CN107208081A - 用于从包含污染宿主细胞蛋白质的材料纯化重组人α‑半乳糖苷酶A的方法 - Google Patents
用于从包含污染宿主细胞蛋白质的材料纯化重组人α‑半乳糖苷酶A的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107208081A CN107208081A CN201680006854.8A CN201680006854A CN107208081A CN 107208081 A CN107208081 A CN 107208081A CN 201680006854 A CN201680006854 A CN 201680006854A CN 107208081 A CN107208081 A CN 107208081A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gal
- column chromatography
- separate sections
- recombinant human
- human alpha
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 101000718525 Homo sapiens Alpha-galactosidase A Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 102000043404 human GLA Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 23
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 claims abstract description 160
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 claims abstract description 160
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims abstract description 13
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 15
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 12
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 12
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 10
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 claims description 7
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 6
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000012784 weak cation exchange Methods 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052587 fluorapatite Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229940077441 fluorapatite Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 59
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 30
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 17
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 8
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 6
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- APFJUBGRZGMQFF-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN APFJUBGRZGMQFF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N Met-Ser-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical group OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- HFQKBOPMAOTAIR-TZSVBWBLSA-N α-d-galactosyl-(1->4)-β-d-galactosyl-(1->4)-β-d-glucosylceramide Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@@H]([C@H](O)/C=C/CCCCCCCCCCCCC)NC(C)=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 HFQKBOPMAOTAIR-TZSVBWBLSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N Ala-Asp-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- IKKVASZHTMKJIR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IKKVASZHTMKJIR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IYCZBJXFSZSHPN-DLOVCJGASA-N Ala-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O IYCZBJXFSZSHPN-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- NIZKGBJVCMRDKO-KWQFWETISA-N Ala-Gly-Tyr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NIZKGBJVCMRDKO-KWQFWETISA-N 0.000 description 2
- HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- UWIQWPWWZUHBAO-ZLIFDBKOSA-N Ala-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 UWIQWPWWZUHBAO-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 2
- FEGOCLZUJUFCHP-CIUDSAMLSA-N Ala-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FEGOCLZUJUFCHP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ADSGHMXEAZJJNF-DCAQKATOSA-N Ala-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N ADSGHMXEAZJJNF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHNDBBVSWOWYII-LPEHRKFASA-N Arg-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O GHNDBBVSWOWYII-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)CN=C(N)N HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- VDBKFYYIBLXEIF-GUBZILKMSA-N Arg-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VDBKFYYIBLXEIF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- ZJEDSBGPBXVBMP-PYJNHQTQSA-N Arg-His-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZJEDSBGPBXVBMP-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 2
- RATVAFHGEFAWDH-JYJNAYRXSA-N Arg-Phe-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RATVAFHGEFAWDH-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- LFAUVOXPCGJKTB-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N LFAUVOXPCGJKTB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- URAUIUGLHBRPMF-NAKRPEOUSA-N Arg-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O URAUIUGLHBRPMF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- UGXVKHRDGLYFKR-CIUDSAMLSA-N Asn-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UGXVKHRDGLYFKR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ZDOQDYFZNGASEY-BIIVOSGPSA-N Asn-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O ZDOQDYFZNGASEY-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 2
- CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N Asn-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N Asn-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- DPSUVAPLRQDWAO-YDHLFZDLSA-N Asn-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DPSUVAPLRQDWAO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N Asp-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- APYNREQHZOGYHV-ACZMJKKPSA-N Asp-Cys-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N APYNREQHZOGYHV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- NZJDBCYBYCUEDC-UBHSHLNASA-N Asp-Cys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NZJDBCYBYCUEDC-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- BIVYLQMZPHDUIH-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)O BIVYLQMZPHDUIH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- TZOZNVLBTAFJRW-UGYAYLCHSA-N Asp-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N TZOZNVLBTAFJRW-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 2
- HXVILZUZXFLVEN-DCAQKATOSA-N Asp-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXVILZUZXFLVEN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- HJZLUGQGJWXJCJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HJZLUGQGJWXJCJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FIAKNCXQFFKSSI-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FIAKNCXQFFKSSI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- OZBXOELNJBSJOA-UBHSHLNASA-N Asp-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N OZBXOELNJBSJOA-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- LTARLVHGOGBRHN-AAEUAGOBSA-N Asp-Trp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(O)=O LTARLVHGOGBRHN-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 2
- LEYKQPDPZJIRTA-AQZXSJQPSA-N Asp-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LEYKQPDPZJIRTA-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 2
- UPJGYXRAPJWIHD-CIUDSAMLSA-N Cys-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UPJGYXRAPJWIHD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SBMGKDLRJLYZCU-BIIVOSGPSA-N Cys-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)O SBMGKDLRJLYZCU-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 2
- GOKFTBDYUJCCSN-QEJZJMRPSA-N Cys-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N GOKFTBDYUJCCSN-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- DVIHGGUODLILFN-GHCJXIJMSA-N Cys-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N DVIHGGUODLILFN-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- JFSNBQJNDMXMQF-XHNCKOQMSA-N Gln-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O JFSNBQJNDMXMQF-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 2
- UFNSPPFJOHNXRE-AUTRQRHGSA-N Gln-Gln-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UFNSPPFJOHNXRE-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 2
- BLOXULLYFRGYKZ-GUBZILKMSA-N Gln-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O BLOXULLYFRGYKZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- NSNUZSPSADIMJQ-WDSKDSINSA-N Gln-Gly-Asp Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NSNUZSPSADIMJQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- YXQCLIVLWCKCRS-RYUDHWBXSA-N Gln-Gly-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O YXQCLIVLWCKCRS-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- HYPVLWGNBIYTNA-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HYPVLWGNBIYTNA-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- HWEINOMSWQSJDC-SRVKXCTJSA-N Gln-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HWEINOMSWQSJDC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N Gln-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 2
- RONJIBWTGKVKFY-HTUGSXCWSA-N Gln-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O RONJIBWTGKVKFY-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 2
- YLABFXCRQQMMHS-AVGNSLFASA-N Gln-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O YLABFXCRQQMMHS-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- KUTPGXNAAOQSPD-LPEHRKFASA-N Glu-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O KUTPGXNAAOQSPD-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- PXXGVUVQWQGGIG-YUMQZZPRSA-N Glu-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PXXGVUVQWQGGIG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- QIQABBIDHGQXGA-ZPFDUUQYSA-N Glu-Ile-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QIQABBIDHGQXGA-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- NWOUBJNMZDDGDT-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 NWOUBJNMZDDGDT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- DWBBKNPKDHXIAC-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O DWBBKNPKDHXIAC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- ZQYZDDXTNQXUJH-CIUDSAMLSA-N Glu-Met-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZQYZDDXTNQXUJH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- UUTGYDAKPISJAO-JYJNAYRXSA-N Glu-Tyr-Leu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UUTGYDAKPISJAO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- UPADCCSMVOQAGF-LBPRGKRZSA-N Gly-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CNC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 UPADCCSMVOQAGF-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- SXJHOPPTOJACOA-QXEWZRGKSA-N Gly-Ile-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SXJHOPPTOJACOA-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- XVYKMNXXJXQKME-XEGUGMAKSA-N Gly-Ile-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XVYKMNXXJXQKME-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 2
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- UOYGZBIPZYKGSH-SRVKXCTJSA-N His-Ser-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N UOYGZBIPZYKGSH-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FWWJVUFXUQOEDM-WDSOQIARSA-N His-Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N FWWJVUFXUQOEDM-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QICVAHODWHIWIS-HTFCKZLJSA-N Ile-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N QICVAHODWHIWIS-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 2
