PT98694A - Gene codificador da proteina mk humana - Google Patents

Description

Este invento está relacionado com uma nova sequência de DMA de uma proteína tendo homologia substancial com o factor neurotrófico humano de ligação a heparina (HBHF), As sequências em questão também apresentam um elevado grau de homologia com uma proteína murina anteríormente descrita designada MKi. A homologia de MK com estas proteínas conhecidas sugere uma utilidade semelhante na indução do crescimento e diferenciação das células nervosas, assim como manutenção e reparação das células nervosas. Ainda, a ocorrência do gene MK em células de teratocarcinoma e no desenvolvimento embrionário indica uma utilidade mais lata como factor indutor da diferenciação, assim como um factor de manutenção ou reparação de tecidos. A proteína do presente inventa é normalmente produzida no cérebro humano, mas aprentemente numa altura diferente do desenvolvimento em relação a HBNF. A proteína MK humana apresenta cerca de 85¾ de homologia com a sequência de MK de ratinho já publicada. Mão foi anteríormente relatada a existência de tal proteína em humanos, se bem que agora pareça que MK é um membro de uma família de genes altamente conservada que está presente numa série de espécies diferentes» 0 gene codificador da proteína MK humana foi isolado a partir de uma biblioteca de cDNA obtida a partir de RNA de cérebro de recém-nascida humano» 0 gene foi sequenciado e clona-do; é uma sequência de 366 núcleotidos fazendo prever uma proteína tendo 121 aminoácidos»

FUNDAMENTO DQ INVENTO

Kadomatsu et al. ÍBiochem. Biophys. Res. Comm» 151s1312-1318, 1988) isolou e sequenciou cDNA derivado de células de murganho, que referiu, como MKI. O correspondente mRNA foi

referido como sendo abundante nas fases iniciais do desenvolvimento embrionário, mas não nas fases mais tardias, Foi sugerido que a proteína MKi está associada ao controle da diferenciação celular, especificamente como uma proteína de ligação a DNA reguladora da expressão genética, Não se encontrou relação com quaisquer outras sequências de proteínas conhecidas. Uma publicação subsequente (Tontoraura et al, « J, Biol. Chem, 2ó5u 10765-1Θ770, 199©) descreveu a expressão do gene MK nas fases iniciais da diferenciação de células do carcinoma embrionário e também observou a ocorrência de tr'i's classes distintas de clones de cBNAy referidas como MKI, MK2 e MK3, Kadomatsu et al, <J, Cell, Biol, 110s6©7~61ò? 199©) sugeriu que MK possa desempenhar um papel fundamental na diferenciação de uma variedade de células e que possa estar envolvido na geração de tecidos epiteliais e na remodelação da mesoderme.

Encontrou-se que a sequência MKI de murganho tem um elevado grau de hologia no grupo de proteínas conhecidas como factores neurotróficos de ligação ã heparina CHBNFs); a sequência de nucleótidos codificadora destas últimas proteínas foi descrita pelo requerente no pedido copendente N2 de Série ©7/568,574. As proteínas HBNF foram originalmente descritas como HBBliS em EP 325076« Descobriu-se agora inespersdamente que um gene correspondente á sequência MK de murganho também se encontra em cérebro humano. 0 presente inventa proporciona toda a sequência do gene codificador da proteína humana, assim como a sequência de aminoá-cidos prevista para a proteína madura, vectores de clonagem e expressão e células hospedeiras capzes de expressarem o gene e produtoras de proteína MK» Face à forte hamologia entre as proteínas MK e HBNF, é provável que estas constituam uma família de genes e proteínas tendo significado no desenvolvimento.

