JP2005500327A - 肝臓へのdnaのトランスフェクションの増強 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
この出願は、米国仮出願 出願番号60/303,784、2001年6月10日出願に基づく優先権を主張する。
【0002】
本発明は、哺乳動物の肝臓へのDNAのトランスフェクション、特に哺乳動物の器官、とりわけ肝臓へのDNAのトランスフェクションの超音波マイクロスフェア増強に関する。
【背景技術】
【0003】
導入遺伝子の発現を増強する目的でインビボ遺伝子治療の効率を改善する1つの研究法はDNAの細胞へのトランスフェクションを促進するための超音波の利用に関係する。Manomeら、Circulation、99(20):2617-2620(1999)(参照として本明細書に組み入れられる)は、超音波を用いるインビトロおよびインビボでの裸のプラスミドDNAの大腸癌腫細胞へのトランスフェクションを開示している。この研究では、大腸菌(Escherichia coli)lacZまたはベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子(ベータ・gal)を含有するレポーターpcDNA3−lacZプラスミド、およびネオマイシン3’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)を用いて移動効率を評価した。MC38細胞、マウス大腸癌腫細胞を同系マウスに移植し、裸のDNAを伴うプラスミドをマウスおよび細胞に注入した。細胞を1.0−MHz、20W/cm2の超音波に連続的に暴露した。一過的アッセイでは、有意な数の細胞が、ベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子で形質導入された。
【0004】
Lawrieら、Circulation、99(20):2617-2620(1999)は、インビトロで脈管細胞のトランスフェクションの後、超音波が遺伝子発現を増強することを報告した。Lawrieらは、非ウィルス性遺伝子送達を増強するため補助的な超音波の使用を研究した。この研究では、培養ブタ脈管平滑筋細胞および内皮細胞を裸のまたはリポソーム複合ルシフェラーゼ・レポータープラスミドでトランスフェクションした。内皮細胞のリポフェクションの後、補助的な超音波暴露によりルシフェラーゼ活性が増強された。超音波暴露は、細胞の生存性には影響しなかったが、脈管平滑筋細胞増殖を阻止したが、内皮細胞増殖を阻止しなかった。
【0005】
Shohetら、Circulation、101(22):2554-2556(2000)(参照として本明細書に組み入れられる)は、遺伝子の形質導入のための非侵襲性の方法について記載している。この研究では、ベータ・ガラクトシダーゼを含有し、そして構成プロモーターにより誘導される組換えアデノウイルスは、アルブミンコーティングされたペルフルオロプロパン充填マイクロバブルの表面に結合された。次いでアデノウイルスを効率よく送達させるために同時心エコー図法を伴うかまたは伴わずにラット頚静脈にマイクロバブルを注入した。ウイルスを含有する超音波媒介のマイクロバブルの破壊を行った全ラットの心臓でベータ・ガラクトシダーゼ導入遺伝子の心筋発現が示された。
【0006】
Anwerら、Gene Ther.7(17):1516-1525(2000)は、分子医学の形態である遺伝子治療が、将来的に医学処置に大きな影響力を有すると予測されるが、遺伝子治療の臨床使用は、十分な、正確なそして安全なDNAがインビボで標的細胞に取り込まれることを確実にする遺伝子分配系が、不十分であることにより阻まれていると報告した。Anwerらは、非ウイルス性トランスフェクション法が安全な適用に有利であるが、とりわけインビボで、トランスフェクション率を上昇させることが有益であろうと報告した。Anwerの研究は、インビトロおよびインビボでのDNAプラスミドの移動を増強させるために超音波の使用に注目した。ベータ・ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼDNAレポータープラスミドをインビトロで4つの細胞系(NIH 3T3 繊維芽細胞、悪性メラノーマ Mewo、HeLa、Dunning 前立腺腫瘍 R3327-AT1)にトランスフェクションした。超音波は、55(Mewo)から220倍(AT1)の刺激を誘導し、インビトロで2%(Mewo)から12%(AT1)のトランスフェクション効率をもたらした。ベータ・ガラクトシダーゼレポーターを用いてコペンハーゲン・ラットの皮下に移植したDunning 前立腺腫瘍 R3327−AT1でインビボでの刺激を評価した。腫瘍内にDNAを注入した後、集中的な超音波により組織学的にベータ・ガラクトシダーゼ陽性細胞の10倍増加、およびELISAアッセイにおいてベータ・ガラクトシダーゼタンパク質発現の15倍増加が誘導された。対照的に、静脈内プラスミド適用後に超音波が、レポーター遺伝子発現を増強することは見出されなかった。