- UKTUOMWSJPXODT-GUDRVLHUSA-N Ile-Asn-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N UKTUOMWSJPXODT-GUDRVLHUSA-N 0.000 description 2
- RPZFUIQVAPZLRH-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N RPZFUIQVAPZLRH-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- MASWXTFJVNRZPT-NAKRPEOUSA-N Ile-Met-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N MASWXTFJVNRZPT-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- BCISUQVFDGYZBO-QSFUFRPTSA-N Ile-Val-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O BCISUQVFDGYZBO-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 2
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- LJHGALIOHLRRQN-DCAQKATOSA-N Leu-Ala-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N LJHGALIOHLRRQN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- VQPPIMUZCZCOIL-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VQPPIMUZCZCOIL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- ZYLJULGXQDNXDK-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZYLJULGXQDNXDK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- LKXANTUNFMVCNF-IHPCNDPISA-N Leu-His-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O LKXANTUNFMVCNF-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- JNDYEOUZBLOVOF-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O JNDYEOUZBLOVOF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- QNTJIDXQHWUBKC-BZSNNMDCSA-N Leu-Lys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QNTJIDXQHWUBKC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- GKFNXYMAMKJSKD-NHCYSSNCSA-N Lys-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GKFNXYMAMKJSKD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- JOSAKOKSPXROGQ-BJDJZHNGSA-N Lys-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JOSAKOKSPXROGQ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- VOOINLQYUZOREH-SRVKXCTJSA-N Met-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCSC)N VOOINLQYUZOREH-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- MHQXIBRPDKXDGZ-ZFWWWQNUSA-N Met-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 MHQXIBRPDKXDGZ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- DJBCKVNHEIJLQA-GMOBBJLQSA-N Met-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N DJBCKVNHEIJLQA-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 2
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 2
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- LWPMGKSZPKFKJD-DZKIICNBSA-N Phe-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LWPMGKSZPKFKJD-DZKIICNBSA-N 0.000 description 2
- APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- FQUUYTNBMIBOHS-IHRRRGAJSA-N Phe-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N FQUUYTNBMIBOHS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N Phe-Pro-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=CC=C1 MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- GZGPMBKUJDRICD-ULQDDVLXSA-N Phe-Pro-His Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)O GZGPMBKUJDRICD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- JFNPBBOGGNMSRX-CIUDSAMLSA-N Pro-Gln-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JFNPBBOGGNMSRX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N Pro-Leu-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- RIAKPZVSNBBNRE-BJDJZHNGSA-N Ser-Ile-Leu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RIAKPZVSNBBNRE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- GDUZTEQRAOXYJS-SRVKXCTJSA-N Ser-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GDUZTEQRAOXYJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N Ser-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- AXKJPUBALUNJEO-UBHSHLNASA-N Ser-Trp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AXKJPUBALUNJEO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- QWMPARMKIDVBLV-VZFHVOOUSA-N Thr-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O QWMPARMKIDVBLV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 2
- RKDFEMGVMMYYNG-WDCWCFNPSA-N Thr-Gln-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RKDFEMGVMMYYNG-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- MQUZMZBFKCHVOB-HJGDQZAQSA-N Thr-Gln-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O MQUZMZBFKCHVOB-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N Thr-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 2
- PUEWAXRPXOEQOW-HJGDQZAQSA-N Thr-Met-Gln Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PUEWAXRPXOEQOW-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N Thr-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- BIJDDZBDSJLWJY-PJODQICGSA-N Trp-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BIJDDZBDSJLWJY-PJODQICGSA-N 0.000 description 2
- PKUJMYZNJMRHEZ-XIRDDKMYSA-N Trp-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PKUJMYZNJMRHEZ-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- KRCPXGSWDOGHAM-XIRDDKMYSA-N Trp-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KRCPXGSWDOGHAM-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- GFUOTIPYXKAPAH-BVSLBCMMSA-N Trp-Pro-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O GFUOTIPYXKAPAH-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 2
- XKDOQXAXKFQWQJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O XKDOQXAXKFQWQJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- OSMTVLSRTQDWHJ-JBACZVJFSA-N Tyr-Glu-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OSMTVLSRTQDWHJ-JBACZVJFSA-N 0.000 description 2
- MXFPBNFKVBHIRW-BZSNNMDCSA-N Tyr-Lys-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O MXFPBNFKVBHIRW-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- NZBSVMQZQMEUHI-WZLNRYEVSA-N Tyr-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N NZBSVMQZQMEUHI-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 2
- OJCISMMNNUNNJA-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OJCISMMNNUNNJA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N Val-Ala-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- UKEVLVBHRKWECS-LSJOCFKGSA-N Val-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N UKEVLVBHRKWECS-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- VIKZGAUAKQZDOF-NRPADANISA-N Val-Ser-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VIKZGAUAKQZDOF-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N Val-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 108010078114 alanyl-tryptophyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 108010010430 asparagine-proline-alanine Proteins 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine Chemical compound CCCCN HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010085059 glutamyl-arginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical group 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 108010060857 isoleucyl-valyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N pemoline Chemical compound O1C(N)=NC(=O)C1C1=CC=CC=C1 NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 salt Salt Chemical class 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 2
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 2
- 108010029599 tyrosyl-glutamyl-tryptophan Proteins 0.000 description 2
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical class NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical class OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2h-chromen-2-one Chemical group C1=CC=CC2=C1OC(=O)C=C2C PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091006522 Anion exchangers Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000432824 Asparagus densiflorus Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000345998 Calamus manan Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000004652 Cardiovascular Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N Chlorine Chemical compound ClCl KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 244000050510 Cunninghamia lanceolata Species 0.000 description 1
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010557 Lipid storage disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 206010027727 Mitral valve incompetence Diseases 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 201000007981 Reye syndrome Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- BNMJSBUIDQYHIN-UHFFFAOYSA-N butyl dihydrogen phosphate Chemical compound CCCCOP(O)(O)=O BNMJSBUIDQYHIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002506 iron compounds Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000013190 lipid storage Effects 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 208000014416 lysosomal lipid storage disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 208000005907 mitral valve insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004987 o-phenylenediamines Chemical class 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000012950 rattan cane Nutrition 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013621 viresolve pro solution Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
Abstract
公开了用于以大规模产生高纯度的重组人α‑半乳糖苷酶A(rhα‑Gal A)的方法。所述方法包括如下步骤：(a)在无血清培养基中培养产生rhα‑Gal A的哺乳动物细胞，(b)收集培养物上清液，(c)使所述培养物上清液经过阴离子‑交换柱色谱，(d)经过疏水柱色谱，(e)经过采用对磷酸基团具有亲和性的材料作为固相的柱色谱，(f)经过阳离子‑交换柱色谱，(g)经过染料‑亲和柱色谱，和(h)经过凝胶过滤柱色谱，以该顺序进行。
Description
技术领域
本发明一般涉及采用宿主细胞产生人α-半乳糖苷酶A(rhα-Gal A)的方法，并且涉及从包含污染宿主细胞蛋白质的材料中纯化由此产生的所述rhα-Gal A的方法。更具体地，本发明涉及通过在无血清培养基中培养产生rhα-Gal A的哺乳动物细胞来产生rhα-Gal A的方法，以及，采用柱色谱(包括染料-亲和柱色谱)从培养物上清液纯化由此产生的rhα-Gal A的方法，所述方法实现高产量，并且达到高纯度以允许该纯化的蛋白质作为医药药物直接使用。
背景技术
α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)是一种溶酶体酶，其具有水解糖脂和糖蛋白的末端α-半乳糖基键的活性。三己糖神经酰胺，其包含三个己糖部分，是α-半乳糖苷酶A的底物之一，并且接受该酶在其末端己糖部分处水解。人α-Gal A表达为包含429个氨基酸的前体肽，其中N末端的31个氨基酸构成信号肽。该前体经加工成成熟肽，其在移除该信号肽之后剩下的部分由398个氨基酸组成，并且，一对成熟肽分子容易形成同二聚体，只要条件允许，其即为人α-Gal A的酶活形式。人α-Gal A具有包含甘露糖-6-磷酸残基的寡糖链，并且能通过甘露糖-6-磷酸受体被靶向至溶酶体。
法布瑞氏病是X连锁的遗传性溶酶体贮积病，其由编码α-Gal A的基因的遗传异常所致。该酶活性的缺乏造成三己糖神经酰胺在多种组织中的累积，导致肾损伤、血管扩张性疣和心血管异常，包括心室扩大和二尖瓣闭锁不全。
在上世纪60年代已知晓，在患有法布瑞氏病(Fabry's disease)的患者的组织中几乎检测不到或仅能微弱地检测到α-半乳糖苷酶A的酶活。因此，已推测编码α-Gal A的基因的一些遗传异常应是法布瑞氏病的病因。基于该推测，已通过如下方式进行了针对法布瑞氏病的α-Gal A替代治疗(replacement therapy)：将从人血浆或脾提取并纯化的α-GalA输注给所述患者，获得如下证实结果：α-Gal A替代治疗可降低患有法布瑞氏病的患者血液中三己糖神经酰胺的水平(见NPL 1、NPL 2、NPL 3)。因此，人们认定了α-Gal A酶替代治疗对于法布瑞氏病而言一定是具有前景的。然而，α-Gal A替代治疗的实践应用受到该酶供应缺乏的高度限制。
在1986年，分离了编码人α-Gal A的基因(见NPL 4)，进一步地，在1988年，报到了通过采用转化有人α-Gal A表达载体的CHO细胞来表达并产生rhα-Gal A的方法(见NPL 5)。利用重组技术，这些发现使得以大规模产生人α-Gal A并利用该酶作为用于法布瑞氏病的酶替代治疗的药物成为可能。还在昆虫细胞中表达了rhα-Gal A(PTL 1)。
此外，报道了一些用于纯化rhα-Gal A的方法，其包括采用疏水柱色谱、肝素琼脂糖柱色谱、羟基磷灰石柱色谱、阴离子-交换柱色谱，和凝胶过滤柱色谱(PTL 2、PTL 3)。尽管已显示PTL 2或PTL 3中所描述的用于纯化的方法获得的rhα-Gal A的纯度充分地高，并不认为其能完全适用于人类应用。原因在于，待输注给患者的任何药物均必须不含污染物，具体而言，例如，源自所用宿主细胞的蛋白质，无论PTL 2还是PTL 3均没有显示纯化的rhα-Gal中是否余留有这样的污染物。此外，据报道，用于纯化rhα-Gal A的方法包括，按顺序使用阴离子-交换柱色谱、疏水柱色谱、采用对磷酸基团具有亲和性的材料作为固相的柱色谱、阳离子-交换柱色谱，和凝胶过滤柱色谱(PTL 4)。然而PTL没有提及rhα-Gal A的宿主细胞蛋白质污染。
目前，包含rhα-Gal A作为活性成分的法布瑞氏病的医药药物已在市场上以商品名例如ReplagalTM和FabrazymeTM出售。
引用列表
专利文献
PTL 1:WO 90/11353
PTL 2:WO 98/11206
PTL 3:WO 00/53730
PTL 4:WO 14/017088
非专利文献
NPL 1:Mapes等:Science 169:987-9(1970)
NPL 2:Brady等:N.Engl.J.Med.289:9-14(1973)
NPL 3:Desnick等:Proc Natl Acad Sci USA 76:5326-30(1979).
