DE60226251T2

DE60226251T2 - Verbesserung der transfektion von dna in die leber

Info

Publication number: DE60226251T2
Application number: DE60226251T
Authority: DE
Inventors: Michael H Highland Park Davidson
Original assignee: Sonogene Glen Ellyn LLC; SonoGene LLC
Current assignee: Sonogene Glen Ellyn LLC; SonoGene LLC
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2022-07-11
Also published as: WO2003006608A2; CA2452471C; EP1420643A4; US20040248832A1; DE60226251D1; US7211248B2; AU2002320348B8; AU2002320348B2; JP4426288B2; WO2003006608A3; ATE392812T1; EP1420643B1; JP2005500327A; EP1420643A2; US20070196283A1; CA2452471A1

Description

Bereich der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Transfektion von DNA in die Leber eines Säugers und betrifft insbesondere die Verstärkung der Transfektion von DNA in die Organe eines Säugers, insbesondere die Leber, durch Ultraschall und Mikrosphären.
Hintergrund der Erfindung
Ein Ansatz zur Verbesserung der Wirksamkeit einer Gentherapie in vivo mit dem Ziel, die Expression eines Transgens zu verstärken, beinhaltet die Anwendung von Ultraschall, um die Transfektion von DNA in Zellen zu erleichtern. Manome et al., Circulation, 99(20): 2617–20 (1999) offenbaren eine Transfektion von nackter Plasmid-DNA in Kolonkarzinomzellen in vitro und in vivo unter Verwendung von Ultraschall. In dieser Studie wird ein Reporterplasmid pcDNA3-lacZ, das Escherichia coli lacZ oder das beta-Galactosidasegen (beta-gal) enthält, und ein Neomycin-3'-Phosphotransferasegen (neo) für die Bestimmung der Übertragungseffizienz verwendet. MC38-Zellen, Mäusekolonkarzinomzellen, wurden in syngenetische Mäuse implantiert und Plasmid mit nackter DNA in die Mäuse und die Zellen injiziert. Die Zellen wurden einer kontinuierlichen Ultraschallbehandlung bei 1,0 MHz, 20 W/cm² unterzogen. In einem transienten Assay wurde eine signifikante Anzahl an Zellen mit dem beta-Galactosidasegen transduziert.
Lawrie et al., Circulation 99(20): 2617–20 (1999) berichten, dass Ultraschall eine Genexpression nach Transfektion von Gefäßzellen in vitro verstärkt. Lawrie et al. untersuchten die Verwendung von adjunktivem Ultraschall zur Verstärkung der nichtviralen Geneinführung. In dieser Studie wurden kultivierte glatte Gefäßmuskelzellen vom Schwein und Endothelzellen mit nacktem oder liposomkomplexiertem Luciferasereporterplasmid transfektiert. Die Luciferaseaktivität nach Lipofektion von Endothelzellen wurde durch adjunktive Ultraschallbehandlung verstärkt. Ultraschallbehandlung zeigte keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit von Zellen, obwohl sie die Proliferation bei glatten Gefäßmuskelzellen, aber nicht von Endothelzellen inhibierte.
Shohet et al., Circulation 101 (22): 2554–6 (2000) beschreiben ein nichtinvasives Verfahren zur Transduktion eines Gens. In dieser Studie wird rekombinanter Adenovirus, der beta-Galactosidase enthält und von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, an die Oberfläche von mit Albumin überzogenen und Perfluorpropan gefüllten Mikrobläschen angeheftet. Dann wurden die Mikrobläschen in die Drosselvene (Vena jugularis) von Ratten mit und ohne gleichzeitige Echokardiographie infusiert, um den Adenovirus in das Rattenmyokardium wirksam einzuführen. Die Herzen aller Ratten, die eine durch Ultraschall vermittelte Zerstörung der den Virus enthaltenden Mikrobläschen erfuhren, zeigten Expression des beta-Galactosidasetransgens im Myokardium.
