens zwei Komponenten, das zum einen Gefäßneubildung (Neoangiogense) induziert des weiteren jedoch auch Gefäßverschlüsse (Restenosen) verhindert, das Verfahren seiner Herstellung und seine Verwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eukaryotische Expressionsplasmide, die zum einen Gefäßneubildung (Neoangiogense) induzieren und des weiteren auch Gefäßverschlüsse (Restenosen) verhindern, das Verfahren ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Vermeidung einer peripheren arteriellen Verschlußkrankheit (pAVK).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eukaryotische Expressionsplasmide, die zum einen Gefäßneubildung (Neoangiogenese) induzieren und des weiteren auch Gefäßverschlüsse (Restenosen) verhindern, das Verfahren ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Vermeidung einer peripheren arteriellen Verschlußkrankheit (pAVK).

Die periphere arterielle Verschlußkrankheit (pAVK) ist eine häufige Komplikation des Diabetes mellitus. Die periphere arterielle Verschlußkrankheit beginnt mit der verminderten Durchblutung des betroffenen Gewebes, die u. a. zu verminderter Sauerstoffversorgung der Zellen führt (Ischämie). Nährstoffe gelangen nicht in ausreichenden Mengen zum Gewebe, toxische Stoffwechselprodukte, die unter diesen Bedingungen vermehrt entstehen, häufen sich an. Die Wundheilung ist gestört und kleine Verletzungen infizieren sich. Geschwüre (Ulcera) können entstehen. Im Rahmen der beschränkten Heilung entstehen kleinste Gefäßverschlüsse (Mikrothromben), die zu weiteren Gefäßverengungen führen. Blutgefäße des peripheren Systems werden durch Blutgerinnsel (Thromben) verschlossen und demzufolge gelangt das Blut nicht in nachgeschaltete Gefäße. So kommt es zu kompletten Gefäßverschlüssen (Occlusion, Infarkt), in deren Folge das betroffene Gewebe abstirbt (Nekrose). Häufig infiziert sich an Nekrosen angrenzendes Gewebe mit Bakterien.

Für den Patienten führt pAVK zunächst zu Ruheschmerz (Claudicatio intermittens) und anschließend zum Absterben von Beingewebe (ischämische Nekrose, Gangrän), ein Vorgang, der häufig von zahlreichen bakteriellen Infektionen begleitet wird und mit der Amputation der Extremität endet.

Liegt der Verschluß des Gefäßes im Oberschenkelbereich, so können die betroffenen Gefäße großen Durchmessers operativ durch Gefäßbypass oder durch Katheterdilatation für begrenzte Zeit wieder durchlässig gemacht werden. Bei der bei Diabetikern primär auftretenden pAVK des Unterschenkels (Jensen, L. et al., 1992, Eur. J. Vasc. Surg., 6(5), 533-539) ist dies jedoch aufgrund des geringen Gefäßdurchmessers nicht möglich.

Die Therapie des diabetischen Fußes wird entscheidend von dem Krankheitsbild des Patienten bestimmt. pAVK kann sowohl allein auftreten (60% aller diabetischen Füße) oder von einer Degeneration der Nerven des Fußes (Polyneuropathie) begleitet sein (30%, Creuzig, A. et al., 1991, Versicherungsmedizin 43, 154-158).

Bei Polyneuropathie sieht das Krankheitsbild wie folgt aus: Der diabetische Stoffwechsel führt unter anderem zu krankhaft vermehrter Hornhautproduktion am Fuß (Hyperkeratose, Bildung von Hornhautplatten häufig unter der Fußsohle). Durch die mechanische Belastung des Gewebes unter der Hornhautplatte kommt es zu Einblutungen, Wundhöhlen entstehen, die sich infizieren können. Ausgehend von infizierten Wundhöhlen kommt es zur Bildung von Geschwüren (Ulcera). Aufgrund der Degerneration der Nerven verursachen diese gefährlichen Veränderungen dem Patienten keine Schmerzen. Selten wird das unter einer Hornplatte liegende Gewebe durch den Druck allein nekrotisch (Drucknekrose).

Trotz unterschiedlicher Genese kann es sowohl bei pAVK als auch bei Polyneuropathie zur Entstehung von Geschwüren (Ulcera) kommen, die sich infizieren können. Möglich ist auch die Ausweitung der Infektion auf die Fußknochen (Osteomyelitis). Dem Stand der Technik entspricht das therapeutische Konzept nach Vollmar (1996, Rekonstruktive Chirurgie der Arterien, Thieme Verlag), das nachstehend nur auszugsweise beschrieben werden kann. Es basiert auf dem I-R-A-Grundsatz:

• - Infektionsbekämpfung (I)
• - Revaskularisation (R)
• - Amputation (A)

Zur Infektionsbekämpfung oder auch der Wundheilung wird infiziertes oder avitales Gewebe entfernt [mechanische Entfernung mit Skalpell, biochemische Entfernung mit enzymhaltigen Salben (Fibrolan®/Parke Davis)]. Die bakterielle Entzündung wird zusätzlich durch abstrichkontrollierte intravenöse oder orale Applikation von Antibiotika eingedämmt, damit ein sauberer, nicht infizierter Wundgrund als Basis für anschließende Therapiemaßnahmen vorliegt. Durch die Entfernung des avitalen oder infizierten Gewebes können tiefe Wundhölen entstehen. Der Gewebsverlust muß durch körpereigenes Ersatzgewebe ausgeglichen werden. Dessen Bildung wird durch granulationsfördernde Primärwundverbände (Hydrokolloid-, Alginat- oder Kieselsäuregelverbände) und im Rahmen neuer Therapieansätze durch Arginin- Glycin-Asparaginsäure-Matrix (Steed, D. L. et al., 1995, Diabetes Care, 18(1), 39-46) oder wachstumsfaktor-haltige Salben (Seed, D. L., 1995, J. Vasc. Surg., 21, 71-81//PDGF-Salbe Becaplermin (Syn. Regranex®)/Janssen-Cilag) verstärkt. Ebenfalls eingesetzt wird eine Therapie, die dreidimensionale Fibroblastenkulturen in Wundhölen einbringt, um deren Heilung zu verstärken (Mansbridge, J. et al., 1998, Tissue Eng., 4(4), 403-414).

Wann die Wiedereröffnung von verengten oder verschlossenen Blutgefäßen (Revaskularisation) erfolgt, ist eine Fallentscheidung des behandelnden Arztes. Es kann möglich und notwendig sein, die Revaskularisation vor oder zeitgleich zur Infektionsbekämpfung vorzunehmen, da nur die ausreichende Blutversorgung eine Heilung des infizierten Bereiches ermöglicht. Ist der Bereich der Verengung/des Verschlusses jedoch mit dem infizierten Bereich identisch, so ist der operative Eingriff erst nach beendeter Infektionsbekämpfung möglich.

In jedem Fall ist die Wiederherstellung einer guten Durchblutung notwendig, um weitere Infekte und Nekrosen zu verhindern. Die Wahl geeigneter operativer Maßnahmen hängt von dem Gesamtbefund des Patienten ab. Im folgenden soll nur ein nicht falldifferenzierter Überblick über die derzeit eingesetzten Maßnahmen gegeben werden.

Die Revaskularisation verengter Gefäße erfolgt gemäß dem Stand der Technik mittels Gefäßaufdehnung durch kurzzeitiges Einbringen von Kathetern (Angioplastie: z. B. Rotations- oder Laserangioplastie (Scholz, A. P. et al., 1992, Angio., 14, 75-79), und gegebenenfalls durch das anschließende Einsetzen einer Spirale in die vorher gedehnte Engstelle (Stent). Alternativ wird operativ ein Zusatzgefäß eingeführt, welches die vorliegende Engstelle umgeht (Bypass: Jensen, L. et al., 1992, Eur. J. Vasc. Surg., 6(5), 533-539). Liegen Gefäßverschlüsse (Occlusionen) vor, wird zunächst eine lokale Thrombolyse durchgeführt, bevor die angioplastische Maßnahme beginnen kann (Hess, H., 1989, Kardiovaskuläre Erkrankungen, 12-21).

Die Revaskularisation kleiner Gefäße erfolgt nach konservativen Methoden mittels lokaler Thrombolyse. Thrombolyse bezeichnet die Infusion von Enzymen, welche einen Gefäßverschluß auflösen können (Streptokinase, Urokinase, Plasminogen-Gewebsaktivator (r-tPA): Weichenhain, B. et al., 1996. Der diabetische Fuß, Hrsg. W. Hepp, Backwell- Wissenschaft, 49-55). Sie wird in Kombination mit angioplastischen Maßnahmen für große Gefäße (Stiegler, H. et al., 1987, Akt. Endokrinol. Stoffw. 8, 40-43) oder allein zur Revaskularisation kleinerer Gefäße eingesetzt (Weichenhain, B. et al., 1996. Der diabetische Fuß, Hrsg. W. Hepp, Backwell-Wissenschaft, 49-55).

In einer Studie an acht Patienten konnte durch lokale Thrombolyse die Durchblutung bei sechs Patienten kurzfristig verbessert werden. Langfristig (innerhalb eines Jahres) mußten jedoch vier von ihnen operativ revaskularisiert werden (Vannini, P. et al., 1991, Diabetes Care, 14(10), 925-927). Die Restenosewahrscheinlichkeit dieses Verfahrens ist also ebenfalls hoch. Eine weitere Grenze der lokalen Thrombolyse wird bei langen Occlusionen deutlich. Ist die Occlusion länger als 16 cm, so ist die Revaskularisierungswahrscheinlichkeit mit 66% für Diabetiker deutlich geringer als jene der Kontrollpatienten (88%). Ein Verhältnis, welches auch für die Langzeitrevaskularisation gilt (Diabetiker 55%; Kontrollgruppe 77%: Stiegler, H. et al., 1990, Med. Klin., 85(4), 171-175). Zusätzlich ist für den Thrombolyseprozess das Alter des Verschlusses von Bedeutung. Nur Thromben, die jünger als 12 Monate sind, können enzymatisch aufgelöst werden (Weichenhain, B. et al., 1996. Der diabetische Fuß, Hrsg. W. Hepp, Backwell-Wissenschaft, 49-55).

Zusammenfassend bleibt festzuhalten:

• - Auch Fibrinolyse kann Restenose oder Reocclusion nicht verhindern, meist muß eine invasive Revaskularisierung nachgeschaltet werden.
• - Geringe Revaskularisierungswahrscheinlichkeiten bei alten Thromben (älter als 12 Monate) und langen Occlusionen (< 16 cm).

Sind großlumige Gefäße von Verengung oder Verschluß betroffen, z. B. koronare oder großlumige Beingefäße beim diabetischen Patienten, werden operative Maßnahmen (Angioplastie mit und ohne Stent (Scholz, A. et al., 1992, Angio., 14, 75-79) oder Bypass- Operationen (Jensen, L. et al., 1992, Eur. J. Vasc. Surg., 6(5), 533-539) eingeleitet.

Begleitend zu allen Verfahren kann systemische Pharmakotherapie eingesetzt werden, die das Verschlußrisiko durchgängiger Gefäße verringern soll. Für Verschlüsse kleiner Gefäße (unterhalb des Knies) ist sie oftmals die einzige Behandlungsmöglichkeit (Weichenhain, B. et al., 1996, Der diabetische Fuß, Hrsg. W. Hepp, Backwell-Wissenschaft, 49-55). Sie verändert Eigenschaften des Blutes durch die orale Applikation bestimmter Substanzgruppen:

Eigenschaft	Substanzklasse
Erhöhte Flußgeschwindigkeit	Durchblutungsfördernde Mittel
Verringerte Aggregations-Thrombosewahrscheinlichkeit	Gerinnungshemmer
Weitstellung der Gefäße	Vasodilatoren

Die systemische Pharmakotherapie hat zwei entscheidende Nachteile:

• - Sie wirkt unselektiv auf den gesamten Körper, eine Tatsache, die ihren Einsatz deutlich begrenzt. So werden durch Vasodilatoren (z. B. Prostaglandin E1) noch zur Regulation befähigte Gefäße weitgestellt. Sie transportieren mehr Blut in nicht mehr regulierbare, erkrankte Gefäßbereiche oder ischämische kapillardurchzogene Gewebe. Da das erhöhte Blutvolumen in den Bereich, in welchem es besonders benötigt wird, nicht eingeleitet werden kann, dient es nicht zur Versorgung des z. B. ischämischen Bereiches, sondern wird abgeleitet (Steal-effect). Aufgrund dieser Phänomene wird die Therapie z. B. mit Prostaglandin E1 kontrovers diskutiert. Erhält ein Patient mit generalisierter Arteriosklerose eine systemische Pharmakotherapie, so führt die Gefäßerweiterung zum Lungenödem.

