DE69636764T2

DE69636764T2 - Zusammensetzungen zur behandlung von ischamischem gewebe

Info

Publication number: DE69636764T2
Application number: DE69636764T
Authority: DE
Inventors: M. Jeffrey Weston ISNER
Original assignee: St Elizabeths Medical Center of Boston Inc
Current assignee: St Elizabeths Medical Center of Boston Inc
Priority date: 1995-10-20
Filing date: 1996-10-18
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2016-10-19
Also published as: WO1997014307A1; JP2011219502A; EP1625858B1; ATE419014T1; JP2008024718A; DE69637800D1; ATE347910T1; CA2235372A1; EP1625858A1; US6121246A; AU7454896A; CA2235372C; AU725290B2; JPH11514366A; EP0883343A4; EP0883343A1; DE69636764D1; EP0883343B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Verstärkung der Entwicklung von Blutgefäßen in ischämischem Gewebe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die therapeutischen Implikationen von angiogenen Wachstumsfaktoren wurden vor mehr als zwei Jahrzehnten zuerst von Folkman und Kollegen beschrieben (Folkman, N Engl J Med, 285: 1182–1186 (1971)). Neuere Untersuchungen haben ergeben, dass rekombinante angiogene Wachstumsfaktoren, beispielsweise aus der Familie der Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF, fibroblast growth factor) (Yanagisawa-Miwa et al., Science, 257: 1401–1403 (1992) und Baffour et al., J Vasc Surg, 16: 181–91 (1992)), Endothelzellwachstumsfaktoren (ECGF, endothelial cell growth factor) (PU et al., J Surg Res, 54: 575–83 (1993)) und, in jüngster Zeit, Gefäßendothelwachstumsfaktoren (VEGF, vascular endothelial growth factor) zur Beschleunigung und/oder Steigerung der Entwicklung von Kollateralarterien in Tiermodellen mit Myokardischämie oder Ischämie der hinteren Extremitäten (Takeshita et al., Circulation, 90: 228–234 (1994) und Takeshita et al., J Clin Invest, 93: 662–70 (1994)) verwendet werden können. In Studien mit rekombinanten angiogenen Wachstumsfaktoren wurde der Wachstumsfaktor über einen Zeitraum von 10 bis 14 Tagen wiederholt intramuskulär verabreicht. Somit wird die Therapie mit rekombinanten Proteinen hauptsächlich durch die Notwendigkeit eingeschränkt, möglicherweise über längere Zeit eine optimal hohe und lokale Konzentration aufrechterhalten zu müssen.
Bisher eingesetzte Gentransfersysteme sind durch zwei Hauptkomponenten gekennzeichnet, nämlich eine Makrotransfer-Vorrichtung, die für den Transfer der DNS-Träger-Mischung zu dem betreffenden Gefäßabschnitt bestimmt ist, sowie ein Mikrotransfer-Vehikel, beispielsweise Liposomen, die benutzt werden, um das Eindringen der DNS in die Zellen der Arterienwand durch die Membran zu unterstützen. Der Makrotransfer erfolgt typischerweise mit Hilfe eines oder zweier Katheter, die anfänglich für die lokale Verabreichung von Medikamenten entwickelt worden waren; dabei handelt es sich um einen Doppelballonkatheter, der zur Lokalisierung eines serumfreien Arteriensegmentes, in den die Träger-DNS-Mischung injiziert werden kann, dient, oder um einen Katheter mit porösem Ballon, mit dem Genlösungen unter Druck in die Arterienwand injiziert werden. Jorgensen et al., Lancet 1: 1106–1108 (1989); Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol., 15: 475–485 (1990); March et al., Cardio Intervention, 2: 11–26 (1992)); WO 93/00051 und WO 93/00052.
Doppelballonkatheter sind Katheter, bei denen zwischen den in den Kathetern befindlichen Ballons ein Raum verbleibt, wenn diese in einer Arterie aufgepumpt werden. Bei bisherigen Versuchen wurde DNS-haltiges Material zwischen die Ballons infundiert, wo das DNS-Material eine Zeitlang ruhen konnte und so den Transfer zu den Zellen ermöglichte; anschließend wurde die Luft aus den Ballons abgelassen, so dass das restliche genetische Material die Arterie hinunterströmen konnte. Perforierte Ballons sind Ballons mit kleinen Löchern, welche typischerweise mit Hilfe von Lasern ausgebildet werden. Im Gebrauch wird eine das genetische Material enthaltende Flüssigkeit durch die Löcher in den Ballons ausgestoßen, so dass sie in Kontakt mit den Endothelzellen in der Arterie kommt. Diese Gentransfersysteme sind jedoch durch Probleme mit der Wirksamkeit und/oder Sicherheit in Frage gestellt.
Es wurde dessenungeachtet erkannt, dass für den Gebrauch von Doppelballonkathetern und Kathetern mit porösem Ballon gewisse Notwendigkeiten bestehen. Beispielsweise können weder Doppelballonkatheter noch Katheter mit porösem Ballon für die Durchführung der Gefäßplastik selbst verwendet werden. Somit müssen bei Anwendungen, welche sowohl eine Gefäßplastik als auch die Gabe von Medikamenten erfordern, um beispielsweise eine erneute Stenose zu verhindern, zwei Verfahren durchgeführt werden. Zudem benötigt der Doppelballon typischerweise lange Inkubationszeiten von 20 bis 30 Minuten, während die für die transmurale Medikamentenabgabe aus dem Katheter mit durchlässigem Ballon verantwortlichen Hochgeschwindigkeitsdüsen mit einer Arterienperforation und/oder einer starken entzündlichen Infiltration in Zusammenhang gebracht wurden (Wolinsky et al., siehe oben).
Vor kurzem wurde die Durchführbarkeit einer intraarteriellen Gentherapie für die Behandlung von Ischämien in einem Kaninchenmodell mit VEGF nachgewiesen, wobei ein anderes Gentransfersystem verwendet wurde, nämlich ein hydrogelbeschichteter Angioplastieballon. Ein erfolgreicher Transfer und eine anhaltende Expression des VEGF-Gens in der Gefäßwand steigerten anschließend die Gefäß neubildung in der ischämischen Extremität (Takeshita et al., Proc Natl Acad Sci USA (in Druck)). Jedoch sind aus einer Reihe von Gründen immer noch alternative Methoden für die Auslösung der Angiogenese wünschenswert. Zum einen kann die Verwendung von katheterbasierten Gentransfersystemen einen nicht voraussagbaren plötzlichen Verschluss oder eine schwere Beschädigung an der Stelle der Ballondilatation verursachen. Die Folgen können noch schwerwiegender sein, wenn es sich bei der beschädigten Arterie um die Hauptversorgung der vorhandenen Kollateralen oder das einzige offene Gefäß handelt, welches das ischämische Gewebe versorgt. Zum anderen kann es besonders bei diffusen Gefäßerkrankungen schwierig sein, einen Katheter bis zur distalen Läsion einzuführen. Schließlich ist es trotz großer Fortschritte bei den Methoden sowohl der operativen als auch der perkutanen Revaskularisation bei vielen Patienten mit einer diffusen peripheren Gefäßerkrankung nicht möglich, die Gliedmaßen zu retten und die ischämischen Schmerzen zu lindern. Isner et al., Circulation, 88: 1534–1557 (1993)).