Anwer et al., Gene Ther. 7 (17): 1516–25 (2000) berichten die Erwartung, dass Gentherapie als eine Form von Molekularmedizin einen großen Einfluss auf medizinische Behandlungen in der Zukunft besitzen wird, dass aber die klinische Anwendung der Gentherapie durch ungenügende Geneinführungssysteme behindert wird, die eine ausreichende, akkurate und sichere DNA-Aufnahme in den Zielzellen in vivo gewährleisten. Anwer et al. berichten, dass nichtvirale Transfektionsverfahren den Vorteil einer sicheren Anwendung aufweisen, dass es aber hilfreich wäre, ihre Transfektionsraten, insbesondere in vivo, zu steigern. Anwers Studien legen ihren Schwerpunkt auf die Verwendung von Ultraschall, um einen verstärkten Transfer von DNA-Plasmiden in vitro und in vivo zu erreichen. In vitro wurden das beta-Galactosidase- und Luciferase-DNA-Reporterplasmid in vier Zelllinien transfektiert (NIH 3T3 Fibroblasten, maligne Melanome Mewo, HeLa, Dunning-Prostatatumor R3327-AT1). Ultraschall induzierte eine 55-fache (Mewo) bis 220-fache (AT1) Stimulation, was zu Transfektionseffizienzen in vitro zwischen 2% (Mewo) und 12% (AT1) führte. Die Stimulation in vivo wurde beim Dunning-Prostatatumor R3327-AT1, der subkutan in Copenhagen Ratten implantiert wurde, unter Verwendung des beta-Galactosidasereporters untersucht. Nach DNA-Injektion in den Tumor induzierte fokussierter Ultraschall eine 10-fache Zunahme der beta-galactosidasepositiven Zellen in der Histologie und eine 15-fache Zunahme der beta-Galactosidase-Proteinexpression im ELISA-Assay. Hingegen wurde gefunden, dass nach intravenöser Plasmidanwendung, keine Verstärkung der Reportergenexpression auftrat.
In einer anderen Studie untersuchten Anwer et al., Gene Ther. 7 (21): 1833–9 (2000) den Einfluss einer lokalisierten Anwendung von Ultraschall auf den Gentransfer zu Primärtumoren nach systemischer Verabreichung von kationischen Lipid-Transfektionskomplexen. Anwer at al. berichten, dass zuvor gezeigt wurde, dass systemische Verabreichung von (N-[(1-(2-3-Dioleyloxy)propyl)]-N-N-N-trimethylammoniumchlorid)-Cholesterol-Transfektionskomplexen an Mäuse mit Tumoren zu einer Expression im Tumor und anderen Geweben, primär den Lungen, führte.
Eine durch Mikrobläschen verstärkte Ultraschalltechnik für Gefäßgeneinführung wurde von Lawrie et al., Gene Ther. 7 (23): 2023–2027 (2000) berichtet. Lawrie stellte fest, dass Fortschritte in der kardiovaskulären Gentherapie durch Bedenken bezüglich der Sicherheit und Durchführbarkeit von Virusvektoren und die Ineffizienz von derzeitigen nichtviralen Transfektionstechniken behindert wird.
Miller et al. Ultrasound in Med. & Biol., Band 25, Nr. 9 1425–1430, 1999 beschreiben die Ultraschallverstärkung von Gentransfektion in Mela nomtumoren bei Mäusen und beschreiben Studien sowohl in vitro wie in vivo.
Klibanov, Advanced Drug Delivery Reviews 27 (1999) 139–157 gibt eine allgemeine Übersicht über gezielte Abgabe von gasgefüllten Mikrosphären mit Schwerpunkt primär auf ihre Verwendung als Kontrastmittel für Ultraschallbildgebung.
US-Patent Re. 36,939 von Tachibana et al. beschreibt einen Booster mit Mikrobläschen aus einem Gas in einer Flüssigkeit, z. B. ungefähr 4 × 10⁷ Zellen/ml Mikrobläschen eines Gases mit einem Durchmesser von 0,1 bis 100 μm in 3 bis 5% humaner Serumalbuminlösung und eine pharmazeutische Flüssigkeitszusammensetzung mit dem Booster und ein Medikament, die für die Therapie von verschiedenen Krankheiten geeignet sind, in Verbindung mit einer Anwendung von Ultraschallwellen.
US-Patent Nr. 5,542,935 von Unger et al. offenbart ein therapeutisches Abgabesystem umfassend gasförmige mit Vorstufenverbindung gefüllte Liposome mit darin verkapseltem Kontrastmittel oder Arzneistoff.
Die PCT-Veröffentlichung WO8902464 offenbart ein Verfahren zum Einführen von Material in lebende Säugerzellen oder zum Fusionieren von Material mit den Zellen. Das Verfahren umfasst Behandeln der Zellen in flüssiger Suspension in Gegenwart des Materials mit einer Ultraschallanregung, die ausreichend ist, um die Zellen zu traumatisieren. Das in die Zellen oder in eine Zellmembran eingeführte Material ist bevorzugt DNA oder RNA oder ein Protein.
Das chinesische Patent Nr. 1056124 offenbart ein Verfahren zur Genleitung unter Verwendung von Ultraschallwellen für die Genverfahrenstechnik an Tieren und Pflanzen. Ein biologisches Material in DNA-Lösung behandelt mit einer Ultraschallwelle bewirkt, dass die Zellmemb ranen des biologischen Materials ihre Struktur derart verändern, dass DNA-Moleküle in der Lösung in die Zellen diffundieren können.
Die PCT-Veröffentlichung WO9806864 offenbart Verfahren unter Verwendung lokaler Erwärmung, um die Genexpression zu steuern. Der Hitzschockprotein(hsp)-Genpromotor wird mit einem ausgewählten therapeutischen Gen rekombiniert und in ausgewählten Zellen exprimiert. Lokale kontrollierte Erwärmung wird angewendet, um den hsp-Promotor zu aktivieren, zum Beispiel unter Verwendung von fokussiertem Ultraschall.