NPL 4:Bishop等:Proc Natl Acad Sci USA 83:4859-63(1986)
NPL 5:Bishop等:《脂质贮积疾病-生物学与医学方面》(Lipid StorageDisorders-Biological and Medical Aspects)，纽约普莱纽姆出版社(NY Plenum Press)P809-823(1988)
发明内容
技术问题
针对上述背景，本发明的一个目的在于：提供以在无血清培养基中培养产生rhα-Gal A的哺乳动物细胞开始的，产生和纯化重组人α-半乳糖苷酶A(rhα-Gal A)的方法。
本发明的另一个目的在于，提供用于从包含污染物宿主细胞蛋白质的培养物上清液纯化rhα-Gal A的方法，通过包括染料-亲和柱色谱的柱色谱，以实现高产量，并且达到高纯度以允许该纯化的蛋白质作为医药药物直接使用。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明的发明人发现，在无血清培养基中培养产生rhα-Gal A的细胞的上清液中所含的rhα-Gal A，可从包含污染宿主细胞蛋白质的该上清液纯化至极高纯度，并且同时获得极高的产量，通过使rhα-Gal A经过包括阴离子-交换柱色谱、疏水柱色谱、采用对磷酸基团具有亲和性的柱的色谱、阳离子-交换柱色谱、染料-亲和柱色谱，和凝胶过滤柱色谱的组合的纯化方法来实现。本发明通过基于该发现做出进一步研究而完成。
因此，本发明提供如下内容：
1.用于产生重组人α-Gal A的方法，其包括如下步骤：
(a)在无血清培养基中培养产生重组人α-Gal A的哺乳动物细胞，以让其在该培养基中分泌重组人α-Gal A，
(b)通过从在上述步骤(a)中获得的培养物去除细胞来收集培养物上清液，
(c)使在上述步骤(b)中收集的培养物上清液经过阴离子-交换柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，
(d)使在上述步骤(c)中收集的该分级分离部分经过疏水柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，
(e)使在上述步骤(d)中收集的该分级分离部分经过采用对磷酸基团具有亲和性的材料作为固相的柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，
(f)使在上述步骤(e)中收集的该分级分离部分经过阳离子-交换柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，
(g)使在上述步骤(f)中收集的该分级分离部分经过染料-亲和柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，和
(h)使在上述步骤(g)中收集的该分级分离部分经过凝胶过滤柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，以所述顺序进行。
2.如上述(1)所述的方法，其中，阳离子-交换柱色谱中所用的阳离子交换器是弱阳离子交换器。
3.如上述(2)所述的方法，其中，所述弱阳离子交换器具有基于疏水相互作用和氢键形成的选择性。
4.如上述(2)或(3)所述的方法，其中，弱阳离子交换器具有苯基基团、酰胺键和羧基基团。
5.如上述(1)-(4)之一所述的方法，其中，所述染料-亲和柱色谱中所用的染料是蓝色三嗪染料。
6.如上述(1)-(5)之一所述的方法，其中，所述对磷酸基团具有亲和性的材料选自下组：羟基磷灰石和氟磷灰石。
7.如上述(6)所述的方法，其中，所述对磷酸基团具有亲和性的材料是羟基磷灰石。
8.如所述(1)-(7)之一所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞是转染有表达载体的CHO细胞，所述表达载体经设计以在EF-1(α)启动子的调控下表达重组人α-Gal A。
9.通过上述(1)-(8)之一所述的方法产生的重组人α-Gal A组合物。
10.一种药物，其包含如上述(9)所述的组合物，其定期地给予患者。
11.如上述(10)所述的药物，其中，所述药物通过注射给予所述患者。
发明效果
本发明允许从包含污染宿主细胞蛋白质的材料纯化rhα-Gal A。由此纯化的重组人α-Gal A适合作为药物用于法布瑞氏病的酶替代治疗(ERT)。在该治疗中，rhα-Gal A必须定期地给予患有法布瑞氏病的患者。因此，如果α-Gal A药物包含宿主细胞蛋白质，则采用该药物的ERT可能会具有诱导患者中针对宿主细胞蛋白质的严重抗原-抗体反应(即过敏性反应)的潜在风险。该风险可通过采用根据本发明纯化作为药物的rhα-Gal A而被最小化。此外，因为已允许以细胞的无血清培养作为起始来产生rhα-Gal A，本发明提供这样的rhα-Gal A，其不含任何血清源性的污染物，包括病原体例如病毒或朊病毒。因此，根据本发明获得的rhα-Gal A可作为安全药物给予人体，其基本不具有接触此类病原体的任何风险。此外，因为已允许以基本避免应用任何有机溶剂的方式纯化rhα-Gal A，本发明消除了rhα-Gal A变性的风险，否则，可能因与所用的有机溶剂接触而导致该风险。此外，本发明是环境有益的，因为在根据本发明的纯化方法进行之后剩下的废液不含有机溶剂，并且从经济角度考虑也是如此，因为本发明的方法不需要用于处理(在其它情况下将会包含在废液中的)有机溶剂的设备。
此外,本发明允许对在其寡糖链中有甘露糖-6-磷酸残基的rhα-Gal A的高度选择性纯化。为了在给予人体之后发挥其酶活，rhα-Gal A必需被相关细胞通过在其表面上表达的甘露糖-6-磷酸受体摄取。因此，本发明实现的高度选择性纯化将获得这样的rhα-Gal A产物，其作为药物具有显著增加的功效。
附图的简要说明
[图1]
图1显示说明用于构建载体pE-neo/hGHpA的方法的示意图。
[图2-1]
图2-1显示说明用于构建载体pE-gs/hGHpA(α-Gal A)的方法的示意图的第一部分。
[图2-2]
图2-2显示说明用于构建载体pE-gs/hGHpA(α-Gal A)的方法的示意图的第二部分。
[图3]
图3显示用于表达rhα-Gal A的重组细胞的生长曲线，以及rhα-Gal A在培养基中的浓度。
[图4]
图4显示纯化的rhα-Gal A的SDS-PAGE电泳的结果。泳道1中，施加了5微克的纯化的rhα-Gal A。
[图5]
图5显示纯化的rhα-Gal A的SE-HPLC图表。纵轴和横轴分别显示215nm处的吸光度和保留时间。
具体实施方式
本发明中，尽管重组人α-半乳糖苷酶A(rhα-Gal A)优选是人野生型α-Gal A的重组蛋白，但不排除rhα-Gal A是相比人野生型α-Gal A的氨基酸序列而言具有一个或多个氨基酸的一处或多处取代、缺失、添加和/或插入的突变型蛋白质。人野生型α-Gal A的DNA序列和其编码的氨基酸序列，包括N-末端信号序列，分别示为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。N-末端信号序列由31个氨基酸组成，并且在翻译后移除。
本发明中，术语"产生重组人α-Gal A的哺乳动物细胞"或"产生rhα-Gal A的哺乳动物细胞"表示，已被人工操作以表达或强力表达编码人α-Gal A的基因的哺乳动物细胞。尽管该待被强力表达的基因是利用其中纳入了该基因的表达载体而引入哺乳动物细胞(转化)的，但其也可以是已经人工改良以被强力表达的固有基因。用于人工改良固有基因以使其本身强力表达的手段的示例包括但不限于，用强力诱导该基因表达的启动子替代该固有基因上游的启动子。此类方法已公开于若干文献(即WO94/12650，WO95/31560)中。尽管对于待采用的哺乳动物细胞的类型没有具体限制，优选是人来源、小鼠来源或中国仓鼠来源的那些，并且其中，特别优选来源于中国仓鼠卵巢细胞的CHO细胞。
本发明中，术语"重组人α-半乳糖苷酶A"或"rhα-Gal A"表示，在培养过程中，通过上述产生重组人α-Gal A的哺乳动物细胞分泌在培养基中的人α-半乳糖苷酶A。
本发明中，术语"寡糖链"表示，共价结合至α-Gal A的肽链的寡糖的链，包括天冬酰胺型糖链，其共价结合至α-Gal A的天冬酰胺残基。
本发明中，其中待培养产生rhα-Gal A的哺乳动物细胞的优选的无血清培养基的示例有如下培养基：其包含，3-700mg/mL的氨基酸、0.001-50mg/L的维生素、0.3-10g/L的单糖、0.1-10000mg/L的无机盐、0.001-0.1mg/L的微量元素、0.1-50mg/L的核苷、0.001-10mg/L的脂肪酸、0.01-1mg/L的生物素、0.1-20微克/L的氢化可的松、0.1-20mg/L的胰岛素、0.0-10mg/L的维生素B12、0.01-1mg/L的腐胺、10-500mg/L的丙酮酸钠，和水溶性铁化合物。必要时，其还可包括胸苷、次黄嘌呤、常规pH指示剂，和抗生素。
此外，DMEM/F12培养基，一种由DMEM和F12组成的混合的培养基，也可用作基础无血清培养基。这些培养基均是本领域技术人员熟知的。作为无血清培养基，也可采用DMEM(HG)HAM改良的(R5)培养基，其包含碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、胰岛素、亚硒酸钠、二氨基丁烷、氢化可的松、硫酸亚铁(II)、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸，和聚乙烯醇。此外，市售可得的无血清培养基也可用作基础培养基，例如CDoptiCHOTM、CHO-S-SFM II或CD CHO(英杰公司(Invitrogen))、IS CHO-VTM或IS CHO-V-GSTM(欧文科技公司(IrvineScientific))、EX-CELLTM 325PF CHO或EX-CELLTM CD(西格玛公司(SIGMA))等。
本发明中，培养产生rhα-Gal A的哺乳动物细胞至少5天，更优选8-14天，用于在培养基中产生rhα-Gal A。然后，收集包含rhα-Gal A的培养物上清液，并使其经历针对rhα-Gal A的纯化方法。
需要时，用于从包含污染宿主细胞蛋白质的培养物上清液纯化rhα-Gal A的各色谱操作可在非离子表面活性剂的存在下进行，以防止该蛋白质的非特异性结合。尽管对于待使用的非离子表面活性剂的类型没有具体限制，但优选使用基于聚山梨酯的表面活性剂，更优选聚山梨酯80或聚山梨酯20。此类非离子表面活性剂的浓度优选是0.005％(w/v)-0.05％(w/v)，更优选是约0.01％(w/v)。
所述用于纯化rhα-Gal A的方法可在室温或更低温度进行，但优选更低温度，特别是1-10℃。
在所述纯化方法的第一色谱步骤中，所述培养物上清液的pH优选调节至7.0-8.0，更优选调节至pH 7.2-7.8，且更优选至约pH 7.5。然后，将培养物上清液施加至阴离子-交换柱，该柱已用补充有盐的磷酸盐缓冲液平衡，以使rhα-Gal A结合至柱。该磷酸盐缓冲液的pH优选是7.0-8.0，更优选是约7.2-7.8，且更优选是约7.5。尽管对于待添加至磷酸盐缓冲液的盐的类型没有具体限制，优选氯化钠和氯化钾。在其中采用氯化钠的情况中，其浓度优选在5-100mM范围内，更优选在10-60mM范围内，且更优选是约50mM。
在对结合了rhα-Gal A的阴离子-交换器柱进行清洗之后，rhα-Gal A采用具有增加的盐浓度的磷酸盐缓冲液洗脱。尽管对于待使用的盐的类型没有具体限制，但优选氯化钠和氯化钾。在其中采用氯化钠的情况中，其浓度优选在125-500mM范围内，更优选175-350mM，且更优选是约225mM。
此外，尽管对于待采用的阴离子-交换器树脂的类型没有具体限制，可优选使用强阴离子-交换器树脂。可优选使用市售可得的树脂，例如Q Sepharose Fast Flow(GE医疗公司(GE Healthcare))。
疏水柱色谱，所述纯化方法的第二步骤，是利用rhα-Gal A和连接至该树脂的疏水配体的疏水相互作用来去除污染物的步骤。尽管对于待用于该疏水柱色谱中的疏水配体的类型没有具体限制，优选的是包含苯基基团的配体，且更优选的配体包含通过间隔臂(spacer arm)连接至该树脂的苯基基团，例如，由下式代表：R-O-CH2-CH(OH)-CH2-O-C6H5，其中R表示该树脂。用于此目的的特别优选的柱材料是Phenyl Sepharose 6Fast Flow(GE医疗公司)，其中苯基基团通过某种间隔臂共价固定至Phenyl Sepharose 6Fast Flow基质。