Bei der gestreiften Muskulator von Tieren wurde gezeigt, dass diese injizierte fremde Markergene, die in Form von Plasmid-DNS transferiert wurden, aufnehmen und exprimieren (Wolff et al., Science, 247: 1465–1468 (1990)). Die therapeutische Gentransfektion in Form von direkt in die Muskeln injizierter „nackter" Plasmid-DNS ist gegenüber Verfahren, bei denen virale Vektoren und katheterbasierte Transfersysteme eingesetzt werden, von Vorteil. In erster Linie ist sie frei von mit viralen Proteinen verbundenen immunologischen Reaktionen (Miller, Nature, 357: 455–60 (1992)) und vermeidet mögliche Gefäßverletzungen aufgrund von Verfahren, die für die Katheterein führung oder Ballondilatation verwendet werden. Jedoch erachtet man die Expression eines direkten Gentransfers als zu ungenügend, als dass sie für die Anwendung in Gentherapieversuchen am Menschen in Betracht käme (Wolff et al., siehe oben, und Jiao et al., Hum Gene Ther, 3: 21–33 (1992)). In Circulation, 91, 1995, 2687–2692, führte der Transfer eines einen Plasmidkode enthaltenden VEGF über die Hydrogelbeschichtung eines Ballonkatheters in ischämisches Gewebe zu einer Augmentation der Kollateralen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nun entdeckt, dass mit Nukleinsäure (DNS oder RNS), mit der ein angiogenes Protein (ein Protein, das Angiogenese bewirken, d.h. neue Blutgefäße bilden kann) exprimiert werden kann, eine Antiogenese ausgelöst werden kann, wenn sie in ischämisches Gewebe injiziert wird, so dass das ischämische Gewebe mit mehr Blutgefäßen versehen wird. Dies ermöglicht die Behandlung von ischämischem Gewebe in Verbindung mit ischämischen Erkrankungen, wobei gleichzeitig die Verwendung anderer Gentransfersysteme vermieden wird.
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung einer Nukleinsäure vor, mit der ein angiogenes VEGF-(vascular endothelial growth factor, Gefäßendotehl-Wachstumsfaktor-)Protein exprimiert werden kann, wobei es sich bei dem angiogenen VEGF-Protein um einen Endothelwachstumsfaktor handelt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Ischämie durch die Injektion der Nukleinsäure in ischämisches Gewebe.
Die vorliegende Erfindung kann für die Behandlung jedes beliebigen ischämischen Gewebes, d.h. eines Gewebes, welches infolge einer ischämischen Erkrankung einen Blutmangel aufweist, verwendet werden. Bei derartigem Gewebe kann es sich beispielsweise um Muskel, Gehirn, Niere und Lunge handeln. Zu den ischämischen Erkrankungen gehören beispielsweise cerebrovaskuläre Ischämie, renale Ischämie, pulmonale Ischämie, Ischämie in den Extremitäten, ischämische Kardiomyopathie und Myokardischämie.
Die Nukleinsäure kann mittels eines beliebigen Injektionsmittels in das ischämische Gewebe injiziert werden. Ein bevorzugtes Mittel ist eine Injektionsnadel. Weitere Mittel umfassen eine äußerlich angebrachte lokale Injektionsvorrichtung, wie sie beispielsweise für die Injektion von Antigenen bei Allergietests Verwendung findet, oder einen transkutanen „Lappen", der für die Abgabe in die subkutane Muskulatur geeignet ist. Die Nukleinsäure kann auch an mehr als nur einer Stelle in das ischämische Gewebe injiziert werden. Gegebenenfalls kann die Nukleinsäure erneut injiziert werden, um eine zusätzliche Expression des angiogenen Proteins vorzusehen.
Die vorliegende Erfindung benötigt kein Mikrotransfer-Vehikel, wie beispielsweise kationische Liposomen und adenovirale Vektoren, jedoch können derartige Vehikel als Träger für die Nukleinsäure dienen. Es können Nukleinsäuren, die den Kode für verschiedene angiogene Proteine enthalten, getrennt voneinander oder gleichzeitig verwendet werden.
Im vorliegenden Dokument steht der Begriff „angiogenes Protein" für jedes beliebige Protein, Polypeptid, Mutein oder Bruchstück desselben, das in der Lage ist, direkt oder indirekt die Bildung neuer Blutgefäße anzuregen. Zu derartigen Proteinen gehören beispielsweise saure und basische Fibroblastenwachstumsfaktoren (aFGF und bFGF) und Gefäßendothel-Wachstumsfaktoren (VEGF). Vorzugsweise enthält das angiogene Protein eine Sekretions-Signalsequenz, welche die Sekretion des Proteins ermöglicht. VEGF ist das Protein, auf dem die vorliegende Erfindung beruht.
Der Begriff „effektive Menge" meint eine Menge der in die Zellen des ischämischen Gewebes abgegebenen Nukleinsäure, die ausreicht, um einen angemessenen Spiegel des angiogenen Proteins zu erzeugen, d.h. einen Spiegel, der eine Angiogenese bewirken kann. Somit ist der Spiegel des exprimierten Proteins ein entscheidender Faktor. Dementsprechend kann man mehrere Transkripte verwenden oder das Gen unter der Kontrolle eines Promoters halten, der zu hohen Expressionsspiegeln führt. In einer alternativen Ausgestaltung steht das Gen unter der Kontrolle eines Faktors, der zu außergewöhnlich hohen Expressionsspiegeln führt, beispielsweise TAT und das entsprechende TAR-Element.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B zeigen repräsentative Angiogramme, die an Tag 30 sowohl von den Kontrolltieren (1B) als auch den mit VEGF behandelten Tieren (1A) aufgenommen wurden.
2A und 2B zeigen den angiographischen Score, der in den akuten (2A) und den chronischen (2B) Ischämiemodellen beobachtet wurde.
3A und 3B zeigen die günstige Wirkung des intramuskulären VEGF-Gentransfers bei der Revaskularisation auf Kapillarebene (3A: VEGF, 3B: Kontrolle).
4A und 4B zeigen die Kapillardichte und das Kapillaren-Muskelzellen-Verhältnis sowohl für die akute Ischämie (4A) als auch das chronische Modell (4B) von Ischämie in den Extremitäten.
5A und 5B zeigen die Verringerung des hämodynamischen Defizits in der ischämischen Extremität sowohl für die akute Ischämie (5A) als auch das chronische Modell (5B) nach intramuskulärer VEGF-Transfektion, bestätigt durch Messung des Wadenblutdrucks.
6 zeigt den Zeitverlauf der VEGF-Expression. Spur 1: Marker; Spur 2: positive Kontrolle; Spur 3: nicht-transfizierter Muskel; Spur 4: bei RT; Spur 5, 6, 7 und 8: 3, 7, 14 beziehungsweise 30 Tage nach Transfektion.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung einer Nukleinsäure vor, mit der ein angiogenes VEGF-(vascular endothelial growth factor, Gefäßendotehl-Wachstumsfaktor-)Protein exprimiert werden kann, wobei es sich bei dem angiogenen VEGF-Protein um einen Endothelwachstumsfaktor handelt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Ischämie durch die Injektion der Nukleinsäure in ischämisches Gewebe.
Die den Kode des angiogenen Proteins enthaltende Nukleinsäure ist auf operative Weise mit einem Promoter (Nukleinsäurekassette) verknüpft, so dass das Protein bei Abgabe in das ischämische Gewebe exprimiert wird.
Die daraus resultierende Expression des angiogenen Proteins führt zu einer erhöhten Ausbildung von Blutgefäßen in dem gesamten ischämischen Gewebe. Die Verwendung [Methoden] einer Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung kann für die Behandlung von ischämischem Gewebe erfolgen, welches aus ischämischen Erkrankungen entstanden ist, beispielsweise cerebrovaskulärer Ischämie, renaler Ischämie, pulmonaler Ischämie, Ischämie in den Extremitäten, ischämischer Kardiomyopathie und Myokardischämie.
