CN102344937A

CN102344937A - 重组人血管内皮生长因子165与免疫球蛋白Fc片段融合蛋白(VEGF165-Fc)的实验技术

Info

Publication number: CN102344937A
Application number: CN2011102743594A
Authority: CN
Inventors: 柴笑梅; 朱月珍; 杨宣武; 周慧芳; 卢守英; 江永海
Original assignee: ABZYME BIOTECHNOLOGY Inc
Current assignee: ABZYME BIOTECHNOLOGY Inc
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2012-02-08

Abstract

本发明涉及一种将人重组人血管内皮生长因子165与人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合基因(VEGF165-Fc)转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋白产物的技术。本发明旨在建立用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的VEGF165-Fc蛋白的方法。在工业生产中满足生产成本降低、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的VEGF165-Fc蛋白。本项技术应用于VEGF165-Fc蛋白的大规模生产，能够明显降低成本、简化工艺流程，提高产品产量和质量。

Description

重组人血管内皮生长因子165与免疫球蛋白Fc片段融合蛋白(VEGF165-Fc)的实验技术

技术领域

本发明涉及一种将人重组人血管内皮生长因子165与人免疫球蛋白IgGl的Fc段融合基因(VEGF165-Fc)转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋白产物的技术。

背景技术

1.VEGF的生物学作用与应用前景

血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)，也称血管渗透因子(vascular permeability factor，VPF)，是由Ferrara N等人于1989年在牛垂体滤泡星状细胞培养液中纯化得到的一种糖蛋白。VEGF由单一基因编码，经过可变剪切可形成至少5种不同的同源二聚体糖蛋白产物，它们分别是VEGF121，VEGF145，VEGF165，EGF189和VEGF206。VEGF是内皮细胞的特异性丝裂原，通过结合其受体(主要是VEGFR2)激活胞内酪氨酸激酶，启动下游信号通路，进而促使新脉管生长、功能调节及肿瘤的侵润和转移等过程中发挥重要的作用。

VEGF是内皮细胞分化和新生脉管萌芽的关键性刺激因子，是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的有丝分裂原。VEGF与内皮细胞上的两种受体KDR和Flt-1高亲和力结合后，直接刺激血管内皮细胞发生增殖分裂，并诱导血管内皮细胞迁移和形成脉管结构；VEGF还可增加微血管通透性，引起血浆蛋白如纤维蛋白原外渗，并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成，在血管发生和形成过程中起着中枢性的调控作用，对于发育及损伤修复过程中血管的形成至关重要。

VEGF诱导的血管形成和血管通透性增加对于肿瘤的侵润和转移是必需的。肿瘤细胞通过释放VEGF激活血管内皮细胞，促进内皮细胞的增殖和迁移，内皮细胞又能通过旁分泌效应产生某些生长因子刺激肿瘤细胞的生长。另外，VEGF与其它因子还能诱导血管内皮细胞分泌某些蛋白酶类，水解血管下基质，使内皮细胞穿过基质向肿瘤组织迁移，肿瘤细胞则通过这些蛋白酶向反方向运动从而使肿瘤细胞更易于发生浸润。肿瘤组织的新生血管结构及功能异常，血管基质不完善，肿瘤细胞易发生渗漏，可直接穿透到血管内进入血流并在远端形成转移。研究还表明，新生血管的生长速度及其密集程度与肿瘤的恶性程度呈正相关。

VEGF在肿瘤的发展转移过程中起重要作用，VEGF作为药物作用的靶点抑制血管形成能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。2004年，Genentech公司开发的VEGF单克隆抗体Bevacizumab(商品名：Avastin)获得了美国食品和药物管理局的批准上市用于一线治疗晚期结直肠癌。Bevacizumab通过封闭VEGF阻止肿瘤细胞中新生血管的生成，从而起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。除VEGF单抗之外，可溶性受体VEGFR的开发是针对VEGF进行靶向治疗的另一途径。可溶性VEGFR通过拮抗性结合VEGF或与膜结合型VEGFR结合形成异二聚体，抑制VEGF与膜结合型受体结合从而阻断其下游的信号通路，产生抗肿瘤活性。

VEGF还与其它疾病的发生和发展关系密切，VEGF可作为其它疾病的诊断指标和治疗靶点。目前应用VEGF抑制剂治疗新生血管性眼病已受到越来越多的重视。2006年，Genentech公司开发的多克隆抗体片段Ranibizumab(商品名为Lucentis)，得到美国FDA批准应用于眼科疾病的治疗。Ranibizumab可与VEGF的所有异构体结合并使其失活，从而抑制新生血管的形成。其它抑制VEGF的相关药物如哌加他尼钠(Pegaptanib sodium)，VEGF-trap等也已获得FDA审批或正在进入临床试验，用于眼科疾病的治疗。除眼病外，VEGF还在高血压病动脉粥样硬化、糖尿病肾病等过程中发挥重要作用。VEGF相关蛋白产品和诊断试剂盒的开发有望为某些疾病提供早期诊断的依据和疾病靶向治疗的基础。

