CN101104847A - 圆斑蝰蛇蛇毒凝血x因子激活酶及其提取方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种圆斑蝰蛇蛇毒凝血X因子激活酶及其提取方法与应用。其目的是提供一种来源于圆斑蝰蛇蛇毒的凝血X因子激活酶及其提取方法与其在制备止血药和治疗出血性疾病的药物中的应用。该酶是将圆斑蝰蛇蛇毒依次进行DEAE－SephadexA－50离子交换层析、透析、纤维素DEAE－32离子交换层析和Superose－12凝胶过滤层析后收集的具有凝血X因子激活酶活性的蛋白。可以本发明的凝血X因子激活酶为活性成分制备治疗外科出血、内科出血、妇产科出血、五官科出血、儿科出血和组织活检后出血等临床出血及出血性疾病的药物，将在生物制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及酶及其提取方法与应用，特别是涉及一种来源于圆斑蝰蛇蛇毒的凝血X因子激活酶及其提取方法与其在制备止血药和治疗出血性疾病的药物中的应用。
背景技术
凝血是一个比较复杂的生理过程，大体分为三个阶段：第一阶段，凝血X因子(coagulation factor X，Fx)激活；第二阶段，凝血酶原激活；第三阶段，纤维蛋白原变为纤维蛋白。
从蛇毒中提取止血药具有悠久的历史。目前，临床应用较为成功的有瑞士生产的止血药Reptilase，即立止血，它是从巴西矛头腹蛇蛇毒中提取的。国内仿Reptilase的产品有从蛇岛蝮蛇、从圆斑蝰蛇、尖吻蝮蛇以及浙江蝮蛇的蛇毒中提取得到的血凝酶，这些产品和立止血都是类凝血酶和少量的类凝血激酶(一种凝血X因子激活物)的混合物，主要机理是类凝血酶使纤维蛋白原I单体交联成纤维蛋白形成血凝块而实现止血。
有关蛇毒Fx激活物的研究，国内外都有报道，如杨丽娟等从泰国产的圆斑蝰蛇毒中经分离、纯化得到一种Fx激活剂VRS-X，在还原和非还原条件下，经SDS-PAGE测定VRS-X的分子结构是由一条肽链组成，分子量为61.1±1.5kDa，60.4±1.9kDa(杨丽娟，刘广芬，王晴川，圆斑蝰蛇泰国亚种(Vipera russllii siamensis)凝血X因子激活剂的纯化及部分特性研究[J].福建医科大学学报，2002，36(3)：242-189)。Furie报道其得到的一种Fx激活剂RVV-X为一单链蛋白，分子量为60kDa(Furie BC，Furie B.Interaction of lanthanide ions with bovine factor X andtheir use in the affinity chromatography of the venom coagulant protein ofVipera russelli[J].Biol Chem，1975，250(2)：601-608)。Siigur等报道从蝰科蛇毒中分离得到的一种Fx激活物VLFXA的分子由三条肽链组成，一条重链的分子量为57.5kDa，两条轻链的分子量为1-2kDa(10.Siigur E，Tonismagi K，Trummal K，etal.Factor Xacivator from Vipera lebetina snake venom，molecularcharacterization and substrate specificity[J].Biochim BiophysActa，2001，1568(1)：90~98.)。Lee从眼睛王蛇毒中分离的FX激活剂，也是单链分子，分子量为64.5kDa(Lee WH，Zhang Y，Wang WY，et al.Isolation and properties ofa blood coagulation factor Xactivator from the venom of kingcobra(Ophiophagus Hannah)[J].Toxicon，1995，33(10)：1263-1276)。
发明内容
本发明的目的是提供一种凝血X因子激活酶以及从圆斑蝰蛇蛇毒中提取该凝血X因子激活酶的方法。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种凝血X因子激活酶，是将圆斑蝰蛇蛇毒依次进行DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)离子交换层析、透析、纤维素DEAE-32离子交换层析和Superose-12凝胶过滤层析后收集的具有凝血X因子激活酶活性的酶。
所述凝血X因子激活酶来源于圆斑蝰蛇泰国亚种(vipera russelli siamensis)。
所述层析过程中具有凝血X因子激活酶活性的蛋白的检测方法可为：将等体积(优选1mL)并预热至37℃的收集液和50mmol/L CaCl2溶液混匀，再将等体积(优选1mL)的上述混合液与预热至37℃的凝血质控血浆混合并在37℃下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血X因子激活酶活性的；反应过程中避免震动。
本发明的第二个目的是提供一种上述凝血X因子激活酶的提取方法。
本发明所提供的凝血X因子激活酶的提取方法，包括以下步骤：
1)将圆斑蝰蛇蛇毒溶于Tris-HCl缓冲液中，得到浓度为200-300g/L的圆斑蝰蛇蛇毒液；
2)对步骤1)获得的圆斑蝰蛇蛇毒液进行离子交换柱层析，固相填充物为DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)，直线梯度洗脱，洗脱液为Tris-HCl缓冲液；
3)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集各吸收峰中具有凝血X因子激活酶活性的部分；