【0007】
別の研究では、Anwerら、Gene Ther.7(21):1833-1839(2000)は、陽イオン性脂質基盤のトランスフェクション複合体の全身投与後の原発腫瘍への遺伝子移入に及ぼす超音波の局所適用の影響を調査した。Anwerらは、(塩化N−[(1−(2−3−ジオレイロキシ)プロピル)]−N−N−N−トリメチルアンモニウム):コレステロール基盤のトランスフェクション複合体の腫瘍担持マウスへの全身投与の結果、腫瘍およびその他の組織、主に肺における発現に至ることが以前に示されていることを報告した。
【0008】
脈管遺伝子分配のためのマイクロバブル増強超音波技術が、Lawrieら、Gene Ther.7(23):2023-2027(2000)により報告されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。Lawrieは、心脈管遺伝子治療の進歩が、ウイルスベクターの安全性および実用性ならびに現在の非ウイルス性トランスフェクション技術の効率の悪さに対する懸念により阻まれていることに注目した。
【0009】
Tachibanaら、に対する米国特許Re.第36939号は、液体中に気体のマイクロバブルを含むブースター、例えば3〜5%のヒト血清アルブミン溶液中に0.1〜100μmの直径を有する気体のマイクロバブルの約4×107セル/ml、および超音波への暴露を伴う、種々疾患の治療に有用であるブースターおよび医薬品を含む医薬用液体組成物について記載している。
【0010】
Ungerらに対する米国特許第5542935号は、造影剤または薬物がそこにカプセル化されている気体状の前駆体充填リポソームを含む治療用送達系を開示している。
【0011】
PCT公開W08902464は、生存哺乳動物細胞への材料の導入または材料と細胞の融合の方法を開示している。該方法は、材料の存在下で液体懸濁液中の細胞を、細胞に損傷をあたえるのに十分な超音波励起に供することを含む。細胞または細胞膜に導入される材料は、DNAもしくはRNA、またはタンパク質であるのが好ましい。
【0012】
中国特許第1056124号は、動物および植物の双方の遺伝子操作のために超音波を使用する遺伝子伝導方法を開示している。超音波で処理するDNA溶液中の生物学的材料は、溶液中のDNA分子が細胞内に拡散するような、生物学的材料の細胞膜に構造変化を引き起こす。
【0013】
PCT公開WO9806864は、遺伝子発現を制御するために局所熱を使用する方法を開示している。熱ショックタンパク質(hsp)遺伝子プロモーターは、選択された治療用遺伝子で組換えられており、そして選択された細胞で発現される。局所的に調節された加熱、例えば集中的な超音波を用いてhspプロモーターを活性化する。
【0014】
PCT公開WO0042988は、患者の組織に付着する白血球に選択的に結合する材料物質を利用する、そこに付着する白血球を有する組織を同定および/または処置する方法を開示している。該材料は、活性化された炎症性組織に選択的に結合する気体充填マイクロバブル・造影剤でよい。超音波エコー図法により活性化された白血球に結合するマイクロバブルを位置決定でき、そしてマイクロバブル・造影剤に担持される薬物または遺伝子配列により炎症性組織を処置することができる。
【0015】
米国特許第6265387号 BIおよび2000年8月31日に公開されたPCT出願国際公開第00/50617号は、ポリヌクレオチドが細胞にトランスフェクションされ、そして治療レベルで発現されるように、細胞に連結された脈管にポリヌクレオチドを注入することによる哺乳動物細胞へのポリヌクレオチドの送達に関する遺伝子治療の方法を開示している。これらの開示では、脈管内静水(物理学的)圧を増加させるか、または浸透圧を増加させることにより、組織脈管の透過性を上昇させることによりこの脈管内投与経路を増強する。
【0016】
本発明にしたがって、DNAまたは等価物を末梢血に注入し、そして肝臓に超音波を当てることにより肝臓における遺伝子発現が達成される。超音波は単独で、場合により注入圧を上昇させて、破壊されたマイクロスフェアにより増強される場合、DNAまたは等価物の核への効率のよいトランスフェクションを導く。
【0017】
発明の概要
したがって本発明の目的は、細胞、例えば哺乳動物の肝臓またはその他の器官における遺伝子発現を誘導する方法を提供することである。
【0018】
本発明の別の目的は、DNAまたは等価物を肝臓にトランスフェクションするための方法を提供することである。
【0019】