Bei der Nukleinsäure kann es sich um eine beliebige Nukleinsäure (DNS oder RNS), einschließlich genomischer DNS, cDNS und mRNS, handeln, welche den Kode eines angiogenen Proteins enthalten, d.h. eines Proteins, Polypeptids, Muteins oder Bruchstücks desselben, das in der Lage ist, direkt oder indirekt die Bildung neuer Blutgefäße anzuregen. Zu derartigen Proteinen gehören beispielsweise jedes beliebige Protein, Polypeptid, Mutein oder Brückstück desselben, welches in der Lage ist, direkt oder indirekt die Bildung neuer Blutgefäße anzuregen. Folkman et al., Science, 235: 442–447 (1987). Diese umfassen beispielsweise Gefäßendothel-Wachstumsfaktoren (VEGF, vascular endothelial growth factor). Muteine oder Fragmente eines angiogenen Proteins können verwendet werden, solange sie die Bildung neuer Blutgefäße induzieren oder fördern. VEGF ist das Protein, auf dem die vorliegende Erfindung beruht.
Neuere Untersuchungen haben ergeben, dass rekombinante Formulierungen von angiogenen Wachstumsfaktoren zur Beschleunigung und/oder Steigerung der Entwicklung von Kollateralarterien in Tiermodellen mit Myokardischämie oder Ischämie der hinteren Extremitäten verwendet werden können. Siehe Baffour et al., siehe oben (bFGF); Pu et al., Circulation, 88: 208–215 (1993) (aFGF); Yanagisawa-Miwa et al., siehe oben (bFGF); Ferrara et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 161: 851–855 (1989) (VEGF).
Darüber hinaus wurde in den gleichen oder eng verwandten Modellen nach der Verabreichung von rekominantem Endothelzellwachstumsfaktor (ECGF, endothelial cell growth factor) (Pu et al., Circulation, 88: 208–215 (1993)) und VEGF (Takeshita et al., Circulation, 90: 228–234 (1994) siehe oben) eine therapeutische Angiogenese erzielt. In früheren Studien, bei denen das Tiermodell mit einer chronischen Ischämie in den Extremitäten verwendet wurde, wurde eine Wirksamkeit der Verabreichung von intramuskulärem Endothelzellwachstumsfaktor (ECGF) (Pu et al., Circulation, 88: 208–215 (1993)) oder VEGF (Takeshita et al., Circulation, 90: 228–234 (1994) siehe oben) nachgewiesen.
VEGF wurde unabhängig als Tumorsekretionsfaktor mit Gefäßpermeabilität nach der Analyse von Miles (Keck et al., Science, 246: 1309–1342 (1989) und Connolly et al., J. Biol. Chem., 264: 20017–20024 (1989)) und somit seiner alternativen Bezeichnung, als Gefäßpermeabilitätsfaktor (VPF, vascular permeability factor), gereinigt. Zwei Eigenschaften unterscheiden VEGF von anderen heparinbindenden angiogenen Wachstumsfaktoren. Zum Einen steht vor dem NH₂-Terminus des VEGF eine typische Signalsequenz, weshalb VEGF, anders als bFGF, von intakten Zellen abgesondert werden kann. Zweitens sind seine Bindungsstellen mit hoher Affinität, die nachweislich die Tyrosinkinaserezeptoren Flt-1 und Flt-1/KDR enthalten, auf Endothelzellen vorhanden. Ferrara et al., siehe oben, und Conn et al., Proc Natl Acad Sci USA, 87: 1323–1327 (1990). (Für eine Wechselwirkung von VEGF mit Bindungsstellen niedrigerer Affinität wurde gezeigt, dass sie eine mononukleäre Phagozyten-Chemotaxis auslöst). Shen et al., Blood, 81: 2767–2773 (1993) und Clauss et al., J. Exp. Med., 172: 1535–1545 (1990). Die DNS, die den VEGF-Kode enthält, ist in der Patentschrift US 5,332,671 offenbart, welche hiermit im vorliegenden Dokument durch Bezugnahme offenbart ist.
Der Nachweis, dass VEGF Angiogenese in vivo stimuliert, wurde in Versuchen mit der Hornhaut von Ratten und Kaninchen (Levy et al., Growth Factors, 2: 9–19 (1989) und Connolly et al., J. Clin. Invest., 84: 1470–1478 (1989)) der Chorioallontismembran (Ferrara et al., siehe oben) sowie dem Kaninchen-Knochentransplantat-Modell entwickelt. Connolly et al., J. Clin. Invest., 84: 1470–1478 (1989) siehe oben.
Vorzugsweise enthalten die im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendeten angiogenen Proteine eine Sekretions-Signalsequenz, die die Sekretion des Proteins ermöglicht. VEGF besitzt natürliche Signalsequenzen. Angiogene Proteine, die keine natürlichen Signalsequenzen besitzen, z.B. bFGF, können mit Hilfe routinemäßiger genetischer Manipulationstechniken so modifiziert werden, dass sie derartige Signalsequenzen enthalten. Siehe Nabel et al., Nature, 362: 844 (1993).
Die Nukleotidsequenz zahlreicher angiogener Proteine stehen über eine ganze Reihe von elektronischen Datenbanken, zum Beispiel GenBank, EMBL und Swiss-Prot, schnell zur Verfügung. Mit diesen Informationen kann ein DNS-Segment, welches den Kode des gewünschten Proteins enthält, chemisch synthetisiert werden; alternativ kann ein derartiges DNS-Segment mit Hilfe von Routineverfahren der Technik, z.B. PCR-Amplifikation, gewonnen werden.
Um die Manipulation und Handhabe der Nukleinsäure, welche den Kode des Proteins enthält, zu vereinfachen, wird die Nukleinsäure vorzugsweise in eine Kassette eingesetzt, wo sie auf operative Weise mit einem Promoter verknüpft wird. Der Promoter muss in der Lage sein, eine Expression des Proteins in Zellen mit dem gewünschten Zielgewebe zu treiben. Die Auswahl eines geeigneten Promoters kann leicht bewerkstelligt werden. Vorzugsweise wird ein Promoter mit hoher Expression verwendet. Ein geeigneter Promoter ist zum Beispiel der 763 Basenpaare umfassende Cytomegalusvirus-Promoter (CMV). Die Rous-Sarkomvirus-Promoter (RSV) (Davis et al., Hum Gene Ther 4: 151 (1993)) und die MMT-Promoter können ebenfalls verwendet werden. Bestimmte Proteine können mit Hilfe ihres natürlichen Promoters exprimiert werden. Weitere Elemente, die eine Expression verstärken können, können ebenso enthalten sein, beispielsweise ein Enhancer oder ein System, welches zu hohen Expressionsspiegeln führt, z.B. ein Tat-Gen oder ein Tar-Element. Diese Kassette kann dann in einen Vektor eingesetzt werden, z.B. einen Plasmidvektor, wie pUC118, pBR322 oder andere bekannte Plasmidvektoren, der beispielsweise einen E.-coli-Replikationsursprung umfasst. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989). Der Plasmidvektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, wie beispielsweise das β-Lakatamase-Gen für Ampicillinresistenz, vorausgesetzt das Markerpolypeptid hat keine Nebenwirkungen auf den Stoffwechsel des behandelten Organismus. Die Kassette kann auch an eine Nukleinsäure-bindenden Anteil in einem synthetischen Transfersystem gebunden sein, wie beispielsweise das in WO 95/22618 offenbarte System.
