PT866130E

PT866130E - Sialidase de células cho por tecnologia de adn recombinante

Info

Publication number: PT866130E
Application number: PT98106858T
Authority: PT
Inventors: Thomas G Warner; Mary B Sliwkowski
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1993-05-17
Filing date: 1994-05-17
Publication date: 2010-10-26
Also published as: ATE474925T1; EP0866130B1; EP0700443A1; DE69415669T2; US5928915A; WO1994026908A1; ATE175239T1; NZ266714A; GR3029781T3; AU7841998A; ES2128562T3; CA2160458A1; EP0866130A1; DK0866130T3; ES2346941T3; JPH08510133A; DE69415669D1; DK0700443T3; EP0700443B1; DE69435304D1

Description

ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Sialidase de células CHO por tecnologia de ADN recornbinante"

Campo do invento 0 presente invento refere-se à actividade de sialidase, em particular à enzima sialidase isolada, a linhas celulares recombinantes que possuem actividade de sialidase modificada e à produção de sialidase em quantidades comercialmente úteis por tecnologia de ADN recornbinante.

Antecedentes do invento

As sialidases são uma família de enzimas glico-hidrolíticas que cortam os resíduos de ácido siálico dos componentes oligossacarídicos de glicoproteínas e glicolípidos. Têm sido estudadas enzimas virais e bacterianas, por exemplo as sialidases de influenza em particular (Air, G.M. e Laver, W.G. (1989) Proteins: Struct. Func. Genet., 6:341), mas as sialidases de mamífero não foram bem caracterizadas. Na sua maioria, os estudos das sialidases de mamíferos têm-se restringido à investigação de especificidades para com substratos e análises cinéticas, utilizando preparações parcialmente purificadas, embora se tenha purificado até à homogeneidade uma sialidase de fígado e músculo de rato (Miyagi, T. e Tsuiki, S. (1985) J. Biol. Chem.,206:6710). As sialidases foram identificadas em diversos organelos celulares: a membrana plasmática (Schengrund, C. Rosenberg, A. e Repman, M.A. (1976) J. Biol. Chem., 79:555), os lisossomas e o citosol (Tulsiani, D.R.P. e Carubelli, R. (1970) J. Biol. Chem., 245:1821).

As glicoproteínas são muitas vezes produzidas por expressão de genes codificantes em células hospedeiras recombinantes in vitro, tendo as células os componentes enzimáticos normais da maquinaria celular de glicosilação. O ácido siálico no componente oligossacarídico de uma glicoproteína está envolvido na mediação da depuração do soro e afecta as propriedades físicas, químicas e imunogénicas da molécula de proteína. É portanto importante manter o teor de ácido siálico das glicoproteínas, particularmente das proteínas que são para utilização como agentes terapêuticos. 2 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Sumário do invento

Descreve-se aqui a modificação, numa linha celular recombinante, da expressão constitutiva de genes que codificam para enzimas que estão envolvidas na destruição ou produção das porções oligossacarídicas de glicoproteinas. Em particular, a modificação na linha celular recombinante pode ser tal que assegure que o gene, ou genes, de interesse não sejam expressos de forma funcional. De interesse particular, é um gene de sialidase numa linha celular recombinante, especialmente um gene que codifica para uma sialidase citosólica. Exemplos de linhas celulares são as que derivam de ovário de hamster Chinês e de rins embrionários humanos.

Na linha celular recombinante a expressão funcional do gene pode ser danificada por mutação, adição ou deleção de um ou mais nucleótidos. Estas mutação, adição ou deleção podem ser realizadas por qualquer um dos métodos conhecidos dos peritos na especialidade, por exemplo, por recombinação homóloga entre o gene genómico e uma sequência de ácido nucleico diferente, mas bastante homóloga, introduzida nas células. 0 gene pode ser delecionado na totalidade. 0 gene poderá não ser expresso de forma funcional devido à danificação da função do gene através da regulação da sua transcrição ou tradução, por exemplo, utilizando ARN de anti-sentido. 0 presente invento proporciona uma sialidase substancialmente homogénea que pode ser obtida a partir de fluido de cultura celular de uma linha celular de ovário de hamster chinês, ou a partir de células hospedeiras recombinantes que são capazes de expressar a sialidase. Caracteristicas destas sialidases são descritas e discutidas infra. São igualmente descritos anticorpos que são capazes de se ligar às sialidase. Estes anticorpos são úteis para fins de diagnóstico, tal como a identificação ou determinação de sialidase numa amostra de teste, para fins terapêuticos, e para a purificação da sialidase. 0 invento proporciona também uma sonda oligonucleotidica que é útil para obter um gene que codifica uma sialidase e uma sequência de ácido nucleico obtida por um processo 3 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ compreendendo a hibridação da sonda com ácido nucleico numa biblioteca de ADN de mamífero para formar híbridos que podem ser isolados. 0 ácido nucleico pode ser utilizado para a expressão de sialidase. Pode ser modificado de todas as maneiras, por exemplo, por mutação, adição ou deleção de um ou mais nucleótidos, amplificação, clivagem e corte modelado.

Proporciona igualmente a sequências nucleotídica de um gene de codificação de uma sialidase isolada de células de ovário de hamster chinês, assim como vectores recombinantes e células hospedeiras compreendendo ADN isolado possuindo essa sequência nucleotídica. Os vectores e células hospedeiras podem ser utilizados, por exemplo, para produzir a enzima sialidase recombinante. São também descritas composições farmacêuticas compreendendo sialidase numa quantidade eficaz para remover resíduos de ácido siálico dos componentes oligossacarídicos de glicoproteínas e glicolípidos num ser humano ou outros mamíferos.

Um gene de sialidase de uma célula pode ser danificado de forma a que não seja expresso de forma funcional, sendo o nível de sialidase funcional produzida pelas células tal que os resíduos de ácido siálico nas cadeias laterais carbo-hidrato da glicoproteína produzida pelas células não são cortados, ou não são cortados numa extensão que afecte a função da glicoproteína. Estas células são úteis como células hospedeiras para a expressão de glicoproteínas recombinantes a partir de ácido nucleico transformado nas células, sob condições adequadas. As glicoproteínas produzidas por expressão de ácido nucleico codificante introduzido nestas células, deverão ter cadeias laterais de carbo-hidrato funcionais, intactas. As células deficientes em sialidase são especialmente úteis, portanto, para a expressão recombinante de proteínas com resíduos de ácido siálico, que são necessários para a actividade enzimática, imunológica ou outra actividade biológica da proteína, desejadas.

Estes e outros aspectos do invento serão evidentes a partir da descrição pormenorizada que se segue. 4 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Descrição sumária dos desenhos

Figura 1: Perfil de eluição de cromatofocagem de sialidase de células CHO em DEAE Sepharose. A coluna foi eluida com tampão Polybuffer 96, como descrito em Métodos, o = pH de cada fracção. A localização da enzima foi determinada por ensaio utilizando 4-MU-Neu5Ac como substrato = actividade enzimática. 0 teor proteico (Δ) de cada fracção foi determinado por ensaio colorimétrico.

Figura 2: Gel de SDS-poliacrilamida da sialidase de células CHO purificada, corado para proteína. Pista A: sialidase de células CHO, 2μg. Pista B: padrões de peso molecular, fosforilase b, 97 400; albumina de soro bovino, 66 200; ovalbumina 45 000; anidrase carbónica, 31 000; inibidor de tripsina de semente de soja; 21 500; e lisozima, 14 400.

Figura 3: Gel de poliacrilamida de focagem isoeléctrica da sialidase de células CHO purificada. O gel foi desenvolvido como descrito em Métodos e corado para proteína. Pista 1: Padrões de proteína; ribonuclease, pi = 9,5; mioglobina de baleia (recombinante), pi = 8,3; mioglobina de cavalo, pi = 7,3; conalbumina, pi = 5,9; albumina de soro bovino, pi = 4,7; amiloglucosidase, pi = 3,5. Pista b: sialidase de CHO purificada, Sa e Sb, 2 μρ de carga total. Pista C: Gel corado com substrato fluorogénico. Antes da coloração da proteína, o gel foi impregnado com 4-MU-Neu5Ac e incubado a 37°C. O gel foi visualizado sob luz ultravioleta, a fim de detectar as bandas com actividade de sialidase.

Figura 4: Dependência da actividade enzimática em relação ao pH. Os ensaios foram realizados com a enzima purificada (pontos a cheio) ou com lisados celulares brutos (pontos a branco) utilizando 4-MU-Neu5Ac como substrato (veja-se Métodos). Tampão fosfato: quadrados. Tampão acetato: triângulos.

Figura 5: Detecção por análise de Imunotransferência de carbo-hidratos na sialidase de células CHO, em membranas de fluoreto de polivinilideno. A sialidase (1,5 μρ) e a transferrina (0,8 μρ) foram submetidas a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e transferidas electroforeticamente para a membrana. Pistas A e B: sialidase e transferrina, 5 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ respectivamente, com coloração para proteína. Pistas C e D: sialidase e transferrina, respectivamente, com coloração para carbo-hidratos. A membrana foi tratada com metaperiodato de sódio e fizeram-se reagir os carbo-hidratos com hidrazida de ácido digoxigenin-3-0-succinil-e-aminocapróico. Após tratamento com anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina, detectaram-se as glicoproteínas por incubação com substratos de fosfatase alcalina.

Figura 6: Derivados de Neu5Ac2en testados como inibidores de sialidase. Os compostos foram sintetizados como descrito em Métodos.

Figura 7: Detecção de sialidase por imunotransferência, em extractos celulares brutos. Submeteram-se homogenatos de diversas linhas de células CHO a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e transferiram-se para membrana de nitrocelulose, como descrito em Métodos. A sialidase de cada preparação foi visualizada utilizando anticorpos peptídicos, em sobreposição com IgG anti-coelho de cabra, conjugada com peroxidase de rábano: Pista A: sialidase purificada 0,03 μρ. Pista B: CHO 14.16 (200 μρ de proteína), Pista C: CHO 12 (200 μρ proteína), Pista D: Lee 2 (200 pg de proteína).

Figura 8: Mostra as sequências de aminoácidos de péptidos obtidos por digestão tríptica da sialidase (SEQ ID NOS 3-13).

Figura 9: Apresenta as sequências de aminoácidos de péptidos obtidos por digestão com tripsina, lisina C e protease V8, da sialidase purificada a partir da fraeção 2 do passo de cromatografia em S-Sepharose (SEQ ID NOS 3, 5-6, 8-9, 14-24).

Figura 10: Apresenta a sequência nucleotídica do ADNc de sialidase de células CHO (SEQ ID NO. 25) (veja-se exemplo 9, clone 15) e a sequência de aminoácidos prevista (SEQ ID NO. 26), codificada pelo ADNc. As porções da sequência de aminoácidos que correspondem aos fragmentos de péptidos derivados a partir da digestão com protease apresentados na Figura 9 estão sublinhados. A porção da sequência de aminoácidos que corresponde à sonda de PCR 14/17 está sublinhada com linha dupla. 6 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Descrição pormenorizada do invento A. Definições Sialidase:

Este termo refere-se a um polipéptido com a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 10 para a sialidase de células CHO, bem como a sequências de aminoácidos variantes desse polipéptido, e suas formas modificadas, em que o polipéptido ou a sequência de aminoácidos variantes, foram covalentemente modificados, por substituição por uma porção diferente de um aminoácido que ocorre naturalmente, desde que essas variantes e formas modificadas do polipéptido tenham uma actividade biológica que a sialidase natural de células CHO possui. Exemplos destas variantes e formas modificadas de sialidase, biologicamente activas, incluem polipéptidos que são imunologicamente reactivos com anticorpos anti-sialidase natural de células CHO, ou que têm actividade glico-hidrolítica com substratos adequados.

As sequências de aminoácidos variantes de sialidase são polipéptidos que possuem uma sequência de aminoácidos que difere da apresentada na Figura 10, para a sialidase de células CHO, devido à inserção, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido na sequência da Figura 10. As sequências de aminoácidos variantes terão geralmente cerca de 75% de homologia (e muitas vezes mais que 85% de homologia) com a sialidase de células CHO, com base numa comparação dos aminoácidos presentes em cada posição nas sequências, após alinhamento das sequências de um modo que proporcione um máximo de homologia.

As sequências de aminoácidos variantes da sialidase podem ser de ocorrência natural ou podem ser preparadas sinteticamente, tal como por introdução de alterações de nucleótidos apropriadas num ADN de codificação de sialidase previamente isolado, ou por síntese in vitro do polipéptido variante desejado. Como indicado acima, estas variantes compreenderão deleções, inserções ou substituições de um ou mais resíduos de aminoácido no inteiro da sequência de aminoácidos para a sialidase de células CHO mostrada na Figura 10. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita de modo a chegar a u a sequência de aminoácidos variante da sialidase, e está dentro do âmbito do 7 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ presente invento, desde que o polipéptido variante resultante seja biologicamente activo, como descrito acima.

Linha celular recombinante:

Esta expressão refere-se a células estabelecidas em culturas ex vivo e que têm alguma modificação genética relativamente às células progenitoras originais, a partir das quais são derivadas. Esta modificação genética poderá ser o resultado da introdução de um gene heterólogo, para a expressão do produto do gene, ou poderá consistir na introdução de um gene, possivelmente com elementos promotores, para a produção, nas células, de ARN anti-sentido para regular a expressão de outro gene. De igual modo, a modificação genética poderá ser o resultado de mutação, adição ou deleção de um ou mais nucleótidos de um gene, ou mesmo deleção de um gene na totalidade, por qualquer mecanismo. As células de uma linha celular recombinante utilizada na produção de um produto proteico desejado têm os meios para a glicosilação de proteínas, por adição de cadeias laterais oligossacarídicas. Estas células têm também a capacidade de remover e/ou modificar enzimaticamente parte ou todas as cadeias laterais oligossacarídicas das glicoproteínas.

Expressão funcional e termos gramaticalmente relacionados

Expressão funcional de um gene refere-se à produção do produto proteico codificado pelo gene numa forma, ou na extensão, necessária para que o produto desempenhe a sua função normal no ambiente celular. Deste modo, um gene que codifica para uma enzima envolvida na glicosilação, ou desglicosilação, de proteínas, é expresso de forma funcional quando é produzida enzima suficiente numa forma activa, para gl icosilar, ou desglicosilar, a um nível normal, a proteína produzida na célula. A expressão funcional de um gene pode ser danificada por modificação da sequência de nucleótidos do gene, de tal forma que o produto proteico do gene é defeituoso na sua função, ou por deleção ou modificação de parte ou todas as sequências promotoras associadas com o gene e envolvidas na transcrição do gene, ou por deleção do próprio gene do genoma da célula, ou por interferência com a tradução de ARNm transcrito a partir do gene, por exemplo, por interferência com ARN anti-sentido, ou por qualquer combinação de qualquer destes um com o outro, ou através de outros meios conhecidos do perito na especialidade para danificar a função de um gene. 8 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

As expressões "sequência de ADN codificante", "ADN codificante" e "ácido nucleico codificante" (ou "de codificação") referem-se à ordem ou sequência de desoxirribonucleótidos ao longo de uma cadeia de ácido desoxirribonucleico. A ordem destes desoxirribonucleótidos determina a ordem dos aminoácidos ao longo da cadeia polipeptidica. A sequência de ADN codifica assim para a sequência de aminoácidos.