疏水柱色谱柱用补充有盐的磷酸盐缓冲液平衡。该磷酸盐缓冲液的pH优选是6.5-7.5，更优选是约6.7-7.3，且更优选是约7.0。尽管对于待添加至磷酸盐缓冲液的盐的类型没有具体限制，优选氯化钠和氯化钾。在其中采用氯化钠的情况中，其浓度优选在500mM-1M范围内，且更优选在700-800mM范围内，且更优选是约750mM。当前，可将Tris缓冲液添加至该磷酸盐缓冲液，添加浓度优选是30-70mM，更优选是约50mM。
然后，将第一步骤中获得的洗脱物的包含rhα-Gal A的分级分离部分施加至柱。在对其上结合了rhα-Gal A的柱进行清洗之后，洗脱rhα-Gal A。洗脱可通过未补充盐的磷酸盐缓冲液来进行，其中磷酸盐缓冲液的浓度优选是3-10mM，且更优选是约5mM。当前，可将Tris缓冲液添加至该磷酸盐缓冲液，添加浓度优选是30-70mM，更优选是约50mM。或者，洗脱可通过纯水来进行。
采用对磷酸基团具有亲和性的固相的柱色谱，所述纯化的第三步骤，是消除污染蛋白质(例如羧基肽酶)的步骤。尽管对于待使用的、对磷酸基团具有亲和性的固相的类型没有具体限制，可优选使用羟基磷灰石和氟磷灰石，并且特别优选羟基磷灰石。
当使用羟基磷灰石柱时，其用补充有盐的磷酸盐缓冲液平衡。该磷酸盐缓冲液的pH优选是6.5-7.5，更优选是约6.8-7.2，且更优选是约7.0，并且磷酸盐的浓度优选是3.0-20mM，更优选是约3-15mM，且更优选是约10mM。尽管对于待添加至磷酸盐缓冲液的盐的类型没有具体限制，优选氯化钠和氯化钾。在其中采用氯化钠的情况中，其浓度优选低于800mM，且更优选在10-200mM范围内，且更优选是约50mM。当前，可将Tris缓冲液添加至该磷酸盐缓冲液，添加浓度优选是30-70mM，更优选是约50mM。
然后，将第二步骤中获得的洗脱物的包含rhα-Gal A的分级分离部分施加至柱。在对其上结合了rhα-Gal A的柱进行清洗之后，洗脱rhα-Gal A。洗脱可通过包含盐的磷酸盐缓冲液来进行。该磷酸盐缓冲液的pH优选是6.5-7.5，更优选是约6.7-7.3，且更优选是约7.0，并且磷酸盐的浓度优选在30-80mM范围内，更优选在40-60mM范围内，且更优选是约45mM。尽管对于待使用的盐的类型没有具体限制，但优选氯化钠和氯化钾。在其中采用氯化钠的情况中，其浓度优选低于300mM，且更优选在10-200mM范围内，且更优选是约50mM。
阳离子-交换柱色谱，所述纯化方法的第四步骤，是消除污染蛋白质的步骤。尽管对于待用于该阳离子-交换柱色谱中的阳离子-交换器的类型没有具体限制，优选弱阳离子交换器，且更优选具有基于疏水相互作用和氢键形成的选择性的弱阳离子交换器。例如，可采用具有苯基基团、酰胺键和羧基基团且具有基于疏水相互作用和氢键形成的选择性的弱阳离子交换器，例如Capto MMC(GE医疗公司)等。
在该阳离子-交换柱色谱中，该柱采用补充有盐的乙酸盐缓冲液平衡。该乙酸盐缓冲液的pH优选是4.5-6.5，更优选是约5.0-6.0，且更优选是约5.5。尽管对于待添加至磷酸盐缓冲液的盐的类型没有具体限制，优选氯化钠、氯化钾和氯化钙。在其中采用氯化钠的情况中，其浓度优选在50-250mM范围内，更优选在100-200mM范围内，且更优选是约150mM。
然后，将第三步骤中获得的洗脱物的包含rhα-Gal A的分级分离部分施加至柱。在对其上结合了rhα-Gal A的柱进行清洗之后，rhα-Gal A采用具有增加的pH的磷酸盐缓冲液洗脱，该pH优选在约5.5-7.5的范围内，更优选在约6.0-7.0范围内，且更优选是约6.5。
染料-亲和性色谱，所述纯化的第五步骤，是用于去除污染物，即宿主细胞蛋白质(HCP)的过程。优选使用蓝色三嗪(Blue triazine)染料，但其它三嗪染料也是合适的。特别优选的是Blue Sepharose 6FF,Fast Flow(GE医疗公司)，如下方示意化学式所示，其由Sepharose 6Fast Flow基质组成，其上通过共价键连接有染料CibacronTM Blue F3GA。
[式1]
染料-亲和性色谱柱用补充有盐的磷酸盐缓冲液平衡处于或接近中性pH，优选pH6.8-7.2，更优选约pH 7.0。尽管对于待添加至磷酸盐缓冲液的盐的类型没有具体限制，优选氯化钠和氯化钾。在其中采用氯化钠的情况中，其浓度优选在50-150mM范围内，更优选在100-150mM范围内，且更优选是约125mM。
然后，将第四步骤中获得的洗脱物的分级分离部分施加至该柱。在对结合了rhα-Gal A的柱进行清洗之后，rhα-Gal A采用含有增加的盐浓度的磷酸盐缓冲液洗脱。尽管对于待添加至磷酸盐缓冲液的盐的类型没有具体限制，优选氯化钠和氯化钾。在其中采用氯化钠的情况中，其浓度优选在400-750mM范围内，更优选在400-500mM范围内，且更优选是约450mM。氨基丁三醇(Trometamol)(三(羟甲基)氨基甲烷)可以优选40-60mM且更优选是约50mM的浓度同时添加至该缓冲液。
凝胶过滤柱色谱，所述纯化方法的第六步骤，是用于消除低分子量杂质(例如内毒素)以及多聚复合物或rhα-Gal A的分解产物的步骤。因此，通过所述纯化方法的第六步骤获得基本纯的rhα-Gal A。
此外，可向包括阴离子-交换色谱、染料-亲和柱色谱、疏水柱色谱、采用对磷酸基团具有亲和性的固相的柱色谱、阳离子-交换柱色谱，和凝胶过滤柱色谱的上述纯化方法再纳入一种柱色谱。所述额外色谱柱优选是染料-亲和柱色谱，其可在必要时于所述纯化方法的任何两个相邻步骤之间使用。
可任选地向本发明的纯化方法添加用于病毒失活的步骤。尽管对于待施用的用于病毒失活的方法类型没有具体限制，但可优选施用溶剂-去污剂方法。为此，将非离子表面活性剂添加至包含rhα-Gal A的溶液，并且将所得的混合物孵育超过3小时。尽管对于待使用的表面活性剂类型没有具体限制，但可优选以单独或以任何组合的方式使用聚山梨酯20、聚山梨酯80、曲通X-100和三(正丁基)磷酸盐，且可更优选地采用聚山梨酯80和三(正丁基)磷酸盐的组合。
所述用于病毒失活的额外步骤可在所述纯化方法之前或在上述纯化方法的任何两个相邻步骤之间使用。
此外，本发明还提供用于从包含污染宿主细胞蛋白质的材料纯化rhα-Gal A的方法。该方法包括这样的步骤，其中使包含rhα-Gal A和用于产生rhα-Gal A的宿主细胞中的固有蛋白质的溶液经过染料-亲和柱色谱。该步骤的主要目的是消除污染宿主细胞蛋白质。该步骤可以任何顺序与选自下组的至少一个其它纯化步骤组合：阳离子-交换柱色谱、疏水柱色谱、阴离子-交换柱色谱、采用对磷酸基团具有亲和性的固相的柱色谱(即羟基磷灰石柱色谱)和凝胶过滤柱色谱。优选地，该组合是按如下顺序的阴离子-交换柱色谱、疏水柱色谱、采用对磷酸基团具有亲和性的固相的柱色谱、阳离子-交换柱色谱、染料-亲和柱色谱和凝胶过滤柱色谱。
通过本发明方法产生的重组人α-Gal A组合物适用于制备待定期地给予患者的药物。待给予所述患者的药物优选通过静脉内注射，更优选通过静脉内输注，并且可优选每周一次至每2-4周一次，更优选每两周一次给予所述患者。一次给予患者的rhα-Gal A的量可优选0.1-2mg/kg体重，更优选0.1-2mg/kg体重。该药物可以预填充注射器的形式供应。
本发明在下文中参考实施例进行进一步详述。然而，这并不意味着本发明限于所述实施例。
[实施例1]
pE-gs/hGHpA(α-GalA)，一种rhα-Gal A表达载体的构建。
pEF/myc/nuc载体(英杰公司)用KpnI和NcoI消化以切出包括EF-1(α)启动子及其第一内含子的DNA片段，其然后用T4DNA聚合酶产生钝端。然后，将因此制备的DNA片段插入pC1-neo载体(英杰公司)，其已用BglII和EcoRI消化然后用T4DNA聚合酶产生钝端。插入该载体的是上述的包括EF-1(α)启动子及其第一内含子的钝端片段，以获得pE-neo7载体(图1)。
包含人生长激素基因的聚腺苷酸化信号序列的DNA片段通过将如下四种合成寡核苷酸退火来合成：(a)hGH-f1(ID NO:1)，(b)hGH-r1(SEQ ID NO:2)，(c)hGH-f2(SEQ ID NO:3)，和(d)hGH-r2(SEQ ID NO:4)。将因此制备的DNA片段插入pE-neo7的MluI和KpnI位点之间，以获得pE-neo/hGHpA载体(图1)。
中国仓鼠谷氨酰胺合成酶("Ch GS"或"GS")编码区的5'一半通过PCR扩增，扩增采用引物组、GS-1(SEQ ID NO:5)和GS-3(SEQ ID NO:6)，以及，从提取自CHO细胞的RNA制备的ssDNA作为模板。Ch GS编码区的3'一半通过PCR扩增，扩增采用引物组、GS-2(SEQ ID NO:7)和GS-4(SEQ ID NO:8)，以及，从提取自CHO细胞的RNA制备的ssDNA作为模板。然后，将扩增的Ch GS编码区的5'一半连接进入pT7blue-T载体(EMD密理博公司(EMD Millipore))。因此获得的载体用EcoRV和BamHI消化，然后扩增的CH GS编码区的3'一半，在用EcoRV和BamHI消化之后，插入消化的载体，以获得包含Ch-GS的全长cDNA的质粒载体。获得的质粒称为pT7blue(GS)(图2-1)。
人α-GalA编码区的5'一半通过PCR扩增，扩增采用引物组、GAL-Mlu(SEQ ID NO:9)和GAL-Sca2(SEQ ID NO:10)，和人胎盘Quick-CloneTM cDNA(克隆泰克公司(Clontech))作为模板。人α-GalA编码区的3'一半通过PCR扩增，扩增采用引物组、GAL-Sca1(SEQ ID NO:11)和GAL-Xba(SEQ ID NO:12)，和人胎盘Quick-CloneTM cDNA(克隆泰克公司)作为模板。然后，将两个PCR产物连接进入pBluescriptSK(+)载体的EcoRV位点。然后，通过用MluI和ScaI消化，从因此获得的载体切下人α-GalA编码区的5'一半，并且通过用ScaI和NotI消化，从该载体切下人α-GalA编码区的3'一半。然后，将切下的片段同时插入pE-neo载体的多克隆位点的MluI和NotI位点，以获得人α-GalA的全长cDNA。因此获得的质粒称为pE-neo(α-GalA)(图2-2)。
pE-neo/hGHpA用AfIII和BstXI消化，并且向因此消化的载体插入Ch-GS cDNA，其已通过用AfIII和BstXI消化而从pT7blue(GS)切出。获得的质粒称为pE-gs/hGHpA(图2-1)。pE-gs/hGHpA载体用MluI和NotI消化，并向因此消化的载体插入人α-GalA cDNA，其已通过用MluI和NotI消化而从pE-neo(α-GalA)切出。获得的质粒称为pE-gs/hGHpA(α-GalA)，其用作其它实验中的rhα-Gal A表达载体(图2-2)。
[实施例2]
用于表达rhα-Gal A的重组细胞的产生。
CHO细胞(CHO-K1：购自美国典型培养物保藏中心)用上述表达载体pE-gs/hGHpA(α-Gal A)转染，转染根据如下方法采用LipofectamineTM 2000(英杰公司)进行。简言之，转染前两天，将2.5x105CHO-K1细胞接种于包含含有5％FCS(D-MEM/F12/5％FCS)的3mL的D-MEM/F12培养基的3.5-cm培养皿，然后细胞在湿润的5％CO2和95％空气的气氛中于37℃培养。培养两天之后，细胞用PBS清洗，并且添加1mL的新鲜无血清D-MEM/F12培养基。然后，细胞通过添加200微升的由LipofectamineTM 2000溶液(用Opti-MEMTM I培养基(生命技术公司(Life Technologies))稀释20倍)和pE-gs/hGHpA(α-GalA)溶液(用Opti-MEMTMI培养基稀释至20微克/mL)组成的1:1混合物溶液来转染，然后在5％CO2和95％空气的湿润气氛中37℃孵育5小时。转染之后，培养基用D-MEM/F12/5％FCS替代，并另培养24小时。
然后，培养基用补充有1x GS补充物(西格玛公司)、10％透析的FBS和30微摩尔/L蛋氨酸亚砜亚胺(MSX)的无谷氨酰胺的GMEM-S培养基(西格玛公司)替代，然后在5％CO2和95％空气的湿润气氛中37℃进行选择性培养。用于选择性培养的已在该培养基中生长的细胞在该培养基中经历数轮连续亚培养，以获得重组细胞。在选择性培养时程后，一步步地升高该培养基中的MSX的浓度，以扩增插入的重组基因。最后，以升高的MSX浓度(100和300微摩尔/L MSX)进行两步亚培养之后，获得在具有300微摩尔/L MSX的培养基中稳定生长的细胞群。
然后，根据限制性稀释技术，具有扩增的重组基因的细胞以每孔可能接种不多于一个细胞的方式接种于96孔板上。然后，细胞培养约10天以使其各自形成单克隆集落。分别对其中形成单克隆集落的孔中的培养物上清液取样，然后如下所述检测其人α-Gal A活性，并且挑选显示表现人α-Gal A的高活性的细胞系。