Gegebenenfalls kann die DNS auch mit einem Mikrotransfer-Vehikel verwendet werden, beispielsweise mit kationischen Liposomen und adenoviralen Vektoren. Eine Besprechung der verfahren für eine Zubereitung von Liposomen, Zielausrichtung und Inhaltsabgabe ist in Mannino und Gould-Fogerite, Bio Techniques, 6: 682 (1988) zu finden. Siehe auch Felgner und Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11 (2): 21 (1989) und Maurer, R. A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11 (2): 25 (1989).
Replikationsdefekte rekombinante adenovirale Vektoren können mit den bekannten Techniken hergestellt werden. Siehe Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581–2584 (1992), Stratford-Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90: 626–630 (1992) und Rosenfeld et al., Cell, 68: 143–155 (1992).
Die wirksame Dosis der Nukleinsäure wird abhängig sein von dem jeweiligen exprimierten Protein, dem Zielgewebe, dem Patienten oder der Patientin und seinem bzw. ihrem klinischen Zustand. Die effektive DNS-Menge liegt zwischen ca. 1 und 4000 μg, vorzugsweise zwischen ca. 1000 und 2000 μg, besonders bevorzugt zwischen ca. 2000 und 4000 μg.
In bestimmten Situationen kann es wünschenswert sein, Nukleinsäuren zu verwenden, die den Kode von zwei oder mehr unterschiedlichen Proteinen enthalten, um das Therapieergebnis zu optimieren. Mindestens eine der Nuk leinsäuren muss in jedem Fall den Kode eines VEGF enthalten. Beispielsweise kann DNS verwendet werden, die den Kode zweier angiogener Proteine enthält, z.B. VEGF und bFGF. Oder der angiogene Faktor kann mit anderen Genen oder ihren kodierten Genprodukten kombiniert werden, um die Aktivität der Zielzellen zu verstärken und gleichzeitig eine Angiogenese zu induzieren; dazu gehören beispielsweise Stickstoffmonoxidsynthase, L-Arginin, Fibronektin, Urokinase, Plasminogenaktivator und Heparin.
Um die Injektion zu erleichtern, wird die Nukleinsäure ((Anm.d.Ü.: hier nur „nucleic" im Engl., soll sicherlich „nucleic acid" heißen)) mit einem pharamzeutisch annehmbaren Träger formuliert. Dazu gehören beispielsweise geeignete Träger, wie Kochsalzlösung, Albumin, Dextrose und steriles Wasser. Die Nukleinsäure wird in das ischämische Gewebe mit Hilfe von standardmäßigen Injektionsverfahren injiziert, z. B. mit einer Injektionsnadel. Die Größe der Injektionsnadeln liegt vorzugsweise zwischen Nr. 29 bis Nr. 16.
Die Nukleinsäure kann auch mit Hilfe einer extern angebrachten lokalen Injektionsvorrichtung injiziert werden, wie sie beispielsweise für die Injektion von Antigenen bei Allergietests Verwendung findet, oder mit einem transkutanen „Lappen", der für die Abgabe in die subkutane Muskulatur geeignet ist.
Die Nukleinsäure kann auch an mehreren Stellen in dem gesamten ischämischen Gewebe injiziert werden.
Nach der Injektion wird die Nukleinsäure, mit der das gewünschte angiogene Protein exprimiert werden kann, aufgenommen und durch die Zellen des Gewebes exprimiert. Da die Vektoren, die die entsprechende Nukleinsäure enthalten, normalerweise nicht in das Genom der Zellen integriert werden, findet die Expression des entsprechenden Proteins nur für einen begrenzten Zeitraum statt. Typischerweise wird das angiogene Protein nur auf therapeutischem Niveau für ungefähr zwei Tage bis mehrere Wochen, vorzugsweise für 1 bis 2 Wochen, exprimiert. Um zusätzliche Expressionszeiten des angiogenen Proteins vorzusehen, kann die DNS auch erneut injiziert werden. Gegebenenfalls kann mit der Verwendung eines Retrovirusvektors, mit dem die heterologe DNS in das Genom der Zellen integriert wird, die Zeitdauer, in der das therapeutische Polypeptid exprimiert wird, auf mehrere Wochen bis unendlich verlängert werden.
Die Expression des angiogenen Proteins und seine Sekretion aus den Gewebezellen bewirkt eine Angiogenese und ermöglicht die Behandlung von Ischämie und somit von Erkrankungen, wie Ischämie in den Extremitäten, cerebrovaskuläre Ischämie, renale Ischämie, pulmonale Ischämie, ischämische Kardiomyopathie und Myokardischämie.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele erläutert.
BEISPIEL 1
Induktion von Angiogenese in ischämischem Gewebe durch direkte Injektion von DNS
METHODEN
Plasmide
Komplementäre DNS-Klone für rekombinanten humanen VEGF₁₆₅ ((Anm.d.Ü.: Fehler im Engl.: „VEFG")), aus cDNS-Bibliotheken isoliert, die aus HL60-Leukämiezellen präpariert wurden, wurden in einem einfachen eukaryotischen Expressionsplasmid angeordnet, welches einen 736 Basenpaare umfassenden Cytomegalus-Virus-Promoter/-Enhancer zum Antreiben der VEGF-Expression benutzt. Stromabwärts von der VEGF-cDNS befindet sich eine SV40-Polyadenylierungssequenz. Ferner umfasst dieses Plasmid ein Fragment, welches den die kurze wiederholte 72 Basenpaare lange Sequenz umfassenden SV40-Replikationsursprung enthält, aber diese Sequenz ist in Abwesenheit des SV40-T-Antigens funktionell nicht relevant (für die autonome Replikation). Diese Fragmente kommen in dem Vektor pUC118 vor, welcher einen E.-coli-Replikationsursprung und das β-Galaktosidase-Gen für Ampicillinresistenz enthält. Die biologische Aktivität von VEGF₁₆₅, der aus mit diesem Konstrukt (ph VEGF₁₆₅) transfizierten Zellen abgesondert wird, wurde zuvor durch den Nachweis bestätigt, dass Medien, die durch transfizierte humane 293-Zellen konditioniert wurden, die Proliferation von kapillaren Zellen förderten (Leung et al., Science, 246: 1306–9 (1989)).
Das Plasmid pGSVLacZ (mit freundlicher Genehmigung von Dr. Claire Bonnerot), welches eine an die frühen Promoter des Simianvirus 40 (Bonnerot et al., Proc Natl Acad Sci, USA, 84: 6795–9 (1987)) gekoppelte kernlokalisierte β-Galaktosidase-Sequenz enthält, wurde für alle Kontroll-Transfektionsversuche verwendet.
Tiermodell
Weiße Neuseelandkaninchen mit operativ induzierter unilateraler Gefäßinsuffizienz der hinteren Gliedmaßen (Takeshita et al., Circulation, 90: 228–234 (1994), siehe oben; Takeshita et al., J. Clin. Invest. 93: 662–70 (1994), siehe oben; Pu et al., Circulation, 88: 208–215 (1993), siehe oben) wurden als Modell für akute und chronische Ischämie verwendet. Alle Protokolle wurden vom „Institutional Animal Care and Use Committee" (Komitee zur Pflege und Nutzung von in Institutionen untergebrachten Tieren) genehmigt. Die Pflege der Tiere entsprach den Richtlinien des „Canadian Council of Animal Care" (Kanadischer Rat für Tierpflege), der „Principles of Laboratory Animal Care" (Grundsätze der Labortierpflege) und des „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (Anleitung für die Pflege und Nutzung von Labortieren) (NIH-Publikation Nr. 80-23, überarbeitete Ausgabe 1985). Neunundfünfzig weiße Neuseelandkaninchen (durchschnittliches Gewicht = 3 kg) wurden mit Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) anästhetisiert. Über einen länglichen Schnitt in einen medialen Oberschenkel wurde die Arteria femoralis in ihrer ganzen Länge freigelegt; dies erfolgte ebenso für alle Hauptäste der Arteria femoralis, einschließlich der Arteria epigastrica inferior, der tiefen Arteria femoralis, der seitlichen Arteria circumflexa und der oberflächlichen Arteria epigastrica. Nach weiterer distaler Sektion der Arteria poplitea und der Arteria saphena wurden die Arteria iliaca externa sowie alle oben erwähnten Arterien abgebunden. Schließlich wurde die Arteria femoralis vollständig aus ihrem proximalen Ursprung als Ast der Arteria iliaca externa bis zu dem distalen Punkt exzidiert, wo sie sich in die Arteria saphena und die Arteria poplitea aufteilt.