As expressões "vector de expressão replicável" e "vector de expressão" referem-se a uma porção de ADN, normalmente de cadeia dupla, que poderá ter nela inserida uma porção de ADN estranho. 0 ADN estranho é definido como ADN heterólogo, que é ADN que não se encontra naturalmente na célula hospedeira. 0 vector é utilizado para transportar o ADN estranho ou heterólogo para uma célula hospedeira adequada. Uma vez na célula hospedeira, o vector pode replicar independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro e podem-se produzir várias cópias do vector e da sua inserção de ADN (ADN estranho). Para além disso, o vector contém os elementos necessários para permitir a tradução do ADN estranho num polipéptido. Deste modo, podem ser facilmente sintetizadas muitas moléculas do polipéptido codificado pelo ADN estranho.

As expressões "célula hospedeira transformada" e "transformada" referem-se à introdução de ADN numa célula. A célula é designada por "célula hospedeira" e pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. As células hospedeiras procarióticas típicas incluem várias estirpes de E. coli. As células hospedeiras eucarióticas típicas são células de mamífero, tais como as células de ovário de hamster Chinês, ou células 293 de rim de embrião humano. 0 ADN introduzido está geralmente na forma de um vector que contém uma porção de ADN inserida. A sequência de ADN inserida pode ser da mesma espécie que a célula hospedeira, ou de uma espécie diferente da célula hospedeira, ou pode ser uma sequência de ADN híbrida, contendo uma parte de ADN estranho e uma parte homólogo.

Os termos "digestão", "corte" ou "clivagem" do ADN referem-se à clivagem catalítica do ADN, com uma enzima que actua apenas em locais particulares no ADN. Estas enzimas são designadas por endonucleases de restrição e o local ao longo da sequência de ADN em que cada enzima corta, é designado por 9 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ local de restrição. As enzimas de restrição estão disponíveis a nível comercial e são utilizadas de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. As enzimas de restrição são designadas por abreviaturas, compostas por uma letra maiúscula, seguida de duas ou três letras minúsculas que representam o microorganismo a partir do qual cada enzima de restrição foi obtida. Estas letras são seguidas por um ou mais números romanos, que identificam a enzima particular. Em geral, utiliza-se cerca de 1 pg de plasmídeo ou fragmento de ADN, com cerca de 2 unidades de enzima, em cerca de 20 μΐ de solução tampão. O tampão, a concentração de substrato, a temperatura de incubação e o tempo de incubação adequados para cada enzima são especificados pelo fabricante. Após incubação, a enzima e outros contaminantes são removidos do ADN por extracção com uma solução de fenol-clorofórmio e o ADN digerido é recuperado a partir da fracção aquosa, por precipitação com etanol. A digestão com uma enzima de restrição pode ser seguida de tratamento com fosfatase alcalina bacteriana ou fosfatase alcalina de intestino de vitela. Isto evita que duas extremidades cortadas por restrição, de um fragmento de ADN, "circularizem" ou formem uma dobra fechada, que iria impedir a inserção de outro fragmento de ADN no local de restrição. Salvo indicação em contrário, a digestão de plasmídeos não é seguida de desfosforilação no terminal 5'. Estes procedimentos e reagentes para desfosforilação estão descritos nas secções 1.60-1.61 e secções 3.38-3.39 de Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (19891). A "recuperação" ou "isolamento" de um determinado fragmento de ADN a partir do resultado de uma digestão por enzimas de restrição, significa a separação do fragmento de ADN resultante por electroforese num gel de poliacrilamida ou de agarose, a identificação do fragmento de interesse por comparação da sua mobilidade com a de fragmentos de ADN marcadores, de peso molecular conhecido, a remoção da secção de gel que contém o fragmento desejado e a separação do ADN do gel. Este procedimento é conhecido, de um modo geral. Por exemplo, veja-se R. Lawn et al., 1981 Nucleic Acid Res, 9:6103 e D. Goeddel et al., 1980, Nucleic Acids Res, 8:4057. "Análise de Southern" ou "Transferência de Southern" é um método através do qual se confirma a presença de sequências de 10 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ ADN num digerido ou numa composição que contém ADN, por hibridação com um fragmento de ADN ou oligonucleótido marcado, conhecido. A análise de Southern refere-se à separação do ADN digerido num gel de agarose, desnaturação do ADN e transferência do ADN do gel para uma membrana de nitrocelulose, ou de nylon, utilizando métodos originalmente descritos por Southern (J. Mol. Biol. 98:503[1975]) e modificados como descrito nas secções 9.31-9.57 de Sambrook et al., supra. O termo "transformação" significa introduzir ADN num organismo de forma a que o ADN seja replicável, quer como elemento extracromossómico quer como parte integrante do cromossoma. O método utilizado para a transformação depende do facto de a células hospedeira ser de um eucariota ou de um procariota. Um método preferido utilizado para transformar procariotas é o método do cloreto de cálcio, como descrito na secção 1.82 de Sambrook et al. supra. Os eucariotas podem ser transformados utilizando o método do fosfato de cálcio, como descrito nas secções 16.32-16.37 de Sambrook et al., supra. 0 termo "ligação" refere-se ao processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de ADN de cadeia dupla, utilizando a enzima ligase num tampão adequado que contém também ATP. O termo "oligonucleótido" refere-se a sequências de cadeia simples ou dupla, de pequeno tamanho, de desoxirribonucleótidos ligados por ligações fosfodiéster. Os oligonucleótidos podem ser sintetizados quimicamente por métodos conhecidos e purificados em géis de poliacrilamida.

Abreviaturas

Neu5Ac2en, ácido 5-acetamido-2,6-anidro-3,5-didesoxi-D-glicero-O-galacto-non-2-enóico; 9-azido-Neu5Ac2en, ácido 5-acetamido-2,6-anidro-9-azido-3,5,9-tridesoxi-D-glicero-D-galacto-non-2-enóico; 9-PANP-Neu5Ac2en, ácido 9-S-(4'-azido-2'-nitrofenil)-5-acetamido-2,6-anidro-9-tio-2,5,9-tridesoxi-D-glicero-O-galacto-non-2-enóico; 4-MU-Neu5Ac, ácido (4-metil-umbeliferil-5-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-d-Ό-galacto-nonulopiranósido)ónico; HPLC, cromatografia liquida de alta eficiência; SDS dodecilsulfato de sódio; CHO, ovário de hamster Chinês, EDTA, ácido etilenodiaminotetra-acético; DEAE, 11 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ dietilaminoetil-; GMi, I I3NeuAc-GgOse4cer; GM2, II3NeuAc-GgOsescer; GM3, II3NeuAc-LacCer; GDia, lV3NeuAc, II3NeuAc-GgOse4cer; GDib, II3(NeuAc)2-GgOse4Cer; GTib, IV3NeuAc, II3 (NeuAc) 2-GgOse4Cer. Os aminoácidos são designados como se segue:

Asp D ácido aspártico Ile I isoleucina Thr T treonina Leu L leucina Ser s serina Tyr Y tirosina Glu E ácido glutâmico Phe F fenilalanina Pro P prolina His H histidina Gly G glicina Lys K lisina Ala A alanina Arg R arginina Cys C cisteína Trp W triptofano Vai V valina Gin Q glutamina Met M metionina Asn N asparagina B. Métodos gerais de ADN recombinante A sialidase proporcionada pelo presente invento pode ser utilizada e manipulada de muitas maneiras. A digestão da proteína com uma enzima proteolítica como a tripsina, por exemplo, origina polipéptidos relativamente curtos, que podem ser sequenciados utilizando técnicas convencionais. 0 conhecimento da sequência de aminoácidos permite a construção de sondas oligonucleotídicas para o gene codificante que a origina. São bem conhecidas dos peritos na especialidade, diversas abordagens para a sondagem de um gene. São procedimentos ilustrativos a abordagem de "conjunto misto" de Wallace et al., Nucleic Acid Res, 6, 3543 (1979), em que se utiliza um conjunto completo de todas as sequências de nucleótidos possíveis que codificam para uma pequena porção da proteína, e a técnica de "sonda longa" de Ullrich et al., The EMBO Journal 3, no. 2, 361-364 (1984), também EPO Pub. 128 042 publicado em 12 de DEZ de 1984. Na técnica de Wallace, uma do conjunto de sondas terá que ter uma sequência complementar à sequência de ADN subjacente. A técnica de Ullrich preferida, utiliza uma única sonda de mais de cerca de 30 nucleótidos de comprimento, que pode ser sintetizada com base na informação sobre aminoácidos, independentemente da degenerescência do código genético. 12 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Pode-se sequenciar a proteína sialidase completa e utilizar a informação para projectar e sintetizar sondas oligonucleotidicas. Os oligonucleótidos são facilmente sintetizados utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade, tais como as descritas por Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 5765 (1978) ou Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987).

Pode-se utilizar a sondagem com oligonucleótidos para obter o gene de sialidase a partir de uma biblioteca genómica, ou de uma biblioteca de ADNc, construídas utilizando técnicas conhecidas na especialidade, por exemplo, as descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory. A sequência de ADN que codifica para a sialidase é útil para a produção da proteína, utilizando tecnologia de ADN recombinante, e também formas variantes e modificadas da sialidase. Também se podem utilizar métodos conhecidos para mutar ou alterar o ADN que codifica para a sialidase, quer in vivo, quer in vitro, de modo a produzir um gene de sialidase que não será expresso de forma funcional numa célula. Este gene modificado pode ser utilizado para a criação de uma linha celular recombinante com um gene de sialidase que não é expresso de forma funcional, por exemplo, através de um processo que envolve recombinação homóloga, como discutido infra. 1. Deleções e inserções simples

Pode-se utilizar a digestão de ADN com endonucleases de restrição, seguida de ligação, para produzir deleções, como descrito na secção 15.3 de Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque [1989]). A fim de utilizar este método, é preferível que o ADN estranho seja inserido num vector plasmídico. Terão que estar disponíveis mapas de restrição de ambos os ADN, o ADN estranho (inserido) e o ADN vector, ou terão de conhecer-se as sequências do ADN estranho e do ADN vector. 0 ADN estranho terá que ter locais de restrição únicos que não estejam presentes no vector. São então feitas deleções no ADN estranho, por digestão deste entre estes locais de restrição únicos, utilizando as endonucleases de restrição adequadas, sob as condições 13 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ sugeridas pelo fabricante das enzimas. Se as enzimas de restrição utilizadas originarem extremidades lisas ou extremidades compatíveis, as extremidades podem ser ligadas directamente uma à outra, utilizando uma ligase, tal como a ADN-ligase do bacteriófago T4, e incubando a mistura a 16°C durante 1-4 horas, na presença de ATP e tampão de ligase, como descrito na secção 1.68 de Sambrook et al., supra. Se as extremidades não são compatíveis, então deverão ser primeiro tornadas lisas utilizando o fragmento Klenow da ADN-polimerase I ou a ADN-polimerase do bacteriófago T4, necessitando ambas de quatro desoxirribonucleótido-trifosfatos para preencher as extremidades salientes em cadeia simples do ADN digerido. Alternativamente, as extremidades podem ser tornadas lisas utilizando uma nuclease como a nuclease SI ou a nuclease de feijão mungo, que actuam ambas cortando para trás as cadeias simples salientes do ADN. 0 ADN é então re-ligado, utilizando uma ligase.

Pode-se utilizar uma estratégia semelhante para construir variantes de inserção, como descrito na secção 15.3 de Sambrook et al., supra. Após digestão do ADN estranho no(s) local(ais) de restrição único(s), liga-se um oligonucleótido no local em que o ADN estranho foi cortado. 0 oligonucleótido é concebido de forma a codificar para os aminoácidos que se desejam inserir e tem adicionalmente extremidades 5' e 3' que são compatíveis com as extremidades do ADN estranho que foi digerido, de modo a tornar possível a ligação directa. 2. Mutagénese mediada por oligonucleótidos A mutagénese dirigida por oligonucleótidos pode ser também utilizada para preparar, de forma conveniente, as variantes de substituição, deleção e inserção do presente invento. Esta técnica é bem conhecida na especialidade, como descrito por Adelman et al. (ADN, 2:183[1983]).

De um modo geral, utilizam-se oligonucleótidos de pelo menos 25 nucleótidos de comprimento para inserir, eliminar ou substituir dois ou mais nucleótidos na molécula. Um oligonucleótido óptimo terá 12 a 15 nucleótidos perfeitamente correspondentes, de cada lado dos nucleótidos que codificam para a mutação. Isto assegura que o oligonucleótido irá hibridar de forma correcta com a molécula molde de ADN de cadeia simples. Os oligonucleótidos são facilmente 14 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ sintetizados utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade, tais como a descrita por Crea et al. (Proc Natl. Acad. Sei. USA 75:5765 [ 1978]) . A molécula molde de ADN é a forma em cadeia simples do vector com a inserção de ADNc do tipo selvagem. 0 molde de cadeia simples apenas pode ser produzido pelos vectores que são derivados a partir de vectores do bacteriófago M13 (os vectores M13mpl8 e M13mpl9 comercialmente disponíveis, são adequados) ou pelos vectores que contêm uma origem de replicação do fago, em cadeia simples, como descrito por Veira et al. (Meth. Enzymol., 153:2[1987]) . Deste modo, o ADNc que se pretende mutar terá que ser inserido num destes vectores, de forma a produzir um molde de cadeia simples. A produção do molde de cadeia simples é descrita na secções 4.21-4.41 de Sambrook et al., supra.

Nestas técnicas, para mutar a sialidase do tipo selvagem, hibrida-se o oligonucleótido com a molécula molde de ADN de cadeia simples, sob condições de hibridação adequadas. Adiciona-se em seguida uma enzima de polimerização de ADN, normalmente o fragmento Klenow da ADN-polimerase I de E. coli. Esta enzima utiliza o oligonucleótido como um iniciador para completar a síntese da cadeia de ADN portadora da mutação. Deste modo, forma-se uma molécula em heterodúplex, de tal forma que uma das cadeias de ADN codifica para a sialidase do tipo selvagem inserida no vector e a segunda cadeia de ADN codifica para a forma mutada inserida no mesmo vector. Esta molécula em heterodúplex é em seguida transformada numa célula hospedeira adequada, normalmente um procariota como E. coli JM101. Após o crescimento das células, estas são plaqueadas em placas de agarose e pesquisadas utilizando o iniciador oligonucleotídico marcado radioactivamente com 32-P, para identificar as colónias que contêm a forma mutada. Estas colónias são seleccionadas e sequencia-se o ADN para confirmar a presença de mutações na molécula.