为适应无血清悬浮物细胞培养物，所选细胞系各自在市售可得的无血清培养基，补充有10mg/L胰岛素、40mg/L胸苷、100mg/L次黄嘌呤(hypoxantine)和100微摩尔/L MSX的CD-OptiCHOTM培养基(英杰公司)中，于5％CO2和95％空气的湿润气氛中37℃培养直至细胞稳定生长。然后，细胞悬浮于补充有10mg/L胰岛素、40mg/L胸苷、100mg/L次黄嘌呤(hypoxantine)、100微摩尔/L MSX和10％DMSO的CD-OptiCHOTM培养基(英杰公司)中，并液氮贮存作为种子细胞。
[实施例3]
用于表达rhα-Gal A的重组细胞的培养
上述种子细胞经解冻并稀释至4x105细胞/mL的密度，然后用补充有10mg/L胰岛素、40mg/L胸苷、100mg/L次黄嘌呤(hypoxantine)和100微摩尔/L MSX(CD培养基)的CD-OptiCHOTM培养基培养3-4天，然后用CD培养基稀释至2x105细胞/mL的密度并培养3-4天。这些细胞用CD培养基再次稀释至2x105细胞/mL的密度并进一步培养3-4天。
对因此培养的细胞数量计数，并且细胞培养物用CD培养基稀释至2x105细胞/mL的密度，然后将1L该稀释培养物中的细胞振荡培养数天。培养规模升级直至培养体积到达200L。
然后，对细胞数量计数，并且细胞用补充有10mg/L胰岛素、40mg/L胸苷、100mg/L次黄嘌呤(hypoxantine)和0.1％HY大豆(英杰公司)的1800L的CD-OptiCHOTM培养基稀释至2x105细胞/mL的密度，并培养11天。CD-OptiCHOTM培养基中的包含8.84g胰岛素、35.2mmol次黄嘌呤(hypoxantine)、5.6mmol胸苷和1.8kg HY大豆的22.4L的种子溶液在第3天、第5天、第7天，和第9天添加。在培养过程中每天取样，并且测量细胞数量、存活率、葡萄糖浓度和表达的rhα-Gal A的量。在其中葡萄糖浓度变得低于3g/L的情况中，添加30％葡萄糖溶液，从而该浓度到达3.5g/L。在11天的培养过程中，每天监测活细胞密度和rhα-Gal A浓度。在培养第6-7天，活细胞密度到达约6x106细胞/mL，指示成功实现高密度细胞培养物(图3)。如ELISA检测(如下所述)，培养基中由细胞分泌的rhα-Gal A的浓度随时间增加，并且在第6天几乎到达140mg/L(图3)。
在完成上述培养之后，细胞培养物经收集并依次过滤通过Millistak+TM HC PodFilter级D0HC(密理博公司(Millipore))、Millistak+TM HC Pod Filter级X0HC(密理博公司)，然后是Durapore OpticapTM XLT20(0.22微米，密理博公司)，以获得培养物上清液。所得的培养物上清液通过配备有PS膜(聚砜膜)的中空纤维模块浓缩至原始体积的1/13。
[实施例4]
病毒失活
将三正丁基磷酸盐(TNBP)和聚山梨酯80添加至约75L的上述浓缩的培养物上清液，从而其终浓度将分别是0.3％(v/v)和1％(w/v)，然后，该混合物溶液室温柔和搅拌3-4小时。
[实施例5]
用于纯化rhα-Gal A的方法
然后，通过添加1M Tris-缓冲液(pH 8.8)，将上述病毒失活的溶液的pH调节至7.5，随后通过添加包含1M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，将电导率(conductivity)调节至包含50mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)的电导率。然后，将溶液过滤通过Durapore OpticapTM XL10(密理博公司)，然后加载至Q Sepharose Fast Flow柱(柱体积：约19.2L，床高：约20cm，GE医疗公司)(一种阴离子-交换柱)上，该柱已用包含50mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)以150cm/小时的线性流速平衡以允许rhα-Gal A被所述柱吸附。然后，柱用以相同流速供给的三倍柱体积的相同缓冲液清洗，然后，吸附的rhα-Gal A用六倍柱体积的包含225mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)、随后是三倍柱体积的包含1MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗脱，从而收集包含rhα-Gal A的分级分离部分。
向在上述Q Sepharose Fast Flow柱色谱步骤处收集的该分级分离部分添加四分之一体积的2M NaCl，以调节NaCl浓度至约500mM，随后添加乙酸以调节pH至7.0。将所得溶液加载至Phenyl Sepharose 6Fast Flow柱(柱体积：19.2L，床高：约20cm，GE医疗公司)(疏水柱)，其已采用50mM Tris-HCl，包含750mM NaCl的5mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)以150cm/小时的线性流速平衡，以允许rhα-Gal A被所述柱吸附。然后，柱用三倍柱体积的以相同流速供给的相同缓冲液清洗，吸附的rhα-Gal A用九倍柱体积的由50mM Tris-HCl和5mM磷酸盐(pH7.0)组成的缓冲液，随后用三倍柱体积的纯水洗脱，从而收集包含rhα-Gal A的分级分离部分。
将在上述Phenyl Sepharose 6Fast Flow柱色谱步骤处收集的分级分离部分加载至CHT-I陶瓷羟基磷灰石柱(柱体积：19.2L，床高：约20cm，伯乐实验室公司(Bio-RadLaboratories))(羟基磷灰石柱)上，其已用50mM Tris-HCl，包含50mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)以150cm/小时的线性流速平衡，以允许rhα-Gal A被所述柱吸附。然后，柱用五倍柱体积的以相同流速供给的相同缓冲液清洗，然后，吸附的rhα-Gal A用九倍柱体积的包含50mM Tris-HCl、45mM磷酸钠和50mM NaCl(pH 7.0)的缓冲液，随后用三倍柱体积的200mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱，从而收集包含rhα-Gal A的分级分离部分。
向在上述CHT-I陶瓷羟基磷灰石柱色谱的步骤处收集的分级分离部分添加乙酸，以调节pH至5.5。通过OpticapTM SHC XL5(0.22微米，密理博公司)过滤来移除由此形成的沉淀物。将所得的溶液加载至CaptoTM MMC柱(柱体积：6.3L，床高：约20cm，GE医疗公司)(具有基于疏水相互作用和氢键形成的选择性的阳离子-交换柱)上，其已用包含150mM NaCl的50mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)以300cm/小时的线性流速平衡，以允许rhα-Gal A被所述柱吸附。然后，在柱用四倍柱体积的以相同流速供给的相同缓冲液清洗之后，吸附的rhα-Gal A用五倍柱体积的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)，随后用三倍柱体积的包含1M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱，从而收集包含rhα-Gal A的分级分离部分。
向在上述CaptoTM MMC柱色谱步骤处收集的分级分离部分，添加1M Tris缓冲液(pH8.8)，以调节pH至7.0。将所得溶液的一半加载至Blue Sepharose 6FF柱(柱体积：约19.2L，床高：约20cm，GE医疗公司)上，该柱用以150cm/小时的线性流速提供的包含125mMNaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)平衡，以允许rhα-Gal A被所述柱吸附。然后，柱用三倍柱体积的以相同流速供给的包含125mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)清洗，然后吸附的rhα-Gal A用四倍柱体积的以相同流速供给的包含450mM NaCl的50mM Tris-HCl/5mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗脱，从而收集包含rhα-Gal A的分级分离部分。该溶液的另一半通过染料-亲和柱色谱以与如上所述相同的方式相继处理。收集的包含rhα-Gal A的分级分离部分经合并以供进一步纯化。
在上述染料-亲和柱色谱步骤处收集的分级分离部分采用配备有BiomaxTM30膜(密理博公司)的PelliconTM 3Cassettes浓缩，直至总体积变得小于1L。将1/3的浓缩的溶液加载至SuperdexTM 200制备级柱(柱体积：约58L，床高：约30cmx2，GE医疗公司)上，该柱已用包含137mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH 5.8)平衡。然后，以25cm/小时的线性流速供应相同缓冲液，并且收集对应于在吸光度280nm观察到的主峰的分级分离部分，作为包含纯化的rhα-Gal A的分级分离部分。该色谱进行三次以纯化所有的上述浓缩溶液，并且将通过每次跑动收集的分级分离部分合并。
在上述SuperdexTM 200制备级柱色谱的步骤处汇集的分级分离部分通过配备有PS膜的中空纤维模块浓缩，并且向该浓缩的溶液以终浓度0.02％添加聚山梨酯80。所得的溶液过滤通过ViresolveTM Pro Modus1.3(0.07m2尺寸，密理博公司)，以避免终产物中任何可能的病毒和微生物污染。
在各纯化步骤中，采用ELISA(如下所述)对加载的材料中包含的rhα-Gal A的量和在收集的分级分离部分中回收的rhα-Gal A量进行定量。结果见表1。在该表中，"rhα-Gal A回收率/步骤"表示，该步骤中回收的rhα-Gal A的量与该步骤中加载的rhα-Gal A的量之比，而"rhα-Gal A回收率/总计"表示，该步骤中回收的rhα-Gal A的量与经历所述纯化方法的rhα-Gal A的初始量之比。经历所述纯化方法的rhα-Gal A的初始量是140.6g，其中91.4g最终被回收，因此rhα-GalA回收率/总计高达65.0％。这些结果显示，上述纯化方法允许以极高产量和大生产规模纯化rhα-Gal A。
[表1]
表1.各纯化步骤中rhα-Gal A的回收率
[实施例6]
人α-Gal A的ELISA分析
向96孔微滴定板(Nunc)的各孔添加100微升的小鼠抗人α-Gal A单克隆抗体(用0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)稀释至0.25微克/mL)，然后该板在不受影响的条件下室温放置至少1小时或2-8℃过夜，以允许抗体被孔吸收。然后，在用包含0.05％吐温20(PBS-T)的磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS)清洗各孔之后，添加300微升的包含1％BSA的PBS-T，并且该板在不受影响的条件下室温放置至少一小时。然后，在各孔用PBS-T清洗三次之后，向孔添加100微升的测试样品或人α-Gal A标准品(必要时，其已用包含0.5％BSA和0.05％吐温20的PBS(PBS-BT)稀释)，然后该板以不受影响的条件室温放置至少一小时。然后，在各孔用PBS-T清洗三次之后，添加100微升的辣根过氧化物酶标记的兔抗人α-Gal A多克隆抗体(用PBS-BT稀释)，然后该板在不受影响的条件下放置至少一小时。然后，在各孔用PBS-T清洗三次之后，向各孔添加100微升的具有包含0.009％过氧化氢的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)的0.4mg/mL邻苯二胺，然后该板在不受影响的条件下室温放置10-25分钟。然后向各孔添加0.1mL的1mol/LH2SO4以停止反应，并且在96孔板酶标仪上检测各孔的490nm的光学密度。
[实施例7]
rhα-Gal A活性检测