本発明の更に別の目的は、マイクロスフェアおよび超音波を伴って、ならびに場合により注入圧を上昇させて、望ましいDNAまたは等価物を肝臓にトランスフェクションするための新たなおよび改善された方法を提供することである。
【0020】
アポA1遺伝物質を肝臓に注入し、そして超音波およびマイクロスフェアを用いてアポA1遺伝子の肝臓細胞におけるトランスフェクションを促進してアポA1遺伝子の発現を増強することにより、アポA1遺伝子発現を誘導することが本発明の更に別の目的である。
【0021】
本発明の前記のおよびその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明を読むこと、および添付の図面を参照することにより明らかになろう。
【0022】
本発明は、前記の目的および利点を満たして、DNAまたは等価物を哺乳動物の肝臓またはその他の器官にトランスフェクションするための新たなおよび新規の遺伝子治療法を提供し、該方法は、
【0023】
a)DNAまたは等価物を肝臓の脈管構造に送達させる工程、および
【0024】
b)肝臓をDNAに暴露している間に肝臓に超音波を適用して肝臓におけるDNAの発現を誘導する工程
を含む。
【0025】
別の態様では、マイクロスフェアまたはマイクロバブルを血液に注入してトランスフェクション過程を増強する。場合により別の態様においては、DNAまたは等価物の注入圧を上昇させてトランスフェクション手順を増強する。
【0026】
発明の説明
本発明は、ポリヌクレオチド、例えばDNAおよびRNAの哺乳動物の器官、例えば肝臓へのトランスフェクションのための材料および方法を含む。該方法は、高い注入圧、標的器官、例えば肝臓の超音波処置、または超音波処置および注入圧の組み合わせおよび/またはそれとマイクロバブルもしくはマイクロスフェアとの組み合わせ、またはこれらの手順のいずれかの組み合わせを用いてDNA含有溶液の脈管内投与を利用する。
【0027】
本発明では、DNAまたは等価物は、一度哺乳動物細胞に組み込まれると活発に翻訳され得るDNA、いずれかのプラスミドDNA、またはDNAのその他の形態を意味する。DNAを超音波活性物質、例えば小型の気泡と共に処方できる溶液で使用するのが好ましい。気泡は、カプセル化された気体マイクロスフェアまたは界面活性剤、脂質、タンパク質、リポタンパク質、および重合体のごとき材料により安定化された気泡の形態でよい。気体はいずれの種類の気体から成ってもよいが、生理学的に適合する気体、例えば空気および窒素が好ましい。気泡は、血液系において気泡の循環が自由に行えるように、赤血球の大きさに近いかまたはそれより小さい、直径およそ7ミクロンであるのが好ましい。
【0028】
本明細書で用いる「トランスフェクション」なる用語は、概して分配、またはより具体的には細胞膜の直ぐ外側から細胞膜の内側へのポリヌクレオチドの移動を意味する。ポリヌクレオチドが、メッセンジャーRNAにプロセシングされる1次RNA転写物である場合、リボソームが、メセンジャーRNAを翻訳して細胞質内でタンパク質を生成する。ポリヌクレオチドが、DNAである場合、それは核に入り、そこでメッセンジャーRNAに転写されて細胞質に輸送され、そこでタンパク質に翻訳される。ポリヌクレオチドは、その転写および翻訳に必要な配列を含有している。これには開始に必要なプロモーターおよびエンハンサー配列などがある。DNAおよびひいては対応するメッセンジャーRNA(DNAから転写された)は、スプライシングされるはずのイントロン、ポリA付加配列、ならびにそのタンパク質への翻訳の開始および終止に必要な配列を含有する。したがって、ポリヌクレオチドが、その同族タンパク質を発現する場合には、それが細胞に入っていなければならない。
【0029】
ポリヌクレオチド、例えばDNAまたはRNAが、細胞に分配されて治療的な細胞変化を生み出すことができる。ポリヌクレオチドまたはその他の遺伝物質の治療目的での分配が、遺伝子治療として記載される。ポリヌクレオチドは、タンパク質全体または部分を発現するためにコード化され、そして直接的に器官にその場で、または次いで器官に移植される細胞への移動により間接的に、のいずれかで送達させることができる。DNAまたはRNAは、遺伝子治療に有用ないずれかの治療用試薬、例えば血清Apo A1またはルシフェラーゼ酵素のヌクレオチドでよい。
【0030】
肝臓の実質細胞には、肝細胞、クッパー細胞、ならびに胆管および胆小管を裏打ちする上皮細胞などがある。肝臓実質細胞の主要な構成要素は、肝類洞の少なくとも片側、および胆細管の反対側に存在する多角柱状肝細胞(肝臓細胞としても公知である)である。実質細胞ではない肝臓細胞には、脈管内の細胞、例えば内皮細胞または繊維芽細胞などがある。
【0031】