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Breve Descrição doa Desenhos

Figura i (Ver também Listagem de Sequências 1). Sequência de nucleótidos e de aminoécidos do gene MK humano. Os aminoá— eidos a carregado representam a pré-sequência prevista da proteína, a seta representa o e>:tremo N prevista da proteína madura e as duas sequências peptídicas correspondendo aos iniciadores i © 2 usadas para amplificar a sonda de DNA genómico de murganho estão sublinhados, fts duas sequências de poliadenilação perto do extremo 3 do gene estão sublinhadas. A Figura 2 mostra uma omparação da região da proteína madura de HBNF humano (Ver também Listagem de Sequências 3) e nucleótidos de MK e sequência de aminoácidos deduzida. Os amino-ácidos idênticos estão indicados a carregado. As identidades nas duas sequências de nucleótidos estão indicadas por asterisco (*)»

A Figura 3 mostra uma sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos deduzida da MK humana e de murganho (Ver também Listagem de Sequências 2). As diferenças nas duas sequências de nucleótidos estão indicadas por asteriscos í$). As diferenças nos aminoácidos estão indicadas como letras carregadas. Os aminoácidos usados para projectar os iniciadores genómi-cos de murganho para F‘CR estão sublinhados.

Figura 4. Expressão bacteriana de proteínas HBNF e MK humanas recombinantes. Os lisados celulares são de culturas bacterianas contendo os plasmídeos de expressão pETHHB ou pETMH2« fts faixas 1 e 2 são lisados de culturas não induzidas e induzidas com IPTG contendo ρΕΤΜΗ^. A faixa 3 é proteína MK recombinante purificada. As faixas 4 e 5 são culturas não induzidas e induzidas contendo pETHHB* A faixa & é proteína HBNF recombinante purificada. Os padrSes de proteína são da BRL.

Figura 5. Ensaios de crescimento de neuritos com as proteínas HBNF e MK recombinantes purificadas. As proteínas purificadas foram testadas em neurSes fetais de ratos com 18 dias nas concentrações indicadas. (A) Células neuronais sem proteína adicionada, <b> Proteína HBNF derivada de cérebro bovino <16© ng/ml). <c> Proteína HBNF recombinanie humana purificada (15© ng/ml), íd) Proteína MK recombinante humana purificada (15€í ng/ml).

Figura 6 mostra (a) Expressão do gene HBNF durante a

embriogénese de rato, De cada tecido foi aplicada 2© pg de RNA total por faixa e hibridado com sonda de cBWA de HBNF humano marcado com '“‘^P. Os tecidos usados no isolamento de RNA foram de embrião total para ES e Ε1Θ, cabeças para E12 e £14, cérebro

total para E16, E18, E2©, P2 e adulto? (b> Expressão do gene MK durante a embriogénese do rato. A mesma transferência Northern de 7,2 (a) hibridada com uma sonda de cBNA MK humano marcada com " P,

Figura 7« Expressão dos genes de HBNF e MK no cérebro de rato adulto. RNA extraído de várias regiões do cérebro de ratos com Ξ meses cie idade foi sujeito a análise de transferência northern íl© pg/faixa de RNA? Faixa 1 - cérebro total, 2 córtex, 3 - hipocampos, 4 - cerebelo, 5 - nucleus caudato, 6 -cérebro médio + hipotalamus, 7 - pedúnculo cerebral), A transferência resultante foi hibridada consecutivamente com sondas de HBNF, MK e β-actina.

Figura 8« Expressão induzida por ácido retinóico dos genes HBNF e MK em células NT2/D1. As células NT2/D1 foram tratadas com concentrações variáveis de RA, cultivadas durante 9 dias e extraído o RNA, (A) Para cada concentraçãade RA usou—se 1© pg de RNA na análise northern, A transferência resultante foi consecutivamente hibridada com sondas de HBNF, MK e β-actina» <B>

Os sinais de hibridaçâo obtidos em (A) para HBNF (preto) ε MK (tracejada) foram medidos por densitometria e normalizados para os sinais de IS-aetina.