Die PCT-Veröffentlichung WO 0042988 offenbart ein Verfahren zum Identifizieren und/oder Behandeln von Gewebe mit daran anhaftenden Leukozyten, das ein Material verwendet, das sich selektiv an die Leukozyten heftet, die am Gewebe des Patienten anhaften. Das Material kann ein gasgefülltes Mikrobläschen-Kontrastmittel sein, das selektiv an aktiviertes entzündetes Gewebe anheftet. Die an aktivierten Leukozyten anhaftenden Mikrobläschen können durch Ultraschallechographie geortet werden, und das entzündete Gewebe kann durch einen Arzneistoff oder eine Gensequenz behandelt werden, die das Mikrobläschen-Kontrastmittel trägt.
US-Patent Nr. 6,265,387 B1 und PCT-Anmeldung WO 00/50617 , veröffentlicht am 31. August 2000, offenbaren Verfahren zur Gentherapie, die die Abgabe eines Polynukleotids an eine Zelle in einem Säuger beinhalten, indem das Polynukleotid in ein Blutgefäß, das mit der Zelle verbunden ist, derart injiziert wird, dass das Polynukleotid in die Zelle transfektiert und auf therapeutische Werte exprimiert wird. In diesen Offenbarungen wird dieser intravaskuläre Verabreichungsweg dadurch gesteigert, dass die Permeabilität des Gewebeblutgefäßes durch Erhöhen des hydrostatischen (physikalischen) Drucks oder Erhöhen des osmotischen Drucks im Gefäß erhöht wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Genexpression in der Leber durch periphere Injektion von DNA oder einem Äquivalent in das Blut und Sonifizieren der Leber mit Ultraschall erreicht. Die Ultraschallwellen allein, führen zu einer effizienten Transfektion der DNA oder des Äquivalents in den Nukleus, wenn sie durch zerstörte Mikrosphären, gegebenenfalls mit erhöhtem Injektionsdruck, verstärkt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist dementsprechend Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zum Induzieren einer Genexpression in Zellen, wie den Zellen der Leber oder eines anderen Organs eines Säugers, zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren zur Transfektion von DNA oder einem Äquivalent in die Leber zur Verfügung zu stellen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein neues und verbessertes Verfahren zur Transfektion einer gewünschten DNA oder eines Äquivalents in die Leber unter Verwendung einer Technik, die Mikrosphären und Ultraschall und optional erhöhten Injektionsdruck beinhaltet, zur Verfügung zu stellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, Expression des Gens apo A1 durch Injektion von apo A1 genetischem Material in die Leber zu induzieren und die Expression des Gens apo A1 unter Verwendung von Ultraschall und Mikrosphären zu verstärken, so dass eine Transfektion des Gens apo A1 in die Leberzellen erleichtert wird.
Die obigen und weitere Ziele, Merkmale und Vorteile dieser Erfindung werden beim Studium der folgenden ausführlichen Beschreibung und mit Bezugnahme zur begleitenden Zeichnung ersichtlich.
Zur Erfüllung der zuvor genannten Aufgabe und Vorteile stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung umfassend proteinstabilisierte gasgefüllte Mikrosphären und nackte Plasmid-DNA, die für ein apo A1 kodiert, funktional verknüpft mit einem Promotor für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Arteriosklerose oder koronarer Herzerkrankung bei einem Säuger umfassend die Schritte:

a) Injizieren der Zusammensetzung in das Gefäßsystem der Leber und
b) Anwenden von Ultraschall an der Leber bei Einwirkung der Zusammensetzung, um die Transfektion der DNA in der Leber zu induzieren, wobei apo A1 in der Leber exprimiert wird, zur Verfügung.

In weiteren Ausführungsformen werden Mikrosphären oder Mikrobläschen in das Blut injiziert, um den Transfektionsprozess zu verstärken. In einer weiteren optionalen Ausführungsform wird ein erhöhter Injektionsdruck der DNA oder eines Äquivalents angewendet, um das Transfektionsverfahren zu verstärken.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst Materialien und Verfahren für die Transfektion von nackter Plasmid-DNA in ein Organ eines Säugers, wie die Leber. Das Verfahren wendet intravaskuläre Verabreichung einer DNA enthaltenden Lösung unter Verwendung eines hohen Injektionsdrucks, Ultraschallbehandlung des Zielorgans, wie der Leber, oder Kombinationen von Ultraschallbehandlung und Injektionsdruck und/oder Kombinationen davon mit Mikrobläschen oder Mikrosphären oder Kombinationen dieser Vorgehensweisen an.