本発明では、ポリヌクレオチドを遠位または近位の部位で肝臓脈管に送達させる。肝臓脈管には消化管または別の内臓(例えば脾臓、膵臓、および胆嚢)から肝臓へ血液を輸送する門脈系などがある。別の肝臓脈管は、肝臓静脈である。下大静脈または最終的に肝臓に繋がる別の脈管を介して肝臓静脈を連絡させることができる。針またはカテーテルを用いてポリヌクレオチドを脈管系に注入する。切開および組織脈管の可視化に続いて直接観察下で注入を実施することができる。あるいは、カテーテルを遠位部位に挿入し、そして標的組織に繋がる脈管系に存在するように通り抜けさせることができる。別の態様では、無傷の皮膚を横切り、そして標的組織に供給またはそこから排出する脈管に入る針を用いて注入を実施することができる。
【0032】
肝臓では、肝臓静脈が通常肝臓から下大静脈へ血液を運ぶので、輸出脈管である。また肝臓で門脈および肝臓動脈が通常肝臓へ血液を運ぶので、肝臓に関する輸入脈管である。プラスミドDNAが、肝臓の流出脈管(すなわち肝臓静脈)に分配されると、効率よく発現され得る。
【0033】
本発明の方法では、場合により注入圧と組み合わせた超音波技術を用いてポリヌクレオチド、例えばDNAおよび/またはRNAを肝臓にトランスフェクションする。
【0034】
該方法を実施する場合に、DNAまたはRNAをトランスフェクション試薬と共に溶液にし、そして次いで脈管に注入する。DNAまたはRNA溶液は、超音波活性物質、例えば、血液系を循環するのを可能にするほど十分に小さい直径である小型の気泡と共に処方するのが好ましい。気体のマイクロスフェアを液体中に捕捉することによりマイクロバブルを形成する。気体は、いずれかの所望の気体でよいが、安全性の理由から、生理学的な気体、例えば空気、酸素、もしくは窒素、または不活性気体、例えば貴ガス、六フッ化イオウまたはペルフルオロカーボンガスであるべきである。液体は、生理学的に適合するpHおよび浸透圧を有する生理食塩水(約1から8重量%)、水性グルコース溶液、ヒト血清アルブミン溶液の溶液等であるのが好ましい。好ましくは、泡の直径は約0.01から約7ミクロンである。
【0035】
別の態様では、いずれかの公知の方法、例えば遮蔽法により、または注射器の機能として注入圧を上昇させることができる。注入圧は、約2から10秒間で約1から500mlの溶液を投与することにより達成される圧力であるのが好ましい。しかしながら、圧力は、肝臓を損傷し得る圧力以下であるべきである。適当に装着された注入ポンプを用いて注入圧を上昇させることができる。
【0036】
超音波処置のために、超音波造影剤をDNAまたはRNA溶液に含める。かかる造影剤は、市販により入手可能であり、そしてMolecular Biosystems(San Diego、カリフォルニア州)のOptison超音波造影剤、およびインドシアニン・グリーン溶液、攪拌高張生理食塩水、自己血液、または水性マグルミン・ジアトリアゾエート等がある。
【0037】
好ましくは0.5から10.0MHzの超音波シグナルを提供する公知の超音波装置により超音波を適用することができる。
【0038】
本発明の方法を単独で、または例えば腫瘍の処置において化学療法剤と併せることを含む別の形態の治療との組み合わせで用いることができる。
【0039】
アポ−A1遺伝子は、アポリポタンパク質A1を生成し、これは冠動脈心疾患に随伴されるアテローム性動脈硬化症を低減させるのに活発な役割を果たす。HDL−コレステロール(HDL)は、冠動脈心疾患の進展と逆相関する。高レベルのHDLは、冠動脈心疾患のリスクを低減させ、低レベルは早発性の冠動脈心疾患のリスクの著明な上昇に随伴される。HDLは、恐らく、大抵の場合、末梢細胞(特に動脈マクロファージ)からのコレステロールの流出を促進することにより冠動脈心疾患のリスクを低減させ、そして異化作用のためにコレステロールを肝臓に輸送する。このプロセスは、コレステロール逆輸送して知られている。
【0040】
コレステロール逆輸送の進行は、アポリポタンパク質A1を含有し、そして実質的な脂質含有量を欠いている初期HDL粒子と、細胞表面のABC1トランスポーター・タンパク質との相互作用で開始する。ABC1トランスポーター・タンパク質は、初期HDLと相互作用して、コレステロールのHDL粒子への流出を促進する。アポリポタンパク質A1は、遊離のコレステロールをコレステロールエステルにエステル化する血漿酵素レシチン・コレステロール・アシルトランスフェラーゼ(LCAT)を活性化する。コレステロールエステルの疎水性特性により、コレステロールエステルは、HDLおよび脂肪のコアに移動し、初期HDL粒子は、コレステロールエステルでコーディングされた形状の球状になる。この成熟HDL粒子は、脂質をVLDL(超低密度リポタンパク質)コレステロールエステルトランスファータンパク質(CETP)に移すことによりそのコレステロースエステルを開放するか、またはコレステロールエステルはスカベンジャーレセプターB1(SRB1)レセプターを利用して肝臓により取り込まれる。