Descrição Detalhada do Invento A sequência de DNA codificadora de liK humana foi clonada por isolamento de uma combinação de reacção em cadeia com polimerase (PCR) e despiste de uma biblioteca de cDNA derivada de cDNA de cérebro de humano recém nascido. A sequência de HBNF humano foi usada como ponto de partida para a projecçSo de oligonucleótidos de uma reacção de amplificação por PCR; esta sequência está apresentada na Figura 2. Projectaram-se oligonu-cleótidos específicos para as regiões mais conservadas entre HBNF e a sequência de BNft publicada para MKi, Estes oligonucleótidos foram usados como iniciadores numa reacção em cadeia com polimerase (PCR) em DNA genómico de murganho. 0 produto esperado de 15© pares de bases foi clonada num vector adequada e determinada a sequência. Este clone foi usado como sonda para o despiste de uma biblioteca de cDNA de cérebro humano para identificar o gene equivalente de MK humano. Isolou-se um único clone que se subclo-nou e sequenciou. A sequência de um destes clones está apresentada na Figura 1 e constitui cerca de 79© nucleótidos dos 11©© nucleótidos do mRNA de MK madura humana. A sequência de nucleóti— dos foi subsequentemente confirmada noutros clones de MK mais curtos, os quais contêm diferentes fragmentos sobreponíveis do clone original. A sequência do cDNA de MK inclui dois sinais de poliadenilação e uma cauda poli A (Figura í). 0 clone original isolado tem uma grelha de leitura aberta com uma região codificadora começando no nucleótido 22 e definindo uma proteína de 143 resíduos, fi sequência N—terminal è altamente hidrofóbica e tem as características de um peptídeo sinal (Von Heijne, J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985). Com base nos critérios para estruturas de um - 7 - peptídeo sinal estabelecidos por Von Heijne (id; Nucl, Acid Res. 14ϊ4683“4&905 198è) e comparações com sequências de MK de murganho e H8NF humana, assumiu-se que a clivagem do peptídeo sinal ocorre entre os resíduos de aminoácidos 22 (Ala) e 23 Lis), dando assim origem a um polipeptídeo MK maduro de 121 resíduos de comprimento.

Como se mostra, na Figura 3, uma comparação da sequência de aminoácidos deduzida para MK humana com a sequência da proteína MK de murganho indica uma diferença de apenas cerca de 15¾. ft maior parte destas alterações são conservadoras, fi homologia entre MK e HBNF, apresentado na Figura 2, indica uma homologia de 50%, aumentando para è3% quando são incluídas as alterações de aminoácidos conservadoras. Dez císteinas que estão presentes em ambas as proteínas estão perfeitemente alinhadas, sugerindo estruturas semelhantes.

Para proporcionar uma fonte da proteína MK madura livre de proteínas eucariotas coniaminantes, clones de cDNA isolados atrás foram usados como moldes para amplificação por PCR com iniciadores destinados a colocar um codão de metionina imediata-mente 5’ relativamente ao resíduo lisina N-terminal das proteínas maduras. 0 produto amplificada foi clanado numa forma modificada do vector de expressão pET-3a (Studier, et al.„ 199Θ) e o plasmí-deo resultante pETMH2 foi usado para transformar E. coli estirpe BL21 LvsS. Os extractos proteicos de bactérias contendo pETMH2 induzidas com IPTB expressam uma banda proteica principal que migra de acordo com um peso molecular de 16,5 KBa (Figura 4, Faixa 2). A cultura não induzida (Faixa 1, bactérias contendo pETMH2) contem muito menos da proteína conforme avaliado pelas intensidades das bandas em SDS-PAGE. A proteína MK recombinante foi purificada a partir de culturas bacterianas induzidas por IPTG através de cromatografia de afinidade para beparina (Figura

4, Faixa 3) e confirmada a sua sequência N-terminal e composições em aminoácidos» \ »

A homologia entre d DMA de MK humano e d de murganho publicada e as sequências de proteína deduzidas mostram um nível mais baiKo de conservação comparado com uma comparação evolutiva semelhante de HBNF (Figura 3> = Usando um extremo N putativo derivado da proteína MK madura deduzida da homologia com HBNF, observou-se 86% de identidade de aminoácidos incluindo uma deleção de três aminoácidos na sequência de murganho» Tanto HBNF como MK são expressas na cérebro mas a sua regulação temporal e espacial difere» Hibridação preliminar in situ mostrou padrões distintos de expressão para as duas mensagens. A análise de hibridação Northern de RNA de muragrtho de tecidos adultos examinados indica que apenas o cérebro expressou uma mensagem de 1650 nucleétidos para HBNF (Figura 6). Isto é consistente com trabalhos anteriores sobre as características de expressão da proteína HBNF observada no cérebro (EP 326 075, Rauvala, EMBO J. 8s2933--2941, 1989). Recentemente, a proteína HBNF foi também isolada a partir de útero bovina (Milner et al. Biochem» Biophys. Res» Comm. 165; 1096-·! 103, 1989). Estas experiências iniciais indicaram que MK não é expresso em qualquer tecido adulto examinado (Figura 6). No entanto, experiências subsequentes indicaram que o mRNA de MK é detectável em duas regiões do cérebro adulto, o nucleus caudato e o tronca cerebral (Figura 7). Com base em tempos de exposição signifícativamente mais longos necessários para se ver estas bandas em RNA de adulto comparado com quantidades equivalentes de RNA embrionário, parece que oRNA de MK é expresso em níveis mínimos no adulto. A expressão temporal de ambos os genes foi avaliada por análise de transferências northern com RNA total de rato em diferentes fases do desenvolvimento» A hibridação com uma sonda 9