Kleine, verengte oder bereits verschlossene Gefäße sind für die eingesetzten Pharmaka nicht zugänglich, da sie von der Blut- und somit Medikamentenversorgung weitgehend oder völlig abgeschnitten sind.

Die bislang bekannten Spleißvarianten des humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF₂₀₆, VEGF₁₈₉, VEGF₁₆₅, VEGF₁₂₁: Houck, K. et al., 1991, Mol. Endocrinol.; 5, 1806-1814), werden seit 1994 zur Induktion von Neoangiogenese eingesetzt, die zunächst an Tieren untersucht wurde (Takeshita, S. et al., 1992, J. Clin. Invest., 93 (2), 662-670) und später auch klinisch zum Einsatz kam (Isner, J. M. et al. 1996, Lancet 348, 370- 374).

Die Gefahr eines erneuten Gefäßverschlusses (Thromboserisiko) wird durch orale Applikation von Gerinnungshemmern (Marcumar®, Roche) reduziert. Eine Weltstellung der Gefäße (zur besseren Blutversorgung) wird durch oralen Einsatz von vasodilatierenden Medikamenten erreicht (Prostaglandin E1/Prostavasin, Schwarz-Pharma). Da bei Diabetikern pAVK zumeist jedoch die Gefäße des Fußes oder des Unterschenkels betrifft (< 90%, Jensen, L. et al., 1992, Eur. J. Vasc. Surg., 6(5), 533-539), also Gefäße, die selten mittleren und zumeist kleinen Durchmessers sind, sind operative gefäßrekonstruktive Maßnahmen nur bedingt möglich.

Die diabetische Grunderkrankung führt jedoch mit hoher Wahrscheinlichkeit zu Wiederverengungen (Restenose) oder Wiederverschlüssen (Occlusionen), welche die Rekanalisationsrate in der Langzeitbetrachtung deutlich vermindern und häufig zu Folgeoperationen führen (Stiegler, H. et al., 1987, Akt. Endokrinol. Stoffw., 8, 40-43; Field, C. K. et al., 1995, J. Diabetes Complications, 9(3), 186-189; Strunk, H. et al., 1991, Rofo. Fortschr. Geb. Röntgenstr. Neuen Bildgeb. Verfahr., 154(3), 315-320, Asakura, Y. et al., 1998, J. Cardiovasc. Risk, 5(5-6), 331-334; Lau, K. W., 1998, Am. Heart J., 136(1), 150-155).

Ähnlich limitiert wie Angioplastie allein, ist auch Angioplastie mit angeschlossener Stentbehandlung. Auch bei dem Einsatz von Stents wächst die Restenosewahrscheinlichkeit proportional zu der Verkleinerung des Gefäßdurchmessers (max.: poplietale Angioplastie, Reocclusion nach fünf Jahren 100%; Lau, K. W. et al., 1998, Am. Heart J., 136(1), 150-155). Der Einsatz von Bypass-Operationen bei diabetischen Patienten weist ebenfalls die gleiche Problematik auf (Detre, K. M, et al., 1999, Circulation, 99(5), 633-640).

Gelingt die Wiederherstellung der guten Durchblutung nicht, droht als letztes Mittel der konventionellen Therapie kurz- oder langfristig die Amputation des Fußes/Beines. Sie bewahrt den Patienten davor, durch Ausweitung der Infekte in einen septischen Allgemeinzustand zu geraten, der häufig zum Tod führt.

Die Amputation dient der Bekämpfung von Fußinfekten und der Schaffung belastungsfähiger Stümpfe unter der Prämisse, möglichst große Teile des Fußes zu erhalten. Diese Grenzzonenamputation ist jedoch nur selten erfolgreich. Wundheilungsstörungen und Wundinfektionen, beides gefördert durch schlechte Durchblutung, zwingen zu Nachamputationen. Häufig werden schließlich Amputationen des kompletten Unter- oder Oberschenkels (Majoramputationen) vorgenommen, die zu einer 15-25% Krankenhaussterblichkeit der Patienten führen (Greitemann, B. & Baumgartner, R., 1993, Orthopäde, 23, 80-87/Paetow, P., 1991, Prävention und Rehabilitation, 3, 112-118). Nach einseitigen großen Amputationen können weitere 15-25% der Patienten nicht rehabilitiert werden; über 30% der Beinstümpfe sind auf Dauer nicht belastbar (Falkenberg, M., 1990,. Scand. J. Prim. Health Care, 8, 25-29). 40% der einfach Beinamputierten verlieren das zweite Bein innerhalb der folgenden 1-3, 55% innerhalb der folgenden 3-5 Jahre (Levin, M. E., Peripheral vascular disease in the diabetic patient, Diabetes Mellitus editors Porte, D., Jr., Sherwin, R. S., Appleton & Lange, 1997).

Zusammenfassend bleibt festzuhalten:

• - Daß die Gefäßöffnung durch operative Eingriffe in großlumige Gefäße bei der Therapie des diabetischen Fußes/Beines nicht sicher erreicht werden kann.
• - Daß die operative Gefäßöffnung für den Großteil der diabetischen Stenosen und Occlusionen als Behandlungsmöglichkeit ausscheidet, da über 90% der Ereignisse am Unterschenkel und somit an kleinen Gefäßen auftreten (Jensen, L. et al., 1992, Eur. J. Vasc. Surg., 6(5), 533-539).
• - Daß die Wahrscheinlichkeit einer Restenose oder erneuter Occlusion mit zunehmender Länge der initialen Occlusion und mit abnehmendem Durchmesser des Gefäßes wächst. Die Reocclusionswahrscheinlichkeit beträgt selbst für große Gefäße ab 10 cm Initial- Occlusionslänge nur 24 Monate nach der Operation 100%. Somit erfolgt durch den operativen Eingriff nur eine kurz- bis mittelfristige Lösung des Problems.
• - Daß die Restenosewahrscheinlichkeit eines Diabetikers wesentlich höher ist als jene eines nicht-diabetischen Patienten. Zudem entstehen bei Diabetikern im Zeitraum der Restenosebeobachtungen neben Restenosen zunehmend auch neue Stenosen am behandelten Gefäß (18% aller Stenosen innerhalb eines Jahres). Bei nicht-diabetischen Patienten gibt es nur 10,5% neue Stenosen im gleichen Beobachtungszeitraum (Rozenmann, Y. et al., 1997, J. Am. Coll. Cardiol., 30(6), 1420-1425).

Zusätzlich treten folgende Nachteile auf:

• - Die Infektionsgefahr des diabetischen Beines während und nach der operativen Revaskularisation ist erhöht (Webster, M. W. I. & Scott, R., 1997, Lancet, 350(S1), 23- 28). Entstehende Infektionen verursachen gemeinsam mit dem schlechten Allgemeinzustand des Diabetikers vor der Operation eine hohe postoperative Sterblichkeit bereits während des Krankenhausaufenthaltes (Oberschenkelamputationen 15-25%: Greitemann, B. & Baumgartner, R., 1993, Orthopäde, 80-87). Die Sterblichkeitsrate nach einem Jahr liegt bei 50%, nach 5 Jahren leben noch 15-20% der Patienten (Diehm, C. et al., 1996, Der diabetische Fuß, Hrsg. W. Hepp, Backwell-Wissenschaft, 57-68)
• - Die Wundheilung ist bei diabetischen Patienten verschlechtert, was zu langen Krankenhausaufenthalten im Zusammenhang mit operativen Eingriffen führt (Curie, C. J. et al., 1998, Diabetes Care, 21, 42-46).
• - Die operative Revaskularisation eröffnet pro Eingriff maximal ein Gefäß. War ein großes Gefäß verschlossen, so kann dies die Blutversorgung des gesamten Fußes oder Beines wieder herstellen. Befindet sich die Stenose oder Occlusion im Bereich kleinerer Gefäße, so reicht die Revaskularisation eines Gefäßes nicht aus, da kleinere Gefäße nur Teilbereiche des Fußes/Beines mit Blut versorgen. Um in diesem Fall Erfolge zu erzielen, müssen mehrere Eingriffe erfolgen, was zur Multiplikation der oben genannten Risikofaktoren führt.

Die periphere arterielle Verschlußkrankheit (pAVK) tritt jedoch nicht ausschließlich bei Diabetikern auf. Sie kann ebenfalls durch chronischen Arterienverschluß (z. B. infolge von Arteriosklerose (begünstigt durch erhöhten Blutdruck und/oder Hyperlipidämie), Gefäßkrämpfe (Raynaud Syndrom) oder Thrombangiitis obliterans) verursacht werden. Die Folgen der pAVK und auch ihre Behandlung entsprechen jener Therapie, die bereits für Diabetiker beschrieben wurde. Für nicht-diabetische pAVK-Patienten führt die konventionelle Therapie nicht zu befriedigenden Ergebnissen: 150000 Patienten pro Jahr verlieren in den USA durch nicht-diabetische pAVK ein Bein (Dormandy J. A. & Thomas, PRS., 1988, Limb Savage and Amputation for Vascular Disease, ed. by Greenhalgh et al., 11-26), und die postoperative Sterblichkeit beträgt 10-20% (Second European consensus document on chronic critical leg ischemia, 1991, Circulation, 84, IV, 1-26).

Aus diesem Grund erarbeitete die Arbeitsgruppe um Jeffrey M. Isner (St. Elizabeth's Medical Center of Boston Inc. USA mit den angegliederten Firmen Genentech Inc. und CATO) eine alternative Gentherapie. Sie setzen einen nicht-viralen Vektor ein, welcher einen CMV- Promotor vor der Sequenz des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors VEGF₁₆₅ enthält (im Detail beschrieben in WO 97/14307 und US-A 9616723) und induzieren die Neubildung von Gefäßen (Neoangiogenese), um Gefäßverschlüsse zu umgehen (Isner, J. M. et al., 1996, Hum. Gene. Therap., 7, 959-988).

Zunächst wurde das CMV-VEGF₁₆₅-Plasmid auf einem hydrogelbeschichteten Angioplastieballon in ein verengtes und mechanisch zu dehnendes Gefäß eingebracht. Das Plasmid wurde in die Zellen aufgenommen, und das exprimierte VEGF₁₆₅-Gen inhibierte nach einer Gefäßdehnung bei Nicht-Diabetikern die ansonsten auftretende Verdickung der Neointima und führte zur Bildung neuer Gefäße. Diese Methode wurde später mit gleichen Ergebnissen bei nicht vorgeschädigten Gefäßen größeren Durchmessers eingesetzt (Behandlungsprotokoll: Isner, J. M. et al., 1996, Hum. Gene. Therap., 7, 959-988, Ergebnisse (klinisch): Isner et al., 1996, Lancet 348, 370-374, Ergebnisse (präklinisch): Asahara et al., 1995, Circulation, 91, 2793-2801). Das Verfahren ist als Revaskularisierung nach einem angioplastischen Eingriff unter WO 97/12519 und US-A 5830879 geschützt.

Seit 1997 wird das VEGF-codierende Plasmid intramuskulär in sauerstoffunterversorgtes (ischämisches) Gewebe injiziert (Baumgartner, I. et al., 1998, Circulation, 97, 1114-1123). Auch diese Methode führt zur Neoangiogenese, wie in präklinischen (Tsurumi, Y., 1997, Circulation, 96(SII), 382-388) und auch in klinischen Studien (Baumgartner, I. et al., 1998, Circulation, 97, 1114-1123) gezeigt werden konnte. Das Verfahren ist Bestandteil von WO 97/14307 und US-A 5830879.

Mit beiden Verfahren wird Neoangiogenese als Revaskularisationsmaßnahme sowohl im peripheren Gewebe (Isner, J. M. et al., 1996, Lancet 348, 370-374) als auch im koronaren Bereich (Losordo, D. W. et al., 1998, Circulation, 98(25), 2800-2804) bei Nicht-Diabetikern erfolgreich induziert.