VEGF自身作为药物治疗局部缺血性疾病前景广阔。研究表明，用转染的VEGF165给药治疗缺血肢体，患处血管侧枝数量明显提高，且其数量与VEGF165剂量呈正相关；动物实验结果证实VEGF165转染血管平滑肌细胞，损失部位内皮再生加快、修复完整，血管舒张反应恢复。1996年，FDA批准VEGF治疗了1例缺血性坏疽准备截肢的患者。术后可见明显的血管生成现象，形成了新生的血管侧枝，有效地延缓了疾病的进程。另有报道用重组人VEGF表达载体直接肌肉注射的方法治疗难以治疗性溃疡患者能诱导侧枝血管形成，部分患者溃疡治愈或明显改善。VEGF蛋白可用于手术及介入治疗的替代方案。

VEGF作为一种特异的多功能细胞因子，参与了多种疾病的发生发展，针对其展开的靶向研究及其相关药物的开发对于相关疾病的诊断和治疗有重要意义。开发与其配套的早期诊断试剂盒或寻找能够降低或抑制其表达和功能的药物，将会为某些疾病的诊断和治疗提供新的希望。重组VEGF蛋白的生产将为这些方面的研究提供更多的空间，在药物研究及临床检验中具有很大的市场潜力。

2.Fc融合蛋白的表达

免疫球蛋白IgG的Fc融合蛋白是指在基因水平将目的基因同IgG的Fc片段基因相连而表达的重组蛋白，同时具有目的蛋白及免疫球蛋白的结构域，从而赋予了重组蛋白许多新的特性，拓展了蛋白在科研、制药及临床等方面的应用。

在重组蛋白表达的过程中，Fc重组蛋白易于结合Protein A，从而简化了蛋白的纯化过程；Fc片段可以方便地进行流式、免疫组化和免疫共沉淀等方法检测，可用于感兴趣的基因研究；体外实验中，Fc融合蛋白可用于拮抗或激活细胞表面受体用来研究受体-配体反应和信号通路；此外，Fc重组蛋白还能应用于噬菌体展示技术，如作为抗原制备人类全抗体库。

另外，Fc片段还赋予了重组蛋白一些其它特性，增加了其在在制药和临床方面的应用价值。融合蛋白中加入重链的恒定区，其半衰期明显延长，延长了其在体内的半衰期；Fc段能穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用等；重组蛋白含有的铰链区结构域使其形成二聚体或多聚体，增强了其抗原结合力。以上这些特点拓展了融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗方面的临床应用前景。

3.研究现状

目前国际上生产的VEGF165-Fc重组蛋白基本都是采用大肠杆菌或酵母表达系统获得的，蛋白产物未经糖基化或糖基化程度不高，活性和毒素含量难以满足临床诊断和治疗的目的。用哺乳动物细胞生VEGF165-Fc重组蛋白是生产科研和临床用VEGF165的重要途径，对于推动临床诊断环节的新型生物技术发展和临床药物开发具有重要意义。

发明内容

本发明旨在建立用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的VEGF165-Fc蛋白的方法。在工业生产中满足生产成本降低、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。

本发明包括制备转染用质粒和PEI、质粒转染293T细胞和表达、蛋白纯化及等四个步骤。用PEI作为转染试剂，其作为“质子海绵”可以高效地结合双链DNA，把其带入目的细胞中，蛋白产物可在短暂的时间(一般可以表达一周的时间)内获得一过性表达从而获得大量的蛋白。

本发明所用的293T细胞是工业生产人临床用蛋白最为常见的一种细胞。不仅表达水平高，蛋白翻译后加工方式如糖基化等与体内天然蛋白相似，而且无潜在的生物危害性，自身分泌的蛋白很少从而简化了后续的纯化过程，特别适于分泌型细胞因子或趋化因子等产物的大规模生产。而且这种细胞可以通过驯化在无血清培养基中生产，对于降低工业生产的成本是必需的。细胞密度能够提高数十倍甚至数千倍，大大提高了蛋白产量。

采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的VEGF165-Fc蛋白。本项技术应用于VEGF165-Fc蛋白的大规模生产，能够明显降低成本、简化工艺流程，提高产品产量和质量。

附图说明：

图1是SDS-PAGE鉴定Protein A亲和层析柱纯化后的VEGF165-Fc重组蛋白电泳结果图(1.洗脱液E-1；2.洗脱液E-2；3.洗脱液E-3；4.洗脱液E-4；5.Prestained Marker；6.还原条件下的E-1；7.还原条件下的E-2；8.还原条件下的E-3；9.还原条件下的E-2)