标准溶液如下制备：在稀释缓冲液(26.7mM柠檬酸盐-44.8mM磷酸盐缓冲液，pH4.6，包含0.1mg/mL BSA)中以0-200微摩尔/L的浓度溶解4-甲基伞形酮。底物溶液如下制备：在稀释缓冲液中以5mM的终浓度溶解4-甲基伞形基-α-D-半乳糖苷(SIGMA)。将10微升的各个标准品溶液或测试样品(用稀释缓冲液稀释)添加至96孔微滴定板(FluoroNunc板，Nunc)的各孔。将75微升的底物溶液添加至包含稀释的测试样品或任何标准品溶液的各孔，然后该板在不受影响的条件下37℃避光放置1小时。在该孵育之后，将200微升的停止缓冲液(0.2M甘氨酸-NaOH，pH 10.6)添加至各孔。然后各孔中溶液的荧光强度通过96孔板酶标仪以335nm波长的发射光和460nm波长的荧光检测。
标准曲线通过用标准品溶液测得的荧光强度绘点，并且在各绘制的数据点之间内插来产生。采用标准曲线，将各样品的荧光强度对应于释放的4-MUF的浓度。人α-Gal A的特定活性计算为单位/mg，其中一单位活性等于37℃每分钟产生的一微摩尔的4-MUF。参考公开的美国专利申请(公开号2004-0229250)来进行关于rhα-Gal A活性的上述检测。通过上述方法纯化的rhα-Gal A的特定活性显示为约50U/mg(48.3-53.7U/mg)。
[实施例8]
rhα-Gal A的纯度分析。
五微克的上述纯化的rhα-Gal A经历还原性、加热(70℃10分钟)条件下的SDS-PAGE电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色，显示对应于SuperdexTM 200pg分级分离部分中的rhα-Gal A的单一条带(图4)。
此外，上述纯化的rhα-Gal A通过尺寸消除(Size-elimination)HPLC(SE-HPLC)进行分析。HPLC采用LC-20A系统，SPD-20AV UV/VIS检测器(Shimazu公司)进行。对于SE-HPLC分析，将包含2mg/mL的上述纯化的rhα-GalA的10微升的样品溶液施加至TSKgel G3000SWXL柱(7.8mm I.D.x30cm，TOSOH)上，该柱用25mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)以0.5ml/分钟的流速平衡。通过监测215nm处的吸光度产生洗脱概况。
上述纯化的rhα-Gal A的SE-HPLC分析仅显示单一峰(图5)。结果显示上述获得的rhα-Gal A是高度纯化的且不含任何检测得到的污染物。该结果显示上述纯化的rhα-Gal A具有如此高的纯度以至于可以直接用作医药药物。
[实施例9]
宿主细胞蛋白质(HCP)检测
纯化步骤1-6中各自收集的rhα-Gal A-活性分级分离部分的汇集物中存在的污染宿主细胞蛋白质(HCP)通过ELISA以常规方式定量，并与该汇集物中所含的rhα-Gal A的量做比较。结果于表1中示为"HCP/rhα-Gal A(ppm)"，其为HCP的与rhα-Gal A之质量比。如表1中所示，该比例，在最终的纯化步骤之后，低至20ppm，该水平足够低以允许因此纯化的rhα-Gal A用作通过注射重复给予人的药物。
在所述纯化方法的步骤中，第五，染料-亲和性色谱，最为有效地从被HCP污染的rhα-Gal A移除HCP。即，该步骤中，几乎97％的HCP被移除，并且HCP/rhα-Gal A比率从8.6x103ppm降至2.5x102ppm。结果显示染料-亲和性色谱是从rhα-Gal A制备物移除HCP的显著有效的方式。
工业可行性
本发明用于以大规模产生rhα-半乳糖苷酶A(rhα-Gal A)，其具有作为向患有法布瑞氏综合征的患者给予的药物的足够高的纯度。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1＝hGH-f1，合成序列
SEQ ID NO:2＝hGH-r1，合成序列
SEQ ID NO:3＝hGH-f2，合成序列
SEQ ID NO:4＝hGH-r2，合成序列
SEQ ID NO:5＝引物GS-1，合成序列
SEQ ID NO:6＝引物GS-3，合成序列
SEQ ID NO:7＝引物GS-2，合成序列
SEQ ID NO:8＝引物GS-4，合成序列
SEQ ID NO:9＝引物GAL-Mlu，合成序列
SEQ ID NO:10＝引物GAL-Sca2，合成序列
SEQ ID NO:11＝引物GAL-Sca1，合成序列
SEQ ID NO:12＝引物GAL-Xba，合成序列
序列表
<110> JCR制药股份有限公司(JCR PHARMACEUTICALS CO., LTD)
福井刚(FUKUI, Tsuyoshi)
川崎敦子(KAWASAKI, Atsuko)
秦野勇吉(HATANO, Yukichi)
伊藤八重(ITO, Yae)
三原和敏(MIHARA, Kazutoshi)
杉村厚(SUGIMURA, Atsushi)
<120> 用于从包含污染物宿主细胞蛋白的材料纯化重组人α-半乳糖苷酶A的方法
<130> GP183-PCT
<150> PCT/JP2015/000290
<151> 2015-01-22
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH-f1, 合成序列
<400> 1
cgcgtgaatt cgcggccgct ctagacccgg gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc 60
tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaa 114
<210> 2
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH-r1, 合成序列
<400> 2
tgatgcaact taattttatt aggacaaggc tggtgggcac tggagtggca acttccaggg 60
ccaggagagg cactggggag gggtcacagg gatgccaccc gggtctagag cggccgcgaa 120
ttca 124
<210> 3
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH-f2, 合成序列
<400> 3
attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat aatagcgcag caccatggcc 60
tgaaataacc tctgaaagag gaacttggtt aggtac 96
<210> 4
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH-r2, 合成序列
<400> 4
ctaaccaagt tcctctttca gaggttattt caggccatgg tgctgcgcta ttatagaagg 60
acacctagtc agacaaaa 78
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GS-1, 合成序列
<400> 5
cttaagatgg ccacctcagc aagtt 25
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GS-3, 合成序列
<400> 6
acgatatccc tgccataggc tttgtct 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GS-2, 合成序列
<400> 7
agacaaagcc tatggcaggg atatcgt 27
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GS-4, 合成序列
<400> 8
ccatcgtgat ggttagtttt tgtattggaa 30
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAL-Mlu, 合成序列
<400> 9
ggtacgcgtg acaatgcagc tgagga 26
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAL-Sca2, 合成序列
<400> 10
gtgattgcag tactgtcgga t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAL-Sca1, 合成序列
<400> 11
atccgacagt actgcaatca c 21
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAL-Xba, 合成序列
<400> 12
gagtctagat tttaaagtaa gtcttttaat gacat 35
<210> 13
<211> 1290
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1290)
<400> 13
atg cag ctg agg aac cca gaa cta cat ctg ggc tgc gcg ctt gcg ctt 48
Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu
1 5 10 15
cgc ttc ctg gcc ctc gtt tcc tgg gac atc cct ggg gct aga gca ctg 96
Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu
20 25 30
gac aat gga ttg gca agg acg cct acc atg ggc tgg ctg cac tgg gag 144
Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu
35 40 45
cgc ttc atg tgc aac ctt gac tgc cag gaa gag cca gat tcc tgc atc 192
Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile
50 55 60
agt gag aag ctc ttc atg gag atg gca gag ctc atg gtc tca gaa ggc 240
Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly
65 70 75 80
tgg aag gat gca ggt tat gag tac ctc tgc att gat gac tgt tgg atg 288
Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met
85 90 95
gct ccc caa aga gat tca gaa ggc aga ctt cag gca gac cct cag cgc 336
Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg
100 105 110
ttt cct cat ggg att cgc cag cta gct aat tat gtt cac agc aaa gga 384
Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly
115 120 125
ctg aag cta ggg att tat gca gat gtt gga aat aaa acc tgc gca ggc 432
Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly
130 135 140
ttc cct ggg agt ttt gga tac tac gac att gat gcc cag acc ttt gct 480
Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala
145 150 155 160
gac tgg gga gta gat ctg cta aaa ttt gat ggt tgt tac tgt gac agt 528
Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser
165 170 175
ttg gaa aat ttg gca gat ggt tat aag cac atg tcc ttg gcc ctg aat 576
Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn
180 185 190