4)透析：将步骤3)获得的具有凝血X因子激活酶活性收集液封闭在截留分子量为12000D-14000D的透析袋中，放入蒸馏水中透析12-16小时，所述蒸馏水的体积为收集液体积的10-12倍；
5)将步骤4)透析后的收集液进行离子交换柱层析，固相填充物为纤维素DEAE-32，直线梯度洗脱，洗脱液为Tris-HCl缓冲液；
6)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，图谱应呈现两组吸收峰，弃去第一吸收峰，保留第二吸收峰的组分；
7)冻干；
8)将步骤7)获得的冻干粉用注射用水复溶；
9)再层析：将复溶液进行凝胶过滤层析，固相填充物为Superose-12，洗脱液为注射用水；
10)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集具有凝血X因子激活酶活性活性的部分，得到纯的凝血X因子激活酶浓缩液液。
在上述凝血X因子激活酶的提取方法中，步骤1)中所用的圆斑蝰蛇蛇毒为圆斑蝰蛇泰国亚种(vipera russelli siamensis)；为获得更纯的凝血X因子激活酶，可先用离心的方法去除圆斑蝰蛇蛇毒液中的杂质，离心条件可根据实际情况进行选择，如在3000rpm下离心10分钟。
步骤2)中的DEAE-Sephadex A-50层析柱在使用前，先用Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min；层析时，待圆斑蝰蛇蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加Tris-HCl缓冲液，体积为柱体积的1/45-1/40，然后用Tris-HCl缓冲液和等量的含氯化钠0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min。
步骤3)中的收集方法可为：用自动馏分收集器收集，每管12-15mL，待液杯内的缓冲液流出1/2时，向前面的液杯内加入含氯化钠0.25mol/L的Tris-HCl缓冲液，向后面的液杯内加入含氯化钠1.5mol/L的Tris-HCl缓冲液，两杯要同时快速加入，恢复到原体积，始终保持液面一平，并保持洗脱流速不变。
步骤3)中具有凝血X因子激活酶活性的收集部分的检测方法可为：将等体积(优选1mL)并预热至37℃的收集液和50mmol/L CaCl2溶液混匀，再将等体积(优选1mL)的上述混合液与预热至37℃的凝血质控血浆混合并在37℃下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血X因子激活酶活性的。
步骤5)中的DEAE-32层析柱在使用前，先用含氯化钠0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min；层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加含氯化钠0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，体积为柱体积的1/23-1/20，然后用含氯化钠0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含氯化钠0.75mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min。
步骤9)中的Superose-12层析柱在使用前，先用注射水平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min；层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加注射水，然后用注射水洗脱，流速为0.8-1.0mL/min。
步骤6)和步骤10)中洗脱液的收集方法均与步骤3)相同。
步骤1)-步骤5)所用的Tris-HCl缓冲液均为pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液，优选为pH7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
本发明从圆斑蝰蛇蛇毒中提取到了一种Fx激活物-凝血X因子激活酶。该酶具有以下结构特点：1)在280nm处有最大吸收峰；2)等电点(PI)为5.2±0.5；3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱呈单一条带，测定的分子量为72±5Kd，飞行质谱测定的分子量为61±5Kd；4)将该酶用胰蛋白酶水解，然后对水解后的样品进行肽谱分析，所得肽谱如图1所示；在MASCOT软件中分析未得到显著结果，表明该蛋白质为一未知蛋白。此外，该酶还具有以下功能特点：1)止血效用显著好于此前报道的Fx激活物，0.001μg即可达到治疗目的；2)该酶依赖血管内皮下因子发挥作用，因此只在血管破裂处可发挥促凝作用，在正常血管内不发挥作用，具有高度的安全性；3)该酶的提取方法以常规的层析技术为主，通过变换层析条件和调节技术参数实现精确分离的目的，且可以在常温下进行操作，并具有条件简单容易放大，成本低(选择的层析胶可以反复使用)，收率高和产品纯度高(可以达到色谱纯)的优点。基于上述特点，可以本发明的凝血X因子激活酶为活性成分制备治疗外科出血、内科出血、妇产科出血、五官科出血、儿科出血和组织活检后出血等临床出血及出血性疾病的药物，将在生物制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明凝血X因子激活酶的ABI Voyager DE Pro飞行时间质谱图。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、圆斑蝰蛇蛇毒凝血X因子激活酶的提取