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de HBNF indica um aumenta gradual da mensageiro ao langa da desenvolvimento, ocorrendo o nível atais alto no cérebro adulto (Figura 6a). A hibridação da mesma transferência com uma sonda MK indica que apenas tecidos embrionários de 12, 14 e 16 dias continham o mensageiro. A presença atais abundante da mensageiro MK parece ser na fase emhrionária de 12 dias (Figura 6b). Estes resultados estão de uma forma geral de acordo com os estudos de hibridação in situ de Kadomatsu (supra). No entanto, ao contrário dos resultados de Kadomatsu., fomos incapazes de detectar a expressão de mRNft MK em tecido do rim. Estudos da proteína HBNF em cérebros de rato sugerem que o nível mais elevado ocorre nas 7 dias após o nascimento. Este nível reflete uma diferença de dez vezes quando comparado com animais de 56 dias de idade (Rauvala, supra).

A linha celular de carcinoma embrionário humano íEC) NT2/D1 pode ser induzida para se diferenciar em concentrações de ácido retinóico RA) variando entre @,@i e lô μΜ com a proporção de células EC em diferenciação variando entre 5@% a RA @,01 μΜ (Simeone, st al., Nature 346s763-766, 199Θ) até mais de 99% a RA 1 e 10 μΜ (Andrews, Dev. Biol. 1@3;285-293, 1984). Estudou-se a expressão de MK e HBiMF durante a diferenciação de MT2/D1, em concentrações variando entre @,01 e lô μΜ. Após nove dias de exposição a RA, extraiu—se RNA total de células e despistou—se a expressão de genes por análise de northern. A expressão de ambos os genes segiu um padrão semelhante (Figura 8). Os níveis de expressão de mRNA permaneceram num nível de fundo estacionário com RA @,1 - 0,5 μΜ, rapidamente aumentou entre RA @,1 e @,5 μΜ e manteve-se neste nível em concentrações até RA 1@ μΜ inclusive. Suando os sinais de hibridação de RNft foram normalizados para uma sonda testemunha da β-actina, os aumentos máximos foram calculados como sendo de 6 vezes para HBNF e 11 vezes para MK (Figura 8). Estes resultados são comparáveis aos observados para MK durante a indução com ácido retinóico da. linha, celular EC de murganho., BM-1 íKadomatsu et al«. supra). Nesta linha celular, a expressão do gene MK foi induzida 8-10 vezes acima do fundo»

As proteínas HBNF e MK recombinantes foram testadas quanto à capacidade para estimular o crescimento de neuritos em naurSes de cérebro fetal de rato com i8 dias. Ambas as proteínas derivadas de bactérias apresentaram actividades promotoras do crescimento de neuritos semelhantes á de HBNF nativo de bovino {Figura 5). A proteína MK recombinante foi também testada quanto à actividade mitogénica em células endoteliais da aorta de bovino adulto e em fibroblastos NIH 3T3. A proteína MK não mostra actividade mitogénica nestas células. No entanto, o meio condicionado de células L. transfectadas com MK foi descrito como sendo miiDgénicD para células PC12 por Tomomura (Biochem. Biophys» res» Coram. 171 s 603, 609, 1990).