【0041】
アポリポタンパク質A1は、肝臓および腸において合成される。そのアミノ酸配列は同定されている。しかしながらこれまでに、アポA1がどのように合成されるかを決定するのに利用できる情報はほとんどなく、したがってアポA1合成を上方制御する薬物は未だ開発されていない。
【0042】
アポA1ノックアウトマウスでは、アテローム性動脈硬化を進行させることが示されている。ウイルスベクターを利用する遺伝子治療によりこれらのノックアウトマウスにおけるアポリポタンパク質A1レベルが上昇し、そしてアテローム性動脈硬化が低減されている。肝臓が、アポリポタンパク質A1の合成に関与する主要な器官であるので、アポA1遺伝子形質導入を誘導するためのウイルスベクターのヒトにおける反復接種は、現在のところ有害である可能性があり、そしてこれらの安全性の懸念のためにヒトにおいて実行可能な治療ではない。したがって、肝臓でアポA1遺伝子発現を誘導するためのより安全で非観血的経路が、希求されている。
【0043】
本発明は、遺伝子、例えば肝臓におけるアポA1遺伝子発現を誘導するための非観血的経路のための方法として特に適している。この手順では、前記した方法を用いて、場合により注入圧を上昇させて、裸のプラスミドアポA1 DNAを、処方を含有するマイクロスフェアまたはマイクロバブルを介して末梢血に注入する。肝臓の毛細管内皮細胞は、有窓性であり、したがってプラスミドの肝臓細胞への取り込みの増強を可能にできる。次いで肝臓細胞を超音波で処置して、マイクロスフェアを破壊し、そして内皮肝臓細胞の一過性の有孔性を引き起こし、アポA1 DNAの進入、およびDNAの内皮細胞の核へのトランスフェクションを可能にする。
【0044】
具体的な方法では、アルビノマウス(体重約20から30gのCD−1)の3から6匹のマウスの尾静脈に裸のプラスミド・ベータ・ガラクトシダーゼDNA(レポーター遺伝子)200mgをマイクロバブル、例えばOPTISONと共に注入し、一方肝臓を標準的な超音波撮像装置で超音波処理する。3日後、マウスを屠殺し、そして形質導入されたベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子を伴う細胞のパーセントに関して肝臓組織を再計算する。
【0045】
マウス実験によりDNAの最適用量、マイクロバブル、ならびに超音波を当てる期間および正確な位置を評価する。プラスミドを球体の内部、内部シェルに、シェル全体にわたって、または表面に配置することができる。その他の代替には、リポソームDNAを利用すること、またはレポーターDNAと、アポA1プラスミドを含有するマイクロスフェアを用いる末梢血へのトランスフェクション率を増強できるVEGFとを組み合わせること、および肝臓に超音波を当てることなどがある。超音波は、単独でおよび破壊されたマイクロスフェアにより増強されて肝臓の内皮細胞の一過性の有孔性を導き、それによりアポA1 DNAの進入およびDNAの核へのトランスフェクションが可能になる。
【0046】
一度マイクロスフェアおよびDNAを決定すると、アポA1ノックアウトマウスにマイクロスフェアと裸のアポA1プラスミドDNAの組み合わせ(その他のマイクロスフェアまたはその他の形態のDNAを利用することができる)を注入し、一方肝臓に超音波を当てる。主要効果評価項目は、マウス血漿中のアポA1のレベルである。
【0047】
明らかに、前記の教示に鑑みて本発明の多くの修飾および変更が可能である。したがって、本明細書で具体的に記載した以外に添付の請求の範囲内で本発明を実施できることは理解されよう。
【実施例1】
【0048】
超音波および高圧の組み合わせを用いるマウスの肝臓のトランスフェクション
【0049】
マウスの4群に、ルシフェラーゼ酵素をコードするDNAプラスミドの注入の処置をし(I.Dankoら、Gene Therapy 1:114(1994))、肝臓を志向させた。体重20から23gのマウスをイソフルランで麻酔した。腹部正中線切開を行い、そして門脈に27ゲージのバタフライ針でカニューレ処置を施した。Harvard注入ポンプを用いて、プラスミドDNAを含有する処方を動物に投与した。24時間後、動物の肝臓を収集し、そしてルシフェラーゼ活性に関して検定した。肝臓の小切片を病理学評価用にも調製した。血液を収集して、肝臓損傷の指標としてALT(アラニン・アミノトランスフェラーゼ)に関して検定した。
【0050】
群1:高圧分配
【0051】
3匹のマウスに10秒間かけててDNA50μgを含有する生理食塩水1.0mlを注入した。注入を行っている間に肝臓の下および上の双方でIVCを閉塞し、注入中の肝臓内部で高圧を作り出した。
【0052】
群2:超音波分配
【0053】