Eine identisch durchgeführte neoangiogenetische Therapie bei diabetischer pAVK wurde bislang nur für zwei Patienten veröffentlicht (Baumgartner, I. et al., Circulation, 1998, 97, 1114-1123). Acht Diabetiker sind in laufende VEGF₁₆₅-Studien eingeschlossen, der Therapieerfolg ist jedoch nicht mit jenem von Nicht-Diabetikern zu vergleichen (J. M. Isner, persönliche Mitteilung). Im Tierexperiment wurde der Erfolg der CMV-VEGF₁₆₅-Therapie bei diabetischer pAVK kürzlich mit jener nicht-diabetischer pAVK verglichen. Diabetische Mäuse reagierten auf Angiogenesestimulation (durchgeführt nach WO 9714307/US 9616723) nur halb so gut wie nicht-diabetische (Rivard, A. et al., 1999, Am. J. Pathol., 154, 355-363). In diesem Tierexperiment wurde die diabetesbedingt verschlechterte Therapiefähigkeit durch adenoviralen Gentransfer mit VEGF₁₆₅, also durch eine verstärkte Neoangiogeneseinduktion ausgeglichen. Ergebnisse zur Stabilität der neuen Gefäße liegen bislang nicht vor.

Diabetiker haben schlechtere Therapievoraussetzungen als Nicht-Diabetiker. Bei nicht insulinpflichtigen Diabetikern (NIDDM) sind bereits zum Zeitpunkt der Diabetesdiagnose Zeichen der peripheren arteriellen Erkrankung erkennbar. 22% haben periphere arterielle Verkalkung, bei 13% ist mindestens ein peripherer Puls nicht mehr tastbar und 5% hinken (University Group Diabetes Program. A study of hypoglycemic agents on vascular complications in patients with adult onset diabetes II. Mortality results. Diabetes, 1970: 19 (Suppl. 2), 789-815). Die diabetischen pAVK Patienten sind jünger als nicht-diabetische. Die Krankheit entwickelt sich schneller und betrifft sowohl an Verschlüsse angrenzende Gefäße, Gefäße beider unteren Extremitäten und Kollateralgefäße. Bei Nicht-Diabetikern sind an Occlusionen grenzende Gefäße nicht betroffen, pAVK manifestiert sich in der Regel nur in einer unteren Extremität und betrifft Kollateralgefäße nicht. (Lewin, M. E., O'Neal, L. W., Baker, J. H., eds., 1993, The Diabetic foot, Lous Mosby).

Diabetes führt zur verzögerten Wundheilung (Curie, C. J. et al., 1998, Diabetes Care, 21, 42- 46) und zu systemischen Komplikationen wie Lungenembolie, Herzinfarkt oder Nierenproblemen. Nach operativen Eingriffen kommt es leichter zu Infektionen (Webster, M. W. I. & Scott, R., 1997, Lancet, 350 (S1), 23-28) und die Restenoserisiken sind sowohl nach operativer (Koronar-Angioplastie: Van Beile, E., 1997, 96(5), 1454-1460) als auch nach konservativer Behandlung (lokale Thrombolyse: Stiegler, H., 1990, Med. Klin. 85(4), 171- 175) von Gefäßverengungen deutlich erhöht.

Ebenfalls ist die endogen induzierte Bildung kollateraler Gefäße sowohl im koronaren Bereich (Aronson, D. & Rayfield, E. J., 1998, Textbook of cardiovascular Medicine, ed. by E. J. Topol, Philadelphia, Lippincoll-Raven, 171-194) als auch im diabetischen Fuß/Bein (Towne, T. B. 1959, Management of foot lesions in the diabetic patient, Vascular Surgery, ed. by R. B. Rutherford, Philadelphia, Saunders) gestört.

Die experimentelle Therapie bringt das VEGF₁₆₅-Gen zum einen auf einem Angioplastieballon in durch Angioplastie beschädigte Arterien, später auf demselben Weg in unbeschädigte verengte Gefäße ein (Behandlungsprotokoll: Isner, J. M. et al., 1996, Hum. Gene Therap., 7, 959-988, Ergebnisse (klinisch): Isner et al., 1996, Lancet 348, 370-374, Ergebnisse (präklinisch): Asahara et al., 1995, Circulation, 91, 2793-2801). In geschädigten Gefäßen verhindert die VEGF₁₆₅-Expression eine Verdickung der Gefäßwand der behandelten Stelle (WO 97/12519 A1/US-A 5830879).

Dieser Therapieansatz läßt sich auf zahlreiche Verschlüsse von Diabetikern nicht übertragen, da diese in Gefäßen liegen, deren Lumen für operative Maßnahmen und somit den angioplastievermittelten Einsatz von VEGF₁₆₅ zu klein ist.

Sollte der Verschluß in einem angioplastiegeeigneten Gefäß vorliegen, ist zu beachten, daß beim diabetischen Gefäß deutlich stärker als beim nicht-diabetischen Gefäß neben einer wesentlich größeren Anzahl an Restenosen (siehe Tabelle 1a) auch deutlich mehr neue Verschlüsse im behandelten Gefäß entstehen. Die an den vormals verschlossenen Bereich angrenzenden Gebiete werden bei dieser Therapie jedoch nicht mit VEGF₁₆₅ behandelt. Der zweite Weg der CMV-VEGF₁₆₅-Therapie ist die intramuskuläre Injektion des Plasmides in den ischämischen Bereich des Beines (oder des Herzens). Für diese Methode liegen Veröffentlichungen vor, die die Vaskularisierung der behandelten Bereiche im nicht- diabetischen System betrachten (präklinisch: Tsurumi, Y. et al., 1997, Circulation, 96(S2), 382-388/klinisch: Baumgartner, I. et al., 1997, Circulation, 97, 1114-1123), nicht jedoch die Restenosehäufigkeit der neuen Gefäße. Diese müßte jedoch nach dem Stand der Technik bei Diabetikern deutlich erhöht sein, was zum einen das Wachstum von neuen Gefäßen reduzieren wird und zusätzlich den Bestand neuer Gefäße gefährden kann.

Bislang wurde der Verlauf der CMV-VEGF₁₆₅-Therapie (WO 97/14307/US-A 9616723) bei diabetischer pAVK von Isner et al. nur für zwei Diabetiker beschrieben. In laufende Studien sind acht Diabetiker integriert, bei welchen die CMV-VEGF₁₆₅-Therapie jedoch nicht so erfolgreich ist wie bei nicht-diabetischen pAVK-Patienten (persönliche Mitteilung J. M. Isner). Die Ursachen sind in diesem Bereich noch ungeklärt.

Eine Studie an Typ-I-diabetischen Mäusen belegt die unterschiedliche Therapiefähigkeit diabetischer Mäuse im Vergleich zu nicht-diabetischen Tieren mit CMV-VEGF₁₆₅ (Rivard, A. et al., 1999, Am. J. Pathol., 154, 355-363). Diabetische Tiere zeigten deutlich geringere Angiogeneseraten in ischämischen Bereichen als nicht-diabetische Tiere. Es wurden bei diabetischen Tieren verringerte endogene VEGF-Spiegel festgestellt. Die Angiogeneserate konnte durch verstärkte exogene Zufuhr von viralem VEGF₁₆₅ ausgeglichen werden.

Bei einer Interpretation dieser Daten ist unserer Meinung nach zu beachten, daß der verringerte VEGF-Titer nicht den einzig in diesem Fall relevanten Unterschied zwischen diabetischen und gesunden Mäusen darstellt. Desweiteren wurden die ausschließlich angiogenetischen Daten nur bis zu 35 Tage nach VEGF₁₆₅-Applikation erhoben. Ein Zeitraum, in dem die Entstehung von Gefäßen, nicht jedoch deren Restenosewahrscheinlichkeit beurteilt werden kann.

Der virale Gentransfer des Wachstumsfaktors ist unserer Ansicht nach für den klinischen Einsatz nicht geeignet, da er gemeinhin zu wesentlich höheren Proteinsyntheseraten führt als der CMV-vermittelte Gentransfer und die Proteinexpression zeitlich länger auftritt. Zudem ist die Gefahr der Integration von Fremd-DNA in das Zellgenom höher. Für zu hohe lokale VEGF₁₆₅-Konzentrationen wurde eine lokal übermäßige Bildung von Gefäßen beschrieben (Spinnenförmiges Angionom: Isner et al., 1996, Lancet 348, 370-374). Desweiteren wird das übermäßige Thromboserisiko des Diabetikers bei dieser unifaktoriellen Therapie nicht berücksichtigt.

Zusammenfassend beinhaltet die experimentelle pAVK-Therapie mit VEGF₁₆₅ bei Diabetikern folgende Nachteile:

• - Die diabetische Grundsituation, die den Verlauf der pAVK maßgeblich beeinflußt, wird nicht berücksichtigt.
• - Es gibt in der bisherigen VEGF-Therapie keine Komponente, die das erhöhte Restenoserisiko der Diabetiker im Vergleich zu nicht-diabetischen Patienten berücksichtigt.
• - Der Therapieerfolg von CMV-VEGF₁₆₅ bei Diabetikern ist zweifelhaft.
• - Eine virale VEGF₁₆₅-Therapie ist für den klinischen Einsatz nicht unumstritten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, effektive Arzneimittel zur nicht-operativen Behandlung der pAVK des diabetischen Unterschenkels zu entwickeln, die Gefäßverschlüsse beheben oder zur Bildung neuer Umgehungsgefäße führen (angiogenetisch wirksam sind) und darüber hinaus der diabetischen Grunderkrankung des Patienten Rechnung tragen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Plasmide, enthaltend in jeweils getrennten Expressionskassetten je eine codierende Sequenz (Gen) für humanes VEGF₁₆₅ in Kombination mit mindestens einer codierenden Sequenz aus der Gruppe humanes Leptin, humanes Thrombomodulin (TM), humane Prostazyklinsynthase (PGI-S) und/oder humane konstitutive NO-Synthase (cNOS), ausgenommen der Kombination von VEGF₁₆₅ und der konstitutiven NO-Synthase sowie die codierende Sequenz für humanes Leptin in Kombination mit mindestens einer codierenden Sequenz aus der Gruppe humanes Thrombomodulin, humane Prostazyklinsynthase und/oder humane konstitutive NO-Synthase sowie weiterem humanen Leptin, diese Aufgabe lösen, was zur Induktion der Neoangiogenese bei Diabetikern führt, und im Bereich der Revaskularisation erhebliche Vorteile bietet. Die erfindungsgemäßen Plasmide oder deren Kombinationen induzieren Neoangiogenese (Gefäßneubildung) auch unter diabetischen Bedingungen und reduzieren diabetesbedingte Re- oder Neustenose. Ihre Wirkung ist nicht eingeschränkt durch das Alter oder die Länge der Verschlüsse sowie das Lumen des betroffenen Gefäßes. Operative Eingriffe werden vermieden, da die Plasmide injiziert werden können. Sie wirken nur im unmittelbaren Applikationsbereich.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Plasmide, enthaltend in jeweils getrennten Expressionskassetten je eine codierende Sequenz (Gen) für humanes VEGF₁₆₅ in Kombination mit mindestens einem Gen aus der Gruppe humanes Leptin, humanes Thrombomodulin, humane Prostazyklinsynthase und/oder humane konstitutive NO-Synthase, ausgenommen der Kombination von VEGF₁₆₅ und der konstitutiven NO-Synthase sowie ein Gen für humanes Leptin in Kombination mit mindestens einem Gen aus der Gruppe humanes Thrombomodulin, humane Prostazyklinsynthase und/oder humane konstitutive NO-Synthase sowie weiterem humanen Leptin.

Ein Plasmid im Sinne der Erfindung ist ein autonomes, selbstreplizierendes, extrachromosomales, ringförmiges DNA-Molekül variabler Größe, welches bevorzugt superspiralisiert eingesetzt wird. Es enthält einen spezifischen Startpunkt für seine eigene Replikation in Bakterien (Prokaryoten), den Origin "ORI". In den zur Erfindung gehörenden Plasmiden können die ORI-Sequenzen verschiedener Plasmide enthalten sein, z. B. pBR322, ColE1 oder pUC. Von uns werden der ORI pUC und ORI ColE1 bevorzugt eingesetzt. Damit die Bakterien, die das Plasmid beinhalten, von nicht-plasmidtragenden Bakterien unterschieden werden können, kann das Plasmid die codierende Sequenz verschiedener Resistenzgene tragen. Die Genprodukte vermitteln bakterielle Resistenz gegen Antibiotika wie z. B. gegen Kanamycin, Streptomycin, Tetrazyklin, Sulfonamid oder Penicillin/Ampicillin. Das erfindungsgemäße Plasmid enthält bevorzugt die codierende Sequenz des β-Lactamasegens. Das codierte Protein spaltet die ansonsten für Bakterien tödlichen Antibiotika Ampicillin/Penicillin.