Die DNA wird bevorzugt in einer Lösung verwendet, die mit einem ultraschallaktiven Mittel, wie kleinen Gasbläschen formuliert ist. Die Gasbläschen können in Form von verkapselten Gasmikrosphären oder durch Proteine oder Lipoproteine stabilisierte Gasbläschen vorliegen. Das Gas kann aus jeglicher Art von Gas gebildet sein, aber physiologisch verträgliche Gase, wie Luft und Stickstoff, sind bevorzugt. Die Gasbläschen weisen bevorzugt eine Größe ähnlich wie rote Blutzellen oder kleiner auf, ungefähr 7 Mikrometer im Durchmesser, so dass eine freie Zirkulation der Bläschen im Blutsystem möglich ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Transfektion" bedeutet allgemein Abgabe oder speziell Transfer eines Polynukleotids von direkt außerhalb einer Zellmembran ins Innere der Zellmembran.
Die DNA kommt in den Kern, wo sie in eine Messenger-RNA transkribiert wird, die in das Cytoplasma transportiert wird, wo sie in ein Protein transliert wird. Das Polynukleotid enthält Sequenzen, die für seine Transkription und Translation erforderlich sind. Diese beinhalten Promotor- und Verstärkersequenzen, die für eine Initiation erforderlich sind. DNA und damit die zugehörige Messenger-RNA (aus der DNA transkribiert) enthalten Introns, die gespleißt werden müssen, Poly-A-Additionssequenzen und Sequenzen, die für die Initiation und Termination ihrer Translation in ein Protein erforderlich sind. Wenn daher ein Polynukleotid sein zugehöriges Protein exprimiert, muss es in eine Zelle eingedrungen sein.
Eine DNA kann in eine Zelle eingeführt werden, um eine Zellveränderung zu erzeugen, die therapeutisch wirkt. Die Abgabe von Polynukleotiden oder anderem genetischen Material zu therapeutischen Zwecken wird als Gentherapie beschrieben. Die Polynukleotide sind so kodiert, dass sie ein ganzes oder einen Teil eines Proteins exprimieren, und können entweder direkt in situ in den Organismus eingeführt werden oder indirekt durch Transfer in eine Zelle, die dann in den Organismus transplantiert wird. Die DNA oder RNA kann das Nukleotid einer beliebi gen therapeutischen Substanz sein, die in der Gentherapie geeignet ist, wie Serum Apo A1 oder Luciferaseenzym.
In einem Leberorgan beinhalten die Parenchymzellen Hepatozyten, Kuppfer-Zellen und die Epithelzellen, die die Gallentrakt und Gallengänge auskleiden. Der Hauptbestandteil des Leberparenchyms sind polyedrische Hepatozyten (die auch als hepatische Zellen bekannt sind), das mindestens eine Seite einem Lebersinus und gegenüberliegende Seiten einem Gallenkanälchen zuwendet. Leberzellen, die keine Parenchymzellen sind, beinhalten Zellen in den Blutgefäßen, wie Endothelzellen oder Fibroblastzellen.
Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Polynukleotid an distalen oder proximalen Punkten in ein Leberblutgefäß abgegeben. Ein Leberblutgefäß beinhaltet das Pfortadergefäßsystem, das Blut vom Gastrointestinaltrakt und anderen inneren Organen (z. B. Milz, Bauchspeicheldrüse und Gallenblase) zur Leber transportiert. Ein anderes Leberblutgefäß ist die Lebervene. Die Lebervene kann auch über die untere Hohlvene oder ein anderes Blutgefäß erreicht werden, dass letztlich mit der Leber verbunden ist. Es wird eine Nadel oder ein Katheter verwendet, um das Polynukleotid in das Gefäßsystem zu injizieren. Die Injektion kann unter direkter Beobachtung nach einem Einschnitt und sichtbarem Erkennen der Gewebe der Blutgefäße vorgenommen werden. Alternativ kann ein Katheter an einer entfernten Stelle eingesetzt und so eingefädelt werden, dass er im Gefäßsystem liegt, das mit dem Zielgewebe verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform kann die Injektion unter Verwendung einer Nadel durchgeführt werden, die durch intakte Haut geführt wird und in ein Gefäß eindringt, das ein Zielgewebe versorgt oder aus ihm ableitet.
In der Leber ist die Lebervene ein efferentes Blutgefäß, da sie normalerweise Blut von der Leber weg in die untere Hohlvene führt. Ebenso sind in der Leber die Pfortader und die Leberarterien afferente Blutgefäße für die Leber, da sie normalerweise Blut zur Leber führen. Plasmid-DNA kann effizient exprimiert werden, wenn sie in das ableitende Gefäß der Leber (d. h. die Lebervene) abgegeben wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird DNA unter Verwendung von Ultraschalltechniken optional kombiniert mit Injektionsdruck in die Leber transfektiert.