Podem-se utilizar diversas formas para produzir mutantes com mais que um aminoácido substituído. Se os aminoácidos estão localizados perto uns dos outros na cadeia polipeptídica, estes podem ser mutados em simultâneo, utilizando um oligonucleótido que codifica para todas as substituições de aminoácidos desejadas. Se, no entanto, os aminoácidos estão localizados a alguma distância uns dos 15 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ outros (separados por mais que dez aminoácidos, por exemplo) é mais difícil produzir um único oligonucleótido que codifique para todas as alterações desejadas. Em vez disso, pode-se utilizar um de dois métodos alternativos. No primeiro método, produz-se um oligonucleótido separado para cada aminoácido a ser substituído. Os oligonucleótidos são então hibridados com o ADN molde de cadeia simples, simultaneamente, e a segunda cadeia de ADN que é sintetizada a partir do molde irá codificar para todas as substituições de aminoácidos desejadas. 0 método alternativo envolve dois ou mais ciclos de mutagénese para produzir o mutante desejado. 0 primeiro ciclo é como descrito para os mutantes simples: utiliza-se como molde o ADN do tipo selvagem, hibrida-se com este molde um oligonucleótido que codifica para a(s) primeira(s) substituição(ões) de aminoácidos desejada(s) e produz-se então a molécula de ADN heterodúplex. 0 segundo ciclo de mutagénese utiliza como molde o ADN mutante produzido no primeiro ciclo de mutagénese. Deste modo, este molde já contém uma ou mais mutações. 0 oligonucleótido que codifica para a(s) substituição(ões) de aminoácidos desejada(s) adicionais é então hibridado com este molde, e a cadeia de ADN resultante codifica agora para mutações de ambos, o primeiro e segundo, ciclos de mutagénese. Este ADN resultante pode ser utilizado como um molde num terceiro ciclo de mutagénese, e assim sucessivamente. C. Culturas de células hospedeiras e vectores 1. Células procarióticas

Os procariotas são as células hospedeiras preferidas para os passos de clonagem iniciais. São particularmente úteis para a produção rápida de grandes quantidades de ADN, para a produção de moldes de ADN de cadeia simples utilizados para mutagénese dirigida a um local, para a pesquisa de diversos mutantes simultaneamente e para a sequenciação de ADN dos mutantes produzidos. As células hospedeiras procariotas adequadas incluem E. coli K12 estirpe 294 (ATCC número 31 446), E. coli estirpe W3110 (ATCC número 27 325), E. coli X1776 (ATCC número 31 537) e E. coli B; no entanto, também se podem utilizar muitas outras estirpes de E. coli, tais como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 e muitas outras espécies e géneros de procariotas. 16 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Os procariotas podem também ser utilizados como hospedeiros para a expressão de sequências de ADN. As estirpes de E. coli acima listadas, bacilos como o Bacillus subtilis, outras enterobacteriáceas, como a Salmonella typhimurium ou Serratia marcesans e várias espécies de Pseudomonas, podem todos ser utilizados como hospedeiros.

Com estes hospedeiros, utilizam-se os vectores plasmidicos que contêm as sequências de replicação e de controlo que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira. 0 vector tem normalmente um local de replicação, genes marcadores que proporcionam uma selecção fenotípica nas células transformadas, um ou mais promotores, e uma região poliligante que contém vários locais de restrição para inserção de ADN estranho. Os plasmídeos tipicamente utilizados para a transformação de E. coli incluem pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 e Bluescript M13, estando todos eles descritos nas secções 1.12-1.20 de Sambrook et al., supra. No entanto, também estão disponíveis muitos outros vectores adequados. Estes vectores contêm genes que codificam para resistência a ampicilina e/ou a tetraciclina, o que permite que as células transformadas com estes vectores cresçam na presença destes antibióticos.

Os promotores mais vulgarmente utilizados em vectores procariotas incluem os sistemas promotores da β-lactamase (penicinilase) e da lactose (Chang et al. Nature 375:615 [1978]; Itakura et al., Science 198:1056 [1977]; Goeddel et al., Nature, 281:544 [1979]) e um sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al. Nucl. Acids Res 8:4057 [1980]; Ped. EPO Publ. N.° 36 776) e os sistemas da fosfatase alcalina. Apesar de estes serem os mais comummente utilizados, têm-se utilizado outros promotores microbianos, e foram publicados pormenores acerca das suas sequências nucleotídicas, permitindo a um técnico especializado fazer a sua ligação de forma funcional em vectores plasmidicos (veja-se Siebenlist et al., Cell, 20:269 [1980]). 2. Micróbios eucariotas

Podem-se utilizar micróbios eucarióticos, como as leveduras, para a prática desta invenção. A levedura de fermento de padeiro Saccharomyces cerevisiae, é um microorganismo eucariótico comummente utilizado, embora 17 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ estejam também disponíveis diversas outras estirpes. O plasmídeo YRp7 (Stinchcomb et ai., Nature, 282:39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7:141 [1979]; Tschemper et al., Gene, 10:157 [1980]) é vulgarmente utilizado como vector de expressão em Saccharomyces. Este plasmídeo contém o gene trpl que proporciona um marcador seleccionável a uma estirpe mutante de levedura, que não tenha a capacidade de crescer em triptofano, tal como as estirpes ATCC N.° 44 076 e PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). A presença da lesão trpl como característica do genoma da célula hospedeira de levedura, proporciona assim um meio ambiente eficaz para detectar a transformação, através do crescimento na ausência de triptofano.

As sequências promotoras adequadas em vectores de levedura, incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol Chem., 255:2073 [1980]) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]; Holland et al. Biochemistry, 17:4900 [1978]) como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase. Na construção de plasmídeos de expressão adequados, as sequências de terminação associadas com estes genes estão também ligadas no vector de expressão a 3' da sequência que se deseja expressar, para proporcionar a poliadenilação do ARNm e a terminação. Outros promotores que têm a vantagem adicional de ter a transcrição controlada por condições de crescimento, são a região promotora para a álcool-desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto e a gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase acima mencionada e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Qualquer plasmídeo vector que contenha um promotor, uma origem de replicação e sequências de terminação, compatíveis com a levedura é adequado. 3. Organismos multicelulares eucarióticos

Na prática do invento podem-se utilizar culturas de células derivadas de organismos multicelulares, como hospedeiros. Embora sejam aceitáveis tanto culturas de células 18 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ de invertebrados como de vertebrados, as culturas de células de vertebrados, particularmente as culturas de mamíferos, são preferidas. Os Exemplos de linhas celulares adequadas incluem a linha CVI de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha 293S de rim de embrião humano (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 [1977]); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10), células de ovário de hamster chinês (Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 77:4216 [1980]); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod.23:243 [1980]; células de rim de macaco (CVI-76 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células de rim de canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138 ATCC CCL 75); células de fígado humano

(Hep G2, HB8065); células de tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CC1 51); células de hepatoma de rato (HTC, MI.54, Baumann et al., J. Cell Biol, 85:1 [1980]) e células TRI (Mather et al. Annals N. Y. Acad. Sei. , 383:44 [1982]). Os vectores de expressão para estas células incluem vulgarmente (se necessário) sequências de ADN para uma origem de replicação, um promotor localizado em frente ao gene a ser expresso, um local de ligação a ribossomas, um local de splicing de ARN, um local de poliadenilação e um local de terminação da transcrição.

Os promotores utilizados em vectores de expressão de mamíferos são muitas vezes de origem virai. Estes promotores virais são vulgarmente derivados a partir de poliomavírus, adenovírus 2 e mais frequentemente do vírus símio 40 (SV40). O vírus SV40 contém dois promotores que são designados por promotor precoce e tardio. Estes promotores são particularmente úteis, pois são ambos facilmente obtidos a partir do vírus, na forma de um fragmento de ADN que também contém a origem de replicação virai (Tiers et al., Nature 273:113 [1978]). Podem-se também utilizar fragmentos de ADN de SV40 menores ou maiores, desde que contenham a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende desde o local HindIII em direcção ao local Bgl-I, localizado na origem de replicação virai.

Alternativamente, podem-se utilizar os promotores que estão naturalmente associados com o gene estranho (promotores 19 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ homólogos), desde que sejam compatíveis com a linha de células hospedeiras seleccionada para transformação.

Pode-se obter uma origem de replicação a partir de uma fonte exógena, tal como o SV40 ou outro virus (e.g. Polioma, Adeno, VSV, BPV) e inserir no vector de clonagem. Alternativamente, a origem de replicação pode ser fornecida pelo mecanismo de replicação cromossómica da célula hospedeira. Se o vector que contém o gene estranho é integrado no cromossoma da célula hospedeira, este último caso é muitas vezes suficiente. A utilização de uma sequência de ADN codificante secundária pode aumentar os níveis de produção. A sequência codificante secundária compreende tipicamente a enzima di-hidrofolato-redutase (DHFR). A forma do tipo selvagem de DHFR é normalmente inibida pelo produto químico metotrexato (MTX). 0 nível de expressão de DHFR numa célula irá depender da quantidade de MTX adicionado às células hospedeiras em cultura. Uma caracterí st ica adicional de DHFR que o torna particularmente útil como sequência secundária, é o facto de poder ser utilizado como marcador seleccionável para a identificação de células transformadas.

Estão disponíveis duas formas de DHFR para utilização como sequências secundárias, DHFR do tipo selvagem e DHFR resistente a MTX. 0 tipo de DHFR utilizado numa célula hospedeira particular depende do facto de a célula hospedeira ser ou não deficiente em DHFR (de tal forma que, ou produz níveis muito baixos de DHFR endogenamente, ou não produz de todo DHFR funcional). As linhas celulares deficientes em DHFR, tais como a linha celular CHO descrita por Urlaub e Chasin (Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 77:4216 [1980]) são transformadas com sequências que codificam para DHFR de tipo selvagem. Após transformação, estas linhas celulares deficientes em DHFR expressam DHFR funcional e são capazes de crescer num meio de cultura que não possui os nutrientes hipoxantina, glicina e timidina. As células não transformadas não irão sobreviver neste meio. A forma de DHFR resistente a MTX pode ser utilizada como um meio para seleccionar células hospedeiras transformadas, das células hospedeiras que produzem endogenamente quantidades normais de DHFR funcional, que é sensível a MTX. A linha 20 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ celular CH0-K1 (ATCC número CL 61) possui estas características e constitui assim uma linha celular útil para este fim. A adição de MTX ao meio de cultura celular irá apenas permitir o crescimento das células transformadas com o ADN que codifica para DHFR resistente a MTX. As células não transformadas serão incapazes de sobreviver neste meio. A cultura de células hospedeiras de mamífero pode ser efectuada numa diversidade de meios. Os meios comercialmente disponíveis tais como FIO de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ([DMEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ([DMEM, sigma]) são adequados para a cultura das células hospedeiras. Para além disso, pode-se utilizar como meio de cultura para as células hospedeiras qualquer dos meios descritos em Ham e Wallace (Meth. Enz., 58:44[1979]), Barnes e Sato (Anal. Biochem., 102:255 [1980]), Patentes U.S. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; ou 4,560,655; Pedido de Patente Internacional WO 90/03430; WO 87/00195; Pat. Re. U.S. 30,985; ou Patente U.S. 5,122,469. Qualquer destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (como Gentamicina), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais da ordem micromolar) e glucose, ou uma fonte energética equivalente. Podem-se incluir quaisquer outros suplementos necessários, em concentrações adequadas, que serão do conhecimento dos peritos na especialidade. 4. Sistemas de secreção

Muitas das proteínas eucarióticas normalmente segregadas pela células contêm uma sequência de sinal endógena, como parte da sequência de aminoácidos. Esta sequência serve para direccionar a proteína, no sentido da sua exportação da célula por via do retículo endoplasmático e do aparelho de Golgi. A sequência de sinal está tipicamente localizada no terminal amino da proteína, e varia de cerca de 13 a cerca de 36 aminoácidos de comprimento. Embora a sequência efectiva varie entre as proteínas, todas as sequências de sinal eucarióticas conhecidas contêm pelo menos um resíduo carregado positivamente e uma porção altamente hidrófoba de 10-15 aminoácidos (normalmente rica nos aminoácidos leucina, 21 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ isoleucina, alanina, valina e fenilalanina) próximo do centro da sequência de sinal. A sequência de sinal está normalmente ausente na forma da proteína segregada, uma vez que é clivada por uma peptidase de sinal, localizada no retículo endoplasmático, durante a translocação da proteína para o retículo endoplasmático. A proteína com a sua sequência de sinal ainda ligada é muitas vezes designada por "pré-proteína", ou forma imatura da proteína.

No entanto, nem todas as proteínas segregadas contêm uma sequência de sinal no amino-terminal que é clivada. Algumas proteínas, como a ovalbumina, contêm uma sequência de sinal que está localizada numa região interna da proteína. Esta sequência não é normalmente clivada durante a translocação.

As proteínas que se encontram normalmente no citoplasma podem ser direccionadas para secreção, através da ligação de uma sequência de sinal à proteína. Isto é facilmente conseguido pela ligação de ADN que codifica para uma sequência de sinal, à extremidade 5' do ADN que codifica para a proteína, e expressão subsequente desta proteína de fusão numa célula hospedeira adequada. 0 ADN que codifica para a sequência de sinal pode ser obtido na forma de um fragmento de restrição, a partir de qualquer gene que codifica para uma proteína com uma sequência de sinal. Deste modo, as sequências de sinal de procariotas, leveduras e eucariotas podem ser utilizadas no presente invento, dependendo do tipo de célula hospedeira utilizado para a prática do invento. 0 ADN que codifica para a porção de sequência de sinal do gene é excisado, utilizando endonucleases de restrição adequadas, e ligado em seguida ao ADN que codifica para a proteína a ser segregada. A selecção de uma sequência de sinal funcional requer que a sequência de sinal seja reconhecida pela peptidase de sinal da célula hospedeira, de forma a que possa ocorrer a clivagem dessa sequência de sinal e a secreção da proteína. 0 ADN, e a sequência de aminoácidos, que codifica para a porção de sequência de sinal de diversos genes eucarióticos, incluindo, por exemplo, a hormona de crescimento humana, proinsulina e proalbumina são conhecidos (veja-se Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman and Company, Nova Iorque [1988], p. 769) e podem ser utilizados como sequências de sinal em células hospedeiras eucariotas adequadas. As sequências de sinal de levedura, como 22 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ por exemplo a fosfatase ácida (Arima et al., Nuc. Acid. Res., 11:1657 [1983]), factor alfa, fosfatase alcalina e invertase, podem ser utilizadas para dirigir a secreção a partir de células hospedeiras de levedura. As sequências de sinal procarióticas de genes que codificam, por exemplo, para LamB ou OmpF (Wong et al., Gene, 68:193 1988]), MalE, PhoA ou beta-lactamase, bem como outros genes, podem ser utilizadas para direccionar proteínas de células procarióticas para o meio de cultura.

Uma técnica alternativa para proporcionar uma proteína de interesse com uma sequência de sinal tal que permita a sua secreção, é sintetizar quimicamente o ADN que codifica para a sequência de sinal. Neste método, ambas as cadeias de um oligonucleótido que codifica para a sequência de sinal seleccionada são sintetizadas quimicamente e em seguida hibridadas uma com a outra para formar uma dúplex. 0 oligonucleótido de cadeia dupla é em seguida ligado à extremidade 5' do ADN que codifica para a proteína. A construção que contém o ADN que codifica para a proteína com a sequência de sinal a ele ligada, pode então ser ligado num vector de expressão adequado. Este vector de expressão é transformado numa célula hospedeira adequada e a proteína de interesse é expressa e segregada. D. Métodos de transformação

As culturas de células hospedeiras de mamífero e outras células hospedeiras que não possuam barreiras de membrana celular rígidas são normalmente transformadas utilizando o método do fosfato de cálcio, como originalmente descrito por Graham e Van der Eb (Virology, 52:546 [1978]) e modificado como descrito nas secções 16.32-16.37 de Sambrook et al., supra. No entanto, também se podem utilizar outros métodos para a introdução de ADN em células, tais como o Polibreno (Kawai e Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4:1172 [1984]), fusão de protoplastos (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:2163 [1980]), electroporação (Neumann et al., EMBO J., 1:841 [1982]) e microinjecção directa no núcleo (Capecchi, Cell, 22:479 [1980]).

As células hospedeiras de leveduras são normalmente transformadas utilizando o método do polietilenoglicol, como 23 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ descrito por Hinnen (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:1929 [1978]) .