第1のマウスでは、肝臓の下のIVCを閉塞した後、Optison超音波造影剤(Molecular Biosystems、San Diego、カリフォルニア州)0.3mlと混合したTransITトランスフェクション試薬(Mirus Corporation 、Madison,ウィスコンシン州)0.2ml中DNA 50μgから成るDNAを注入した。第2および第3のマウスにはIVC閉塞を行わずに、Optison 0.3mlと混合したDNA 50μgを含有する生理食塩水0.2mlを与えた。
【0054】
すべてのDNA溶液を1分間かけて連続的に注入し、そしてGeneral Electric超音波撮像システム(VIVID5モデル)を用いて肝臓の超音波撮像を1分間実施した。Aquaゲルを充填したゴム手袋の親指の部分にトランスデューサーの先端部を配置した。肝臓の上に配置するときに、ゴム手袋の先端で少量のコンタクトゲルを用いた。超音波設定は、以下のとおりであった。メカニカルインデックス 0.5、フレーム率設定 52フレーム/秒、撮像深度設定 5cm、および周波数 1.6MHz。肝臓内の超音波撮像システムにより注入毎に超音波造影剤を観察した。
【0055】
群3:超音波および高圧分配の組み合わせ
【0056】
3匹のマウスを準備し、そして1群および2群と同様に処置した。マウスに、注入部位の上および下で2分間のIVC閉塞を維持しながら全量1ml(Optison 0.6mlを含む生理食塩水0.4ml中裸のDNA 50μg)を10秒間で与えた。群2の処置と同様に肝臓を1分間撮像した。
【0057】
結果:
【0058】
【表1】
【0059】
処方を含有するDNAの投与の間の肝臓の超音波処置により、基底値よりも189倍大きな平均レベルでのDNAプラスミドの肝臓へのトランスフェクションが可能になった。高圧および高圧と超音波の組み合わせにより、更に大きなレベルのルシフェラーゼDNAをトランスフェクションできたが、双方は観察可能なレベルの急性肝臓損傷を引き起こすようであった。
【実施例2】
【0060】
アポA1をコードするDNAでのマウスの肝臓のトランスフェクション
【0061】
実施例1と同様に、プラスミドDNAをマウスに注入している間に超音波を適用する実験を行った。CMVプロモーターを用いてヒトアポA1をコードするプラスミドDNAを調製した。処置後1、3、および7日に処置した動物のアポA1の血清レベルを測定した。
【0062】
群1:超音波を伴う高圧
【0063】
各マウスをイソフルランで麻酔した。187μl中DNA 250μg、Optison 900μl、および生理食塩水412.5μlから成る注入物質全量1.5mlを10秒間かけて門脈に分配した。肝臓の上および下でIVCにクランプを配置した後、注入し、そして注入後2分に除去した。肝臓に超音波を提供した直後に、DNAを注入し、そして1分間持続した。2.5MHz トランスデューサーを用いて、1.5MHzで操作して、深度2cmで、焦点ゾンーン1cmで、メカニカルインデックス0.5、52フレーム/秒、および粉末設定 8で超音波を適用した。トランスデューサー用に2cmのスタンドオフを形成するためにゲル充填したラテックス手袋を用いて実験1に記載したように超音波を適用した。
【0064】
群2:高圧尾静脈注入
【0065】
各々のマウスにリンガー溶液1.9ml中DNA10μgを含む注入物質1.9mlを注入した。注入物を2から3秒間かけて分配した。
【0066】
群3:超音波を伴う高圧尾静脈注入
【0067】
注入物質が、Optison 950μlをも含むこと以外は群2に関して記載したとおりの注入物質1.9mlを各マウスに注入し、4から5秒間かけて分配した。超音波を注入物質の分配開始から30秒間適用したこと以外は実施例1に記載したように肝臓を超音波で処置した。超音波を主に肝臓の右葉に志向させた。
【0068】
結果:
【0069】
【表2】
【0070】
高圧下または圧および超音波を組み合わせて分配した場合、処方を含有するアポA1 DNAの肝臓への投与により、基底値よりも大きな平均レベルまでDNAプラスミドをトランスフェクションすることができた。高圧および超音波の組み合わせで処置した数匹の動物から急性の肝臓損傷が観察された。
【0071】
本発明を特定の好ましい態様を参照して説明してきたが、それに関する明確な変更は、当業者に明確になるので、本発明はそれには限定されないと考えられる。
Claims (20)
- a)DNAまたはRNAを含有する溶液を肝臓脈管構造へ送達させる工程、および
b)溶液への暴露中に肝臓に超音波を適用し、肝臓におけるDNAの発現を誘導する工程
を含む哺乳動物の肝臓へのDNAまたはRNAのトランスフェクションのための方法。 - 溶液を高めた注入圧で経脈管で送達させる、請求項1記載の方法。
- 溶液が、更に気体のマイクロバブルを含む、請求項1記載の方法。