Os resultados do presente invento indicam assim que HBNF e MK são membros de uma família de genes altamente conservada. Ainda, os dados de expressão de genes implicam que estes genes funcionem na proliferação, manutenção e/ou diferenciação do desenvolvimento do tecido e, em particular, tecido nervoso.

Os exemplos que se seguem ilustram a clonagem e expressão do gene MK num sistema de expressão com RNA-polimerase de T7. No entanto, este sistema de expressão de T7 é muito eficiente, deve-se entender q ue este não é o único meio pelo qual MK pode ser produzido por via recombinante» A produção de MK pode ser conseguida por incorporação do gene MK em qualquer vector de expressão adequado e subsequente transformação de uma célula hospedeira adequada com o vector? como alternativa a transformação de células hospedeiras pode ser conseguida directamente por DMA apenas sem utilizar o vector. A produção de Hk por células

eucarióticas ou por células procarióticas é considerada na presente invento. São exemplos de células eucarióticas isoladas células de mamífera, células vegetais, células de levedura e células de insectos. De um modo semelhante, hospedeiros procarió-ticos adequados além de E. coli. incluem Bacillus subtilis.

Podem também ser empregues outros vectores de expressão adequados que são seleccionados com base na escolha da célula hospedeira. Por exemplo são conhecidos numerosos vectores adequadas para usar na transformação de células bacterianas. Por exemplo, plasmídeos e bacieriófagos, tais como fago lambda, são os vectores ma is vulgarmente usados para. hospedeiros bacterianos e para E. coli em particular. Tanto em células de mamífero como em células de insecto, os vectores virais são frequentemente usados para obter expressão de DMA exógeno. Em particular as células de mamífero são normalmente transformadas com SV4Ô ou vírus polioma; e as células de insecto em cultura podem ser transformadas com vectores de expressão de baculovírus. Os sistemas vectores para levedura incluem os plasmídeos com centró-meros de levedura, plasmídeos epissomais de levedura e plasmídeos de integração de levedura.

Também será compreendido que a realisação do invento não está limitada à utilização da sequência exacta do gene HK cama definido na Figura 1. Modificações da sequência tais como deleçSes, inserções ou substituições na sequência que produsam alterações silenciosas na molécula proteica resultante também são considerados. Por exemplo, alterações na sequência do gene que resultem na produção de um aminoâcido quimicamente equivalente num determinado sitio são também consideradas; assim, um codão codificador do aminoâcido alanina, um aminoâcido hidrofóbico, pode ser facilmente substituído por um codão codificador de um outro resíduo hidrofóbico, como seja glicina, ou podem ser 12 12 »

substituídos por um resídua mais hidrofóbico como seja valina, leucina ou isoleucina. De forma semelhante, as alterações que resultam na substituição de um resíduo carregado negativamente por outro, como seja ácido aspártico por ácido glutâmico ou um resíduo carregada positivamente por outra, como seja lisina opor arginina, também se espera que produzam um produto hiolopgicamen-te equivalente, fts alterações de nucleótidos que resultam na alteração das fracções N-terminal e C-terminal da molécula proteica frequentemente não alteram a actividade da proteína, pois estas regiões não estão geralmente envolvidas na actividade biológica. Pode também ser desejável eliminar uma ou mais das císteinas presentes na sequência, uma vez que a presença de císteina pode resultar na formação indesejável de multímeros quando a proteína é produzida por via recombinante, complicando assim as processos de purificação e cristalização. Cada uma das modificações propostas está dentro do trabalho de rotina realizado na área, tal como a determinação da tempo de retenção da actividade biológica dos produtos codificados. Portanto, sempre que for usada a expressão "sequência de DMA MK" ou "gene MK", na especificação ou nas reivindicações, será entendido que engloba todas estas modificações e variações que resultam na produção de uma proteína MK biologicamente equivalente. Em particular, o inventa engloba as sequências de DMA que são suficientemente duplicativas da sequtncia da Figura 1 de forma a permitir que hibridem com ela em condições convencionais de hibridação Southern de alta restringtncia, tais como as descritas em Maniatis et al.. (MOlecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). A proteína MK é fortemente homóloga da proteína HBNF e, tal coroo HBMF, estimula a indução do crescimento de neuritos. MK é pois, proposta como agente neurotró-fico. Como tal, as proteínas MK são úteis tanto in bvivo como in vitro. no crescimento, manutençaõ e reparação de células nervosas dos sistemas nervosos central e periférico. Um exemplo da aplicação in vitro é na manutenção de implantes de cérebro embrionário que são agora propostos para usar no tratamento da doença de Parkinson.