As células hospedeiras procarióticas ou outras células hospedeiras com paredes celulares rigidas são preferencialmente transformadas utilizando o método do cloreto de cálcio, como descrito na secção 1.82 de Sambrook et al., supra. Alternativamente, pode-se utilizar a electroporação para transformar estas células. E. Métodos de clonagem A construção de vectores adequados que contêm ADN que codifica para sequências de replicação, sequências reguladoras, genes de selecção fenotípica e o ADN estranho de interesse são preparados utilizando processos de ADN recombinante convencionais. Os plasmídeos e fragmentos de ADN isolados são clivados, moldados e ligados uns aos outros por uma ordem especifica, para produzir os vectores desejados. 0 ADN é clivado utilizando a enzima ou enzimas de restrição adequadas num tampão adequado. Em geral, utilizam-se cerca de 0,2-1 pg de plasmídeo ou fragmentos de ADN com cerca de 1-2 unidades da enzima de restrição adequada, em cerca de 20 μΐ de solução tampão. (Os tampões, concentrações de ADN e tempos e temperaturas de incubação adequados, são especificados pelos fabricantes das enzimas de restrição). De um modo geral, são adequados tempos de incubação de cerca de uma ou duas horas a 37°C, embora algumas enzimas necessitem de temperaturas mais elevadas. Após incubação, as enzimas e outros contaminantes são removidos por extraeção da solução de digestão com uma mistura de fenol e clorofórmio, e o ADN é recuperado da fraeção aquosa por precipitação com etanol.

Para ligar os fragmentos de ADN uns aos outros para formar um vector funcional, as extremidades dos fragmentos de ADN deverão ser compatíveis umas com as outras. Nalguns casos, as extremidades serão directamente compatíveis após digestão com endonucleases. No entanto, poderá ser necessário converter primeiro as extremidades coesivas, usualmente produzidas por restrição com endonucleases, em extremidades lisas, de modo a torná-las compatíveis para ligação. Para tornar as extremidades lisas, o ADN é tratado num tampão adequado durante pelo menos 15 minutos a 15°C com 10 unidades do 24 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ fragmento Klenow de ADN-polimerase I (Klenow) na presença dos quatro desoxinucleótido-trifosfatos. Em seguida, é purificado por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol.

Os fragmentos de ADN clivados podem ser separados em função do tamanho e seleccionados utilizando electroforese em gel do ADN. A electrof orese do ADN pode ser feita quer numa matriz de agarose, quer de poliacrilamida. A selecção da matriz irá depender do tamanho dos fragmentos de ADN a ser separados. Após electroforese, o ADN é extraído da matriz por electroeluição, ou, caso se tenha utilizado agarose de baixo ponto de fusão como matriz, fundindo a agarose e extraindo o ADN desta, como descrito nas secções 6.30-6.33 de Sambrook et al., supra.

Os fragmentos de ADN que deverão ser ligados uns aos outros (previamente digeridos com as enzimas de restrição adequadas, de tal forma que as extremidades de cada fragmento a ser ligado sejam compatíveis) estão presentes em solução em quantidades aproximadamente equimolares. A solução conterá também ATP, tampão de ligase e uma ligase, tal como ADN-ligase de T4 a cerca de 10 unidades por 0,5 μρ de ADN. Se o fragmento de ADN é para ser ligado a um vector, o vector é primeiro linearizado, cortando com a(s) endonuclease(s) de restrição adequada(s) e em seguida tratado com fosfatase, quer com fosfatase alcalina bacteriana quer com fosfatase alcalina de intestino de vitela. Isto impede a auto-ligação do vector durante o passo de ligação.

Após ligação, o vector com o gene estranho agora inserido é transformado numa célula hospedeira adequada, mais vulgarmente um procariota como E. coli K12 estirpe 294 (ATCC número 31 446) ou outra estirpe de E. coli adequada. As células transformadas são seleccionadas através do crescimento com um antibiótico, normalmente tetraciclina (tet) ou ampicilina (amp), aos quais são tornadas resistentes devido à presença de genes de resistência a tet e/ou amp no vector. Se a mistura de ligação foi transformada numa célula hospedeira eucariota, as células transformadas podem ser seleccionadas pelo sistema DHFR/MTX acima descrito. As células transformadas são crescidas em cultura e isola-se em seguida o ADN plasmídico (plasmídeo refere-se ao vector ligado ao gene estranho de interesse). Este ADN plasmídico é então analisado por mapeamento de restrição e/ou sequenciação de ADN. A 25 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ sequenciação de ADN é geralmente realizada pelo método de Messing et al., Nucleic Acids Res, 9:309 (1981) ou pelo método de Maxam et al. Methods of Enzymology, 65:499 (1980).

Após as células hospedeiras de mamifero terem sido transformadas de forma estável com o ADN, as sequências que codificam para a proteína-DHFR são amplificadas, fazendo o crescimento das células hospedeiras em cultura na presença de aproximadamente 200-500 nM de metotrexato. A gama efectiva de concentrações de MTX é altamente dependente da natureza do gene e da proteína DHFR e das características do hospedeiro. Como é óbvio, os limites superior e inferior geralmente definidos não podem ser determinados. Podem-se também utilizar concentrações adequadas de outros análogos de ácido fólico ou outros compostos que inibem o DHFR. O MTX é ele próprio, no entanto, conveniente, de fácil acesso e eficaz. F. Anticorpos anti-sialidase

Os anticorpos policlonais para a sialidase são criados em animais através de múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) de sialidase e um adjuvante. Poderá ser útil conjugar a sialidase ou um seu fragmento com uma proteína imunogénica na espécie a ser imunizada, e.g. hemocianina de lapa do género Fissurella, albumina do soro, tiroglobina de bovino, ou inibidor de tripsina de semente de soja, utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo éster de maleimidobenzoílsulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina) , gluteraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R'N = C = NR. Os conjugados adequados podem também ser construídos por métodos de ADN recombinante, através da expressão de uma chamada "proteína de fusão" que compreende as sequências de aminoácidos de ambas, a sialidase e a proteína imunogénica. A sialidase, ou conjugado ou derivado imunogénicos, podem também ser combinados com um adjuvante, como o adjuvante de Freund ou alúmen para injecção no animal, para aumentar a resposta imunitária.

Por exemplo, os animais são imunizados contra conjugados ou derivados imunogénicos, combinando 1 mg ou 1 μg de conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante de Freund completo e injectando a solução intradermicamente em múltiplos locais. Um mês mais 26 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ tarde, dá-se aos animais um reforço com 1/5 a 1/10 da quantidade original de conjugado, em adjuvante de Freund completo, por injecção subcutânea em múltiplos locais. 7 a 14 dias mais tarde os animais são sangrados e o soro é testado quanto ao titulo anti-sialidase. Dão-se aos animais reforços até se atingirem patamares de titulo. De preferência, o reforço dado ao animal é com conjugado da mesma sialidase, mas conjugada com uma proteína diferente e/ou através de um agente de reacção cruzada diferente.

De preferência, os anticorpos anti-sialidase são anticorpos monoclonais. O termo "anticorpo monoclonal" (e o seu plural) é aqui utilizado para designar um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural, que poderão estar presentes em quantidades menores.

Os anticorpos monoclonais incluídos no âmbito do invento incluem anticorpos híbridos e recombinantes (e.g. anticorpos "humanizados"), independentemente da espécie de origem ou da designação da classe ou subclasse de imunoglobulina, bem como fragmentos de anticorpos (e.g. Fab, F(ab')2 e Fv) , desde que sejam capazes de se ligar especificamente à sialidase. Cabilly et al., Patente U.S. 4, 816,567; Mage & Lamoyi, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp 79-97 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987).

Assim, o adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser entendido como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser produzidos utilizando o método do hibridoma, primeiro descrito por Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante. Cabilly et al. , Pat. U.S. 4,816,567.

No método do hibridoma, imuniza-se um ratinho ou outro animal hospedeiro adequado com sialidase ou uma sua porção imunogénica, por via subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular, para produzir linfócitos que produzem, ou são 27 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ capazes de produzir anticorpos que se irão ligar de modo especifico a sialidase. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são em seguida fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, de modo a formar uma célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986). Os anticorpos monoclonais são recuperados a partir de culturas das células de hibridoma resultantes, utilizando técnicas convencionais.

Numa concretização preferida do invento, o anticorpo monoclonal anti-sialidase terá uma afinidade para se ligar a sialidase de pelo menos cerca de 109 litros/mol, como determinado, por exemplo, pela análise Scatchard de Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).

Noutra concretização preferida do invento, o anticorpo monoclonal é um anticorpo neutralizante. O termo "anticorpo neutralizante" tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo monoclonal que é capaz de se ligar especificamente a sialidase e é capaz de inibir ou eliminar substancialmente a actividade enzimática da sialidase. Tipicamente, um anticorpo neutralizante irá inibir a actividade enzimática da sialidase em pelo menos cerca de 50%, e de preferência mais que 80%, como determinado, por exemplo, pelos ensaios de sialidase descritos infra. Os anticorpos neutralizantes do invento são especialmente úteis em aplicações terapêuticas, para prevenir ou tratar actividade de sialidase indesejada num ser humano ou em outro mamífero.

Os anticorpos anti-sialidase são também úteis em ensaios de diagnóstico para sialidase. Os anticorpos anti-sialidase são marcados com radioisótopos, enzimas, fluoróforos, cromóforos e semelhantes e/ou são imobilizados numa matriz insolúvel, e podem ser utilizados em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaio de ligação competitiva, ensaio em sanduíche directo ou indirecto e por ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987) .

Os ensaios de ligação competitiva baseiam-se na capacidade de um padrão marcado (por exemplo sialidase recombinante ou uma sua porção imunologicamente reactiva) competir com a sialidase que está presente numa amostra de 28 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ teste pela ligação a uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de sialidase na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que se liga aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que se liga, os anticorpos são geralmente insolubilizados antes ou após a competição, de forma a que a sialidase padrão e a sialidase da amostra de teste, que estão ligadas aos anticorpos, possam ser convenientemente separadas da sialidase padrão e da sialidase da amostra de teste que permanecem não ligadas.

Os ensaios em sanduíche envolvem a utilização de dois anticorpos, sendo cada um capaz de se ligar a uma porção imunogénica ou epítopo diferentes da proteína a ser detectada. Num ensaio em sanduíche, a sialidase da amostra de teste é ligada por um primeiro anticorpo, o qual está imobilizado num suporte sólido e em seguida um segundo anticorpo liga-se à sialidase, formando deste modo um complexo de três partes, insolúvel. David & Greene, Pat. U.S. 4,376,110. O segundo anticorpo pode ser ele próprio marcado com uma porção detectável (ensaio sanduíche directo) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado com uma porção detectável (ensaio sanduíche indirecto). Por exemplo, um tipo de ensaio em sanduíche é um ensaio ELISA, caso em que a porção detectável é uma enzima.

Os anticorpos do invento são também úteis para imagiologia in_ vivo, em que um anticorpo marcado com uma porção detectável é administrado a um hospedeiro, preferivelmente na corrente sanguínea, e é analisada a presença e localização do anticorpo marcado no hospedeiro. O anticorpo pode ser marcado com qualquer porção que seja detectável num hospedeiro, quer por ressonância magnética nuclear, radiologia, ou outro meio de detecção conhecido na especialidade.

Os anticorpos anti-sialidase são também úteis para a purificação por afinidade da sialidase, a partir de fontes naturais ou a partir de cultura de células recombinantes. Neste processo, os anticorpos são imobilizados num suporte adequado, tal como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos conhecidos na especialidade. O anticorpo imobilizado é em seguida colocado em contacto com uma amostra que contém a proteína sialidase a ser purificada, e em seguida 29 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ ο suporte é lavado com um solvente adequado, que irá remover substancialmente todo o material na amostra, excepto a proteína sialidase que está ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, que irá libertar a proteína sialidase do anticorpo. G. Composições Farmacêuticas

Para aplicações terapêuticas, a sialidase ou o anticorpo anti-sialidase são administrados a um mamífero, preferivelmente um ser humano, numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável, incluindo as que podem ser administradas a um ser humano por via intravenosa na forma de bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intra-cerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou de inalação, para exercer efeitos terapêuticos locais assim como sistémicos.

Estas formas de dosagem abrangem composições farmacêuticas compreendendo a sialidase ou o anticorpo anti-sialidase e opcionalmente um excipiente ou transportador que não é, por si, nem tóxico nem terapêutico. Exemplos destes transportadores incluem permutadores iónicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina sérica humana, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicéridos parciais de ácidos gordos vegetais saturados, água, sais ou electrólitos tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, sódio, cloreto, zinco, sais, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose e polietilenoglicol. Os transportadores para formulações da sialidase tópicas ou à base de gel incluem polissacáridos como carboximetilcelulose de sódio ou metilcelulose, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros de blocos polioxietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol, e álcoois de cera de madeira. Para todas as administrações, formas de depósito convencionais são adequadamente utilizáveis. Estas formas incluem, por exemplo, microcápsulas, nanocápsulas, lipossomas, emplastros, formas para inalação, vaporizações nasais, comprimidos sublinguais, e preparações de libertação sustentada. A sialidase ou o anticorpo anti-sialidase serão tipicamente formulados nestes veículos numa concentração de cerca de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml. 30 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Os exemplo adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo a sialidase, matrizes estas que estão na forma de artigos conformados, e.g. filmes, ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) como descrito por Langer et al., . 15:167 (1981) e Langer, Chem. Tech., 12 : 98-105 (1982), ou poli(álcool vinílico), polilactidas (Pat. U.S. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547 (1983), copolímeros não degradáveis de etileno-acetato de vinilo (Langer et al., supra), degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico tais como o Lupron Depot™ (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante 100 dias, determinados hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando polipéptidos encapsulados permanecem no corpo durante um longo período, podem desnaturar ou agregar-se em resultado de exposição a humidade a 37°C, resultando uma perda de actividade biológica e possíveis alterações de imunogenicidade. Podem ser deduzidas estratégias racionais para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, quando se verifica que o mecanismo de agregação é a formação de ligações S-S intermoleculares através de interpermuta de tiol-dissulfureto, a estabilização pode ser conseguida por modificação de resíduos sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz polimérica específicas.

As composições de libertação sustentada incluem também sialidase ou anticorpos anti-sialidase aprisionados em lipossomas. Os lipossomas contendo a sialidase são preparados por métodos conhecidos na especialidade, tal como descrito em Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); Patente U.S. 4,485,045; Patente U.S. 4,544,545. Normalmente os lipossomas são do tipo unilamelar pequeno (cerca de 200-800 Angstroms) em que o teor lipídico é superior a cerca de 30 mol.% de colesterol, sendo a proporção seleccionada 31 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ ajustada para a terapia óptima de HRG. Lipossomas com tempo de circulação aumentado são divulgados na Patente U.S. 5,013,556.

Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem apropriada de sialidase ou anticorpo anti-sialidase dependerá do tipo de doença a tratar, da gravidade e progressão da doença, de se o polipéptido é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, de terapias prévias, do historial clinico do doente e da resposta a administração(ões) anterior(es) do polipéptido, e da discrição do médico assistente. A sialidase ou o anticorpo anti-sialidase são adequadamente administrados ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

Por exemplo, a sialidase é útil no tratamento ou prevenção de inflamação e desordens inflamatórias, tais como artrite reumatóide ou doença de Crohn. Mostrou-se que a porção ácido siálico de glyCAM (molécula de adesão celular dependente de glicosilação) e moléculas similares está envolvida na mediação da resposta inflamatória por selectinas. Pliatte, et al., Glycobiology 3:201-217 (1993). A sialidase é também útil no tratamento ou prevenção de desordens pulmonares caracterizadas por uma sobre-produção ou excesso de muco, tais como fibrose cística, bronquite crónica, bronquiectasia, asma, tuberculose ou pneumonia, e no tratamento ou prevenção de infecção virai, tal como por vírus influenza, em que um resíduo de ácido siálico de um receptor celular está envolvido na ligação de, e infecção pelo vírus. Stone, Australian J. Exp. Biol. 26:287-298 (1948). A sialidase pode ser administrada sozinha ou em conjunto com outros produtos terapêuticos conhecidos, tais como antibióticos, agentes antivirais, ou mucolíticos, tais como desoxirribonuclease (ADNase).

Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg de sialidase ou anticorpo anti-sialidase constituem uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, quer, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas, quer por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores acima mencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença. Contudo, podem 32 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ ser úteis outros regimes de dosagem. A progressão desta terapia é facilmente monitorada por técnicas e ensaios convencionais. H. Células hospedeiras deficientes em sialidase para o controlo da glicosilação intracelular de proteínas

Pode-se utilizar uma sequência de ADN derivada de ADN que codifica para sialidase, mas que não pode ser expressa de forma funcional, para efectuar o "knock out" (anular) , ou de outra forma, danificar a função do gene de sialidase de uma linha celular, utilizando uma técnica de recombinação homóloga. É também possível utilizar esta abordagem para danificar a função do gene de sialidase, através do direccionamento do promotor para o gene. Uma modificação que danifica a função do gene pode ser designada por "lesão" e pode ser uma inserção, deleção, substituição, ou combinação destas, embora seja provavelmente mais simples utilizar um fragmento de ADN que tem uma deleção parcial da sequência que codifica para a sialidase. Uma deleção adequada poderá ser de cerca de 50 pb ou mais. Introduz-se uma construção de ADN que contém o gene modificado numa célula e ocorre a recombinação entre a construção e o ADN genómico da célula.

De modo a ser possível a detecção de um acontecimento recombinante, incorpora-se um gene marcador na construção. O gene marcador pode estar sob o controlo regulatório de um promotor incorporado na construção, o qual pode ser indutível sob condições adequadas. É, no entanto, necessária a análise do ADN para determinar se a recombinação está no local genómico correcto. Esta análise de ADN pode ser feita utilizando sondas para a inserção e sequenciando regiões flanqueadoras da inserção, determinando desse modo a presença da sequência que codifica para sialidase nessa região, ou utilizando sondas para o gene de sialidase e detectando a modificação que foi feita na inserção de ADN.

As técnicas adequadas estão descritas no pedido de Patente Internacional W091/01140 e em Hasty et al., Molecular and Cellular Biology, Junho 1992, 2464-2474 e são conhecidas do perito na especialidade.

Quando as células alvo são diplóides e possuem duas cópias do gene de sialidase, as duas cópias podem ser 33 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ danificadas uma de cada vez, sendo as células com uma cópia mutada amplificadas e em seguida utilizadas numa segunda fase, envolvendo inactivação ou outra danificação da segunda cópia do gene. Quando nenhuma cópia é expressa de forma funcional, estas células podem ser detectadas através de um ensaio para determinar a ausência de actividade de sialidase.

Outra técnica que pode ser utilizada na danificação da expressão funcional de uma sialidase numa linha celular envolve ARN anti-sentido. 0 ADN que codifica para a sialidase pode ser introduzido nas células sob o controlo de um promotor que assegura a transcrição da cadeia de ADN, diferente da normalmente utilizada para a produção do ARNm que é transcrito para produzir a proteina sialidase. 0 gene anti-sentido pode ser introduzido nas células num vector de expressão que é mantido nas células sem integração no genoma. Os vectores de expressão adequados estão descritos acima, na passagem relativa à clonagem e expressão em organismos multicelulares eucarióticos. Alternativamente, o gene pode ser incorporado no genoma das células por recombinação. É conveniente colocar o gene anti-sentido sob o controlo de um promotor que assegure a transcrição em simultâneo com a transcrição do gene constitutivo de sialidase. 0 promotor pode ser indutivel, de forma que a sua actividade pode ser controlada de forma precisa. 0 modo de acção exacto do ARN anti-sentido na danificação da função normal do gene não é completamente compreendido, embora envolva pelo menos parcialmente, a hibridação do ARN anti-sentido com o ARNm complementar, para formar ARN de cadeia dupla.

Os exemplos seguintes são proporcionados apenas para ilustração do invento e não deverão ser entendidos como limitativos do âmbito do invento. Todas as citações de literatura são expressamente incorporadas por referência.

Procedimentos experimentais São agora descritos os procedimentos utilizados nos Exemplos.

Materiais: o ácido 4-metilumbeliferil-N- acetilneuraminico, o ácido N-acetilneuraminico, a 2,3-sialil- 34 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ lactose, a 2,6-sialil-lactose, os gangliósidos, o ácido eólico, o ácido colominico e a apotransferrina são da Sigma Chem. Co. (St. Louis, Mo) . 0 dimero e o tetrâmero de ácido siálico são de E.Y. Labs Inc. (San Mateo, CA). Os inibidores de sialidase; Neu5Ac2en, 9-azido-Neu5Ac2en e 9-NANP-Neu5Ac2en são preparados como anteriormente descrito [Warner Biochem. Biophys. Res. Commun., 148:1323[1987] e Warnner et al., Carbohydr. Res. 215:315[1991]).

Ensaios de sialidase fluorescente: As condições padrão de ensaio para a monitorização da actividade enzimática durante a purificação utilizando o análogo do substrato fluorescente são: 4-MUNeu5Ac 1,3 mM, tampão fosfato 50 mM , pH 6,8, 0,3 mg de albumina de soro bovino e quantidades variáveis de enzima num volume total de 30 μΐ. Após adição da enzima, as amostras são incubadas a 3 7°C num banho de água com agitação, durante 5 minutos. A reacção é terminada e a fluorescência da umbeliferona libertada é aumentada pela adição de 2 ml de tampão glicina-carbonato 80 mM, pH 9,7. A quantificação do produto é feita através da medição de fluorescência em amostras, com excitação a 365 nm e emissão a 450 nm, utilizando um padrão de 4-metilumbeliferona. Uma unidade de actividade enzimática é definida como pmol/min de ácido siálico libertado.

Ensaios de sialidase com substratos naturais: Quando se testam substratos naturais com a enzima purificada, a quantidade de ácido siálico libertado é medida utilizando o ensaio do ácido tiobarbitúrico, modificado por Uchida [Uchida et al., J. Biochem., 82:1425 (1977)] utilizando ácido siálico como padrão. A quantidade de ácido siálico nas amostras de controlo, que incluem uma mistura de ensaio completa incubada sem enzima adicionada, é subtraída de cada determinação. Todas as amostras são clarificadas por centrifugação (1000 x g, 10 min) antes da determinação da absorvância a 540 nm.

Ensaios de proteínas: As determinações de proteínas durante a purificação são feitas utilizando o estojo comercial de determinação de proteínas contendo ácido bicincónico (reagente BCA) obtido de Pierce Chem. Co. (Rockford, IL). Nas amostras que continham glicerol, as determinações de proteína são feitas utilizando o estojo de ensaio de ligação do corante azul de Coomassie G-250 da BioRad Labs (Richmond, CA), que se baseia no ensaio de proteínas de Bradford [Bradford, M. Anal. 35 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Biochem., 72:248 (1976)]. A albumina de soro bovino é um padrão para ambos os ensaios.

Parâmetros cinéticos da enzima: As condições de ensaio (tempo e enzima adicionada) são modificadas para cada substrato, de forma a medir as velocidades iniciais de reacção. Os parâmetros cinéticos são obtidos a partir de representações gráficas de recíprocos duplos de curvas de saturação de substrato [Segel, I.H. John Wiley, Nova Iorque, Enzyme Kinetics, 18 (1975)]

Electroforese em gel de acrilamida: A electroforese em gel de poliacrilamida é realizada como descrito por Laemmli (Laemmli, U.K. Nature 227:680 [1970]), utilizando géis de acrilamida a 12,5% sob condições desnaturantes. Os marcadores de peso molecular são da BioRad.

Electroforese de focagem isoeléctrica em gel: A análise de focagem isoeléctrica da sialidase purificada é realizada utilizando géis de poliacrilamida preparados comercialmente, com a parte de trás em plástico (Pharmacia, Inc.), impregnados com tampões de anfolina, pH 3-9. Após electrof orese, os géis são fixados, corados e descorados como descrito pelo fabricante, com a excepção da utilização do corante azul de Coomassie G-250 para a coloração de proteínas, em vez de Coomassie R-250. As proteínas marcadoras com valores de pi conhecidos são obtidas de Serva (Heidelberg, Alemanha).

Nalguns casos, a localização da sialidase é determinada por ensaio da enzima no gel.

Após electrof orese, o gel é mantido a 4°C em gelo e coberto com papel de filtro saturado com tampão fosfato 50 mM, pH 6,8, contendo 4-MU-Neu5Ac 1,3 mM. O gel é incubado num banho de água com agitação a 3 7°C durante 10 min. Após remoção do papel de filtro, a localização da enzima é determinada por inspecção do gel, monitorização do produto fluorescente com uma luz ultravioleta suportada à mão (molde Mineralight UVGL-25, UVP, Inc. San Gabriel, CA). As bandas que dão actividade são marcadas cortando o gel e coradas em seguida para a proteína. Os pontos isoeléctricos das amostras de proteína analisadas são determinados com base na migração anódica de cada banda, comparando com a migração de padrões de proteínas com pontos isoeléctricos conhecidos. 36 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Isolamento de péptidos trípticos de sialidase: Dilui-se uma amostra de sialidase purificada, 18 pg em 180 μΐ de tampão fosfato, por adição de 20 μΐ de bicarbonato de amónio 0,1 M. Adiciona-se TPCK-tripsina, 1,6 μρ (Worthington, Inc., Freehold, NJ) em 20 μΐ de HC1 0,01 N e a mistura é incubada durante 18h a 37°C. A reacção é terminada por adição de ácido trifluoroacético a 0,2% em volume e o solvente é reduzido para cerca de 250 μΐ, sob vácuo.

Os péptidos resultantes são isolados por HPLC de fase inversa numa coluna à base de sílica Vydac C-18, de 2,1 x 250 mm (The Separations Group, Inc. Hesperia, CA) . A coluna é equilibrada em ácido trifluoroacético a 0,1% e os péptidos são resolvidos um do outro utilizando um gradiente linear de solventes, com quantidades crescentes de acetonitrilo que contém ácido trif luoroacético, de 0,1% até 100% em 76 min, a um caudal de 0,25 ml/min a 30°C, utilizando um sistema de HPLC Hewlett-Package 1090. O efluente é monitorizado a 214 e 280 nm. São recolhidas cerca de vinte fracções contendo péptidos.

Análise da sequência do terminal amino: Submetem-se alíquotas de diversas fracções de péptidos a análise da sequência N-terminal utilizando um sequenciador ABI 447A/120A. Em geral, as amostras analisadas estão na gama de 100-200 pmol.

Bancos de dados de sequências de proteínas: A sequência dos péptidos trípticos é examinada quanto a semelhança com outras sequências de proteínas conhecidas. A base de dados pesquisada incluía sequências de proteínas da National Biomedical Research Foundation Protein Information Resource, da base de dados SWISSPROT da EMBL e do Banco de Dados de proteínas de Brookhaven.

Preparação de péptidos sintéticos e anticorpos policlonais: Produzem-se anti-soros policlonais em coelhos brancos da Nova Zelândia, fêmeas, contra péptidos sintéticos preparados com base em diversas sequências de péptidos trípticos, como descrito [Bennett et al., J. Biol. Chem., 266:23060 (1991)]. A fracção de IgG é isolada a partir do soro bruto por cromatografia em coluna, utilizando colunas de 37 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ proteína A HiTrap de 1,0 ml, preparadas comercialmente, seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante (Pharmacia, Inc.) . A fracção de IgG resultante contém cerca de 2 mg de proteína/ml.

Análise de imunotransferência: Os extractos celulares de diversas células de ovário de hamster chinês, crescidas tanto em meio contendo soro como em meio sem soro, são preparados suspendendo as células, a 10% p/v, em água, seguido de irradiação sónica com três pulsos de cinco segundos, utilizando um desmembrador sónico Fisher, molde 300 (Fisher Scientific, Springfield, NJ) . Os extractos isentos de células são submetidos a análise em gel de SDS-poliacrilamida e transferidos electroforeticamente para membranas de difluoreto de polivinilideno [Matsudaria, P., J. Biol Chem., 262:10035 (1987)]. Após a transferência estar completa, a membrana é lavada e incubada com a fracção de IgG do anti-soro do péptido diluido em tampão bloqueador como descrito por Burnette [Burnette, W. N. Anal. Biochem., 112:195(1981)]. A detecção de sialidase por análise de imunotransferência é feita utilizando a fracção de anticorpo-IgG do péptido, isolada, diluição 1:1000 e uma IgG anti-coelho de cabra, conjugada com peroxidase de rábano, diluição 1:2000, (BioRad) com substrato 4-cloronaftol.

Análise de imunotransferência de carbo-hidratos: Os carbo-hidratos ligados a proteína são detectados utilizando o sistema de detecção de glicanos comercial (Boehringer), que se baseia no processo de imunotransferência oxidativa descrito por Haselbeck e Hosel [Haselbeck et al. Glycoconjugate £^7:63(1990)]. Segue-se o protocolo de coloração recomendado pelo fabricante, com a excepção de que a proteína é transferida para uma membrana de difluoreto de polivinilideno, em vez de uma membrana de nitrocelulose e os tampões bloqueadores continham 5% de albumina de soro bovino em tampão tris 10 mM, pH 7,4 com 0,9% de cloreto de sódio. A detecção é feita com anticorpos anti-digoxigenina ligados com um conjugado de fosfatase alcalina (Boehringer), diluição 1:1000 em solução salina tamponada com tris, utilizando os substratos de fosfatase, cloreto de 4-nitro-azul de tetrazólio, 0,03% (p/v) e 5-bromo-4-cloro-3-indoílfosfato a 0,03% (p/v) em tampão tris 100 mM, pH 9,5, contendo cloreto de sódio 100 mM e cloreto de magnésio 50 mM. As bandas de proteína que contêm carbo-hidrato são normalmente visualizadas em cerca de 10 a 15 min. 38 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Digestão com péptido-N-glicosilase F: A sialidase purificada (3 pg) ou transferrina, como controlo, é dialisada extensivamente contra bicarbonato de amónio 0,1M e o solvente é removido sob vácuo. 0 resíduo é suspenso em 14 μΐ de um tampão que contém SDS a 0,18%, beta-mercaptoetanol 18 mM, fosfato 90 mM, EDTA 3,6 mM a pH 6,8 e aquecido a 100°C durante 3 min. Após arrefecimento até a temperatura ambiente, divide-se a amostra em duas partes iguais. Uma das alíquota não é mais tratada e serve como controlo. A segunda fracção é ajustada para cerca de 1% de detergente NP-40 seguido de 0,2 unidades de péptido-N-glicosidase F (Boehringer). Ambas as amostras são aquecidas a 37°C durante 2h e em seguida analisadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida.