Ein eukaryotisches Expressionsplasmid im Sinne der Erfindung ist ein Plasmid, das so konstruiert ist, daß es in prokaryotischen Wirtszellen (Bakterien) vermehrt werden kann und zudem mindestens eine Expressionskassette (bestehend aus einem Promotor/Enhancer- Bereich, einer codierenden Sequenz und einem Polyadenylierungssignal) enthält. Die codierende Sequenz wird aufgrund der Kassette in eukaryotischen Zellen in RNA transkribiert und in ein Protein translatiert. In der hier vorgestellten Erfindung kommen zwei verschiedene eukaryotische Expressionsplasmide vor.

• - Das erste Expressionsplasmid (EP1) ist das pCMV-Lic Mammalian Expression Plasmid (Pharmingen, San Diego, USA, No.: 40006P). Es enthält unter anderem die plasmidtypischen Komponenten ColE1-ORI und ein Ampicillinresistenzgen. Als eukaryotisches Expressionsplasmid hat es eine Expressionskassette aus CMV-Promotor, IC-Sequenz zum Einfügen der codierenden Sequenz und das Polyadenylierungssignal des humanen Wachstumshormons (human growth hormone gene HGH-N, AC M13438, Genebank). Seine Bauanleitung kann unter der angebenen Nummer bei Pharmingen eingesehen werden. EP1 wird nur zur Herstellung des erfindungsgemäßen Plasmides eingesetzt.
• - Das zweite Expressionsplasmid (EP2) ist das Cloning Plasmid pCMVbeta (Clontec, Palo Alto, USA/AC U02451 Genebank). Es enthält unter anderem die plasmidtypischen Komponenten einen pUC-ORI und ein Ampicillinresistenzgen. Als eukaryotisches Expressionsplasmid hat es eine Expressionskassette bestehend aus CMV-Promotor, β- Galactosidase-Gen (als codierende Sequenz) und das Polyadenylierungssignal des Simian Virus 40 (SV40). Seine Sequenz kann unter der oben angegebenen Zugriffsnummer eingesehen werden. Mehrere Variationen auf der Basis von EP2 werden als erfindungsgemäßes Plasmid bezeichnet.

Eine Expressionskassette im Sinne der Erfindung ist der Teilbereich eines Expressionsplasmides, der die kodierende Sequenz umgeben muß, damit sie in eukaryotischen Zellen transkribiert und in ein Protein translatiert werden kann. Sie besteht vorzugsweise aus einer Promotor/Enhancer-, einer codierenden und einer Polyadenylierungssequenz, die bevorzugt in der soeben genannten Reihenfolge angeordnet sind.

Ein Promotor ist eine DNA-Region, die an der Bindung der RNA-Polymerase beteiligt ist, um die Transkription zu starten. Ein Enhancer ist eine cis-aktive Sequenz, welche die Aktivität (mancher) eukaryotischer Promotoren steigert und unabhängig zur Orientierung und Position (stromaufwärts oder -abwärts) relativ zum Promotor wirkt. Promotor und Enhancerbereiche können einander unmittelbar benachbart sein oder sich überlagern.

Im Falle unserer Erfindung kann der Promotor/Enhancer aus der Gruppe viraler Promotoren /Enhancer stammen, wie z. B.: human Cytomegalovirus Promotor/Enhancer (Ac K03104, Genebank), Rous Sarcoma Virus Long Terminal Repeat (Ac J02342, J02021, J02343, Genebank), Moloney Leukemia Virus Long Terminal Repeat (Ac M10168, Genebank), Mouse Mammary Tumor Virus (Ac, U41642, Genebank), Epstein-Barr Virus (Ac, V01555, J02070, K01729, K01730, V01554, X00498, X00499, X00784 Genebank). Diese Promotoren sind kommerziell erhältlich von z. B. Stratagen (San Diego, USA). Er kann aber auch zur Gruppe humaner Promotoren gehören, wie z. B. der humane Skelettmuskel-Aktingen- Promotor (Muscat, G. E. et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 4089-4099), der Promotor der humanen Muskelkreatinkinase (Johnson, J. E. et al., 1989, Mol. Cell Biol. 9, 3393-3399), der Promotor der humanen MyoD-Genfamilie (Weintraub, H. et al., 1991, Science, 251, 761- 766), oder die Promotoren Hypoxie-induzierter Faktoren (Semenza, G. L. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5680-5684; Semenza, G. L. et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 23757-23763). Der Promotor kann ebenfalls ein humaner endothelzellspezifischer Promotor sein, so z. B. der Promotor des KDR/VEGF-Rezeptors oder der E-Selectin Promotor (Jaggar, R. T., 1997, Hum. Gene Ther., 8(18), 2239-47), weiterhin der Promotor des von-Willebrand- Faktors (Ozaki, K. et al., 1996, Hum. Gene Ther., 7(13), 1483-90). Bevorzugt ist der CMV- Promotor.

In jede Expressionskassette wird genau eine codierende Sequenz eingebaut. Die codierende Sequenz ist in diesem Falle die Summe der DNA-Abschnitte eines humanen Gens, die in der reifen RNA dieses Gens präsent sind. Die erfindungsgemäße codierende Sequenz ist ein Element aus den codierenden humanen Sequenzen der Gruppe A (Gefäßbildung induzierende Gene): VEGF₁₆₅ (AC M63971-8, HSVEGF 1-8, X62568, Genebank) oder Leptin (AC D49487, Genebank); oder aus den codierenden humanen Sequenzen der Gruppe C (Contra- Restenose gerichtete Gene): konstitutive NO-Synthase (AC L10709, Genebank) oder Prostazyklinsynthase (AC D38145, Genebank) oder Thrombomodulin (AC M16552, Genebank). Eingesetzt werden können auch Derivate der hier aufgeführten Gene. So z. B. andere Isoformen, allelische Varianten und/oder codierende Teilbereiche derselben und/oder auch durch eine beliebige Anzahl von Mutationen (z. B. Insertionen, Deletionen) veränderte Sequenzen, solange sie die Funktionalität des Produktes nicht verändern. Ebenfalls können Hybridproteine als kodierende Sequenzen genutzt werden, solange sie Teilsequenzen der Basissequenzen enthalten. Bevorzugt werden in der von uns beschriebenen Erfindung die obenstehend aufgeführten Originalsequenzen eingesetzt.

Das Polyadenylierungssignal ist der Sequenzbereich der Expressionskassette, der signalisiert, daß an dieser Stelle in der RNA-Prozessierung eine Kette aus 150 bis 200 Adenylatresten angeheftet wird. Mögliche Polyadenylierungssignale beinhalten das Polyadenylierungssignal des SV 40 oder ein LTR-Polyadenylierungsignal und die Polyadenylierungssignale humaner Gene, z. B. des humanen Wachstumsfaktors (human growth hormone gene HGH-N, AC M13438), sind jedoch nicht auf diese limitiert. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Polyadenylierungssignale des SV40 (Ac L29199 J02018 J02026 J02352 K01194 K01195 N00021, Genebank; oder das SV40-Polyadenylierungssignal im CEP4-Plasmid, Invitrogen, San Diego, USA) und da im besonderen das SV40 minor Polyadenylierungssignal und das Polyadenylierungssignal des humanen Wachstumsfaktors.

Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (growth factor) (VEGF) im Sinne der Erfindung ist ein heparinbindender Wachstumsfaktor, der die Teilung von Endothelzellen stimuliert, Monozyten aktiviert und deren Migration steuert sowie die Permeabilität von Blutgefäßen erhöht (Keck, P. J. et al. 1989, Science 246, 1309-1312/Clauss, M. et al. 1990, J. Exp. Med. 172, 1535-1545) und Neoangiogenese induziert (erstmals beschrieben in Shweiki, D. et al., 1992, Nature, 359 (6398), 843-845). Er wird in zahlreichen Geweben gebildet (Berse, B. et. al., 1992, Mol. Biol. Cell., 3, 211-220) und unter anderem von den KDR- und Flt-1 Rezeptoren (Zhu, Z., et al., 1999, Cancer Lett., 136(2): 203-213/Shibuya, M. et al., 1994, Princess Takamatsu Sym., 24, 162-170) der Endothelzellen selektiv erkannt (Jakeman, L. et al., 1992, J. Clin. Invest., 89, 244-253).

Die Proteinsequenz der humanen VEGF-Isoformen ist unter der Kennziffer P 15692 (Datenbank Swissprot), die Nukleinsäuresequenz unter den Zugriffsnummern HSVEGF1-8, M63971-8 und X62568 (EMBL-Datenbank) einzusehen. Die Nukleinsäuresequenz wurde durch Tischer et al. (1991, J. Biol. Chem. 266, 11947-11954) und durch Weindel et al. (1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 183, 11673-1174) veröffentlicht. Die Sequenz der Isoform VEGF₁₆₅ ist durch US-A 5332671 patentiert, die der Isoform VEGF₁₂₁ in DE 196 30 896 A1 beansprucht.

Leptin (Synonym: OB-Protein) im Sinne der Erfindung ist ein Peptidhormon, welches im Fettgewebe gebildet und ans Blut abgegeben wird (Van Gaal, LF. et al., 1999, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 23S1, 29-36). Der Leptintiter des Blutes entspricht dem Fettgehalt des Körpers (Bennett FI. et al., 1997, Am. J. Clin. Nutr., 66(6), 1340-1344) und wird durch Diabetes allein nicht verändert (Kowalska, I., Pol. Arch. Med. Wewn., 1998, 99(6), 470-476). Das Leptingen wurde 1994 von Yiying Zhang et al. (Nature 372: 425-32) an ob/ob-Mäusen charakterisiert. Die humane Nukleotidsequenz wurde 1995 von Masuzaki, H. et al., veröffentlicht (Diabetes, 44(7), 855-858) und ist unter der Kennziffer D49487 (Genbank) einzusehen. Das Leptin-Protein ist unter der Zugriffsnummer P41159 (Swissprot) beschrieben.

Leptin wirkt durch Anlagerung an den Leptinrezeptor (LR), welcher bislang in fünf Isoformen bekannt ist (Houseknecht, K. L., 1998, Domest. Anim. Endocrinol., 15(6), 457-75). Die lange Isoform des LR transformiert das Leptinsignal in der Zielzelle nach bisherigem Kenntnisstand über die Januskinase, STAT (Girard, 1997, Diabetes Metab., 23(S3), 16-24) und MAP-Kinase (Houseknecht; K. L., (1998), Domest. Anim. Endocrinol., 15(6), 457-75). Es wird diskutiert, daß die kurze Rezeptorform nicht signaltransduzierend wirkt (Konopleva, M. et al., 1999, Blood, 93(5), 1668-1676). In humanen Endothelzellen (HUVECS) wurden sowohl die lange als auch die kurze Isoform des Rezeptors nachgewiesen (Bouloumie, A. et al., 1998, Circ. Res., 83(10), 1059-1066).

Zur direkten Leptinwirkung zählen: reduzierte Nahrungsaufnahme (antiobese effect, Barinaga, M., 1995, Science, 269, 475-476), gesteigerte Aktivität des sympathischen Nervensystems (Tang-Christensen, M. et al., 1999, J. Clin. Endocrinol. Metab., 84(2), 711- 717) und erhöhter Blutdruck (Hirose, H., 1998, J. Hypertens., 16(12Pt2), 2007-2012). Indirekt wirkt Leptin über die Hormone Neuropeptid Y, Glucagon-like-Peptide, Melanokortin, kortikotrophes releasing Hormon (CRH) und Kokain-Amphetamin-Releasing Transkript (CART, Trayhurn, P., 1999, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 23(S1), 22-28). Neben Stoffwechselveränderungen aktiviert Leptin auch teilungsrelevante Kinasen und damit verbunden das Zellwachstum, welches zur Bildung von Kapillaren (Angiogenese) führt (gezeigt für HUVECS in Zellkultur: Bouloumie, A. et al., 1998, Circ. Res., 83(10), 1059- 1066/Hornhaut der Ratte in vivo: Sierra-Honigmann, M. R. et al., 1998, Science, 281(5383), 1683-1686). Die durch Leptin induzierte Angiogenese ist, sofern sie von einem adenoviralen Vektor in Adipozyten (in vivo) induziert wird, durch das Patent US-A 5 869 037 geschützt.