- 気体が、空気、窒素、または酸素である、請求項3記載の方法。
- DNAが、細胞に組み込まれたときに活発に翻訳される任意のDNAである、請求項1記載の方法。
- 気泡が、カプセル化された気体マイクロスフェアであるか、または気泡が、1以上の界面活性剤、脂質、タンパク質、リポタンパク質、もしくは重合体で安定化されている、請求項3記載の方法。
- マイクロスフェアが、末梢血に注入される、請求項3記載の方法。
- トランスフェクションされたDNAが、肝臓のコレステロール代謝を改変させる、請求項1記載の方法。
- DNAが、アポA1をコードし、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1記載の方法。
- DNAが、アポA1をコードする裸のプラスミドDNAを含む、請求項1記載の方法。
- DNA含有溶液を高い注入圧下で送達させる、請求項3記載の方法。
- 超音波を適用して肝臓処置の領域を限定する、請求項1記載の方法。
- アポA1をコードするDNAを含む溶液を肝臓の脈管構造へ高い脈管圧下で送達させる工程を含む、肝臓からのアポA1分泌を増加させるための方法。
- a)アポA1遺伝子を含有するマイクロスフェアを形成する工程、
b)マイクロスフェアを肝臓へ送達させる工程、および
c)マイクロスフェアに超音波を適用し、肝臓においてアポA1遺伝子の発現を誘導する工程
を含むコレステロールを調節するための肝臓におけるアポA1遺伝子のトランスフェクションのための方法。 - マイクロスフェアを末梢血に注入する、請求項14記載の方法。
- アポA1遺伝子が、裸のアポA1プラスミドDNAである、請求項14記載の方法。
- 医薬的に許容可能な溶液中にDNAおよび安定化された気泡を含む肝臓のトランスフェクションのための組成物。
- DNAが、プラスミドDNAを含む、請求項17記載の組成物。
- DNAが、アポA1をコードするプラスミドDNAを含み、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項17記載の組成物。
- 安定化された気泡が、気体を充填したマイクロスフェアを含む、請求項17記載の組成物。
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US5580575A (en) * | 1989-12-22 | 1996-12-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic drug delivery systems |
JPH03297475A (ja) * | 1990-04-16 | 1991-12-27 | Ken Ishihara | 共振音波により薬物の放出を制御する方法 |
DE69215722T3 (de) * | 1991-03-22 | 2001-03-08 | Katsuro Tachibana | Verstärker zur Ultraschalltherapie von Erkrankungen sowie diesen enthaltende flüssige Arzneimittelzusammensetzungen |
CN1056124A (zh) | 1991-06-05 | 1991-11-13 | 清华大学 | 高效超声波基因导入方法 |
AU5457294A (en) * | 1992-10-29 | 1994-05-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus-mediated ldl receptor gene transfer and targeting |
WO1994018954A1 (en) * | 1993-02-22 | 1994-09-01 | Vivorx Pharmaceuticals, Inc. | Methods for in vivo delivery of biologics and compositions useful therefor |
EP0717617B1 (de) * | 1993-09-09 | 2000-10-25 | Schering Aktiengesellschaft | Wirkstoffe und gas enthaltende mikropartikel |
US6048903A (en) * | 1994-05-03 | 2000-04-11 | Robert Toppo | Treatment for blood cholesterol with trans-resveratrol |