用下述方法从圆斑蝰蛇中提取凝血X因子激活酶，具体过程包括以下步骤：
1)将圆斑蝰蛇泰国亚种(vipera russelli siamensis)蛇毒冻干粉10g(购于沈阳鸿德蛇类养殖有限公司)溶于40mL pH7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中，得到浓度为250g/L的圆斑蝰蛇蛇毒液，再将圆斑蝰蛇蛇毒液在3000rpm下离心10分钟，弃去沉淀，保留上清液。
2)对步骤1)获得的圆斑蝰蛇蛇毒液进行离子交换柱层析，方法为：层析前先将DEAE-Sephadex A-50层析柱(柱规格100×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用pH7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高≥85cm；层析时，待圆斑蝰蛇蛇毒上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加pH7.8、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液50mL，然后用1000mL pH7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含氯化钠0.5M/L的pH 7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min。
3)用自动馏分收集器收集洗脱液，每管12-15mL，待梯度混合器液杯内的缓冲液流出1/2时，向前面的液杯内加入含氯化钠0.25mol/L的pH7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，向后面的液杯内加入含氯化钠1.5mol/L的pH7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，两杯要同时快速加入，恢复到原体积，始终保持液面一平，并保持洗脱流速不变；在280nm的波长下对收集的洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集各吸收峰中具有凝血X因子激活酶活性的部分；体积约350ml。所述具有凝血X因子激活酶活性的收集部分的检测方法为：将等体积(＞0.5mL)的收集液和50mmol/L CaCl2溶液混匀，再将等体积(1mL)的上述混合液与凝血质控血浆(美国太平洋试剂公司)混合并在37℃下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血X因子激活酶活性的。
4)透析：将步骤3)获得的具有凝血X因子激活酶活性收集液封闭在截流分子量12000D-14000D的透析袋中，放入3500mL蒸馏水中透析12小时。
5)对步骤4)透析后的收集液进行离子交换柱层析，方法为：层析前先将DEAE-32层析柱(柱规格为50×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用含氯化钠0.05mol/L的pH7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高≥40cm；层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加含氯化钠0.05M/L的pH7.8、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液50mL，然后用1000mL含氯化钠0.05M/L的pH7.8、0.05mmol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含氯化钠0.75M/L的pH7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min。
6)用自动馏分收集器收集洗脱液，每管12-15mL；在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，图谱应呈现两组吸收峰，弃去第一吸收峰，保留第二吸收峰的组分；收集液约300mL。
7)冻干：将收集液放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干粉。
8)将步骤7)获得的冻干粉用40mL注射用水复溶；
9)再层析：对步骤8)获得的复溶液进行凝胶过滤层析，方法为：层析前先将Superose-12层析柱(柱的规格为100×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用注射用水平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高≥90cm；层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加注射水50mL，然后用2000mL注射水洗脱，流速为0.8-1.0mL/min。
10)用自动馏分收集器收集洗脱液，每管12-15mL，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集具有凝血X因子激活酶活性活性的部分，得到约100mL凝血X因子激活酶原液。
按照活性【1U(单位)凝血X因子激活酶的确定：将1mL凝血X因子激活酶溶液与1mL 50mmol/L CaCl2溶液混合，如果混合液1mL在37℃下能使1mL凝血质控血浆在60-70秒内凝固，混合前的1mL凝血X因子激活酶溶液中所含的凝血X因子激活酶的量为1U(单位)。】，用注射用水将原液稀释成1000U(单位)/mL，得到凝血X因子激活酶浓缩液；总体积为180mL。