agg act ggc aga agc att gtg tac tcc tgt gag tgg cct ctt tat atg 624
Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met
195 200 205
tgg ccc ttt caa aag ccc aat tat aca gaa atc cga cag tac tgc aat 672
Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn
210 215 220
cac tgg cga aat ttt gct gac att gat gat tcc tgg aaa agt ata aag 720
His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys
225 230 235 240
agt atc ttg gac tgg aca tct ttt aac cag gag aga att gtt gat gtt 768
Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val
245 250 255
gct gga cca ggg ggt tgg aat gac cca gat atg tta gtg att ggc aac 816
Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn
260 265 270
ttt ggc ctc agc tgg aat cag caa gta act cag atg gcc ctc tgg gct 864
Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala
275 280 285
atc atg gct gct cct tta ttc atg tct aat gac ctc cga cac atc agc 912
Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser
290 295 300
cct caa gcc aaa gct ctc ctt cag gat aag gac gta att gcc atc aat 960
Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn
305 310 315 320
cag gac ccc ttg ggc aag caa ggg tac cag ctt aga cag gga gac aac 1008
Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn
325 330 335
ttt gaa gtg tgg gaa cga cct ctc tca ggc tta gcc tgg gct gta gct 1056
Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala
340 345 350
atg ata aac cgg cag gag att ggt gga cct cgc tct tat acc atc gca 1104
Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala
355 360 365
gtt gct tcc ctg ggt aaa gga gtg gcc tgt aat cct gcc tgc ttc atc 1152
Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile
370 375 380
aca cag ctc ctc cct gtg aaa agg aag cta ggg ttc tat gaa tgg act 1200
Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr
385 390 395 400
tca agg tta aga agt cac ata aat ccc aca ggc act gtt ttg ctt cag 1248
Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln
405 410 415
cta gaa aat aca atg cag atg tca tta aaa gac tta ctt taa 1290
Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu
420 425
<210> 14
<211> 429
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu
1 5 10 15
Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu
20 25 30
Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu
35 40 45
Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile
50 55 60
Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly
65 70 75 80
Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met
85 90 95
Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg
100 105 110
Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly
115 120 125
Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly
130 135 140
Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala
145 150 155 160
Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser
165 170 175
Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn
180 185 190
Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met
195 200 205
Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn
210 215 220
His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys
225 230 235 240
Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val
245 250 255
Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn
260 265 270
Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala
275 280 285
Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser
290 295 300
Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn
305 310 315 320
Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn
325 330 335
Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala
340 345 350
Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala
355 360 365
Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile
370 375 380
Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln
405 410 415
Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu
420 425
Claims (11)
1.用于产生重组人α-Gal A的方法，包括如下步骤：
(a)在无血清培养基中培养产生重组人α-Gal A的哺乳动物细胞，以让其在该培养基中分泌重组人α-Gal A，
(b)通过从在上述步骤(a)中获得的培养物去除细胞来收集培养物上清液，
(c)使在上述步骤(b)中收集的培养物上清液经过阴离子-交换柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，
(d)使在上述步骤(c)中收集的该分级分离部分经过疏水柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，
(e)使在上述步骤(d)中收集的该分级分离部分经过采用对磷酸基团具有亲和性的材料作为固相的柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，
(f)使在上述步骤(e)中收集的该分级分离部分经过阳离子-交换柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，
(g)使在上述步骤(f)中收集的该分级分离部分经过染料-亲和柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，和
(h)使在上述步骤(g)中收集的该分级分离部分经过凝胶过滤柱色谱，以收集重组人α-Gal A-活性分级分离部分，以所述顺序进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中，阳离子-交换柱色谱中所用的阳离子交换器是弱阳离子交换器。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述弱阳离子交换器具有基于疏水相互作用和氢键形成的选择性。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中，所述弱阳离子交换器具有苯基基团、酰胺键和羧基基团。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在所述染料亲和柱色谱中使用的染料是蓝色三嗪染料。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述对磷酸基团具有亲和性的材料选自下组：羟基磷灰石和氟磷灰石。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述对磷酸基团具有亲和性的材料是羟基磷灰石。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞是转染有表达载体的CHO细胞，所述表达载体经设计以在EF-1(α)启动子的调控下表达重组人α-Gal A。
9.通过权利要求1-8中任一项所述的方法产生的重组人α-Gal A组合物。
10.一种药物，其包含如权利要求9所述的组合物，其定期地给予患者。
11.如权利要求10所述的药物，其中，所述药物通过注射给予所述患者。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JPPCT/JP2015/000290 | 2015-01-22 | ||
| PCT/JP2015/000290 WO2016116966A1 (en) | 2015-01-22 | 2015-01-22 | Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins |
| PCT/JP2016/000296 WO2016117341A1 (en) | 2015-01-22 | 2016-01-21 | Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107208081A true CN107208081A (zh) | 2017-09-26 |