Thrombomodulin (TM) im Sinne der Erfindung ist ein Rezeptor des Thrombins (T), eines zentralen Proteins der Blutgerinnungskaskade (Koagulationskaskade). Liegt Thrombin frei vor, so vermittelt es gerinnungsfördernde Vorgänge: die Umsetzung von Fibrinogen zu Fibrin, die Aktivierung von Blutplättchen und die indirekte Aktivierung von Faktor V, VIII, XIII. Ist Thrombin an Thrombomodulin gebunden, werden die gerinnungsfördernden (prokoagulanten) Auswirkungen des Thrombins unterdrückt, und es erfolgt statt einer Induktion der Koagulation die Transformation des Proteins C zu aktivem Protein C (APC) durch den T/TM-Komplex. APC unterbricht die Gerinnungskaskade an verschiedenen Punkten (Esmon, N. et al., (1982), J. Biol. Chem., 257, 859-864/Salem, H. et al., (1983), J. Biol. Chem., 259, 12246-12251).

Thrombomodulin hat durch den Anteil am T/TM-Komplex antikoagulierende und antithrombotische Eigenschaften (Musci, G. et al., 1988, Biochemistry, 27, 769/Kumada, T. et al., 1988, Blood, 71(3), 728-733).

Es wird von Endothelzellen, Kreatinozyten, Osteoblasten und Macrophagen gebildet (Boffa M. C. et al., 1998, Lupus, 7(S2), 120-125) und liegt gebunden in der Membran der Endothelzellen und gelöst im Blutstrom vor (Boffa, MC. et al., 1998, Lupus, 7(S2), 120-125). Der T/TM-Komplex wirkt über APC antikoagulativ (s. o.). Im Plasma gelöstes Thrombomodulin scheint nach neuen Erkenntnissen nur bedingt zur Ausbildung des antikoagulativen T/TM-Komplexes in der Lage zu sein (Ishii, H. et al., 1985, J. Clin. Invest., 76, 2178-2181/Ishii, H. et al., 1988, J. Biol. Chem., 263, 5593-5996/Stearns, X., et al., 1989, J. Biol. Chem., 264, 3352-3356).

Die Proteinsequenz des humanen IM ist unter der Kennziffer P07204 (Swissprot) einzusehen und wurde von Suzuki et al. veröffentlicht (1987, EMBO J., 6, 1891-1897). Die Nukleotidsequenz ist unter M16552 (EMBL) registriert und in einem Artikel von Wen et al. (1987, Biochemistry, 26(14), 4350-4357) publiziert.

Im Diabetes wird TM durch die Zerstörung der Endothelzellen freigesetzt (Blann, A. D. et al., 1998, Blood Coagul. Fibrinolysis, 9(3), 261-266), was zur Zunahme des im Blut zirkulierenden (nicht jedoch unbedingt aktivierten) Thrombomodulins führt (Fujiwara, Y. et al., 1998, J. Atheroscler. Thromb., 5(1), 21-28).

Für belastete Endothelzellen konnte im Tierversuch eine verringerte TM-Neusynthese nachgewiesen werden (Waugh, J. M. et al., 1999, Circulation Res., 84, 84-92). Daten zu TM- Expressionsveränderungen durch spezifische diabetesbedingte Endothelzellbelastung liegen bislang nicht vor. Die verringerte Präsenz des Thrombomodulin-Proteins auf der Oberfläche belasteter oder geschädigter Endothelzellen ist eine wesentliche Voraussetzung für Thrombose, da es die Anlagerung thromboseinduzierender und vermittelnder Mediatoren an das Endothel erleichtert (Waugh, J. M. et al., 1999, Circulation Res., 84, 84-92). Werden im Tierversuch Endothelzellen mit adenoviral gekoppeltem TM transfiziert, so verhindert dies die Induktion von arterieller Thrombose (Waugh JM. et al., 1999, Circulation Res., 84, 84-92).

Die Prostazyklin-Synthase (PGI-S) im Sinne der Erfindung ist ein Enzym der Arachidonsäurekaskade. Es konvertiert Prostaglandin H2 (das Produkt der Zyklooxygenasereaktion) zu Prostazyklin (Synonym: Prostaglandin I2) (Hecker, M. & Ulrich, V., J. Biol. Chem., 1(5), 264(1): 141-150). In Endothelzellen ist Prostazyklin das primäre Produkt des Prostaglandinstoffwechsels (Mebazaa, A. et al., Mol. Cell. Cardiol., 1993, 25(3), 245-258). Prostazyklin inhibiert die Proliferation von Muskelzellen, induziert Vasodilatation und verhindert die Aggregation von Blutplättchen (Numaguchi, Y. et al., 1999, Arteriscler. Thromb. Vasc. Biol., 19(3), 727-733/Yang, L., et al., 1999, Thromb. Res., 94(1): 25-32). Die Sequenzen der Prostazyklin-Synthase sind unter den Zugriffsnummern Q16647 (Proteinsequenz/Swissprot) und D38145 (Nukleinsäuresequenz/EMBL) einzusehen und von der Arbeitsgruppe um Tadashi Tanabe sowohl publiziert (Miata, A. et al., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun., 200, 1728-1734) als auch patentiert (US-A 5814509).

Obwohl im diabetischen Fuß keine verringerte PGI-S-Aktivität gemessen wurde (McNamara, D. B. et al., 1986, J. Vasc. Surg., 4(1), 63-70), konnten zwei Einzelfallstudien (Kay, S. & Nancarrow, J. D., 1984, Br. J. Plast. Surg., 37(2), 175-178/Bedani, P. L. et al., 1989, Angiology, 40(6), 589-592) und eine Untersuchung an 109 diabetischen Patienten (Brock, F. E. et al., 1990, Schweiz. Med. Wochenschrift, 120 (40), 1477-1482) zeigen, daß eine mehrwöchige Infusion von PGI2 oder stabilen Analoga die Heilung diabetesbedingter Nekrosen und Geschwüre unterstützt.

Lipofektion eines PGI-S-kodierenden CMV-haltigen Vektors inhibiert im Tierexperiment die ohne Behandlung nach Verletzung des Endothels auftretende Verdickung der Neointima (Numaguchi, Y. et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 19(3), 727-733) ebenso wie eine virusvermittelte Genübertragung der PGI-Sequenz bei gleicher Ausgangssituation (HVJ/­ Todaka, T. et al., 1999, Stroke, 30(2), 419-426).

Die konstitutive NO-Synthase (cNOS) im Sinne der Erfindung ist ein konstitutiv exprimiertes Enzym der Endothelzellen, das Stickstoffmonoxid (NO) produziert (Förstermann, U. et. al., Europ. Heart. Journal, 1993, Vol. 14, Suppl. I, 10-15). NO verhindert auf der dem Gefäß zugewandten luminalen Seite die Anlagerung thrombosefördernder Faktoren und induziert auf der dem Gefäß abgewandten Seite eine Relaxation der Muskelzellen und somit eine Erweiterung des Blutgefäßes (Palmer, R. M. et al., 1988, Nature, 333, 664-666). Sowohl in Tierversuchen (Oyama, Y., 1986, Eur. J. Parmacol., 131, 978-981) als auch am Menschen (diabetischer Fuß/Veves, A. et al., 1998, Diabetes, 47(3), 457-463) konnte nachgewiesen werden, daß Diabetes langfristig zu einer verringerten NO-Ausschüttung bzw. cNOS- Expression führt.

Die Proteinsequenz der cNOS kann unter den Kennziffern P29474, Q14251, Q14434 (Swissprot) eingesehen werden. Veröffentlicht wurde sie 1992 von Janssens et al. (J. Biol. Chem., 267, 14519-14522). Die Nukleinsäuresequenz ist unter der Zugriffsnummer L10709 (EMBL) abzufragen und wurde 1993 von Marsden et al. (J. Biol. Chem., 268, 17478-17488) publiziert.

In Zellkulturversuchen (dreidimensionale Kultur) konnte gezeigt werden, daß NO für die Entstehung neuer Gefäße essentiell ist (Papapetropoulos, A. et al., 1997, Am. J. Pathol., 150(5), 1835-1844). In primären Zellkulturen stimuliert es die Migration von Muskelzellen aus Aorta (Brown, C. et al., 1999, Circ. Res., 84(6), 655-667) und ist Bestandteil der VEGF- A-vermittelten Angiogeneseinduktion (Kroll, J. & Waltenberger, J., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 252(3), 743-746). Eine gesteigerte cNOS-Proteinexpression und -aktivität begleitet die durch den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) induzierte Heilung von Geschwüren im Tierversuch (Akiba Y., 1997, J. Clin. Gastroenterol., 25(S1), 122-128) ebenso wie die durch VEGF induzierte Angiogenese im in-vivo-Versuch (Miles-Assay/­ Murohara, T. et al. 1998, Circulation, 97(1), 99-107//Hasen-Netzhaut: Ziche, M., 1997, J. Clin. Invest., 99(11), 2625-2634).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in den erfindungsgemäßen eukaryotischen Expressionsplasmiden zusätzlich zu der bereits vorhandenen codierenden Sequenz für humanes VEGF₁₆₅ mindestens eine weitere codierende Sequenz für humanes VEGF₁₆₅ vorhanden, wenn gleichzeitig mindestens die codierende Sequenz eines Vertreters auch der Gruppe humanes Leptin, humanes Thrombomodulin, humane Prostazyklinsynthase und/oder humane konstitutive NO-Synthase vorhanden ist.

Die erfindungsgemäßen eukaryotischen Expressionsplasmide können wie folgt hergestellt werden.

Die codierenden Sequenzen der Gene gemäß Anspruch 1 können aus zahlreichen humanen Zellsorten gewonnen werden. Es wurden folgende Zellsorten für die RNA-Präparationen humaner Kultur- oder Primär-Zellen bevorzugt (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1

Zellen zur Isolation der mRNA der codierenden Sequenzen gemäß Anspruch 1

Die Isolation der Gesamt-RNA aus den entsprechenden Zellen erfolgte mit RN-easy Säulen (Qiagen, Hilden, D) nach Angaben des Herstellers. Zur eDNA-Synthese wurden 2 µg Gesamt- RNA pro Ansatz eingesetzt. Als Starter-Oligonukleotid wurden pro Ansatz 2 µg Oligo-dt16- Primer (Pharmacia, Uppsala, S) eingesetzt. RNA und Primer wurden in 10 µl Wasser (depc) gelöst, erhitzt (60°C; 5 mm) und 30 µl der nach Herstellerangaben (Gibco Life-Technologies, Eggenstein, D) gemischten Reaktionslösung zugegeben. Die cDNA-Synthesereaktion erfolgte ebenfalls gemäß den Angaben des Herstellers unter Einsatz von Superskript^TM Reverse Transkriptase RNase H (Gibco Life-Technologies, Eggenstein, D).