实施例2、凝血X因子激活酶的Fx激活活性检测
仪器：TECO M1单通道血凝仪；
试剂：50mM/L CaCl2溶液；
凝血质控血浆：货号10-0595，美国太平洋试剂公司生产。
检测用实施例1方法提取的三个批次(Y20051201、Y20051202、Y20051203)的凝血X因子激活酶的Fx激活活性，方法为：将实施例1获得的凝血X因子激活酶浓缩液经注射用水稀释1000倍作为供试品备用；然后取供试品溶液1mL，加入50mM/L CaCl2溶液1mL混匀，37℃水浴预热；再在反应试管内加入凝血质控血浆0.2mL，在TECO M1单通道血凝仪的试管孔内预热5min(反应温度设为37℃)，然后加入预热后的上述混合液0.2mL，计数凝血时间，平行测3次。以蒸馏水分别代替50mM/L CaCl2溶液和供试品作为对照。
试验结果如表1所示，表明本发明的凝血X因子激活酶是Ca2+依赖性的Fx激活物，在有Ca2+存在的条件下才能发挥凝血作用。
表1 凝血时间试验结果(秒)
| 批号 | 凝血时间 | 平均凝血时间 | ||
| Y20051201Y20051202Y20051203无药对照无钙对照 | 64.465.165.2251.25min未凝 | 64.565.764.6245.85min未凝 | 64.965.765.5250.65min未凝 | 64.665.565.1249.25min未凝 |
实施例3、凝血X因子激活酶Fx激活物特异性检测
Human Factor X(Fx)：货号060817E，法国HYPEN公司产品。
S-2222：货号820316，意大利CMG公司产品。
储存液：含0.15mol/L NaCl和5mmol/L CaCl2的pH7.5、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
Fx应用液：将100μg Fx溶于4mL上述储存液中，混匀分装。
底物溶液：含0.15mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA和200μmol/L S-2222的pH8.3、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
凝血X因子激活酶可特异激活凝血X因子成Xa，活化的Xa可水解底物S2222，释放对硝基苯胺，该物质在405nm处有特异吸收，利用该原理检测用实施例1方法提取的三个批次(20051201，20051202，20051203)的凝血X因子激活酶的Fx激活物特异性，方法为：三批凝血X因子激活酶浓缩液各取1mL，用注射用水1000倍稀释作为供试液；然后取FX应用液0.1mL，37℃水浴4min预热，再加入供试液20μl，将混合液在37℃下水浴4min，再取上述混合溶液50μl，立即加入到950μl的底物溶液中，在405nm处测定0、10min的吸光度变化值。用蒸馏水代替供试液作为空白对照。
结果如表2所示，三个供试组的0、10min的吸光度变化值显著高于对照组，表明本发明的凝血X因子激活酶具有较高的Fx激活物特异性。
表2吸光度变化值
| 批号 | 0min | 10min | 差值 |
| 对照溶液Y20051201Y20051202Y20051203 | 0.00810.00790.00780.0062 | 0.00910.02690.02610.0242 | 0.00100.01900.01830.0180 |
实施例4、凝血X因子激活酶的肽谱检测
将实施例1获得的凝血X因子激活酶浓缩液作为样品，依照《中国药典》2005版三部附录VIIIE的方法处理样品得到供试品；然后，将试品0.75μl与等体积的基质(新鲜配制的10mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸)混合，点于靶上，自然干燥，再将靶装入质谱仪(ABI Voyager DE Pro飞行时间质谱分析仪)进行肽谱分析，相应的参数为反射模式、氮激光(337nm，0.5ns pulse wideth，20Hz repetition rate)，离子延迟提取100ns，Grid voltage 70％，真空度为4×10-8，质谱信号的单次扫描累加150次，正离子测定。肽谱检测结果如图1所示，可以看出，供试品在质核比为1700.64、1968.70、2028.72三个位置具有较强吸收；并且多批次重复检测所的肽谱均一致，表明用本发明的方法能够稳定地从圆斑蝰蛇蛇毒提取到凝血X因子激活酶。且用MASCOT软件进行分析未得到显著结果，表明该蛋白质为一新蛋白。
Claims (10)
1.一种凝血X因子激活酶，是将圆斑蝰蛇蛇毒依次进行DEAE-SephadexA-50离子交换层析、透析、纤维素DEAE-32离子交换层析和Superose-12凝胶过滤层析后收集的具有凝血X因子激活活性的蛋白。
2.根据权利要求1所述的凝血X因子激活酶，其特征在于：所述凝血X因子激活酶来源于圆斑蝰蛇泰国亚种(vipera russelli siamensis)。
3.根据权利要求1所述的凝血X因子激活酶，其特征在于：所述凝血X因子激活酶的等电点为5.2±0.5；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱呈单一条带，测定其分子量为72±5Kd；飞行质谱测定其分子量为61±5Kd。
4.一种提取权利要求1所述的凝血X因子激活酶的方法，包括以下步骤：
1)将圆斑蝰蛇蛇毒溶于pH 7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液中，得到浓度为200-300g/L的圆斑蝰蛇蛇毒液；