US5558092A (en) * | 1995-06-06 | 1996-09-24 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods and apparatus for performing diagnostic and therapeutic ultrasound simultaneously |
US6139819A (en) * | 1995-06-07 | 2000-10-31 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Targeted contrast agents for diagnostic and therapeutic use |
US6265387B1 (en) * | 1995-10-11 | 2001-07-24 | Mirus, Inc. | Process of delivering naked DNA into a hepatocyte via bile duct |
US20010009904A1 (en) * | 1997-12-30 | 2001-07-26 | Jon A. Wolff | Process of delivering a polynucleotide to a cell via the vascular system |
US5849727A (en) * | 1996-06-28 | 1998-12-15 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Compositions and methods for altering the biodistribution of biological agents |
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JP2002515887A (ja) * | 1996-10-19 | 2002-05-28 | クウォドラント、ヘルスケアー、(ユーケー)、リミテッド | 診断および治療における中空マイクロカプセルの使用 |
US6120751A (en) * | 1997-03-21 | 2000-09-19 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Charged lipids and uses for the same |
US6416740B1 (en) * | 1997-05-13 | 2002-07-09 | Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. | Acoustically active drug delivery systems |
US6575956B1 (en) | 1997-12-31 | 2003-06-10 | Pharmasonics, Inc. | Methods and apparatus for uniform transcutaneous therapeutic ultrasound |
US6066123A (en) * | 1998-04-09 | 2000-05-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enhancement of bioavailability by use of focused energy delivery to a target tissue |
US6135976A (en) * | 1998-09-25 | 2000-10-24 | Ekos Corporation | Method, device and kit for performing gene therapy |
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DE60026313D1 (de) * | 1999-07-23 | 2006-04-27 | Uutech Ltd | Sensibilisierung von roten blutkörperchen gegenüber ultraschall durch einwirkung eines elektrischen feldes |
IES990763A2 (en) * | 1999-09-09 | 2001-04-04 | Comtor Ltd | A Wrapping Method and Apparatus |
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
JP2016514155A (ja) * | 2013-03-14 | 2016-05-19 | ソノジェン リミテッド ライアビリティ カンパニー | Abca1発現の音響化学誘導およびそのための組成物 |
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