图2是VEGF165-Fc蛋白经superdex 200纯化柱纯化的峰图

图3是SDS-PAGE分析VEGF165-Fc经superdex 200纯化柱洗脱液蛋白电泳结果图(非还原条件)

图4是SDS-PAGE鉴定经superdex 200纯化的VEGF165-Fc蛋白电泳结果图，蛋白纯度＞95％(非还原条件下)

具体实施方式

1.转染用质粒的制备

用去除内毒素的质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)制备转染所需连有VEGF165-Fc基因的表达质粒pR-VEGF165-Fc。方法见说明书。用200μl TE缓冲液溶解质粒，紫外分光光度计测其浓度。

2.转染用PEI的制备

1)在500ml的烧杯中倒入450ml Milli-Q制备的超纯水；

2)天平称量500mg线性PEI(购自Poly Science公司)，加入烧杯中，磁力搅拌器不断搅动；

3)逐滴加入预先配好的12M浓HCI使其pH＜2.0(大约需要800μl)。搅动PEI溶液约2-3小时；

4)加入预先配制的10M NaOH溶液将pH调至7.0(大约需要500μl)。用Milli-Q超纯水将PEI溶液定容至500ml。

5)0.22-μm滤膜过滤PEI溶液，分装成1ml/管，-20℃保存。

3.质粒转染293T细胞

1)转染前1天(约24小时)，将293T细胞用无抗、含10％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，按照5×10⁵/ml铺入150mm培养皿中，每瓶加入25mL，5％CO2培养箱中培养过夜；

2)转染当天，将所需的Opti MEM培养基(或磷酸盐缓冲液)预热到25°-37℃。冰上溶解连接VEGF165-Fc基因的表达质粒和PEI；

3)在5ml的Ep管中加入2.5ml Opti MEM/PBS，加入43.75μg连有VEGF165-Fc基因的质粒DNA(紫外分光光度计测其浓度后，加入洗脱缓冲液调整浓度至1ug/ul)，在振荡器上轻轻涡旋；

4)加入262.5μL1mg/ml的PEI，立即在振荡器上振荡3次，每次3秒钟。室温下将混合液孵育15分钟；

5)取出预先铺入培养皿的细胞，将DNA/PEI混合液加入细胞培养液中，，轻轻摇晃培养瓶混匀；将细胞放入培养箱中继续培养。

4.表达产物收集及纯化

1)转染6小时后，将细胞培养皿完全中培养基吸出，加入25ml无血清培养基(serum freemedia，SFM)。同时加入4mM L-谷氨酰胺的和1mM的丙酮酸钠后继续培养；

2)转染后2天和4天分别换液并且加入新鲜的SFM及L-谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠。收集细胞上清(注意不要把细胞去掉)，12,000rpm/min离心10min去死细胞和细胞碎片；

3)将上清与等体积的结合/漂洗缓冲液(0.15M NaCl，20mM Na₂HPO₄，pH8.0)。与此同时，用超纯水洗涤蛋白纯化柱，再用1ml结合/漂洗缓冲液洗柱子；

4)吸取1ml ProteinA的Resin加入纯化柱，使其中的液体流尽；加入5mL结合/漂洗缓冲液平衡柱子，使其流速为1ml/min；

5)将稀释后的上清液上柱，调节流速为0.5ml/min；

6)20mL结合/漂洗缓冲液洗柱，调节流速为2ml/min；

7)最后用4×1ml 0.1M洗脱缓冲液(glycine，pH 2.5)洗脱蛋白产物，用1.5ml离心管收集液体，管中预先加入110ul 1M pH 8.5的Tris-Cl调节pH值。紫外分光光度计及SDS-PAGE测蛋白浓度及纯度见附图1。

5.凝胶过滤层析进一步纯化目的蛋白

将洗脱的蛋白产物混合后浓缩至约0.5ml，过superdex 20010/300纯化柱进一步纯化。上柱前先用S200gel filtration column buffer(50mM Tris pH8.0，100mM NaCl)平衡柱子，上样后用相同的缓冲液淋洗蛋白，组分收集器收集洗脱液0.5ml/管。superdex 200纯化峰图见附图2及SDS-PAGE分析纯化柱洗脱液蛋白电泳结果图见附图3，经superdex 200进一步纯化，SDS-PAGE验证获得的是高纯度的蛋白见附图4，蛋白纯度＞95％

Claims

1.一种用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性V165-Fc的蛋白的方法，其特征在于该方法通过如下步骤用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的V165-Fc蛋白：制备转染用质粒和PEI、质粒转染293T细胞和表达、蛋白纯化及等四个步骤。

2.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的V165-Fc蛋白，特征在于所述的V165-Fc是通过能稳定生产的哺乳动物细胞中制备纯化的。

3.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的V165-Fc蛋白，特征在于所述的V165-Fc的表达为分泌性的可溶性蛋白。

4.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的V165-Fc蛋白，特征在于所述的V165-Fc作为生物制剂应用于研究和临床诊断。