Face ao seu papel aparente na diferenciação, a proteína MK é também proposta como um factor geral de diferenciação, manutenção e reparação de tecidos. Em particular, ΙΊΚ pode ser útil no tratamento de células tumorais para induzir a reversão para um fenótipo diferenciado. ft administração in vivo de MK está grandemente simplificada pela descoberta da sequência do gene, particularmente no tratamento de perturbações do sistema nervoso central ou periférico. A identificação do gene e da sua sequência permite a construção de células transgénicas tais como fibroblastos, monócitos ou macrófagos que podem manipulados de forma a permitir a expressão do gene MK e usado como um implante para o tratamento de perturbações neurodegenerativas, reparação de nervos periféricos após cirúrgia ou quaisquer condições em que o aumento do crescimento e/ou reparação das células nervosas seja desejável.

Ainda, a utilização terapêutica de MK não está limitada de apenas humanos. De facto, face à natureza conservada desta proteína entreespécies afastadas, a administração de MK em qualquer forma pode ser benéfica também para aplicação veterinária. As composições terapêuticas compreendem MK numa quantidade eficaz para induzir a actividade biológica pretendida em combinação com um veículo líquido ou sólido. Como alternativa, a composição compreende uma agregação farmaceuticamente aceitável de células transgénicas compatíveis capazes de expressarem MK in vitro» como um implante para tratamento por reparação ou diferenciação da sistema nervoso periférico e central.

EXEMPLO CLQNftSEM E SEQUENCIAÇgP DO I3ENE Μί< A sequência de aminaácidos publicada para a proteína MK de ratinho foi usada para criar oligonucleótidos específicos a serem usados como iniciadores numa reacção em cadeia com polime-rase. O DNA genómico de murganho foi isolado a partir de murganhos 057 Black/òJ, como descrita em Maniatis et al. supra. A reacção de PCR foi realizada num molde de DNA complementar com um emparelhamento de um minuta a 5Θ°C , 2 minutas de extensão a 72°C e 1 minuto de desnaturação a 94°C durante 3Θ ciclos usando polimerase Taq <USB Corp.) 0 produto de 15€? pares de bases de PCR para MK de murganho foi. clonado no vector Blue Scipt ( + ) íStratagene) e usado como sonda no despiste de uma biblioteca de cDNA de cérebro de recém-nascido e de gânglios nasais em lambda gtll (Kamholz, PNAB USA 83s4962-4966, 1986). Um único clone putativo contendo a sequência MK foi isolado e subclonado no sítio ecoRI de Blue Script (+) e sequenciado pelo método de terminação de cadeias de didesoxinucleótidos {Sanger et al. PNAS USA 74;5463-5467, 1988). A sequência do gene MK, assim como a sequência de aminoâcidos prevista estão presentes na Figura 1. A comparação com a sequência MK de murganho mostra uma diferença de 41 nucleótidos, incluindo a deleção de três codoes na sequência de murganho.