Die Zielgene wurden anschließend an die cDNA-Synthese in getrennten PCR-Reaktionen unter Einsatz von LIC-Primern, welche die anschließende Integration des Amplifikates in das pCMV-Lic Mammalian Expression Plasmid (Pharmingen, San Diego, USA, No.: 40006P) ermöglichen, selektiv amplifiziert. Ein Amplifikat enthielt nach beendeter Reaktion jeweils das komplette Zielgen mit Endbereichen, die das einfache Einklonieren in das pCMV-Lic Mammalian Expression Plasmid (Katalog-No. 40006P der Firma Pharmingen, San Diego, USA) erlaubten. Amplifikationsprimer, die mit dem Online-Programm http://www- genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3-www.cgi bestimmt wurden, sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

eingesetzte LIC Amplifikationsprimer

Die Amplifikationen wurden mit DNA-Polymerasen verschiedener Hersteller durchgeführt. Bevorzugt wurden die Platinum Pik DNA-Polymerase (Gibco-life Technologies, Eggenstein, D), die Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, LaJolla, USA) sowie die Taq-DNA-Polymerase I (Boehringer-Mannheim/Roche, Basel, CH) eingesetzt. Die Amplifikationen erfolgten nach den jeweiligen Angaben des Herstellers unter produktabhängig optimierten Bedingungen. Die PCR-Amplifikate wurden gemäß den Angaben des Herstellers (Pharmingen, San Diego, USA) in die LIC-Schnittstelle (Ligation-Independent-Cloning) des pCMV-Lic Mammalian Expressionsplasmids (Pharmingen, San Diego, USA, No.: 40006P) eingebracht, wobei sich für eine Expressionskassette die Reihenfolge Promotor/Enhancer → Zielgen → PolyA-Bereich ergab.

pCMV-LIC-Plasmide, die je eine codierende Sequenz gemäß Anspruch 1 enthielten (mit Namen: pCMV-LIC-VEGF₁₆₅, pCMV-LIC-Leptin, pCMV-LIC-cNOS, pCMV-LIC-PGIS, pCMV-LIC-Thrombomodulin) wurden mit dem Internet Online-Tool Cutter (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.htm) auf mögliche Restriktionsstellen analysiert. Durch die vorgenommenen Restriktionen wurden die Expressionskassetten (EK) bestehend aus Promotor/Enhancer → codierende Sequenz (VEGF₁₆₅ oder Leptin oder cNOS oder PGIS oder Thrombomodulin) → polyA-Bereich aus den pCMV-LIC-Plasmiden (pCMV-LIC- VEGF₁₆₅ oder pCMV-LIC-Leptin oder pCMV-LIC-cNOS oder pCMV-LIC-PGIS oder pCMV-LIC-Thrombomodulin) ausgeschnitten.

Tabelle 3

Restriktionen, um die Expressionskassetten (EK) mit den codierenden Sequenzen aus pCMV-LIC-"codierende Sequenz"-Plasmiden auszuschneiden und für das Einbringen in das Cloning Plasmid - pCMV-VEGF oder pCMV-minus vorzubereiten

Restriktionen und Modifikationen der Expressionskassetten erfolgten gemäß den Angaben der Hersteller der Restriktionsenzyme (siehe Tabelle 3, Spalte 2) oder des Modifikationsenzyms (Mung Bean Nuklease). Waren die Restriktionsenzyme, die für das Ausscheiden einer Expressionskassette genutzt wurden, von verschiedenen Herstellern (siehe Tabelle 3, Spalte 2), so wurden die Fragmente nach der ersten Restriktion mit Microspin^TM HR-Columns (Pharmacia, Uppsala, S) umgepuffert und teilweise gefällt (nach Sambrook et al.: Molekular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), bevor die zweite Restriktion durchgeführt wurde. Nach der zweiten Restriktion wurden die entstandenen Fragmente der pCMV-LIC-"codierende Sequenz"-Plasmide im Agarosegel aufgetrennt (Agaraosegehalt 0,5-3% (w/v), je nach Größe des Zielfragmentes (Sambrook et al., s. o.)) und durch Ethidiumbromid (Sambrook et al., s. o.) sichtbar gemacht. Die durch Restriktion ausgeschnittenen Expressionskassetten wurden durch ihre vorzugsweisen Größen im Gel vorläufig identifiziert, ausgeschnitten und mit Genelute (Qiagen, Hilden, D) gemäß den Angaben des Herstellers aus der Agarose isoliert.

Geeignete Restriktionen [gemäß der mit Cutter (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.htm) angefertigten Restriktionskarten der Expressionskassetten] innerhalb der Expressionskassetten und die bevorzugte Größe der entstandenen Fragmente haben die Identität der codierenden Sequenzen in den Expressionskassetten nachgewiesen.

Die DNA der identifizierten und überprüften Expressionskassette wurde gefällt (Sambrook et al., s. o.) und wie nachfolgend beschrieben in die Cloning Plasmide pCMV-VEGF oder pCMV-minus eingebracht.

Die Herstellung der pCMV-minus-, der pCMV-minus-minus- und der pCMV-VEGF₁₆₅- sowie der pCMV-minus-VEGF₁₆₅-Plasmide aus dem pCMVbeta-Galaktosidase-Plasmid (Clontec, Palo Alto, USA/AC U02451 Genebank) erfolgte wie nachstehend beschrieben:

Die erfindungsgemäßen EP2-Plasmide (pCMV-minus und pCMV-VEGF₁₆₅) basieren auf dem Cloning vector pCMVbeta (bevorzugt 7162 bp, Clontec, Palo Alto, USA/AC U02451, GenBank-Database). Das β-Galaktosidasegen wurde sowohl für das pCMV-minus-Plasmid als auch für das pCMV-VEGF-Plasmid durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym Xma III (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, D) nach Angaben des Herstellers ausgeschnitten.

• - Das pCMVminus-Plasmid basiert auf dem Plasmid pCMVbeta-Galaktosidase-Plasmid (Clontec, Palo Alto, USA/AC U02451 Genebank). Das β-Galaktosidasegen wurde durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym Xma III (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, D) nach Angaben des Herstellers ausgeschnitten. Das Restplasmid (bestehend aus pCMV, PolyA, ORI, β-Laktamasegen; bevorzugt 3683 bp) wurde im Agarosegel von dem β- Galakosidasefragment getrennt und wie bereits beschrieben aufgereinigt und rein dargestellt. Das zirkuläre Produkt dieser Reaktion wurde anschließend an eine Dephosphorylierung (Calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP, Pharmacia, Uppsala, S), nach Angaben des Herstellers) durch die Ligation der komplementären Enden hergestellt (T4-DNA-Ligase nach Angaben des Enzymherstellers (MBI-Fermentas, St. Leon-Rot, D)) und als pCMV-minus-Plasmid bezeichnet. Das pCMV-minus-Plasmid wurde auch zur Eingliederung der VEGF₁₆₅-codierenden Sequenz in der Xma-III-Schnittstelle eingesetzt wie nachfolgend beschrieben. Dazu wurde nach Möglichkeit a) kein Ringschluß des pCMV-minus-Plasmids vollzogen und die VEGF₁₆₅-codierende Sequenz mit Xma-III komplementären Enden eingesetzt oder nach Möglichkeit b) das zirkuläre pCMV-minus- Plasmid mit Ava I (New England Biolabs) nach Angaben des Herstellers geschnitten. Die durch die Ava-I-Restriktion entstandenen einzelsträngigen DNA-Bereiche an den Enden des pCMV-minus wurden mit Mung Bean Nuklease (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, D) nach Angaben des Herstellers entfernt. Der blunt-end-pCMV-minus wurde mit Calf intestinal alkaline Phosphatase (CIAP, Amersham Pharmacia Biotec, Freiburg, D) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert und die VEGF-Sequenz wie bereits beschrieben eingesetzt.
• - Das pCMV-minus-minus-Plasmid basiert auf dem pCMV-minus-Plasmid und wurde aus diesem durch eine Restriktion mit den Restriktionsenzymen BspLU11I und Bbu I (Hersteller) nach Angaben des Enzymfabrikanten hergestellt. Das pCMV-minus-minus- Plasmid (ORI, β-Lactamasegen, bevorzugt 2299 bp) wurde von der Expressionskassette des pCMV-minus-Plasmides (ohne codierende Sequenz/pCMV, Poly A, bevorzugt 1386 bp) im Gel getrennt. Das pCMV-minus-minus-Plasmid wurde zur Eingliederung von LIC- Expressionskassetten eingesetzt wie nachfolgend beschrieben. Dafür wurde zunächst die Plasmid-DNA konzentriert (Sambrook et al., s. o.) und mit Calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP, Pharmacia, Uppsala, S) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert.

Das pCMV-VEGF₁₆₅-Plasmid kann auf verschiedene Weise hergestellt werden.

Das pCMVminus-VEGF₁₆₅-Plasmid hergestellt aus dem pCMVminus-minus-Plasmid und der LIC-VEGF₁₆₅-Expressionskassette

Das Plasmid pCMV-minus-minus wurde wie oben dargestellt auf die Integration der LIC- VEGF₁₆₅-Expressionskassette vorbereitet.

Die LIC-VEGF₁₆₅-Expressionskassette wurde mit den in Tabelle 3 aufgeführten Restriktionsenzymen ausgeschnitten. An der komplementären Bst LU11I-Schnittstelle wurden die komplementären Enden des pCMV-minus-Plasmids und der LIC-VEGFISS- Expressionskassette durch Inkubation mit T4-DNA-Ligase nach Angaben des Enzymherstellers (MBI-Fermentas, St. Leon-Rot, D) verknüpft. Es entstand das linearisierte pCMVminus-VEGF₁₆₅-A-Plasmid. Der Ringschluß wurde durch den Abbau der einzelsträngigen, nicht komplementären DNA-Enden (Bbu I und Pvu I) mit Mung Bean Nuklease (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, D) nach Angaben des Herstellers vorbereitet. Die Dephosphorylierung erfolgte wie bereits dargestellt. Die Ligation der blunt­ ends erfolgte mit T4-DNA-Ligase (MBI-Fermentas, St. Leon-Rot, D) nach Herstellerangaben. Eine Sequenzierung war nicht notwendig, da die Übertragung der kompletten Kassette ein Ablesen der VEGF₁₆₅ kodierenden Sequenz sicherstellte.

Das pCMV-VEGF165-Plasmid hergestellt aus dem pCMVminus-Plasmid und der VEGF₁₆₅-codierenden Sequenz des LIC-Plasmids

Das Plasmid pCMV-LIC-VEGF₁₆₅ wurde parallel mit Tsp 45I und Apo I (New England Biolabs, Schwalbach/Taunus, D) geschnitten. Das Zielfragment (bevorzugt 610 bp) enthält nur die codierende Sequenz des humanen VEGF₁₆₅, nicht seine LIC-Expressionskassette, welche aus Promotor/Enhancer-VEGF₁₆₅-Polyadenylierungssignal bestehen würde. Das VEGF₁₆₅-Fragment wurde im Agarosegel von den anderen Fragmenten getrennt und wie beschrieben analysiert und konzentriert. Die durch die Restriktion entstandenen einzelsträngigen DNA-Bereiche an den Enden des Zielfragmentes wurden mit Mung Bean Nuklease (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, D) nach Angaben des Herstellers entfernt.

Das pCMV-minus-Plasmid wurde nach a) nicht zirkularisiert und besaß somit Xma-III-Enden oder wurde nach b) zikularisiert und anschließend mit Xma III (MBI Fermentas, St. Leon- Rot, D) oder mit Ava I (New England Biolabs, Schwalbach/Taunus, D) nach jeweiligen Herstellerangaben geschnitten. Das bevorzugt 3511 bp große pCMV-minus-Fragment (enthaltend den Polyadenylierungsbereich, den ORI, die codierende Sequenz der Ampicillinresistenz, den pCMV-Promotor/Enhancer) wurde im Agarosegel aufgereinigt. Die durch die Restriktion entstandenen einzelsträngigen DNA-Bereiche an den Enden des pCMVminus-Plasmids wurden mit Mung Bean Nuklease (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, D) nach Angaben des Herstellers entfernt. Das pCMVminus-Plasmid wurde mit Calf intestinal alkaline Phosphatase (CIAP, Amersham Pharmacia Biotec, Freiburg, D) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Die codierende Sequenz des humanen VEGF₁₆₅ und das geschnittene, dephosphorylierte pCMV-minus-Plasmid wurden in den molaren Verhältnissen 1 : 3 bis 3 : 1 mit T4-DNA-Ligase (MBI-Fermentas, St. Leon-Rot, D) nach Herstellerangaben blunt-end ligiert. Die Orientierung des VEGF-Gens innerhalb des pCMV- Vektors wurde durch Sequenzierung (Sanger, F. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463- 5467) des Produktes überprüft. Als Sequenzierprimer wurden folgende Sequenzen eingesetzt, andere sind jedoch ebenfalls gleichwertig möglich: CMV-Sense 5'-TGC TCT AAA AGC TGC GGA AT-3'; CMV-Antisense 5'-TGG TTT GTC CAA ACT CAT CAA-3'. Das entstandene Plasmid wurde mit pCMV-VEGF₁₆₅-A (bevorzugt 4121 bp) bezeichnet.