Condições de cultura de células: As células de ovário de hamster Chinês, CHO 14.16 e CHO 12 são derivadas a partir da linha celular CHO-DUX (dhfr-) [Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sei., 77:4216 (1980)]. As células Lee 2 (ATCC número CRL 1736) são células de ovário de hamster Chinês obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD). As células são crescidas ou em culturas em monocamada ou em suspensão, num meio MEM rico em glucose, suplementado com soro fetal de vitela (10%). As culturas em monocamada são crescidas até próximo da confluência e são recolhidas raspando a placa. As culturas em suspensão são recolhidas a uma densidade de células de cerca de 1,2-1,4 x 106 células/ml. A viabilidade celular é determinada por exclusão com azul de tripano e apenas as culturas que têm uma viabilidade de 90% ou superior são utilizadas para análise. EXEMPLO 1: Purificação de sialidase O protocolo para purificação da sialidase de cerca de 100L de fluido de cultura de células está resumido na TABELA I. O fluido foi obtido a partir de culturas de células CHO 14.16 crescidas num meio isento de soro. Após remoção dos restos celulares, o fluido foi diafiltrado e concentrado cerca de 10 vezes, utilizando uma membrana de poli-sulfona lOkD (Millipore), reduzindo a concentração isotónica de sal do fluido para cerca de 50 mM a pH 7,0. O fluido concentrado da cultura de células foi submetido directamente a cromatografia em DEAE-Sepharose. Sob estas condições de cromatografia, a sialidase não adere à coluna e surge no efluente. O efluente 39 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ da coluna foi concentrado cerca de 30 vezes, utilizando um filtro de membrana de celulose de 10 kD (Millipore). O material concentrado foi armazenado a -20°C e foi utilizado como material de partida para purificação da sialidase.

TABELA I

Purificação de enzima sialidase de células CHO isolada a partir de 100 1 de fluido de cultura de células3 Passo Proteína total (mg) Actividade específica0 ([imol/min-mg) Purificação (vezes) Rendimento (%) 1. efluente de DEAE-Sepharose 22 500 1, 45 x 10~J 1 100 2. sulfato de amónio 8250 2,65 x 10~J 2 67 3. DEAE-Sepharose 1450 7, 88 x 10~J 5 35 4. S-Sepharose 55 0, 149 103 25 5. cromatografia de interacção hidrófoba 31 0, 214 148 20 6. Heparina-Agarose 3,6 1,27 876 13 7. Cromatofocagem 0, 174 10, 1 6963 6 a A actividade específica de sialidase no fluido bruto da cultura de células foi estimada em cerca de 0,3 x 10"3 nmol/min/mg proteína b O 4-MU-Neu5Ac2en foi utilizado como substrato. Os ensaios foram realizados a pH 6,8 para minimizar a contribuição da sialidase lisossómica, que pode estar presente nas fases iniciais de purificação A purificação da enzima foi monitorizada em cada passo utilizando 4-MU-Neu5Ac como substrato. 0 material final purificado foi testado com vários substratos conjugados com sialilo, que ocorrem naturalmente. Todos os passos de purificação são realizados a 4°C.

Passo 1: precipitação com sulfato de amónio: Clarificou-se cerca de 11 de concentrado de DEAE-Sepharose (equivalente a cerca de 1001 de fluido de cultura de células) por centrifugação a 13 000 x g a 4°C durante 20 min. Após remoção da pelete, ajustou-se o sobrenadante para 47% de saturação, por adição de sulfato de amónio sólido. Após centrifugação (17 000 x g, 20 min, 4°C) desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se a pelete por aspiração repetida com uma pipeta, utilizando 30 ml de fosfato 2,5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM (Tampão A). (Salvo indicação em contrário, todos os tampões utilizados durante a purificação contêm EDTA 1 mM) . Dialisou-se a solução durante a noite contra 3 substituições de 41 de tampão A. 40 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Passo 2: cromatografia em DEAE: Após diálise, a preparação de enzima foi aplicada a uma coluna (5 x 15 cm) contendo DEAE-Sepharose FF (Pharmacia) equilibrada em tampão A. A coluna foi eluida com 225 ml de tampão A e desprezou-se o eluato. Realizou-se uma nova eluição com 250 ml de fosfato 10 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM (4X tampão A), seguido de 600 ml de fosfato 20 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, recolhendo fracções de 8 ml. Reuniram-se as fracções que contêm a actividade de enzima e ajustou-se o pH para pH 6,0 com HC1 diluído.

Passo 3: cromatografia em S-Sepharose: A preparação de enzima do passo anterior foi aplicada com uma bomba peristáltica a uma coluna (2,5 X 7,5 cm) contendo S-Sepharose de fluxo rápido (Pharmacia) em 4X tampão A a pH 6,0. Lavou-se a coluna com cerca de 25 ml de tampão fosfato 10 mM, pH 6,0. Realizou-se nova eluição com um gradiente linear de um tampão com uma concentração crescente de fosfato, desde 10 a 150 mM, num total de 400 ml, recolhendo fracções de 5 ml. 0 caudal da coluna foi mantido com uma bomba peristáltica em cerca de 2 ml/min. Eluiu-se actividade numa vasta gama do gradiente. Nalgumas preparações, o pico de actividade principal foi parcialmente resolvido em duas fracções, com níveis de sialidase praticamente iguais. A análise destas fracções por focagem isoeléctrica em poliacrilamida, indicou que cada uma continha várias formas isoeléctricas da enzima. Uma vez que nenhuma das fracções continha uma única forma da enzima, ambas as fracções foram combinadas e purificadas em conjunto como uma mistura.

Passo 4: cromatografia de interacção hidrófoba: O material da S-Sepharose foi concentrado a 2M de sulfato de amónio, ajustado para pH 6,0 e em seguida aplicado numa coluna de Phenyl-Toyopearl 650S, 1,5 x 7 cm, equilibrada num tampão que contém fosfato 50 mM, pH 6,0, EDTA 1 mM e sulfato de amónio 2 M. Após carregamento, lavou-se a coluna com 20 ml de tampão de equilíbrio e em seguida eluiu-se com um gradiente linear decrescente de sulfato de amónio em tampão. Utilizaram-se cerca de 55 g de cada tampão ou cerca de 100 ml do gradiente total, e recolheram-se fracções de dois ml. Após as fracções contendo actividade de enzima serem identificadas, estas foram reunidas e dialisadas durante a noite contra 11 de fosfato 5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, com glicerol a 10%. 41 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Passo 5. Cromatografia em Heparina-Agarose: A amostra dialisada do passo anterior foi aplicada directamente numa coluna de 1,0 x 7 cm contendo heparina-agarose (Sigma) equilibrada em fosfato 5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM contendo NaCl 50 mM. Após carregamento com a ajuda de uma bomba peristáltica, lavou-se a coluna com 8 ml de tampão de equilíbrio e a enzima foi em seguida eluída com um gradiente linear num total de 120 ml de tampão de equilíbrio e concentração crescente de cloreto de sódio, até 500 mM. Recolheram-se fracções de 1,5 ml. Reuniram-se as fracções que contêm actividade e concentraram-se posteriormente, ajustando para 2M de sulfato de amónio e aplicando a uma coluna de 0,5 x 1,0 cm de Phenyl-Toyopearl, eluindo com 2 ml de fosfato 5 mM, EDTA 1 mM. A solução de enzima concentrada foi dialisada contra 11 de tampão de eluição com glicerol a 10%.

Passo 6; cromatografia de cromatofocagem: A preparação de enzima concentrada do passo anterior foi diluída com um volume igual de Tris-HCl, 25 mM, pH 8,0 e cloreto de sódio 25 mM. A mistura foi ajustada para pH 8,0 com hidróxido diluído e aplicada em seguida a uma coluna de DEAE-Sepharose de 1,0 x 18 cm, equilibrada em tampão Tris. Após carregamento, a coluna foi lavada com 8 ml de tampão de equilíbrio. A enzima foi eluída com tampão Polybuffer 96 (Pharmacia), diluída 1:12 e ajustada para pH 6,0 com HC1. Recolheram-se fracções de 2ml, com um caudal de cerca de 0,5 ml/min, mantido com uma bomba peristáltica. A enzima eluída tem um pico estreito a pH 7,0-7,4, num volume total de cerca de 9,0 ml (Fig. 1). As fracções reunidas foram imediatamente ajustadas para 2M de sulfato de amónio e pH 6,0 com HC1 e em seguida concentradas por aplicação numa coluna de Phenyl-Toyopearl de 1,0 x 1,0 cm, equilibrada em fosfato 5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, com glicerol a 10% e sulfato de amónio 2M. Após aplicação da amostra, lavou-se a coluna com 5 ml de tampão de equilíbrio para remover o tampão Polybuffer. A enzima é eluída lavando a coluna com 1,5 ml de fosfato 5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM com glicerol a 20% e dialisando durante a noite contra 11 de tampão de eluição. 42 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ EXEMPLO 2: Avaliação da pureza da enzima e caracterização da enzima

Análise por electroforese em gel de poliacrilamida com SDS: A preparação final de sialidase purificada origina uma única banda principal de proteína a um peso molecular de 43 kD, quando analisada por electrof orese em gel de SDS-poliacrilamida sob condições redutoras (Fig. 2). Detecta-se um contaminante menor a cerca de 60 kD, que se estima como sendo inferior a 1% do material total analisado. Obtém-se um resultado semelhante quando a amostra é analisada na ausência de um agente redutor, excepto que a banda de proteína a 43 kD é consideravelmente mais difusa.

Análise por focagem isoeléctrica: Quando a preparação de sialidase purificada é submetida a focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida, detectam-se pelo menos duas bandas principais de proteína, juntamente com cinco bandas menores (Fig. 3, painel B) . As duas bandas principais de proteína, Sa e Sb, originam pontos isoeléctricos de pi = 6,8 e 7,0, respectivamente. É interessante notar que todas as bandas de proteína tem actividade de sialidase quando o gel é visualizado com substrato fluorogénico impregnado (Fig. 3 painel C) . O nível de actividade em cada banda é proporcional à intensidade de coloração da proteína. pH óptimo e estabilidade: A enzima purificada exibe uma actividade considerável numa vasta gama de pH, estendendo-se desde pH 4,5 a 7,5, com um óptimo a cerca de pH 5,9 (Fig. 4). Obtém-se um resultado semelhante quando a enzima é testada em homogenatos celulares brutos, excepto que o nível de actividade na gama ácida, pH 3,5-4,5 é ligeiramente maior do que com a enzima purificada (Fig. 4) . Assume-se que esta actividade é devida à presença da sialidase lisossómica no homogenato bruto, a qual tem um pH óptimo na região ácida [Warner et al. Biochemistry, 18:2783 (1979)]. A proteína é estável durante a purificação e as fracções são armazenadas a -20°C entre os passos de purificação, quando necessário. No entanto, após cromatofocagem, a preparação final de enzima era lábil à temperatura e era necessária a presença de glicerol a 20% para manter a sua actividade durante a diálise. Mesmo quando se inclui glicerol a 20%, perde-se cerca de 15% da actividade da enzima num único ciclo 43 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ de congelamento/descongelamento. Ο material final é estável durante três meses quando armazenado, congelado a -70°C.

Devido à labilidade térmica da enzima purificada, inclui-se albumina de soro bovino (0,3 mg/ml) no ensaio, de modo a assegurar a manutenção de condições de ensaio lineares, quando se avaliam os parâmetros cinéticos dos vários substratos.

Especificidade para com o substrato: Testaram-se várias classes de glicoconjugados de sialilo como substratos, TABELA II. Os oligossacáridos como a sialil-lactose eram facilmente clivados, embora a enzima apresente uma preferência de cerca de 4 vezes para resíduos de ácido siálico ligados em 2,3. Isto não é surpreendente, uma vez que as glicoproteínas derivadas de roedores contêm, quase exclusivamente, ácidos siálicos em ligações 2,3. As cadeias laterais de oligossacáridos nas glicoproteínas intactas eram também substratos. 0 ácido siálico ligado à transferrina de soro humano é clivado muito mais lentamente do que o ligado a desoxirribonuclease I humana recombinante. A diferença dos valores de Vmax entre estes dois substratos da proteína deve-se provavelmente também às diferenças nas ligações de ácido siálico. A transferrina é isolada a partir de soro humano e contém apenas resíduos de ácido siálico ligados em 2,6 [Baenziger, J.U. The Plasma Proteins 2a ed. (Putnam, F.W., ed) 272-398, Academic Press, New York (1984)]. Em contraste, a desoxirribonuclease I, embora codificada por uma sequência nucleotídica derivada de humanos, era expressa em células de ovário de hamster Chinês e contém assim, presumivelmente, apenas ácidos siálicos ligados em 2,3. Os valores de Km para ambas as proteínas eram praticamente idênticos. Os dímeros de ácido siálico (isolados a partir de hidrolisados de ácido colomínico) ligados em 2,8, eram também substratos para a enzima. Hidrolisaram-se ácidos siálicos oligoméricos superiores, tais como tetrâmeros de ácido siálico e ácido colomínico, mas a taxas substancialmente menores. 44 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

TABELA II

Constantes cinéticas da sialidase com substratos sialilglicoconjugados solúveis3 Substrato Vraax (pmol/min-mg) Km (mM) 4—MU—Neu5Ac 18 0,4 a-2,3-sialil-lactose 16 1,3 a-2,6-sialil-lactose 4 1,2 Transferrina 2 4, 1 rDesoxirribonuclease I 12 5, 8 dímero de ácido siálico 11 3,4 tetrâmero de ácido siálico 3 2,4 a Utilizaram-se condições de ensaio padrão para todos os substratos. Os valores de Km aparente e Vm são determinados como descrito nos Métodos. São apresentadas as médias de determinações em duplicado, com um erro relativo de cerca de 10% entre cada determinação.

Alguns gangliósidos são degradados pela sialidase (TABELA III), embora estes substratos necessitem da presença de ácido eólico como agente solubilizante, no ensaio, para uma actividade óptima. Os gangliósidos GM3, GDia e GTib foram hidrolisados a taxas comparáveis, enquanto que o GMi, GM2 e GDib não eram substratos. Estes resultados são consistentes com o facto de a enzima apresentar uma preferência para resíduos de ácido siálico ligados no terminal da cadeia de oligossacárido. Os resíduos de ácido siálico ligados internamente, como os de GMi e outros gangliósidos, não são aparentemente acessíveis à enzima.

TABELA III

Actividade de sialidase para gangliósidos e ácido colomínico3 Substrato Actividade relativa (%) a-2,3-sialil-lactose 100 gangliósidos/ácido eólico Gmi NRb Gm2 NRb Gm3 29 GDla 21 GDlb NRb GTlb 23 Ácido colomínico 4

Todos os substratos foram testados a 4 mM e ensaiados sob condições de taxa inicial a pH 6,0. O ácido eólico (0,05%) foi incluído com os substratos lipídicos. As condições óptimas foram determinadas com GM3 como substrato, utilizando o ensaio do tiobarbiturato para o ácido siálico. bNR = nenhum produto de reacção detectado de formas a sialidase

Detecçao de carbo-hidratos: A presença electroforéticas múltiplas (Fig. 3) sugere que 45 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ pode ser uma glicoproteína que contém uma mistura heterogénea de cadeias laterais de oligossacáridos com diferentes grupos carregados. Por este motivo, analisou-se a proteína quanto a carbo-hidratos, utilizando o método de imunotransferência oxidativa, descrito por Haselbeck e Hosel (supra.) (Fig. 5). Neste ensaio, não se detectaram nenhuns carbo-hidratos na sialidase (1,5 μg) (Fig. 5, Pista C). Pelo contrário, observou-se um sinal forte das cadeias laterais de oligossacáridos de transferrina (0,8 μg) , apesar de se testar uma pequena quantidade desta glucoproteína (Fig. 5, Pista D). Em experiências não apresentadas, estima-se que os limites de detecção com o ensaio de imunotransferência sejam de cerca de 80 ng de glicoproteína transferida.