EXPRESSÃO DE MK HUMANA RECPWBINANTE 0 clone isolado referida atrás, referido como pMKHC2 foi usado como molde para amplificação por PCR com iniciadores projectados para colocar um codão de metionina e um sítio de restrição Νΰε I imediatamente 5J relativamente à lisina W-termi-nal- O produto de PCR purificada foi danado ntun derivado do vector de BKpressSa pET-3a, que foi modificado pela deleção do fragmento Sall/Pvull de 14ΘΘ pb e inserção de uma origem fi de replicaçSo no sítio EcoRI. Após sequenciação da inserção para confirmar a fidelidade da amplificação por PCR, o plasmídeo (designado pETMH23 também anteriormente referido coaio pETMKHC2> foi usado para transformar a estirpe BL21 lisS e induzida a produção de proteína com IPTG como descrito (Studier et ai .» supra). Os sedimentos de um mililitro de cultura foram ressuspen-sos em μΐ de tampão SDS CLaemmli, Nature 227só8®-685, 1970) e 2,5 μΐ correram num gel de SDS—PASE de 15% de acrilamida. 0 gel foi corado com azul Coomassie. MK recombinante foi purificado a partir de extracto bacteriano em resina de heparina-sefarose CL 6B (Pharmacia) em 10 mH Tris, pH 7,& e eluido a 1-1,13 M NaCI« Foi conseguida mais purificação em colunas de Mono S (Pharmacia) em fosfato de sódio 5® mH, pH 6,8, com concentração crescente de sal de O a 1 M NaCl. A proteína purificada foi eluida a Θ,ό M NaCl - ENSAIOS DE CRESCIMENTO DE NEURIT05 Cérebros de ratos fetais de 18 dias foram removidos em condiçSes estéreis e dispersados em células isoladas em DMEM contendo 1 €>% FCS usando uma seringa estéril de 5 ml« A suspensão de células foi ajustada a 5 x 1θ cêlulas/ml e semeadas em placas de cultura de tecidos qu,e foram previamente revestidas com 5® pg/ml de poli-L-lisina durante 3® minutos á temperatura ambiente (Rauvala e Pihlaskari, 0, Biol. Chem, 262:16625-16635, 1987/. As culturas foram incubadas durante 24 horas a 37°C em 1®% de CCL,, após o meio foi mudado para DMEM contendo 1 mg/ml de BSA e as proteínas H8NF ou MK foram adicionadas nas concentrações indicadas» Após mais um dia de incubação, a actividsde de crescimento 16 - de neuritos foi determinada par ©Mame visual das células relativamente ao crescimento prolongado conforme comparado com as testemunhas. Como se mostra na Figura 5D, Mí< recombinante purificada é capas de estimular o crescimento de neuritos substancial-mente no mesmo grau de HBNF recombinante e HBNF derivado de cérebro bovino.

CRESCIMENTO E INDUÇÃO COM ÁCIDO RETINÓICO DAS CÉLULAS NT2/D1 HUMANAS A linha celular de carcinoma embrionário humana NT2/DÍ foi cultivada como descrito anterior-mente (Andrews, Dev. Biol. 103:285-293, 1984)., Para a indução com ácido retinóico as células foram cultivadas e ressuspensas em meio DMEM contenda 1Θ% de soro fetal bovino Hyclone Laboratories, Inc.) numa densidade de 5 x 5

1® células por placa de 10® mm. Várias concentrações de todo o ácido retinóico trans em dimetilsulfóxido (10 μ!> foram adicionadas e as células foram incubadas durante 9 dias. Meio fresco e RA foram adicionados nos dias 4 e 8. As placas foram lavadas uma vez com tampão de fosfatos salino ε o RNA extraído como descrito atrás. A Figura S mostra uma representação gráfica dos níveis de HBNF e de MK produzidos como resposta a vários níveis de concentração de ácido retinóico. Uma vez que as células NT2/D1 induzidas com Rh foram sugeridas como um sistema modelo para estudos de diferenciação neuronal (Lee and Andrews, J. Neurosci» 6:514-521, 1986), o aumento na indução dos genes HBNF e Mk neste sistema indica um papel possível no desenvolvimento neuronal.

DEPÓSITO DE MATERIAIS BIOLáSXCQS E« coli estirpe M 1®61 portadoras de pMKHC2 e E. coli estirpe BL2T LusS portadora de pETMH2foram depositadas nas colecçSes de culturas da American C-yanamid Company, Lederle 17 17 Laboratories, Pearl River, Collection, 123Ô1 Parklawn acesso ATCC 68384 em 13 de em 17 de Setembro,

New York s na American Type Culture Crive, Rockvi lie, MD, com o número de Agosto, 1990 s número de acesso 68384 1990a respectivamente.

Claims (1)

1. REIVINDICASSES: id» - Gene purificado e isolado, c a. r ac t e r i Ξ a. d o por ser codificador de ucna proteína MK humana. zada par 2ã. - Gene de acordo com a ter a sequência MK descrita Reivindicação X, caracteri-na Figura que se segues

   §