Das pCMV-VEGF165-Plasmid hergestellt aus dem pCMV-minus-Plasmid und der VEGF165 codierenden Sequenz aus dem pGMT-VEGF165-Plasmid

Das pCMV-minus-Plasmid wurde nach Fall a) nicht zirkularisiert wie oben beschrieben. Die VEGFISS codierende Sequenz entstammte dem pGMT-VEGV₁₆₅-Plasmid.

Das Plasmid pGMT-VEGF₁₆₅ wurde von Herrn Dr. Herrmann (bei Prof. Dr. J. Schrader, Institut für Herz und Kreislaufforschung, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf) durch Einfügen der codierenden Sequenz des humanen VEGF₁₆₅ in das pGMT-Plasmid (Promega, Madison, USA) hergestellt. Herr Dr. Hermann stellte es uns für weitere Versuche zur Verfügung. Aus dem pGMT-VEGF₁₆₅-Plasmid wurde die codierende Sequenz des humanen VEGF₁₆₅ durch Restriktion mit Xma III (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, D) nach Angaben des Herstellers ausgeschnitten. Die codierende Sequenz wurde wie bereits beschreiben im Agarosegel von dem Restplasmid getrennt und wie ebenfalls bereits beschrieben aufgereinigt und konzentriert.

Die Plasmidfragmente pCMV-minus und VEGF₁₆₅ wurden wie bereits beschrieben dephosphoryliert und mit den komplementären Xma III-Bereichen ligiert. Die Ligation erfolgte in den molaren Verhältnissen der Plasmidfragmente 1 : 3 bis 3 : 1 mit T4-DNA-Ligase nach Angaben des Herstellers (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, D). Die Orientierung des VEGF-Gens innerhalb des pCMV-Vektors wurde durch Sequenzierung (Sanger, F. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467) des Produktes überprüft. Als Sequenzierprimer wurden folgende Sequenzen eingesetzt, andere sind jedoch ebenfalls gleichwertig möglich: CMV-Sense 5'-TGC TCT AAA AGC TGC GGA AT-3'; CMV- Antisense 5'-TGG TTT GTC CAA ACT CAT CAA-3'. Das entstandene Plasmid wurde mit pCMV-VEGF₁₆₅-B (bevorzugt 4322 bp) bezeichnet.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Kombivektoren nach Anspruch 1, z. B. auf der Basis des pCMV-VEGF₁₆₅-B-Plasmids, erfolgte wie nachstehend beschrieben.

Das pCMV-VEGF₁₆₅-B-Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen BspLU11I/Sal I (Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, D) nach Angaben des Herstellers geschnitten, das entstehende pCMV-VEGF₁₆₅-B-Fragment enthält den ORI, die codierende Sequenz des Ampicilingens und die vollständige Expressionskassette des humanen VEGF₁₆₅ (bevorzugt 3882 bp). Die Restriktionsprodukte wurden im Agarosegel aufgetrennt und durch Einlagerung von Ethidiumbromid sichtbar gemacht (Sambrook et al. s. o.).

Aus den Plasmiden pCMV-LIC-Leptin, pCMV-LIC-Thrombomodulin, pCMV-LIC-VEGF₁₆₅, pCMV-LIC-cNOS, pCMV-LIC-PGIS wurden die Expressionskassetten durch Restriktion entfernt und auf die Integration in das pCMV-minus oder das pCMV-VEGF₁₆₅-Plasmid vorbereitet (siehe Angaben in Tabelle 3).

Das pCMV-VEGF₁₆₅-Fragment wurde nun mittels der BspLU11 I-komplementären Schnittstelle entweder mit der pCMV-LIC-Leptin-Expressionskassette oder mit der pCMV- LIC-Thrombomodulin-Expressionskassette oder mit der pCMV-LIC-VEGF₁₆₅- Expressionskassette durch Inkubation mit T4-DNA-Ligase nach Angaben des Enzymherstellers (MBI-Fermentas, St. Leon-Rot, D) verknüpft. Es entstanden die linearisierten Kombivektoren pCMV-VEGF₁₆₅-pCMV-LIC-Leptin (bevorzugt 6162 bp), pCMV-VEGF₁₆₅pCMV-LIC-Thrombomodulin (bevorzugt 7407 bp) und pCMV-VEGF₁₆₅- pCMV-LIC-VEGF₁₆₅ (bevorzugt 6191 bp). Der Ringschluß wurde durch den Abbau der einzelsträngigen, nicht komplementären DNA-Enden (Sal I und Fsp I (Leptin); Sal I und Eam 1104 I (Thrombomodulin), Sal I und PvuI (VEGF₁₆₅) mit Mung Bean Nuklease (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, D)) nach Angaben des Herstellers vorbereitet. Die Dephosphorylierung erfogt wie bereits dargestellt. Die Ligation der bluntends erfolgte mit T4-DNA-Ligase (MBI-Fermentas, St. Leon-Rot, D) nach Herstellerangaben.

Die Integration der cNOS-Expressionskassette und der PGIS-Expressionskassette durch eine komplementäre Schnittstelle war nicht möglich. Wie bereits in Tabelle 3 beschrieben, wurden in diesem Fall die einzelsträngigen Endbereiche sowohl der Expressionskassetten als auch des Vektors mit Mung Bean Nuklease (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, D) nach Angaben des Herstellers abgetragen. Das pCMV-minus-minus-Plasmid wurde dephosphoryliert und die glatten Enden des Plasmides und der Expressionskassetten in den Verhältnissen (3 : 1 bis 1 : 3) gemischt und blunt-end mit T4-DNA-Ligase (MBI-Fermentas, St. Leon-Rot, D) nach Herstellerangaben ligiert.

Zur Herstellung zusätzlicher pCMV-minus-"codierende Sequenz"-Einzelvektoren (gemäß Anspruch 3) wurde pCMVminus-minus wie oben beschrieben durch Restriktion mit BspLU 11I und Bbu I hergestellt. Nach der ersten Restriktion wurde das Plasmid durch den Einsatz von Microspin^TM HR-Colums (Pharmacia, Uppsala, S) nach Angaben des Herstellers umgepuffert und wie bereits beschrieben für die Verbindung mit der Expressionskassette vorbereitet.

Die Expressionskassetten für Leptin oder Thrombomodulin konnten gemäß der Angaben in Tabelle 3 und den oben stehenden Ausführungen über die komplementäre BspLU 11 I- Schnittstelle eingebracht werden und so zu den Plasmiden pCMV-minus-Leptin (bevorzugt 4579 bp) oder pCMV-minus-Thrombomodulin (bevorzugt 5762 bp) führen.

Die Expressionskassetten für cNOS und PGIS wurden in das pCMV-minus-minus-Plasmid analog zu dem bereits dargestellten Vorgang für das pCMV-VEGF₁₆₅-B-Plasmid eingebracht und ergaben die Plasmide pCMVminus-cNOS (bevorzugt 8778 bp) und pCMVminus-PGIS (bevorzugt 5859 bp).

Der hier dargestellte Weg der Isolation der codierenden Sequenzen und des Einbinden der codierenden Sequenzen in die pCMV-VEGF-Plasmide und/oder pCMV-minus Plasmide wurde von uns bevorzugt, andere Wege sind gleichwertig und ebenfalls möglich. So können z. B. alle aufgeführten proteincodierenden Sequenzen z. B. durch PCR-Amplifikation auf der Basis von humaner cDNA hergestellt werden, aus Genbanken isolierte Sequenzen sein, aus anderen Vektoren durch Restriktion gewonnen oder de novo synthetisiert werden.

Gewinnung, Aufreinigung, Charakterisierung erfolgte wie nachstehend beschrieben:

Die eukaryotischen Expressionsplasmide werden in Standard-Bakterien (E.coli-Stämme, wie z. B. DH5α, DH10B, HB101, JM 109 oder XL1-Blue) unter standardisierten Wachstumsbedingungen vervielfältigt. Bevorzugt werden Bakterien des DH5α-Stammes eingesetzt. Da die eingesetzten Plasmide das β-Lactamasegen enthalten, wurden sie unter Einfluß von Ampicilin (Anwendung gemäß Sambrook et al., s. o.) kultiviert. Bei anderen Resistenzgenen würden entsprechend andere Antibiotika zum Einsatz kommen. Die zirkulären Genkonstrukte wurden mit einer modifizierten Methode zur alkalischen Lyse (z. B. Birnboim & Doly, 1979, Nucl. Acids. Res., 7, 1513-1522) und nachgeschalteter DNA- Adsorption an Silika-Gel-Membranen in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen (Vogelstein und Gillespie, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 615-619) gewonnen. Durch Restriktionsanalysen [Cutter (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.htm)] wurden sie auf den Einbau der Nukleotidsequenzen und, sofern die Zielnukleotidsequenzen eingebaut sind, auf deren Orientierung überprüft. Genkonstrukte, die gewünschte Nukleotidsequenzen bevorzugt in der Reihenfolge Promotor/Enhancer-5'-Nukleotidsequenz-3'- Polyadenylierungssignal enthalten, wurden sequenziert (Sanger, F. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467). Sie wurden z. B. mit Fugene^TM (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, D) oder TfX^TM (Promega, Mannheim, D) oder TR-MAX (Eurogentec, Heidelberg, D) nach Angaben der Hersteller in kultivierte Kontrollzellen eingebracht (z. B. CHO-K1 Zellen (BioWhittaker, Walkersville, USA) oder humane Muskeltumorzellen des Rhabdomyosarcoms (A 673 human rhabdomyosarcoma cells, Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Science, Shanghai, VRC).

Tabelle 4

Proteinnanchweise/Bioreaktivität

Aufgeführt ist nur der jeweils bevorzugte Nachweis von zahlreichen möglichen Nachweisen, andere Nachweise sind gleichwertig und können ebenfalls eingesetzt werden.

Nur Plasmide, die mehrfach fehlerfreie Sequenzen mindestens der enthaltenen Expressionskassetten liefern und in eukaryotischen Zellen zur Produktion des entsprechenden Proteins/der entsprechenden Proteine führen (Kriterien z. B. Proteingröße und Bioreaktivität, Tabelle 4), wurden für die Therapie eingesetzt.

Zur Vermehrung der überprüften Plasmide wurden die betreffenden geprüften eukaryotischen Expressionsplasmide in Bakterienzellen (z. B. E. coli) eingebracht (Transformation z. B. nach Hanahan, D., 1983, J. Mol. Biol., 166, 557-580) und die transformierten Bakterien wurden in großem Maßstab vermehrt. Große Plasmidpräparationen erfolgten endotoxinfrei (EndoFreeMaxiKit, nach Herstellerangaben, Qiagen, Hilden). Die gewonnenen Genkonstrukte wurden erneut wie oben beschrieben überprüft. Die Integrität des Genkonstruktes wurde z. B. im Agarosegel (nach Sambrook s. o.) beurteilt, nur zu über 90% zirkuläre Plasmidpräparationen wurden zugelassen. Die Kontamination mit bakteriellen Nukleinsäuren des Aufzuchtbakteriums wurde durch PCR überprüft (Bej, A. K., 1990, Appl. Environ. Microbiol., 56/2, 307-314); kontaminierte Präparationen sind nicht zugelassen. Die Endotoxinbelastung der Präparation wurde im, limulus amoebocyte lysate bioassay" LAL- Assay (Biowhittaker, Verviers, B) nach Angaben des Herstellers bestimmt. Wurden Endotoxine festgestellt (Nachweisgrenze 10 pg/ml, Brook: Biology of Microoganisms: Prentice-Hall Inc., 1991), war das eukaryotische Expressionsplasmid nicht zugelassen. Mengenbestimmungen der einzusetzenden zirkulären Genkonstrukte wurden z. B. photometrisch (nach Sambrook, s. o.) durchgeführt.

Die beschriebenen eukaryotischen Expressionsplasmide können zur Applikation steril und pyrogenfrei als Suspension, Lösung, Emulsion in Öl oder als wässrige Lösung vorliegen, letzteres wird bevorzugt. Die wässrigen Lösungen können physiologisch verträgliche Puffer (z. B. phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) enthalten. Die Polynukleotide liegen in diesen Lösungen als Salze vor, welche mit pharmazeutisch akzeptablen Basen hergestellt worden sind. Positive Ionen dieser Salze sind unter anderem Natrium, Kalium, Lithium, Ammonium, Calcium und Magnesium. Ebenfalls zugelassen sind Salze organischer, nicht toxischer Basen wie z. B. primärer, sekundärer, tertiärer Amine und basischer Aminosäuren. Eine Übersicht über pharmazeutisch einsetzbare Salze kann der Literatur entnommen werden (Berge, S. M. et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 66, 1-19 (1977).