Beim Durchführen des Verfahrens wird DNA in eine Lösung mit einem Transfektionsreagens formuliert und dann vaskulär injiziert. Die DNA-Lösung ist mit einem ultraschallaktiven Mittel, wie kleinen Gasbläschen, formuliert, wobei die Bläschen im Durchmesser klein genug sind, dass sie eine Zirkulation im Blutsystem ermöglichen. Die Mikrobläschen werden durch Einschluss von Mikrosphären eines Gases in einer Flüssigkeit ausgebildet. Das Gas kann ein beliebiges gewünschtes Gas sein, aber aus Sicherheitsgründen sollte es ein physiologisches Gas ein, wie Luft, Sauerstoff oder Stickstoff, oder alternativ ein Inertgas, wie Edelgase, Schwefelhexafluorid oder Perfluorkohlenstoffgase. Die Flüssigkeit ist bevorzugt eine physiologische Salzlösung (ungefähr 1 bis 8 Gew.-%), eine wässrige Glucoselösung, eine Lösung von humanem Serumalbumin oder dergleichen mit physiologisch kompatiblen pH und Osmolarität. Bevorzugt sind die Bläschen ungefähr 0,01 bis 7 Mikrometer im Durchmesser.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Injektionsdruck nach irgendeinem bekannten Verfahren erhöht werden, wie Okklusion oder in Funktion der Injektionsvorrichtung. Der Injektionsdruck ist bevorzugt der Druck, der durch Verabreichen von ungefähr 1 bis 500 ml einer Lösung in ungefähr 2 bis 10 Sekunden erreicht wird. Der Druck sollte jedoch unter dem liegen, der die Leber schädigen könnte. Eine in geeigneter Weise ausgerüstete Infusionspumpe kann zum Erhöhen des Injektionsdrucks verwendet werden.
Für die Ultraschallbehandlung ist ein Ultraschallkontrastmittel in der DNA-Lösung enthalten. Solche Kontrastmittel sind im Handel erhältlich und beinhalten Optison Ultraschallkontrastmittel von Molecular Biosystems in San Diego, CA, sowie eine wässrige Indocyaningrünlösung, vermischte hypertonische Salzlösung, Eigenblut oder wässriges Maglumindiatriazoat oder dergleichen.
Der Ultraschall kann durch bekannte Ultraschallgeräte angelegt werden, die bevorzugt ein Ultraschallsignal von 0,5 bis 10,0 MHz bereitstellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann allein oder in Kombination mit anderen Therapieformen angewendet werden, darunter in Verbindung mit einem chemotherapeutischen Mittel wie bei der Behandlung von Tumoren.
Das apo-A1-Gen produziert Apolipoprotein A1, das beim Vermindern von Arteriosklerose eine aktive Rolle spielt, die mit koronaren Herzerkrankungen in Zusammenhang steht. HDL-Cholesterin (HDL) ist umgekehrt proportional zur Entwicklung einer koronaren Herzerkrankung. Hohe Werte an HDL vermindern das Risiko einer koronaren Herzerkrankung und niedrige Werte stehen mit einer merklichen Zunahme des Risikos einer frühen koronaren Herzerkrankung in Zusammenhang. HDL vermindert des Risiko einer koronaren Herzerkrankung beträchtlich, hauptsächlich dadurch, dass es die Ableitung von Cholesterin aus peripheren Zellen fördert (speziell arterieller Makrophagen) und das Cholesterin für einen Katabolismus zur Leber transportiert. Dieser Prozess ist als umgekehrter Cholesterintransport bekannt.
Der umgekehrte Cholesterintransportprozess beginnt mit der Wechselwirkung eines naszierenden HDL-Partikels, der Apolipoprotein A1 enthält und keinen wesentlichen Lipidgehalt aufweist, mit dem ABC1-Transporterprotein auf Zelloberflächen. Das ABC1-Transporterprotein steht in Wechselbeziehung zum naszierenden HDL, so dass die Abfuhr von Cholesterin in den HDL-Partikel begünstigt wird. Apolipoprotein A1 aktiviert ein Plasmaenzymlecithin, Cholesterinacyltransferase (LCAT), die das freie Cholesterin zu Cholesterinester verestert. Die hydrophobe Eigenschaft des Cholesterinesters befördert ihn in den Kern von HDL und der flache, naszierende HDL-Partikel erhält eine kugelige Form, die mit Cholesterinester überzogen ist. Dieser reife HDL-Partikel entlädt seinen Cholesterinester durch Überführen der Lipide zum VLVL(Lipoprotein sehr niedriger Dichte)-Cholesterinestertransferprotein (CETP) oder der Cholesterinester wird von der Leber unter Verwendung des Scavengerrezeptors B1 (SRB1) aufgenommen.
Das Apolipoprotein A1 wird in der Leber und im Darm synthetisiert. Seine Aminosäuresequenz wurde identifiziert. Bisher ist jedoch nur wenig Information zur Bestimmung, wie apo A1 synthetisiert wird, verfügbar und deshalb wurden noch keine Wirkstoffe entwickelt, die die Synthese von apo A1 regulieren.