2)对步骤1)获得的圆斑蝰蛇蛇毒液进行离子交换柱层析，固相填充物为DEAE-SephadexA-50，直线梯度洗脱，洗脱液为含氯化钠的pH 7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液；
3)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集各吸收峰中具有凝血X因子激活酶活性的部分；
4)将步骤3)获得的具有凝血X因子激活酶活性收集液封闭在截留分子量为12000D-14000D的透析袋中，放入蒸馏水中透析12-16小时，所述蒸馏水的体积为收集液体积的10-12倍；
5)将步骤4)透析后的收集液进行离子交换柱层析，固相填充物为纤维素DEAE-32，洗脱液为含氯化钠pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱；
6)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，图谱应呈现两组吸收峰，弃去第一吸收峰，保留第二吸收峰的组分；
7)冻干；
8)将步骤7)获得的冻干粉用注射用水复溶；
9)将复溶液进行凝胶过滤层析，固相填充物为Superose-12，洗脱液为注射用水；
10)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集具有凝血X因子激活酶活性的部分，得到凝血X因子激活酶原液。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述步骤1)中的圆斑蝰蛇蛇毒为圆斑蝰蛇泰国亚种(vipera russelli siamensis)蛇毒；用离心的方法去除圆斑蝰蛇蛇毒液中的杂质。
6.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤2)中的DEAE-SephadexA-50层析柱在使用前，先用pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min；层析时，待圆斑蝰蛇蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液，体积为柱体积的1/45-1/40，然后用pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含氯化钠0.5mol/L的pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min。
7.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤3)中的收集方法为：用自动馏分收集器收集，每管12-15mL，待梯度混合器液杯内的缓冲液流出1/2时，向前面的液杯内加入含氯化钠0.25mol/L的pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液，向后面的液杯内加入含氯化钠1.5mol/L的pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液，两杯要同时快速加入，恢复到原体积，始终保持液面一平，并保持洗脱流速不变；所述具有凝血X因子激活酶活性的收集部分的检测方法为：将等体积并预热至37℃的收集液和50mmol/L CaCl2溶液混匀，再将等体积的上述混合液与预热至37℃的凝血质控血浆混合并在37℃下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血X因子激活酶活性的。
8.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤5)中的DEAE-32层析柱在使用前，先用含氯化钠0.05mol/L的pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min；层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加含氯化钠0.05mol/L的pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液，体积为柱体积的1/23-1/20，然后用含氯化钠0.05mol/L的pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含氯化钠0.75mol/L的pH7.6-8.0、0.04-0.06mol/L的的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min。
9.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：所述步骤9)中的Superose-12层析柱在使用前，先用注射水平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min；层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加注射水，然后用注射水洗脱，流速为0.8-1.0mL/min；步骤1)-5)中的Tris-HCl缓冲液均优选为pH7.8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
10.权利要求1或2或3所述的凝血X因子激活酶在制备止血药和治疗出血性疾病的药物中的应用。
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