Intramuskulärer (IM-)Gentransfer
Akute Ischämie in den Extremitäten. In achtundzwanzig Kaninchen wurde der Einfluss eines IM-Gentransfers auf eine akute Ischämie der hinteren Gliedmaßen untersucht. Unmittelbar nach der Entfernung der Arteria femoralis wie oben beschrieben, wurde mit einer 3-ml-Spritze und einer Nadel der Größe 27 an fünf verschiedenen Stellen in drei Hauptmuskeln des Oberschenkels durch einen kleinen Einschnitt in der Haut direkt Plasmid-DNS injiziert. Für jede Injektion wurde die Spitze der Nadel in den Adduktorenmuskel (2 Stellen), den medialen großen Muskel (2 Stellen) und den Semimembranaceus eingeführt; dabei wurde durch unmittelbare Sichtbarmachung jedes Muskels während der Injektion sorgfältig darauf geachtet, dass eine Penetration des Muskels mit Injektat vermieden wurde. Zu demselben Zwecke wurde jedes Mal die Inj ektionsrate auf ca. 5 Sek. verlangsamt, so dass die Injektionslösung nicht durch das Epimysium austreten würde. Mit diesem Injektionsverfahren wurde ein Gesamtvolumen von 2,5 ml von a) 500 μg phVEGF₁₆₅ in Kochsalzlösung (n = 8); b) 500 μg phVEGF₁₆₅ in 0,75%igem Bupivacain, für das vorher nachgewiesen wurde, dass es die Transgen-Aufnahme in der gestreiften Muskulatur verstärkt (n = 10) (Danko I., Gene Therapy, 1: 114–21 (1994); oder c) 500 μg pGSVLacZ, das den Kode für kernlokalisierte β-Galaktosidase enthält (n = 10), verabreicht. Nach Durchführung der 5 Injektionen (0,5 ml @ für jedes Tier) wurde die Haut mit 4,0-Nylon geschlossen.
Chronische Ischämie in den Extremitäten. In einundreißig Kaninchen wurde der Einfluss einer IM-Gentherapie auf eine chronische Hinterbeinischämie untersucht. Der ein zige Unterschied zwischen dem Modell der chronischen Ischämie und dem oben beschriebenen Modell der akuten Ischämie in den Extremitäten liegt darin, dass die Zeitdauer für die postoperative Erholung 10 Tage betrug, einschließlich der endogenen Kollateralgefäße. Dementsprechend wurden die Kaninchen 10 Tage nach Entfernung der Arteria femoralis in das Katheterisierungslabor zurückgebracht. Nach Durchführung der nachfolgend beschriebenen physiologischen Baseline-Messungen wurde ein IM-Gentransfer mit dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben durchgeführt, und zwar mit a) 500 μg phVEGF₁₆₅, verdünnt in 2,5 ml Kochsalzlösung (n = 8); b) 500 μg phVEGF₁₆₅, verdünnt in 0,75%igem Bupivacain (n = 8); c) 500 μg pGSVLacZ, verdünnt in 2,5 ml Kochsalzlösung; oder d) 500 μg pGSVLacZ, verdünnt in 2,5 ml 0,75%igem Bupivacain (n = 8). In jedem Fall wurde nach Durchführung aller 5 Injektionen die Haut wie oben geschlossen.
Anatomische Beurteilung
Selektive Angiographie. Es wurde eine selektive Röntgenkontrastaufnahme der Arteria iliaca interna wie oben beschrieben (Doucette et al., Circulation, 85: 1899–1911) (1992)) durchgeführt. Kurz wurde ein Infusionskatheter (3 Fr.) (Tracker-18, Target Therapeutic, San Jose, CA) in die Arteria carotis communis eingeführt und bis zu der Arteria iliaca interna des ischämischen Glieds mit Hilfe eines Führungsdrahts der Stärke 0,014 Zoll (Hi-Torque Floppy II, Advanced Cardiac System, San Diego, CA) unter Röntgenüberwachung vorgeschoben. Die Katheterspitze wurde in der Arteria iliaca interna auf Höhe des Zwischenraums zwischem dem siebenten Lendenwirbel und dem ersten Kreuzbeinwirbel positioniert. Nach der intraarteriellen Injektion von Nitroglyzerin (0,25 mg, SoloPak Laboratories, Franklin Park, IL) wurde ein Gesamtvolumen von 5 ml eines nichtionischen Kontrastmittels (Isovue-370, Squibb Diagnostics, New Brunswick, NJ) mit Hilfe eines automatischen Angiographie-Injektors (Medrad, Pittsburgh, PA) injiziert, welcher auf eine reproduzierbare Förderung bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/Sek. programmiert war. Anschließend wurden für die Dauer von 10 Sek. mit einer Rate von 1 Film/Sek. Reihenbilder des ischämischen Hinterbeins auf einem 105-mm-Spot-Film aufgenommen.
Es wurde eine morphometrische angiographische Analyse der Entwicklung von Kollateralgefäßen mit Hilfe eines Raster-Overlays aus Kreisen durchgeführt, die einen Durchemsser von 2,5 mm besaßen und in 5 mm voneinander beabstandeten Reihen angeordneten waren. Dieses Overlay wurde auf das auf Höhe des medialen Oberschenkels aufgenommene Angiogramm gelegt. Es wurde ein definierter Bereich gewählt, in dem die Anzahl der die Kreise kreuzenden kontrastgetrübten Arterien sowie die Gesamtanzahl der den medialen Oberschenkelbereich einschließenden Kreise als Single-Blind-Untersuchung gezählt wurden. Für jeden Film wurde ein angiographischer Score als das Verhältnis der kreuzenden getrübten Arterien geteilt durch die Gesamtanzahl der in dem definierten Bereich des ischämischen Oberschenkels vorhandenen Kreise berechnet.