Die plasmidhaltige Lösung kann lyophilisiert werden. Die lyophilisierten Bestandteile können transportiert und aufbewahrt werden. In diesem Fall werden sie vor der Applikation in sterilem und pyrogenfreiem Wasser oder in Puffersubstanzen aufgenommen, wobei auf den pH-Wert und die Osmolarität der entstehenden Lösung zu achten ist. Erlaubt ist eine isotonische, hypotonische oder leicht hypotonische Lösung mit physiologischem pH. Der Anteil des Plasmids oder der Plasmide an der Lösung kann 0,1 bis 99% (v/v) betragen.

Gegenstand der Erfindung ist zudem eine Mischung enthaltend ein oder mehrere Plasmide nach Anspruch 1 oder 2 oder ein und gegebenenfalls zusätzliche Plasmide mit nur einer Expressionskassette enthaltend eine codierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe VEGF₁₆₅, Leptin, cNOS, PGIS, Thrombomodulin. Der Anteil eines jeden Plasmides an der Plasmidgesamtheit kann zwischen 0,1 und 99% betragen, der Anteil der Gesamtheit der Plasmide an der Lösung ebenfalls.

Die Herstellung der Mischung erfolgt wie nachstehend beschrieben:

Die eukaryotischen Expressionsplasmide liegen nach Herstellung einzeln, steril und pyrogenfrei in Lösung oder lyophilisiert (siehe Abschnitt Plasmid) vor. In gelöster Form werden sie in variablen Mengen (eingestellt durch Vermischung verschiedener Volumina der Plasmidlösungen) steril und pyrogenfrei durch Pipettieren vereinigt und flüssig (4°C) oder gefroren (-20°C oder -80°C) aufbewahrt. Die Mischung kann auch als solche erneut oder erstmals lyophilisiert und bei verschiedenen Temperaturen (einschließlich RT) gelagert oder versendet werden. Vor Gebrauch ist die lyophilisierte Mischung wieder zu lösen.

Gegenstand der Erfindung ist zudem ein Mittel, enthaltend ein oder mehrere Plasmide nach Anspruch 1 und/oder 2 und/oder 3 in einer Lösung die Additive (Zusätze, Hilfsstoffe) aus der Gruppe Ethanol, Glycerin, DMSO, Gelatine, Albumin, Natriumchlorid, Dextrose, Mannit, Sorbit, Laktose, Kollagen enthalten kann.

Für den Einsatz eines eukaryotischen Expressionsplasmides oder mehrerer eukaryotischer Expressionsplasmide nach Anspruch 1 und/oder 2 und/oder 3 als Mittel/Medikament werden die Plasmide oder das Plasmid in Lösung mit den üblichen Zusatzstoffen oder Hilfsstoffen versetzt, wie sie bei Gentherapeutika gebräuchlich sind und/oder wie sie zur erleichterten Aufnahme von zirkulären Plasmiden in eukaryontische Zellen eingesetzt werden. Der Anteil jedes einzelnen Zusatzes oder der Gesamtheit aller Zusätze an dem eingesetzten Mittel kann zwischen 0,01% bis 99,9% betragen.

Als Hilfsstoffe, die die Plasmidaufnahme erleichtern sind unter anderem Ethanol, Glycerin und DMSO zu nennen; sie können dem Plasmid, den Plasmiden oder der Mischung einzeln oder in beliebigen Kombinationen zugesetzt werden, um das Mittel herzustellen. Ethanol (Merck, Darmstadt, D) kann mit sterilem Wasser, NaCl-Lösung oder einer anderen pharmazeutisch einzusetzenden Injektionslösung verdünnt und der Mischung nach Ansprüch 3 oder den eukaryotischen Expressionsplasmiden nach Anspruch 1 oder 2 zugesetzt werden. Im Mittel kann er in finalen Konzentrationen von 0,01 bis 100% (v/v), vorzugsweise 0,1 bis 10% (v/v), mehr bevorzugt 5% (v/v), zum Einsatz kommen. Glycerin (1,2,3- Propantriol/Merck, Darmstadt, D) kann zur Injektion mit sterilem Wasser, NaCl-Lösung oder einer anderen pharmazeutisch einzusetzenden Injektionslösung verdünnt und der Mischung nach Anspruch 3 oder den eukaryotischen Expressionsplasmiden nach Anspruch 1 oder 2 zugesetzt werden. Im Mittel kann es in finalen Konzentrationen von 0,1 bis 100% (v/v), vorzugsweise 1 bis 50% (v/v), mehr bevorzugt 20% (v/v), zum Einsatz kommen. DMSO (Burlington Bio-Medical Cooperation, N. Y., USA) ist eine aprotische Lösung, die den Eintritt zahlreicher lokal applizierter Pharmaka in die Zelle erleichtert. Zusätzlich hat DMSO antiinflammatorische und lokal anästhetische Eigenschaften. DMSO kann zur Injektion mit sterilem Wasser, NaCl-Lösung oder einer anderen pharmazeutisch einzusetzenden Injektionslösung verdünnt und der Mischung nach Anspruch 3 oder den eukaryotischen Expressionsplasmiden nach Anspruch 1 oder 2 zugesetzt werden. Im Mittel kann es in finalen Konzentrationen von 0,1 bis 100% (v/v), vorzugsweise 1 bis 50% (v/v), mehr bevorzugt 20% (v/v), zum Einsatz kommen.

Als Stabilisatoren können Gelatine und/oder Albumin (Merck, Darmstadt, D) zugesetzt werden. Zur Herstellung der Isotonie können Additive (alle bei Merck, Darmstadt, D, erhältlich) wie Natriumchlorid, Dextrose, Mannit, Sorbit, Laktose zugegeben werden. Zur Verzögerung der Plasmidfreisetzung kann das Mittel Kollagen enthalten. Kollagen (Medicus Technologies Inc., Pennsylvania, USA) wird in Megen von 50 Mikroliter bis 2 Milliliter eingesetzt, ca. 100 Mikrogramm eukaryotische Plasmid-DNA nach Anspruch 1 oder 2 oder eine Mischung eukaryotischer Plasmid-DNA nach Anspruch 3 werden mit je 1 Milliliter Kollagen gemischt. Weitere Angaben zur verzögerten Plasmid-Freisetzung können der Literatur (Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Oso) entnommen werden.

Es ist jede beliebige Kombination aus ein oder mehreren Hilfsstoffen allein oder in Kombination mit ein oder mehreren Stabilisatoren oder in Kombination mit ein oder mehreren Substanzen zur Herstellung der Isotonie mit und ohne Kollagenzusatz erlaubt. Auch der Einsatz von Stabilisatoren oder Substanzen zur Herstellung der Isotonie ohne den gleichzeitigen Einsatz von Hilfsstoffen mit und ohne Kollagen bis zum Einsatz nur eines Stabilisators oder einer die Isotonie herstellenden Substanz ohne den gleichzeitigen Einsatz von Hilfsstoffen mit und ohne Kollagen ist erlaubt. In jedem Falle werden die resultierenden Lösungen steril und pyrogenfrei eingesetzt.

Zur Herstellung des Mittels werden der Mischung gemäß Anspruch 3 oder den eukaryotischen Expressionsplasmiden gemäß Anspruch 1 oder 2 beliebig viele Substanzen gemäß Anspruch 4 steril und pyrogenfrei zugesetzt. Eine homogene Verteilung aller Komponenten in der Lösung wird durch Rühren gewährleistet. Die eukaryotischen Expressionsplasmide und alle erwählten Zutaten des Mittels können in Mengen für eine Applikation in Ampullen oder in Multidose-Containern steril und pyrogenfrei abgefüllt werden. Die Ampullen oder Multidose-Container werden hermetisch versiegelt, um die Sterilität bis zur Anwendung zu garantieren.

Gegenstand der Erfindung ist zudem die Verwendung eines Mittels zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der peripheren arterielle Verschlußkrankheit.

Zahlreiche Applikationsformen eines erfindungsgemäßen Mittels sind möglich, so z. B. intramuskulär, intraperitoneal, intradermal, subcutan, intravenös und intraarteriell. Bevorzugt sind die intramuskuläre, intradermale und subcutane Verabreichung. Besonders bevorzugt ist die intramuskuläre Applikation. Die Applikation kann mit Hilfe z. B. einer hypodermischen Nadel oder transkutaner Patchtechnik erfolgen.

Eingebracht werden kann ein Mittel nach Anspruch 4 in jedes ischämische Gewebe (z. B. Muskel, Gehirn, Niere, Lunge, Herz). Bevorzugt ist die Anwendung beim diabetischen Patienten insbesondere in der Muskulatur des Beines und/oder Fußes insbesondere bei dem Krankheitsbild der peripheren arteriellen Verschlußkrankheit.

Das Mittel nach Anspruch 4 kann einmalig oder mehrmals an einer oder an mehreren Stellen zu einem oder zu mehreren Zeitpunkten verabreicht werden. Abhängig von der Schwere der Krankheit, der gewählten Applikationsform und der eingesetzten Expressionskassette/den eingesetzten Expressionskassetten (z. B. des Promotors, der proteincodierenden Sequenz, Stabilitätsfaktoren) kann der Zeitraum, in dem vorzugsweise 4-5 Injektionen verabreicht werden, variieren. Die Zeitspanne zwischen der ersten Injektion/den ersten Injektionen bis zu der Folgeinjektion/den Folgeinjektionen kann von 24 Stunden über zwei Wochen bis weit darüber hinaus reichen. Die Dosierung des Medikamentes hängt unter anderem von Alter, Zustand und Gewicht des Patienten sowie von der Schwere der Krankheit, der gewählten Applikationsform und der gewählten Expressionskassette/den gewählten Expressionskassetten ab. Möglich sind Plasmidgesamtmengen von 1 Nanogramm bis zu 10 Milligramm. In manchen Fällen werden Plasmidmengen zwischen 1 Mikrogramm und 1 Milligramm eingesetzt.

Claims (5)

1. Eukaryotische Expressionsplasmide enthaltend in jeweils getrennten Expressionskassetten je eine codierende Sequenz für humanes VEGF₁₆₅ in Kombination mit mindestens einer codierenden Sequenz aus der Gruppe humanes Leptin, humanes Thrombomodulin, humane Prostazyklinsynthase und/oder humane konstitutive NO-Synthase, ausgenommen der Kombination von VEGF₁₆₅ und der konstitutiven NO-Synthase sowie die codierende Sequenz für humanes Leptin in Kombination mit mindestens einer codierenden Sequenz aus der Gruppe humanes Thrombomodulin, humane Prostazyklinsynthase und/oder humane konstitutive NO-Synthase sowie weiterem humanen Leptin.

2. Eukaryotische Expressionsplasmide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu der bereits vorhandenen codierenden Sequenz für humanes VEGF₁₆₅ mindestens eine weitere codierende Sequenz für humanes VEGF₁₆₅ vorhanden ist, wenn gleichzeitig mindestens die codierende Sequenz eines Vertreters auch der Gruppe humanes Leptin, humanes Thrombomodulin, humane Prostazyklinsynthase und/oder humane konstitutive NO-Synthase vorhanden ist.

3. Mischung enthaltend ein oder mehrere Plasmide nach Anspruch 1 oder 2 und gegebenenfalls zusätzliche Plasmide mit nur einer Expressionskassette, enthaltend eine codierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe VEGF₁₆₅, Leptin, cNOS, PGIS, Thrombomodulin.

4. Mittel, enthaltend ein oder mehrere Plasmide nach Anspruch 1 und/oder 2 und/oder 3 in einer unter Plasmid aufgeführten Lösung und/oder Additive aus der Gruppe Ethanol, Glycerin, DMSO, Gelatine, Albumin, Natriumchlorid, Dextrose, Mannitol, Sorbitol, Laktose, Kollagen.

5. Verwendung einer Substanz gemäß Anspruch 1 oder 2 oder 3 oder 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der peripheren arteriellen Verschlußkrankheit.