Noutras experiências (dados não apresentados), a sialidase foi digerida com péptido-N-glicosidase F, uma endoglico-hidrolase que cliva quase todos os tipos de cadeias laterais de carbo-hidratos ligadas a asparagina, em proteínas desnaturadas [Tarentino, A. L. et al. Biochemistry, 24:4665 (1985)]. Este tratamento não teve efeito na enzima, tal como verificado por análise de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, dando indicação adicional de que a sialidase não contém cadeias laterais de carbo-hidrato.

As múltiplas formas electroforéticas observadas para a enzima purificada deverão ser o resultado de heterogeneidade de carga, introduzida na proteína por outros meios, possivelmente corte proteolítico do polipéptido ou desamidação de resíduos de asparagina [Wright, H.T. Crit. Rev. Biochem. and Mol. Biol., 26:1 (1952)]

Estudos com inibidores: Avaliou-se a potência de diversos inibidores competitivos da sialidase, utilizando a enzima purificada e compararam-se os seus valores de K± com os de sialidases de outras fontes (Fig. 6, TABELA IV) . O inibidor microbiano de sialidase, bem conhecido, Neu5Ac2en, era um inibidor potente da sialidase de células CHO, dando um Ki de cerca de 10 μΜ. Os derivados de Neu5Ac2en que contêm substituintes em vez do grupo C-9-hidroxilo foram também avaliados como inibidores da enzima. As modificações incluindo substituição com grupos azida e nitrofenilazida, originaram 9-azido-Neu5Ac2en e 9-PANP-Neu5Ac2en, respectivamente (Fig. 6). Em contraste com a sialidase lisossómica e da membrana plasmática, que eram fortemente inibidas por ambas as 46 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ moléculas de Neu5Ac2en modificadas, a sialidase de células CHO é moderadamente inibida por 9-azido-Neu5Ac2en (Ki = 45 μΜ), e fracamente inibida por 9-PANP-Neu5Ac2en (Ki = 300 μΜ) . Uma análise prévia da sialidase citosólica de músculo de rato, originou resultados semelhantes aos obtidos com a sialidase de células CHO (Warner, T.G. Louie, A., Potier, M. e Ribeiro, A. (1991) Carbohydr. Res., 215:315)

TABELA IV

Constantes de inibição para sialidase de células CHO e derivados Neu5Ac2ena K± (μΜ) Fonte de sialidase Localização celular Neu5Ac2en 9-azido Neu5Ac2en 9-S-PANP Neu5Ac2en Células de ovário de hamster chinês citosol? 10 45 300 Músculo de ratoD citosol 10 50 NIC Fibroblastos0 Lisossoma 10 10 10 Células de rim transformadas com Adenovirusb Membrana plasmática 10 10 10 a A sialidase foi testada com 4-MU-Neu5Ac2en como substrato e as constantes de inibição foram determinadas como descritos em Métodos. b retirado de dados anteriormente publicados (veja-se Warner T.G. Brochem. Biophys. Res. Commun, 148:1323 (1987); Warner T.G. et al. Carbohydr. Res., 215:315 (1991) CNI = não inibido. As experiências cinéticas anteriores não foram realizadas a uma concentração de inibidor suficientemente elevada para determinar valores de Ki acima de 50 μΜ.

EXEMPLO 3: Detecção de anticorpos de sialidase em homogenatos de células CHO A sialidase descrita foi purificada a partir do fluido da cultura de células de uma única linha celular de produção (CHO 14.16) e os lisados desta, e também de outras células CHO, foram analisados quanto à presença de enzima, de forma a obter informação acerca da frequência de expressão na linhagem celular de CHO. Utilizaram-se imunoensaios, pois os ensaios enzimáticos directos dos homogenatos celulares para sialidase poder-se-ão tornar complicados devido à presença de sialidase lisossómica e talvez de outras sialidases celulares, que poderão ter actividade na gama de pH neutro.

Como um primeiro passo no sentido de produzir anticorpos anti-sialidase, digeriu-se a sialidase purificada com tripsina e sequenciaram-se os péptidos trípticos resultantes. A figura 8 mostra as sequências de 11 péptidos tripticos de sialidase. Comparando a sequência de aminoácidos dos 47 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ fragmentos trípticos com as sequências de sialidases microbianas e outras proteínas de mamífero, utilizando bases de dados de sequências, não foram encontradas semelhanças de sequência significativas para o péptido 11 (Fig. 8).

Prepararam-se anticorpos altamente específicos para um péptido sintético com a sequência de aminoácidos do péptido 11 CRVQAQSPNSGLDFQDN (SEQ ID NO 13) e utilizaram-se na determinação da presença de sialidase em análise de imunotransferência de extractos celulares, (Fig. 7). A enzima purificada originou um sinal forte a cerca de 43 kD com o anticorpo do péptido. Obteve-se um resultado semelhante com extractos celulares da linha celular CHO 14.16 e extractos de diversas outras pistas celulares de CHO. Estes resultados demonstram que a sialidase de células CHO não se limita à linha celular específica utilizada para a sua purificação. No entanto, os níveis de sialidase variam ligeiramente entre diferentes pistas celulares. EXEMPLO 4: Síntese de sondas oligonucleótídicas 0 carácter único da Seq ID. No. 11 torna-a útil a construção de uma sonda oligonucleotídica para o gene de sialidase a ser utilizado na técnica de "sonda longa", como descrito em Ullrich, A. Berman, C.H. Dull, T.J. Gray, A. e Lee, J.M., The EMBO Journal 3, no. 2, 361-364 (1984), também na EP Pub. 128,042 publicada em 12 de DEZ 1984. Esta técnica requer a síntese de uma única sonda que possui uma sequência nucleotídica que é uma das muitas sequências possíveis que codificam para sequências de aminoácidos (tais como a sonda que se baseia na sequência de aminoácidos do péptido 11, Fig. 8).

Sintetiza-se um oligonucleótido utilizando o método de Crea, R. e Horn. T., Nucleic Acids Research, 8, 2231 (1908). O oligonucleótido é sintetizado num suporte sólido de celulose por adição sequencial de blocos de monómeros, dímeros ou trímeros totalmente protegidos. O polímero nucleotídico final é tratado com base (amoníaco conc. aq.) e ácido (ácido acético aq. a 80%) para libertar o oligonucleótido do polímero, o polímero é removido por centrifugação e o sobrenadante que contém o oligonucleótido é evaporado até à secura. O resíduo, dissolvido em amoníaco aq. a 4%, é lavado com éter (3x) e utilizado para o isolamento do fragmento totalmente 48 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ desprotegido. A purificação é conseguida num gel de poliacrilamida a 15% e recuperação por electroeluição e precipitação com etanol. EXEMPLO 5: ADN gue codifica para sialidase isolado a partir de uma biblioteca genómica.

Prepara-se ADN de células de ovário de hamster Chinês de acordo com o processo de Blin e Stafford, Nucleic Acid Research, 3:2303 (1976) e submete-se a digestão não limitada com as endonucleases de restrição HaelII e Alui. Os produtos são fraccionados por tamanho por centrifugação em gradiente de sacarose. Veja-se Maniatis et al., Cell, 15:1157 (1978). Isolam-se fragmentos grandes (15-20 kb) e tratam-se com metilase EcoRI a fim de tornar os locais de EcoRI no ADN, resistentes a clivagem com EcoRI. As moléculas de ADN dodecaméricas sintéticas que possuem um local de clivagem EcoRI (ligantes de EcoRI) são ligadas ao ADN metilado e digeridas com EcoRI, para produzir extremidades coesivas EcoRI. Após nova selecção por tamanho (15-20 kb) o ADN é adequado para inserção no vector de clonagem bacteriófago, Charon 4A (ÀCH4A)

Pode-se inserir ADN estranho no vector ÀCH4A após remoção de dois fragmentos EcoRI internos, que contêm genes não essenciais para a fase de crescimento. Os dois "braços" do ADN de bacteriófago são hibridados através das suas extremidades coesivas de 12 pares de bases e unidos ao ADN por ligação das extremidades coesivas EcoRI. A reacção de ligação é realizada a uma concentração de ADN elevada, para promover a formação de moléculas de ADN concateméricas longas, que são os substratos para o empacotamento in vitro. Amplificam-se aproximadamente 1 x 106 fagos empacotados in vitro, 106 vezes, por crescimento de baixa densidade em placas de ágar, a fim de estabelecer uma biblioteca permanente de fragmentos de ADN clonados.

Pesquisa da biblioteca genómica A biblioteca de HaelII-Alu é pesquisada utilizando a técnica de hibridação de placas in situ de Benton e Davis, Science, 196:180 (1977). Plaqueiam-se 100 000 fagos recombinantes em 3,1 x 108 células bacterianas em fase exponencial em placas de Petri NZCYM de 15 cm. A fim de evitar que o ágar de topo adira ao filtro de nitrocelulose quando 49 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ este é levantado da placa (o que tende a aumentar a hibridação de ruído de fundo), secam-se as placas num incubador a 37°C durante várias horas ou deixam-se durante a noite para escorrer o excesso de líquido. A utilização de agarose a 0,7 porcento, em vez de ágar, na camada de topo de ágar também minimiza este problema. As placas são incubadas a 37°C durante 14-16 horas, altura em que as placas estão confluentes. As placas são refrigeradas durante uma hora ou mais antes da aplicação dos filtros. Os filtros de nitrocelulose (tamanho de poro 0,45 |fm) ajustam-se facilmente numa placa de ágar. O fago e o ADN são adsorvidos nestes filtros em duplicado, la e lb, 2a e 2b, etc., colocando dois filtros em cada placa sequencialmente, 5 min. para cada à temperatura ambiente. Fazem-se pequenos buracos com uma agulha cheia com tinta para orientar os filtros nas placas. O ADN é desnaturado e ligado aos filtros como descrito por Benton e Davis, supra. A fim de preparar os filtros para hibridação com uma sonda sintética marcada, estes são molhados em cerca de 10 ml por filtro de 5X SSC, 5X solução de Denhardt (5X solução de Denhardt = 0,1 % de albumina de soro bovino, 0,1 porcento de polivinilpirrolidona, 0,1 porcento de Ficoll), Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm., 23:641 (1966), 50 mg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado, 0,1 porcento de pirofosfato de sódio e 2 porcento de formamida. Os filtros são pré-hibridados com agitação contínua a 42°C durante 14-16 horas. Os filtros são hibridados com agitação a 42°C em solução de pré-hibridação, que contém uma sonda de hibridação marcada com 32P. A sonda sintética para sialidase é marcada utilizando o processo de Taylor et al. Biochem. Biophys Acta, 442:324 (1976). Após hibridação, os filtros são lavados 6X com agitação em cerca de 15 ml por filtro de 0,1 porcento de SDS, 0,1 porcento de pirofosfato de sódio, 0,2X SSC a 37°C durante 45 min. Os filtros são transferidos a seco, montados num quadro e expostos a filme de raios-X Kodak XR5 com filtros de intensificação Dupont Cronex 11R Xtra Life Lightning-plus a -70°C durante 1-2 dias.

Purificação de placas fágicas recombinantes

Escolhem-se placas fágicas da região de uma placa correspondente a um positivo num autorradiograma e suspendem-se em 0,5 ml PBS (0,05 porcento de gelatina, NaCl 0,10 M, Tris 0,01 M pH 7,4, MgCl2 0,01M). A suspensão de fagos 50 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ é titulada e a placa que contém cerca de 1000 placas fágicas é analisada de novo. O processo de escolha de positivos e nova pesquisa é repetido, até 90 porcento das placas fágicas numa placa darem sinais positivos após pesquisa. Suspendem-se os fagos individuais em 1,0 ml de PBS a 3 7°C durante 2 horas. Adicionam-se 50 μΐ de suspensão a 0,2 ml de células bacterianas em fase exponencial + 0,2 ml de MgCl2 10 mM, CaCl2 10 mM e a cultura é incubada a 37°C durante 15 min. A cultura é em seguida adicionada a 50 ml de meio NZYDT e incubada a 37°C durante 14-16 horas. Adiciona-se clorofórmio e 3 g de NaCl e removem-se as bactérias por sedimentação durante 15 min a 5000 rpm. Adicionam-se 3,5 g de polietilenoglicol ao sobrenadante e incuba-se a mistura lh a 0°C. O fago precipitado é em seguida sedimentado por centrifugação durante 20 minutos a 5000 rpm. A pelete é ressuspensa em 2 ml de PBS + 1,0 g de CsCl e colocada sobre camadas de 0,9 ml de 1,7, 1,5 e 1,45 g/ml de CsCl em PBS. O gradiente é submetido a rotação a 25 000 rpm num rotor Sorvai 50 Ti durante 3 h. A banda do fago é recolhida e dialisada 14-16 h contra NaCl 0,1M, Tris-Cl 50 mM (pH 7,5) e MgSCh 10 mM. O ADN do fago é extraído com fenol equilibrado com tris 10 mM, EDTA 1 mM. Remove-se o fenol com clorofórmio e precipita-se o ADN com etanol a 100 porcento. Ressuspende-se o ADN em água e digere-se com EcoRI a 3 7°C. O ADN digerido é corrido num gel de agarose a 1 porcento. A análise de hibridação de transferência dos fragmentos de ADN digeridos é realizada como descrito por Southern, J. Mol. Biol., 98:503(1975). Utilizam-se sondas nestes filtros sob as mesmas condições que para a biblioteca de fagos, com a sonda do gene de sialidase sintética. O fragmento que híbrida é clonado em M13 (ATCC 15669-B1). Os levantamentos das placas fágicas são realizados como anteriormente descrito e o ADN é produzido a partir das placas fágicas de hibridação. O ADN que é isolado pelos processos anteriores codifica para a sialidase e quando expresso em células hospedeiras recombinantes produz a proteína sialidase. A expressão da proteína sialidase recombinante é facilmente determinada , por exemplo, utilizando um ensaio de sialidase fluorescente descrito supra. O ADN que codifica para sialidase é sequenciado utilizando a técnica de Maxam e Gilbert, descrita em Methods in Enzymology (1980) 65 (parte 1), 497-559. 51 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ A transcrição de ADN que codifica para sialidase produz ARNm para utilização na síntese de ADNc que não possui quaisquer intrões. 0 ADNc é sintetizado como descrito em Maniatis et al., Molecular Cloning - a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory. EXEMPLO 6: Produção de células recombinantes em que um gene constitutivo de sialidase não é expresso de forma funcional, por recombinação homóloga. A técnica aqui utilizada está descrita na totalidade no pedido de Patente Internacional WO 91/01140.

Um vector para utilização na inactivação da expressão de sialidase funcional, é construído a partir de um fragmento de restrição do ADN que codifica para a sialidase obtido no Exemplo 5. O fragmento de restrição não possui uma parte do gene de sialidase de modo que a sua expressão não conduza à produção de uma sialidase funcional. O fragmento de restrição é clonado no plasmídeo pBR322 e introduz-se um gene marcador seleccionável no fragmento.

Introduz-se ADN que compreende o gene de sialidase defeituoso e um gene marcador seleccionável em células de ovário de hamster Chinês, por microinjecção. (Capecchi, Cell, 22, 479-488 (1980)) e as células são crescidas em meio selectivo para o marcador. O crescimento no meio estabelece que o gene de sialidase defeituoso foi integrado no genoma das células. As células de colónias que crescem são isoladas e analisadas, para identificar aquelas em que ocorreu a integração do gene de sialidase defeituoso por recombinação homóloga com o gene do tipo selvagem, em oposição à integração por recombinação não-homóloga noutro local do genoma. Isto é efectuado utilizando sondas oligonucleotídicas para a inserção, um ensaio de transferência Southern e depois a sequenciação das regiões 5' e 3' do ADN obtido, para a presença de uma sequência que codifica para sialidase, que se estenda para além do ADN inserido.