Kapillardichte und Kapillaren-Muskelzellen-Verhältnis. Der anatomische Nachweis der Bildung kollateraler Arterien wurde ferner durch die Messung der Anzahl von Kapillaren in lichtmikroskopischen Schnitten untersucht, die von den ischämischen Hinterbeinen aufgenommen wurden (Takeshita et al., J. Clin. Invest., 93: 662–70 (1994), siehe oben). Aus dem Adduktorenmuskel, dem großen Muskel des medialen Oberschenkels wurden Gewebeproben als Querschnitte des ischämischen Glieds zum Zeitpunkt der Tötung (Tag 30) gewonnen. Muskelproben wurden in OCT-Compound (Miles, Elkhart, IN) eingebettet und in flüssigem Stickstoff gefroren (Snap-Frozen). Mehrere gefrorene Schnitte (5 μm dick) wurden anschließend auf einem Kryostaten (Miles) aus jeder Probe geschnitten, so dass die Muskelfasern in Querrichtung ausgerichtet waren. Die Gewebeschnitte wurden mit Hilfe eines Indoxyl-Tetrazolium-Verfahrens auf alkalische Phosphatase gefärbt, um kapillare Endothelzellen wie oben beschrieben zu erkennen, und danach mit Eosin gegengefärbt. Aus einem Muskelschnitt wurden insgesamt 20 unterschiedliche Felder zufällig ausgewählt und die Anzahl der Kapillaren unter einem 20×-Objektiv gezählt, um die Kapillardichte (durchschnittliche Anzahl von Kapillaren pro mm²) festzustellen. Um sicherzustellen, dass die Analyse der Kapillardichte aufgrund von Muskelatrophie nicht überschätzt oder aufgrund von interstitiellen Ödemen nicht unterschätzt wurde, wurden auch die bei der Obduktion festgestellten Kapillaren in Abhängigkeit der Muskelfasern in dem histologischen Schnitt ausgewertet. Das für die Berechnung des Kapillaren-Muskelzellen-Verhältnisses verwendete Zählschema war ansonsten identisch mit dem für die Berechnung der Kapillardichte verwendeten Zählschema.
Physiologische Beurteilung
Wadenblutdruck. Der Wadenblutdruck wurde mit einem Doppler-Flussmessgerät gemessen (Model 1059, Parks Medical Electronics, Aloha, OR). Der Puls in der Arteria tibialis posterior wurde mit einer Doppler-Sonde identifiziert und der systolische Blutdruck in beiden Extremitäten wurde mit Standardtechniken gemessen (Takeshita et al., J. Clin. Invest., 93: 662–70 (1994)). Das Wadenblutdruckverhältnis wurde für jedes Kaninchen als das Verhältnis des systolischen Blutdrucks der ischämischen Extremität zu dem der normalen Extremität festgelegt.
Intraarterielle Messung der Flussgeschwindigkeit mittels Doppler-Führungsdraht.
An den Tagen 0 und 30 wurde außerdem vor der selektiven Angiographie der Arteria iliaca interna eine intraarterielle Doppler-Beurteilung durchgeführt. Die Spitze des Infusionskatheters (3 Fr.) wurde 2 cm oberhalb der Bifurkation der Aorta platziert. Insgesamt wurden 5 ml nicht-ionisches Kontrastmittel (Isovue 370, Squibb Diagnostics, New Brunswick, NJ) mit einem automatischen Angiographie-Injektor (Medrad, Pittsburgh, PA) mit einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/Sek. injiziert. Anschließend wurden Reihenaufnahmen der Bifurkation Aorta-A. iliaca auf einem 105 mm Spot-Film mit einer Geschwindigkeit von 1 Film/Sek. für die Dauer von 5 Sekunden aufgenommen. Danach wurde der Doppler-Führungsdraht mit einer Stärke von 0,018 Zoll (Cardiometrics, Inc., Mountain View, CA) zur Messung der Flussgeschwindigkeit des Blutes gemäß früherer Beschreibung (Doucette et al., siehe oben) verwendet. Der Draht wurde durch den am Ursprung der Arteria iliaca communis angelegten Infusionskatheter (3 Fr.) bis zum proximalen Abschnitt der die ischämische Extremität versorgenden Arteria iliaca interna vorgeschoben. Der Doppler-Draht zeichnet eine Spektralanalyse des Dopplersignals in Echtzeit auf, aus der die durchschnittliche Spitzengeschwindigkeit (APV (average peak velocity), der zeitliche Durchschnitt der momentanen Wellenform der Spitzengeschwindigkeit) berechnet und online angezeigt wird. Wir verlangten, dass die Geschwindigkeit vor Aufnahme der Ruhe-APV 2 Min. stabil geblieben war. Maximale APV-Werte wurden nach der Injektion eines Papaverinbolus (Sigma, St. Louis, MO), 2 mg in 0,4 ml Kochsalzlösung durch den Infusionskatheter gemessen. Der Dopplerdraht wurde anschließend von der Arteria iliaca interna zurückgezogen und dann bis zur Arteria iliaca communis der normalen Extremität wieder vorgeschoben; die distale Spitze des Infusionskatheters (3 Fr.) wurde am Ursprung der Arteria iliaca communis neu in Stellung gebracht. Anschließend wurde die Flussgeschwindigkeit des Blutes erneut im Ruhezustand und nach der Injektion von Papaverin gemessen. Nach Abschluss aller Dopplermessungen wurde der Infusionskatheter (3 Fr.) zum proximalen Abschnitt der Arteria iliaca interna der ischämischen Extremität umdirigiert und eine selektive Angiographie der Arteria iliaca interna gemäß der vorstehenden Beschreibung durchgeführt.
Quantitative Analyse der Angiogrophie und Flussberechnung. Die Lumendurchmesser der Arteria iliaca interna der ischämischen Extremität und der Arteria iliaca externa der normalen Extremität in der Angiographie wurden mit einem automatischen Kantendetektionssystem ermittelt (Quantum 2000I; QCS, Ann Arbor, MI). Der für die Analyse ausgewählte Film wurde mit einer hochauflösenden Videokamera eingelesen, das von der Videokamera erzeugte Signal wurde digitalisiert und auf einem Videobildschirm angezeigt (Laser Scan; ImageComm, Santa Clara, CA). Die Mittellinien wurden für einen 10 mm langen Abschnitt beginnend unmittelbar distal zur Spitze des Dopplerdrahts manuell nachgefahren. Anschließend wurden die Konturen auf Grundlage der gewichteten Summe der ersten und der zweiten Ableitungsfunktionen der digitalisierten Helligkeitsinformationen automatisch erfasst. Der Gefäßdurchmesser wurde anschließend an der Stelle des Doppler-Probevolumens (5 mm distal zur Drahtspitze) gemessen. Die Querschnittsfläche wurde unter Annahme eines kreisförmigen Lumens berechnet.
Der Doppler-abgeleitete Fluss wurde berechnet als Q_D = (πd²/4)(0,5 × APV), mit Q_D = Doppler-abgeleiteter Fluss im zeitlichen Durchschnitt, d = Gefäßdurchmesser und APV = zeitlicher Durchschnitt der spektralen Spitzengeschwindigkeit. Die mittlere Geschwindigkeit wurde unter Annahme eines parabolischen Geschwindigkeitsprofils über das Gefäß hinweg im zeitlichen Durchschnitt als 0,5 × APV geschätzt. Für den auf diese Weise berechneten Doppler-abgeleiteten Fluss ist das Bestehen einer Korrelation mit Flussmessungen, die mit elektromagnetischen Flussmessgeräten sowohl unter In-vitro- als auch unter In-vivo-Bedingungen ermittelt wurden, nachgewiesen worden (Doucette et al., siehe oben). Da 2 mg Papaverin keine Wirkung auf den Gefäßdurchmesser zeigten, haben wir zur Berechnung sowohl des Ruhe- als auch des maximalen Flusses die Durchmessermessungen aus dem unmittelbar vor den Dopplermessungen aufgezeichneten Angiogramm verwendet.