Apo A1-Knockout-Mäuse zeigen erhöhte Entwicklung von Arteriosklerose. Eine Gentherapie unter Verwendung eines viralen Vektors hat die Werte an Apolipoprotein A1 in diesen Mäusen erhöht und Arteriosklerose vermindert. Da die Leber das Hauptorgan ist, das an der Synthese von Apolipoprotein A1 beteiligt ist, ist wiederholte Verabreichung von viralem Vektor zum Induzieren einer apo A1 Gentransduktion bei Menschen derzeit potentiell schädlich und aufgrund dieser Sicherheitsbedenken für die Therapie an Menschen nicht verfügbar. Deshalb besteht ein Bedarf an sicheren und nichtinvasiven Wegen zum Induzieren einer apo A1 Genexpression in der Leber.
Diese Erfindung ist besonders geeignet als Verfahren für einen nichtinvasiven Weg zum Induzieren von Genen, wie der apo A1 Genexpression in der Leber. Bei dieser Vorgehensweise wird eine nackte Plasmid-DNA von apo A1 über eine Mikrosphären oder Mikrobläschen enthaltende Formulierung unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren in das periphere Blut injiziert, wobei optional ein erhöhter Injektionsdruck angewendet wird. Die kapillaren Endothelzellen in der Leber werden fenestriert, können daher verstärkte Aufnahme von Plasmiden in die Leberzellen ermöglichen. Die Leberzellen werden dann mit Ultraschallwellen behandelt, die die Mikrosphären zerstören und eine vorübergehende Porosität der Leberendothelzellen bewirken, was den Eintritt von apo A1-DNA und Transfektion der DNA in den Kern der Endothelzellen ermöglicht.
Bei einem speziellen Verfahren erhielten Albinomäuse (CD-1 mit einem Gewicht von ungefähr 20 bis 30 Gramm), 200 mg der nackten Plasmid-beta-Galactosidase-DNA (ein Reportergen) mit einem Mikrobläschen, wie OPTISON, in die Schwanzvene von 3–6 Mäusen injiziert, während die Leber eine Ultraschallbehandlung mit einem Standard-Ultraschallbildgebungsgerät erfuhr. Nach 3 Tagen, wurden die Mäuse getötet und das Lebergewebe auf den Prozentsatz an Zellen mit einer Transduktion von beta-Galactosidasegen umgerechnet.
Die Mäuseexperimente zeigen die optimale Dosis der DNA, des Mikrobläschens und der Länge und exakten Lage der Ultraschallanwendung. Die Plasmide können in den Sphären, auf der Innenhülle, in der Hülle oder auf der Oberfläche gelegen sein. Weitere Alternativen beinhalten Verwendung von Liposomen-DNA oder Kombinieren von Reporter-DNA mit VEGF, was die Transfektionsraten in das Blut peripher mit Mikrosphären, die das apo A1-Plasmid enthalten, und Ultraschallbehandlung der Leber verstärken kann. Die Ultraschallwellen allein und verstärkt mit den zerstörten Mikrosphären, führt zu einer vorübergehenden Porosität der endothelen Leberzellen, was den Eintritt von apo A1-DNA und Transfektion der DNA in den Kern ermöglicht.
Sobald die Dosis der Mikrosphären und der DNA bestimmt ist, erhalten Apo A1-Knockout-Mäuse die Kombination der Mikrosphären mit nackter Apo A1-Plasmid-DNA (es können andere Mikrosphären oder anderen Formen von DNA verwendet werden), während die Leber mit Ultraschall behandelt wird. Der Endpunkt mit Haupteffizienz ist Konzentrationen an Apo A1 im Mäuseplasma.
Offensichtlich sind viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Licht der oben angeführten Lehre möglich. Es versteht sich daher, dass im Rahmen der beigefügten Ansprüche, die Erfindung auf andere Weise praktisch ausgeführt werden kann als es hier speziell beschrieben ist.
Beispiel 1
Transfektion der Leber einer Maus mit Kombinationen von Ultraschall und Hochdruck (Referenzbeispiel)
Vier Gruppen von Mäusen wurden mit einer Injektion eines DNA-Plasmids behandelt, das für Luciferaseenzym kodiert (I. Danko et al., Gene Therapy 1, 114, 1994), die auf die Leber gerichtet ist. Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 23 Gramm wurden mit Isofluran anästhesiert. Es wurde ein Schnitt in der Mittellinie des Bauches gesetzt und die Pfortader mit einer 27-er Butterflynadel kanüliert. Unter Verwendung einer Harvard-Infusionspumpe wurde eine Formulierung mit Plasmid-DNA in das Tier verabreicht. Nach 24 Stunden wurden die Lebern der Tiere entnommen und auf die Luciferaseaktivität untersucht. Es wurden auch kleine Schnitte der Leber zur pathologischen Untersuchung präpariert.