| CN107208081B CN107208081B (zh) | 2020-07-14 |
Family
ID=56416538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201680006854.8A Active CN107208081B (zh) | 2015-01-22 | 2016-01-21 | 用于从包含污染宿主细胞蛋白质的材料纯化重组人α-半乳糖苷酶A的方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10385325B2 (zh) |
| EP (1) | EP3247794B1 (zh) |
| JP (1) | JP6749042B2 (zh) |
| KR (1) | KR102288264B1 (zh) |
| CN (1) | CN107208081B (zh) |
| WO (2) | WO2016116966A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX2019002252A (es) | 2016-08-25 | 2019-07-04 | Japan Chem Res | Metodo para producir una proteina de fusion de anticuerpo. |
| CA3212813A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for producing antibody-lysosomal enzyme fusion protein |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020146771A1 (en) * | 1995-05-11 | 2002-10-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Process for producing erythropoietin containing no animal proteins |
| WO2006051070A1 (en) * | 2004-11-09 | 2006-05-18 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh |
| WO2011108451A1 (ja) * | 2010-03-01 | 2011-09-09 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | 遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体リソソーム酵素の製造方法 |
| WO2014016873A1 (en) * | 2012-07-26 | 2014-01-30 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990011353A1 (en) | 1989-03-24 | 1990-10-04 | Research Corporation Technologies, Inc. | Recombinant alpha-galactosidase, a therapy for fabry disease |
| US5356804A (en) * | 1990-10-24 | 1994-10-18 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City Of New York | Cloning and expression of biologically active human α-galactosidase A |
| US5401650A (en) * | 1990-10-24 | 1995-03-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A |
| US5641670A (en) | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
| TW402639B (en) | 1992-12-03 | 2000-08-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Protein production and protein delivery |
| US6458574B1 (en) * | 1996-09-12 | 2002-10-01 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Treatment of a α-galactosidase a deficiency |
| AU4424497A (en) * | 1996-09-13 | 1998-04-02 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Therapy for alpha-galactosidase a deficiency |
| US8227212B2 (en) | 2003-02-11 | 2012-07-24 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Cell that expresses a sulfatase and a formylglycine generating enzyme |
| JP5758920B2 (ja) | 2010-03-02 | 2015-08-05 | プロタリクス リミテッド | 安定化α−ガラクトシダーゼおよびその使用 |
-
2015
- 2015-01-22 WO PCT/JP2015/000290 patent/WO2016116966A1/en active Application Filing
-
2016
- 2016-01-21 WO PCT/JP2016/000296 patent/WO2016117341A1/en active Application Filing
- 2016-01-21 US US15/545,194 patent/US10385325B2/en active Active
- 2016-01-21 KR KR1020177022178A patent/KR102288264B1/ko active IP Right Grant
- 2016-01-21 JP JP2017538733A patent/JP6749042B2/ja active Active
- 2016-01-21 CN CN201680006854.8A patent/CN107208081B/zh active Active
- 2016-01-21 EP EP16739950.0A patent/EP3247794B1/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020146771A1 (en) * | 1995-05-11 | 2002-10-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Process for producing erythropoietin containing no animal proteins |
| WO2006051070A1 (en) * | 2004-11-09 | 2006-05-18 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh |
| WO2011108451A1 (ja) * | 2010-03-01 | 2011-09-09 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | 遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体リソソーム酵素の製造方法 |
| WO2014016873A1 (en) * | 2012-07-26 | 2014-01-30 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3247794B1 (en) | 2020-03-11 |
| JP6749042B2 (ja) | 2020-09-02 |
| US10385325B2 (en) | 2019-08-20 |
| CN107208081B (zh) | 2020-07-14 |
| JP2018504121A (ja) | 2018-02-15 |
| EP3247794A4 (en) | 2018-06-27 |
| US20180016564A1 (en) | 2018-01-18 |
| EP3247794A1 (en) | 2017-11-29 |
| KR102288264B1 (ko) | 2021-08-09 |
| WO2016117341A1 (en) | 2016-07-28 |
| WO2016116966A1 (en) | 2016-07-28 |
| KR20170099406A (ko) | 2017-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TW516962B (en) | A human TNFR1-IgG1 preparation | |
| AU650893B2 (en) | O-glycosylated alpha-2 interferon | |
| KR102022127B1 (ko) | 재조합 인간 이듀로네이트 2-술파타아제의 제조 방법 | |
| JP7407161B2 (ja) | アリールスルファターゼａの精製方法 | |
| EP2119727B1 (en) | Method for production of recombinant human FSH | |
| AU2010234028B2 (en) | Method for purifying recombinant FSH | |
| SE509359C2 (sv) | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel | |
| CN104711243B (zh) | 重组的弹性蛋白酶蛋白质及其制备方法和用途 | |
| EP2877575B1 (en) | Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a | |
| CN107208081A (zh) | 用于从包含污染宿主细胞蛋白质的材料纯化重组人α‑半乳糖苷酶A的方法 | |
| Tanaka et al. | High quality human immunoglobulin G purified from Cohn fractions by liquid chromatography | |
| JP2016535071A (ja) | 組換えヒト凝固第ｘａ因子タンパク質の不均一集団を含む組成物 | |
| EP3428284B1 (en) | Method for producing mutant human erythropoietin | |
| US11324802B2 (en) | C3 fusion protein and methods of making and using thereof | |
| KR101426459B1 (ko) | 형질전환 벼 세포 현탁 배양으로 생산된 재조합 트립신의 효율적인 정제 방법 | |
| CN101671388B (zh) | 血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用 | |
| JP6226435B2 (ja) | 組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1241916 Country of ref document: HK |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1241916 Country of ref document: HK |