Regionaler Blutfluss zum Extremitätenmuskel. Die regionale Gewebeperfusion bei Tieren mit chronischer Hinterbeinischämie wurde mit Hilfe von gefärbten Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 15 μm ermittelt (Kowalik, Circulation 83, 974–82 (1991)). Nach Abschluss der vorstehend beschriebenen invasiven Messungen wurden 3 × 10⁶ gefärbte Dye-Trak Mikrokugeln (Triton Technology, Inc., San Diego, CA) durch einen Teflonkatheter (3 Fr.) über die Arteria carotis communis in die linke Herzkammer injiziert. Zur Sammlung von Blutproben für einen Referenzfluss wurde ein zweiter Katheter über die Arteria carotis communis in die untere abdominelle Aorta eingeführt und an eine mit einer Spritze versehene Blutprobenentnahmepumpe (Sage 351, Orion Research, Boston, MA) angeschlossen. Durch diesen Katheter hindurch wurde die Blutprobe 10 Sek. vor der Injektion der Mikrokugeln mit einer Geschwindigkeit von 1,2 ml/Min. für die Dauer von 3 Min. aufgezogen. Anschließend wurden die Tiere getötet und Gewebeproben (Gewicht = 2 g) von jeweils 2 verschiedenen Muskeln (transfizierter medialer Oberschenkel(Adduktor)-Muskel bzw. Wadenmuskel des Unterschenkels (Gastrocnemius)) beider hinteren Extremitäten entnommen. Die Gewebeproben und die Referenz-Blutproben wurden einer Verdauung mit Kaliumhydroxid unterzogen und danach die Mikrokugeln durch Vakuumfiltration eingesammelt. Nach Extraktion der Farbstoffe aus den Mikrokugeln mit Dimethylformamid wurde die fotometrische Absorption der einzelnen Proben mit einem herkömmlichen Spektrofotometer (Model 8452A, Hewlett Packard, Palo Alto, CA) ermittelt. Der regionale Blutfluss zum Muskel wurde wie folgt berechnet. Gewebe-Blutfluss = (Entnahmerate/Gewebegewicht) × (OD-Gewebe/OD Referenzblut)mit OD = optische Dichte.
Expression des VEGF-Gens in Skelettmuskel
Zur Evaluierung der Expression des phVEGF₁₆₅-Gens im Skelettmuskel wurden 16 zusätzliche männliche Kaninchen (New Zealand White Rabbit) der Modelle für akute bzw. für chronische Ischämie (2 Kaninchen pro Zeitpunkt) an den Tagen 3, 7, 14 und 30 nach der Transfektion getötet. Das Vorhandensein von humaner VEGF-mRNS wurde mit der RT-PCR (Reverse Transkriptions-Polymerasekettenreaktion) gemäß früherer Beschreibung (Takeshita, et al., Proc Natl Acad Sci (in Druck), siehe oben) nachgewiesen. Um die Spezifität zu gewährleisten und die Amplifikation von endogenem Kaninchen-VEGF zu vermeiden, wurden die Primer aus einer Region ausgewählt, die bei verschiedenen Tierarten nicht konserviert ist. Als Primer wurden die folgenden Sequenzen verwendet: 5'-GAGGGCAGAATCATCACGAAGT-3' (Sense) (SEQ ID NR: 1); 5'-TCCTATGTGCTGGCCTTGGTGA-3' (Antisense) (SEQ ID NR: 2). Die Produkte der RT-PCR wurden durch 2% Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die DNS-Banden wurden unter UV-Beleuchtung nach Anfärbung mit Ethidiumbromid dargestellt.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung (SA) angegeben. Die statistische Signifikanz wurde anhand von ANOVA gefolgt vom Scheffe-Test evaluiert. Ein Wert von p < 0,05 wurde als Anzeichen für das Bestehen der statistischen Signifikanz gewertet.
ERGEBNISSE
Anatomische Beurteilung
Angiographie. Repräsentative Angiogramme, die an Tag 30 bei Kontroll- und bei VEGF-behandelten Tieren aufgezeichnet wurden, sind in 1 erläutert. In den an den Tagen 0 und 30 bei den Kontrolltieren aufgezeichneten Angiogramm-Reihen schien die Entwicklung von Kollateralarterien im medialen Oberschenkel unverändert oder nur geringfügig fortgeschritten zu sein. Bei der VEGF-transfizierten Gruppe war dagegen zwischen den Tagen 0 und 30 eine deutliche Progression der Entwicklung von ((Anm.d.Ü.: fehlt im Engl., im Dt. ergänzt)) Kollateralarterien zu beobachten. Wie in 2 erläutert ist, bestanden zu Beginn der Versuche (Baseline, Tag 0) keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen im Hinblick auf die angiographischen Scorewerte (C I: 0,47 ± 0,10, C II: 0,44 ± 0,10, C III: 0,43 ± 0,06, C IV: 0,42 ± 0,10). Bis Tag 30 hatte sich der angiographische Scorewert dagegen bei jeder einzelnen VEGF-transfizierten Gruppe signifikant verbessert im Vergleich zum Wert der Kontrolle (C I: 0,76 ± 0,05, C II: 0,72 ± 0,05, C III: 0,52 ± 0,06, C IV: 0,58 ± 0,09, p < 0,01) sowie zum Akutmodell für Ischämie in den Extremitäten (A I: 0,72 ± 0,06, A II: 0,71 ± 0,03, A III: 0,48 ± 0,10, p < 0,01). Die Verabreichung von Bupivacain zeigte keine erkennbare Wirkung.
Kapillarendichte und Kapillaren-Muskelzellen-Verhältnis. Eine günstige Wirkung des intramuskulären VEGF-Gentransfers auf die Gefäßneubildung war auch auf der Ebene der Kapillaren offensichtlich (3A und 3B). Bei beiden Modellen wurde der Adduktormuskel von Extremitäten mit Ischämie an Tag 30 histologisch untersucht.
Wie in 4 erläutert ist, waren die Muskelfasern bei den VEGF-transfizierten Tieren von mehr Kapillaren umgeben, sowohl bei akuter Ischämie (A I: 248 ± 37, A II: 228 ± 22, A III: 188 ± 32/mm², p < 0,01) als auch bei dem chronischen Modell für Ischämie in den Extremitäten (C I: 259 ± 24, C II: 256 ± 31, C III: 197 ± 18, C IV: 192 ± 31/mm², p < 0,01). Die Analyse des Kapillaren-Muskelzellen-Verhältnisses ergab ebenfalls höhere Werte bei den VEGF-transfizierten Tieren sowohl im akuten als auch im chronischen Modell für Hinterbeinischämie (akutes Modell: A I: 0,73 ± 0, 07, A II: 0, 70 ± 0,06, A III: 0,61 ± 0,09, p < 0,01; chronisches Modell: C I: 0,78 ± 0,08, C II: 0,76 ± 0,05, C III: 0,51 ± 0,06, C IV: 0,55 ± 0,09, p < 0,01). Zwischen den mit Bupivacain bzw. mit Kochsalzlösung behandelten Tieren bestand kein Unterschied.
Physiologische Beurteilung
Wadenblutdruck. Die Senkung des hämodynamischen Defizits in der ischämischen Extremität nach der intramuskulären Transfektion von VEGF wurde durch Messung des Wadenblutdrucks bestätigt. Wie in 5 erläutert ist, war bei Tieren mit akuter Ischämie das an Tag 30 nach der Transfektion gemessene Blutdruckverhältnis bei den VEGF-transfizierten Gruppen signifikant größer als bei den Kontrollen. Ein Unterschied zwischen den mit Bupivacain bzw. mit Kochsalzlösung behandelten Tieren bestand nicht. Im chronischen Modell war 10 Tage nach der Ischämieinduktion (unmittelbar vor der Transfektion) das Wadenblutdruckverhältnis bei allen Gruppen praktisch identisch (C I: 0,36 ± 0,05; C II: 0,36 ± 0,04; C III 0,36 ± 0,05; C IV: 0,32 ± 0,03). Bis Tag 30 nach der Transfektion war das Blutdruckverhältnis bei den VEGF-transfizierten Gruppen signifikant größer als bei der Kontrolle geworden (C I: 0,84 ± 0,09; C II: 0,82 ± 0,06; C III: 0,67 ± 0,06; C IV: 0,66 ± 0,10, p < 0,01). Zwischen den mit Bupivacain bzw. mit Kochsalzlösung behandelten Tieren bestand kein Unterschied.