Es wurde Blut abgenommen, um ALT (Alaninaminotransferase) als Indikator einer Leberschädigung zu analysieren.
Gruppe 1: Hochdruckverabreichung
Drei Mäuse erhielten 1,0 ml Salzlösung, die 50 Mikrogramm DNA enthält, über einen Zeitraum von 10 Sekunden injiziert. Die VCI unter und über der Leber wurde 2 Minuten lang abgeklemmt, während die Injektion vorgenommen wurde, um während der Injektion einen hohen Druck in der Leber zu erzeugen.
Gruppe 2: Ultraschallverabreichung
Bei der ersten Maus wurde die VCI unter der Leber vor der Injektion von DNA abgeklemmt, die aus 50 Mikrogramm DNA in 0,2 ml TransIT Transfektionsreagens (Mirus Corporation, Madison WI) vermischt mit 0,3 ml Optison Ultraschallkontrastmittel (Molecular Biosystems, San Diego, CA) besteht. Die zweite und dritte Maus erhielten keine VCI-Abklemmung und 0,2 ml Salzlösung, die 50 Mikrogramm DNA vermischt mit 0,3 ml Optison enthält.
Alle DNA-Lösungen wurden über einen Zeitraum von 1 Minute kontinuierlich infusiert, wobei 1 Minute lang ein Ultraschallbildgebungssystem von General Electric (Modell VIVID5) verwendet wurde. Die Spitze des Wandlers wurde in den Daumen eines Gummihandschuhs platziert, der mit Aquagel gefüllt ist. An der Spitze des Gummihandschuhs wurde eine geringe Menge an Kontaktgel verwendet, wenn sie über die Leber gesetzt wird. Die Ultraschalleinstellungen waren wie folgt: mechanischer Index bei 0,5, Rahmenrate bei 52 Rahmen/sec, Abbildungstiefe bei 5 cm und eine Frequenz von 1,6 MHz. Bei jeder Injektion wurde das Ultraschallkontrastmittel durch das Ultraschallbildgebungssystem in der Leber beobachtet.
Gruppe 3: Kombinierte Verabreichung mit Ultraschall und Hochdruck

Drei Mäuse wurden ähnlich wie die Gruppen 1 und 2 vorbereitet und behandelt. Die Mäuse erhielten ein Gesamtvolumen von 1 ml (50 Mikrogramm nackte DNA in 0,4 ml Salzlösung mit 0,6 ml Optison) über 10 Sekunden, während die VCI-Abklemmungen über und unter der Injektionsstelle 2 Minuten lang beibehalten wurden. Die Leber wurde eine Minute lang beobachtet, wie bei der Behandlung von Gruppe 2. Ergebnisse:

	Relative Luciferase-Einheiten	Leberpathologie	ALT (Leber-funktionstest)
Gruppe 1 – Hochdruck (n = 3)	17.316.343 Mittel	Wenige kleine Spots Fleckig, harte Stellen Normal	150 767 365
Gruppe 2 – Ultraschall (n = 3)	42.578 Mittel	Normal Normal Normal	45 111 138
Gruppe 3 – Hochdruck und Ultraschall (n = 2)	52.181.055 Mittel	Fleckig, harte Stellen Fleckig, harte Stellen	930 2149
	225 Luciferase-Test Hinter-grund		32 unbeh. Maus

Die Ultraschallbehandlung der Leber bei der Verabreichung von DNA, die die Formulierung enthält, konnte eine Transfektion des DNA-Plas mids in die Leber bei einem mittleren Wert von 189-mal mehr als die Grundlinie erreichen. Hochdruck und die Kombination von Hochdruck und Ultraschall erreichte eine Transfektion von Luciferase-DNA in größerem Umfang, aber beides schien ein merkliches Ausmaß an akuter Leberschädigung zu bewirken.
Beispiel 2
Transfektion der Leber einer Maus mit DNA, die für apo A1 kodiert (Beispiel der Erfindung)
Es wurden Experimente durchgeführt, die Ultraschall anwenden, während Plasmid-DNA in Mäuse injiziert wird, ähnlich wie bei Beispiel 1. Die Plasmid-DNA war so vorbereitet, dass sie für humanes apo A1 unter Verwendung eines CMV-Promotors kodiert. Serumwerte von apo A1 wurden bei den behandelten Tieren am Tag eins, drei und sieben nach der Behandlung gemessen.