Intraarterielle ((Anm.d.Ü.: im Engl. intro-arterial)) Messungen mit Doppler-Führungsdraht (Tabelle 1). Im akuten Ischämiemodell zeigten die VEGF-transfizierten Tiere einen signifikant größeren Fluss zur ischämischen Extremität sowohl im Ruhezustand (A I: 21,6 ± 5,2, A II: 19,5 ± 3,2, A III: 13,9 ± 3,7 ml/Min, p < 0,01) als auch im Papaverin-induzierten Hyperämiezustand (A I: 59,1 ± 16.9, A II: 55,2 ± 5,1, A III: 39,0 ± 11,5 ml/Min, p < 0,01). Im chronischen Modell waren der Fluss zu der ischämischen Extremität und der Papaverin-stimulierte Fluss zu der ischämischen Extremität an Tag 0 bei allen Gruppen identisch (Ruhefluss; C I: 13,7 ± 1,5; C II: 15,5 ± 1,4; C III: 13,7 ± 2,2; C IV: 13,4 ± 1,9 ml/Min, Hyperämiefluss; C I: 28,9 ± 3,6, C II: 30,6 ± 3,0, C III: 31,3 ± 3,7, C IV: 28,1 ± 1,7 ml/Min). An Tag 30 zeigten die VEGF-transfizierten Tiere einen signifikant größeren Fluss zur ischämischen Extremität sowohl im Ruhezustand (C I: 22,7 ± 4,6, C II: 19,9 ± 2,8, C III: 14,9 ± 1,7, C IV: 14,1 ± 1,5 ml/Min, p < 0,01) als auch im Papaverin-induzierten Hyperämiezustand (C I: 52,5 ± 12,6, C II: 56,0 ± 12,0, C III: 38,4 ± 4,3, C IV: 35,8 ± 5,6 ml/Min, p < 0,05). Der Baseline- und der hyperämische Fluss zu den nicht-ischämischen Extremitäten waren bei allen Gruppen an Tag 0 und an Tag 30 identisch. TABELLE 1 Blutfluss zu ischämischer Extremität Modell für akute Ischämie
Modell für chronische Ischämie

Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben (ml/Min)
* p < 0,1, ** p < 0,05 vs. β-gal oder β-gal + Bup laut ANOVA

Regionaler Blutfluss zum Extremitatenmuskel (Tabelle 2). Der regionale Blutfluss zu ischämischen Muskeln in den Extremitäten wurde anhand der Technik mit gefärbten Mikrokugeln im chronischen Ischämiemodell analysiert. Der regionale Blutfluss am Adduktormuskel, am transfizierten medialen Oberschenkelmuskel (C I: 4,3 ± 0,5, C II: 4,6 ± 1,2, C III: 2,9 ± 0,6, C IV: 3, ± 0,4 ml/Min/100 g Gewebe, p < 0,05) sowie am distalen Unterschenkelmuskel (Gastrocnemius) (C I: 3,9 ± 0,8, C II: 4,2 ± 0,7, C III: 2,8 ± 0,9, C IV: 2,6 ± 0,7 ml/Min/100 g Gewebe, p < 0,05) war bei den VEGF-transfizierten Tieren 1,5-fach größer. Signifikante Unterschiede durch die injizierte Lösung wurden nicht festgestellt. Zwischen den Gruppen bestanden keine signifikanten Unterschiede im Hinblick auf den regionalen Fluss zu den nicht-ischämischen Muskeln (Fluss zum Adduktor: (C I: 5,2 ± 0,5, C II: 5,6 ± 1,0, C III: 4,9 ± 0,6, C IV: 5,6 ± 1,0 ml/Min/100 g Gewebe, Fluss zum Gastrocnemius: C I: 4,4 ± 1,0, C II: 4,7 ± 1,0, C III: 4,6 ± 1,2, C IV: 5,0 ± 1,1 ml/Min/100 g Gewebe). TABELLE 2 Regionaler Blutfluss zu Extremitätenmuskel Chronisches Ischämiemodell

Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben (ml/mm/100 g Gewebe)
* p < 0,5 vs. β-gal oder β-gal + Bup laut ANOVA

Expression des Human-VEGF-Gens im Muskel
Zur Bestätigung der Expression von humanem VEGF-Gen im transfizierten Extremitätenmuskel beim Kaninchen unter In-vivo-Bedingungen haben wir transfizierte Arterien mit RT-PCR auf das Vorhandensein von humaner VEGF-mRNS analysiert. Wie vorstehend angegeben, wurden zur Gewährleistung der Spezifität der RT-PCR für die aus der erfolgreichen Transfektion resultierende humane VEGF-mRNS (im Gegensatz zu endogener Kaninchen-VEGF-mRNS) Primer verwendet, die aus einer Region ausgewählt wurden, die bei verschiedenen Tierarten nicht konserviert ist. 3, 7, 14 und 30 Tage nach der Injektion des VEGF-Gens wurden Adduktormuskeln entnommen. Das Vorhandensein von humaner VEGF-mRNS in Adduktorenmuskeln mit phVEGF₁₆₅ war ab Tag 3 bis Tag 14 sowohl im akuten als auch im chronischen Modell leicht nachzuweisen. Adduktorenmuskeln von Kaninchen, die eine Injektion mit pGSVLacZ-Gen erhalten hatten, ergaben einen Negativbefund für humane VEGF-mRNS (6).
Es ist uns gelungen nachzuweisen, dass ein Gen mit dem Kode für ein angiogenes Protein (VEGF) durch Injektion erfolgreich in ischämischen Muskel übertragen werden kann und dass das Gen dort exprimiert wird und Angiogenese induziert und auf diese Weise dem ischämischen Gewebe eine bessere Versorgung mit Blutgefäßen bietet.

Claims

Verwendung einer Nukleinsäure, mit der ein angiogenes VEGF (vascular endothelial growth factor, Gefäßendothel-Wachstumsfaktor)-Protein exprimiert werden kann, wobei es sich bei dem angiogenen VEGF-Protein um einen Endothelwachstumsfaktor handelt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Ischämie durch die Injektion der Nukleinsäure in ischämisches Gewebe.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der Nukleinsäure um DNS handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die DNS außerdem den Kode für eine Sekretions-Signalsequenz enthält.
Verwendung gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei ein kationisches Liposom als Träger für die DNS dient.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei mindestens zwei DNSn, die den Kode für verschiedene angiogene Proteine enthalten, dem Humanpatienten injiziert werden.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei 500 μg der DNS in das Gewebe injiziert werden.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die in das Gewebe injizierte Menge DNS zwischen ungefähr 1000 μg und 2000 μg liegt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die in das Gewebe injizierte Menge DNS zwischen ungefähr 2000 μg und 4000 μg liegt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die DNS in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in einem Volumen von 2,5 ml in das Gewebe injiziert wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei die DNS in einer Reihe von fünf Injektionen in das Gewebe injiziert wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei die injizierte DNS auf operative Weise mit einem Cytomegalusvirus-Promoter verknüpft ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei es sich bei dem ischämischen Gewebe um Muskel, Gehirn, Niere oder Lunge handelt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das ischämische Gewebe aufgrund von: cerebrovaskulärer Ischämie, renaler Ischämie, pulmonaler Ischämie, Ischämie in den Extremitäten, ischämischer Kardiomyopathie oder Myokardischämie einen Blutmangel aufweist.