Gruppe 1: Hochdruck mit Ultraschall
Jede Maus wurde mit Isofluran anästhesiert. Ein Gesamtvolumen von 1,5 ml Injektat zusammengesetzt aus 250 Mikrogramm DNA mit 187 Mikrolitern, 900 Mikrolitern Optison und 412,5 Mikrolitern Salzlösung wurden in die Pfortader über einen Zeitraum von zehn Sekunden eingeführt. Es wurden vor der Injektion über und unter der Leber Klemmen an der VCI gesetzt und zwei Minuten nach der Injektion entfernt. Es wurde über der Leber direkt vor der Injektion der DNA Ultraschall angewendet und eine Minute lang fortgesetzt. Der Ultraschall wurde unter Verwendung eines Wandlers von 2,5 MHz, der bei 1,5 MHz arbeitet, mit einer Tiefe von 2 cm, Brennweite von 1 cm, mechanischem Index von 0,5, 52 Rahmen/sec und Leistungseinstellung 8 angewendet. Der Ultraschall wurde wie in Experiment 1 beschrieben angewendet, wobei ein mit Gel gefüllter Latexhandschuh verwendet wurde, um einen Abstand von zwei Zentimetern für den Wandler auszubilden.
Gruppe 2: Hochdruck-Schwanzveneninjektion
Jeder Maus wurden 1,9 ml Injektat injiziert, das 10 Mikrogramm DNA und 1,9 ml Ringers-Lösung enthält. Das Injektat wurde über einen Zeitraum von 2 bis 3 Sekunden verabreicht.
Gruppe 3: Hochdruck-Schwanzveneinjektion mit Ultraschall

Jeder Maus wurden 1,9 ml Injektat wie bei Gruppe 2 beschrieben injiziert, mit der Ausnahme, dass das Injektat auch 950 Mikroliter Optison enthält und über einen Zeitraum von 4 bis 5 Sekunden verabreicht wurde. Die Leber wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit Ultraschall behandelt, mit der Ausnahme, dass der Ultraschall über 30 Sekunden ab Beginn der Verabreichung des Injektats angelegt wurde. Der Ultraschall war primär auf den rechten Flügel der Leber gerichtet. Ergebnisse:

	Serum apo A1 mg/dl	Anmerkungen
Gruppe 1 – Hochdruck mit Ultraschall (n = 6)	25,7 20,0 17,3 Tag 1 Tag 3 Tag 7	Flecken am linken Leberlappen Maus #6, Weißfärbung am linken Leberlappen Maus #2
Gruppe 2 – Hochdruck-Schwanzveneninjektion (n = 7)	68,0 23,5 15,5 Tag 1 Tag 3 Tag 7	zur Druckerhöhung über 2 bis 3 Sekunden injiziert
Gruppe 3 – mittlerer Druck Schwanzveneninjektion mit Ultraschall (n = 2)	39,5 19,5 17,5 Tag 1 Tag 3 Tag 7	zur Druckminderung über 4 bis 5 Sekunden injiziert
Kontrolle (keine Behandlung (n = 2)	14,0 13,0 15,0 Tag 1 Tag 3 Tag 7

Die Verabreichung von apo A1-DNA enthaltender Formulierung in die Leber konnte eine Transfektion des DNA-Plasmids auf einen mittleren Wert über der Grundlinie erreichen, wenn die Verabreichung unter Hochdruck oder einer Kombination von Druck und Ultraschall erfolgt. Es wurde eine akute Leberschädigung bei einigen Tieren beobachtet, die mit einer Kombination von Hochdruck und Ultraschall behandelt wurden.
Die Erfindung wurde mit Bezug zu einigen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben, es ist jedoch ersichtlich, dass Variationen hierzu, die in den Rahmen der Ansprüche fallen, für die Fachleute erkennbar sind, so dass die Erfindung nicht als darauf beschränkt zu betrachten ist.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung umfassend proteinstabilisierte gasgefüllte Mikrosphären und nackte Plasmid-DNA, die für ein Apolipoprotein A1 (apo A1) kodiert, funktional verknüpft mit einem Promotor für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Arteriosklerose oder koronarer Herzerkrankung bei einem Säuger umfassend die Schritte: a) Injizieren der Zusammensetzung in das Gefäßsystem der Leber und b) Anwenden von Ultraschall an der Leber bei Einwirkung der Zusammensetzung, um die Transfektion der DNA in der Leber zu induzieren, wobei apo A1 in der Leber exprimiert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung vaskulär mit erhöhtem Injektionsdruck injiziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Gas in den gasgefüllten Mikrosphären ein Perfluorkohlenstoffgas ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Gas in den gasgefüllten Mikrosphären Luft, Stickstoff oder Sauerstoff ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung peripher in das Blut injiziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei in der Leber exprimiertes apo A1 den Cholesterinstoffwechsel der Leber verändert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung unter hohem Injektionsdruck injiziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Ultraschall angewendet wird, um den Bereich der Leberbehandlung zu lokalisieren.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Mikrosphären die nackte Plasmid-DNA enthalten.
Therapeutische Zusammensetzung umfassend nackte Plasmid-DNA, die für ein Apolipoprotein A1 (apo A1) kodiert, funktional verknüpft mit einem Promotor und proteinstabilisierte gasgefüllte Mikrosphären in einer pharmakologisch akzeptablen Lösung.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin die gasgefüllten Mikrosphären ein Perfluorkohlenstoffgas umfassen.