As células que apresentam inactivação de uma cópia do gene de sialidase são utilizadas para inactivação da segunda cópia. 52 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ A introdução de um gene de sialidase defeituoso com um marcador seleccionável é repetida. As células em que ambas as cópias do gene de sialidase foram inactivadas são identificadas pela ausência de expressão funcional de actividade de sialidase, determinada através da utilização do ensaio de sialidase fluorescente descrito supra. EXEMPLO 7: Produção de células recombinantes em que um gene constitutivo de sialidase não é expresso de forma funcional, utilizando ARN de orientação inversa

Insere-se ADN que codifica para sialidase num vector de expressão de mamifero, sob o controlo de um promotor que assegura a transcrição da cadeia de ADN, a qual não é a cadeia transcrita em ARNm. 0 vector é introduzido nas células de ovário de hamster Chinês sob condições em que a transcrição ocorre. A actividade de sialidase é testada utilizando técnicas de fluorescência utilizadas nos exemplos anteriores. É encontrada muito pouca ou nenhuma actividade de sialidase, como resultado da interacção de ARN de orientação inversa com o ARNm de sialidase. A actividade constitutiva de sialidase é danificada de forma a que não exista uma expressão funcional. EXEMPLO 8: Expressão de glicoproteína recombinante

As células produzidas como no Exemplo 6 e Exemplo 7 são transformadas utilizando uma técnica descrita supra com um vector de expressão recombinante que compreende ADN que codifica para a glicoproteína desejada. A glicoproteína é expressa e verifica-se que tem cadeias laterais de carbo-hidratos intactas, e que os resíduos de ácido siálico não foram clivados. EXEMPLO 9: Clonagem e expressão do gene de sialidase Purificação da sialidase

Purificou-se a enzima sialidase de células CHO como descrito no Exemplo 1, com a excepção de que as duas fracções de actividade de enzima que foram obtidas no passo de cromatografia de permuta aniónica em S-Sepharose não foram combinadas. A fracção que elui da coluna de S-Sepharose a uma concentração de sal mais elevada ("fracção 2"), com um pi estimado como sendo de cerca de pH = 7,0 foi processada 53 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ independentemente, através de passos de purificação subsequentes descritos no Exemplo 1. Obteve-se assim uma preparação de enzima sialidase de células CHO purificada, obtida a partir da fracção 2 e utilizou-se como fonte de péptidos para análise da sequência de aminoácidos.

Seguenciação de péptidos A análise de sequência do terminal amino foi realizada por deqradação de Edman utilizando o sequenciador Applied Biosystems 477A/120A. Não se observaram nenhuns sinais quando se submeteu a proteína intacta à análise de sequência, indicando que o terminal amino estava bloqueado. Deste modo, a sialidase foi tratada com várias proteases para produzir péptidos para sequenciação. Antes da digestão com protease, a enzima foi reduzida e S-carboximetilada (RCM) com ácido iodoacético, como descrito em Harris et al. Eur. J. Biochem. , 188:291 [1990]. Após tratamento RCM, submeteram-se três amostras separadas de 20pg da sialidase (465 pmol) a degradação proteolítica utilizando TPCK-tripsina (Worthington, Inc. Freehold, NJ) , Lisina C-endoproteinase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) e protease V8 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), respectivamente. Em cada caso, a concentração de protease foi ajustada para ser cerca de 1/20 da quantidade de sialidase presente na amostra.

Após digestão, isolaram-se os péptidos resultantes por HPLC de fase inversa numa coluna de sílica C18 Vydac, 2,1 x 250 mm (The Separations Group, Inc. Hesperia, CA). A eluição da coluna e detecção dos péptidos foi realizada como referido por Harris et al., Biochemistry, 32:6539 [1993]. Submeteram-se alíquotas de várias fracções de péptidos a análise de sequência N-terminal. As sequências de aminoácidos determinadas para os péptidos são apresentadas na Figura 9. Nalguns casos, a identidade do péptido foi ainda confirmada através da determinação do peso molecular do fragmento, utilizando análise de espectro de massa, utilizando um instrumento de electropulverização/quadropolo PE sciex API III (Perkin Elmer, Ontario canada), que estava a operar no modo positivo.

Preparação de uma sonda oligonucleotídica derivada por PCR

Obteve-se uma sonda oligonucleotídica única que codifica para uma porção da sequência de sialidase, como um produto de 54 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ reacção PCR, utilizando ADNc de cadeia simples de células CHO como molde e iniciadores de síntese de oligonucleótidos sintéticos degenerados, deduzidos a partir da sequência de aminoácidos de dois dos péptidos derivados proteoliticamente. Isolou-se ARN Poli(A)+ (5pg) a partir de cerca de 108 células CHO em fase log, utilizando o estojo de ARNm Fast Track™ (Invitrogen, Inc. San Diego, CA) e converteu-se em ADNc de cadeia simples, utilizando iniciadores de síntese de hexadesoxinucleótidos aleatórios e transcriptase inversa de murídeo (Pharmacia, Piscataway, NJ).

Prepararam-se iniciadores oligonucleotídicos sintéticos totalmente degenerados, com base na sequência de aminoácidos do péptido LC18 derivado de lisina C. A sequência de LC18 era uma composição de péptidos trípticos TP14 e TP17 e é aqui designada por TP14/17. Os iniciadores que codificam a extremidade 5' do péptido foram alongados, de forma a conter um local de reconhecimento da endonuclease de restrição Xbal e uma sequência adicional tetranucleotídica, de modo a melhorar o reconhecimento do local pela endonuclease Xbal. De um modo semelhante, os iniciadores de síntese que codificam para a extremidade 3' do péptido foram alongados de modo a conter um local de reconhecimento da endonuclease de restrição HindIII e uma sequência tetranucleotídica adicional, para permitir um melhor reconhecimento desse local pela endonuclease HindIII. 0 conjunto de iniciadores oligonucleotídicos de sentido directo (5'GTCATCTAGAACNGAYGARCAYGCNGAY3')(SEQ ID NO. 1), codifica para os seis resíduos de aminoácidos na extremidade 5' de TP14/17 e o conjunto de iniciadores de anti-sentido (5'CTAGAAGCTTNGTNACNACYTCYTCNGCYTG3')(SEQ ID NO. 2) codifica para os sete aminoácidos da extremidade 3' de TP14/17. (Nas sequências dos iniciadores oligonucleotídicos acima identificados, "R" representa A ou G, "Y" representa C ou T, "W" representa A ou T, "S" representa C ou G e "N" representa qualquer nucleótido)

Utilizando ADNc de cadeia simples como molde (6% da mistura reaccional de síntese de ADNc ou cerca de 2 μρ de ADNc), realizou-se amplificação por PCR utilizando ADN-polimerase AmpliTaq™ (Perkin-Elmer Cetus) fazendo 35 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 42°C e 5 min a 72°C, com um passo de alongamento final durante 5 min a 72°C, utilizando um ciclizador térmico de ADN, molde 480 (Perkin-Elmer-Cetus, Emeryville, CA). Utilizando iniciadores de orientação directa 55 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ e inversa ΤΡ14/17, obtiveram-se vários produtos de reacção, incluindo um fragmento de 113 pares de bases que era esperado que codificasse para o péptido TP14/17 inteiro, incluindo as extensões dos locais de restrição. 0 produto da reacção PCR de 113 pb, PCR 14/17, foi resolvido num gel de poliacrilamida a 1% e posteriormente purificado, esmagando a fatia de poliacrilamida contendo a banda de PCR 14/17 e embebendo-a em tampão Tris durante a noite. Após remoção dos contaminantes do gel por filtração em gel, ligou-se o fragmento de ADN ao plasmídeo pUC19 linearizado, por ligação com ADN-ligase de T4 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) . Transformaram-se células de E. coli C600 com a mistura de ligação e cresceram-se em placas de ágar com ampicilina (50 μρ/ιηΐ). Purificou-se ADN plasmidico a partir de várias colónias bacterianas resultantes, resistentes a ampicilina e determinou-se a sequência nucleotídica do ADN inserido em cada uma.

Verificou-se que o ADN inserido em cada um dos plasmideos codifica para uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do péptido LC18. No entanto, a sequência de nucleótidos do ADN inserido variava entre os diferentes plasmideos isolados, nas posições dos codões nas extremidades 5' e 3' dos ADN inseridos designadas por posições oscilantes ("wobble").

Preparação de sonda radiomarcada

Prepararam-se dois oligonucleótidos sintéticos, cada um com 57 nucleótidos de comprimento, com base na sequência do produto de PCR que possuía o maior teor de timidina nas posições oscilantes ("wobble") nas extremidades 5' e 3' do produto de PCR de 113 pb, PCR 14/17. Os dois oligonucleótidos tinham sequências parcialmente sobreponíveis, de modo a permitir a hibridação por complementaridade entre elas, e compreender em conjunto a sequência nucleotídica apresentada na figura 10. A fim de preparar uma sonda de cadeia dupla para pesquisa de uma biblioteca, misturou-se ^g de cada um dos oligonucleótidos e hibridaram-se a 45°C e a sonda foi tornada radioactiva utilizando uma reacção de preenchimento com ADN-polimerase Klenow (New England Biolabs, Boston, MA) utilizando gama-nucleótidos marcados com 32P (5000 Ci/mmol;

Amersham, Arlington., Heights, IL). A sonda marcada foi 56 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ separada dos nucleótidos não incorporados por filtração em gel, utilizando colunas de cromatografia Bio-Spin™ (Bio-Rad, Richmond CA) . A actividade especifica da sonda PCR 14/17 resultante foi estimada como sendo cerca de 106 dpm/pmol.

Pesquisa de uma biblioteca de ADNc de células CHO

Plaqueou-se uma biblioteca de ADNc -lambda gt 10 de células de ovário de hamster Chinês (JL 1001a, obtido de Clontech Laboratories, Paio Alto, CA) em células E. coli C600 crescidas em placas de ágar e as placas fágicas resultantes foram pesquisadas utilizando métodos convencionais de hibridação de placas fágicas. Pesquisaram-se aproximadamente 450 000 placas fágicas utilizando a sonda PCR 14/17 marcada radioactivamente. Uma das placas fágicas, designada por clone 15, originou um sinal de hibridação forte com a sonda e foi escolhida para posterior caracterização.

Subclonagem e análise de sequência de nucleótidos O ADN de bacteriófago do clone 15 foi isolado de lisados de culturas plaqueadas ou culturas liquidas de células de E. coli infectadas. O ADN foi digerido com a endonuclease de restrição EcoRI e analisado por electroforese num gel de agarose a 1%. O fragmento de ADNc de 1,4 kb foi extraído a partir da fatia de agarose utilizando o estojo de isolamento de ADN, Geneclean™ (BiolOl, La Jolla, CA) , tratado com fosfatase alcalina bacteriana e em seguida ligado ao plasmídeo pUC19 linearizado, por ligação com ADN-ligase de T4. As células de E. coli C600 foram transformadas com a mistura de ligação e foram crescidas em placas de ágar com ampicilina (150 μρ/ιηΐ) . Purificou-se o ADN de plasmídeo de duas colónias bacterianas resistentes a ampicilina resultantes, e determinou-se a sequência de nucleótidos do ADN inserido, em cada uma. A sequência de nucleótidos é apresentada na Figura 10 . EXEMPLO 10: Expressão de sialidase de células CHO em células de insecto

Construção de vector recombinante e transfecçao A expressão do ADNc de sialidase foi realizada utilizando um sistema de vector de expressão de baculovírus modificado (BaculoGold™, Pharmingen, Inc. San Diego, CA) e células de 57

ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ ovário de insecto de Spodoptera frugiperda (células Sf9), como hospedeiro. A inserção de ADNc do clone 15 foi libertada a partir do plasmideo pUC19 recombinante por tratamento com as endonucleases de restrição BglII e EcoRI. A clivagem no local único de BglII resultou na deleção dos primeiros 174 nucleótidos no terminal 5' da inserção de ADNc, com retenção do codão ATG na posição 187 (Figura 10) . O ADNc truncado foi ligado no local de clonagem múltipla do vector de transferência pVL1392 (Pharmingen, Inc, San Diego, CA) ) . As células de E. coli C600 foram transformadas com a mistura de ligação e as células transformadas foram crescidas em culturas liquidas de pequena dimensão. O plasmideo recombinante resultante, pl392S, foi purificado a partir de culturas de células utilizando processos convencionais. Obtiveram-se cerca de 135 μρ de ADN de pl392S

Co-transfectaram-se 2 x 106 células Sf9 com uma mistura de 5 μρ de ADN de 1392S e 0,5 μρ de ADN de vírus BaculoGold™, como descrito pelo fabricante. Após quatro dias de crescimento, recolheram-se as células Sf9 por centrifugação, romperam-se por adição de 50 μΐ de solução aquosa de saponina a 2% (Sigma) e pesquisou-se quanto à presença de sialidase de células CHO, utilizando análise de imunotransferência. O virus BaculoGold™ contém uma deleção letal no gene da poli-hedrina que pode ser apenas evitada por recombinação homóloga com o vector de transferência. Com este sistema, a frequência de recombinação por co-transfecção é quase 100%. Deste modo, o fluido da cultura de células, das células transfectadas serve como fonte do novo vírus recombinante formado, directamente, sem qualquer amplificação e purificação adicionais por selecção de placas fágicas.

Detecção de sialidase de células CHO recombinantes em células Sf9 transfectadas, por análise de imunotransferência A expressão de sialidase em células de insecto foi determinada por análise de imunotransferência de proteínas presentes em homogenatos das células Sf9 transfectadas. O anti-soro utilizado nestas experiências foi criado contra um péptido sintético cuja sequência foi produzida com base na sequência parcial de aminoácidos do péptido TP8 (Fig. 9), como descrito por Warner et al. , Glycobiology, 3:455[1993] . 58 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Separaram-se amostras de proteínas de células Sf9 transfectadas, por electroforese em géis de SDS-poliacrilamida sob condições desnaturantes e em seguida transferiram-se electroforeticamente para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Immobilon). Incubou-se a membrana com um anti-soro anti-péptido e a proteína sialidase imunorreactiva foi detectada utilizando um anticorpo secundário anti-coelho de cabra, conjugado com peroxidase de rábano e substrato 4-cloronaftol. Este exemplo demonstra a utilidade do presente invento para a produção de sialidase em células hospedeiras recombinantes.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Genentech, Inc. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Sialidase de células CHO por tecnologia de ADN recombinante (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS : 26

(iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO: Genentech, Inc. (B) RUA: 460 Point San Bruno Blvd (C) CIDADE: South San Francisco (D) ESTADO: Califórnia (E) PAÍS: E.U.A. (F) ZIP: 94080 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete de 360 kB, 5,25 polegadas

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: patin (Genentech) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: 08/062586 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 17 de Maio de 1993

(viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE 59 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ (Α) ΝΟΜΕ: Johnston, Sean A. (Β) NÚMERO DE REGISTO: P35,910

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 826P1PCT

(xi) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES (A) TELEFONE: 415/225-3562 (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 28 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.1: GTCATCTAGA ACNGAYGARC AYGCNGAY 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 31 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.2: CTAGAAGCTT NGTNACNACY TCYTCNGCYT G31 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.3:

Vai Vai Tyr Leu Asn Ala Arg 1 5 7 60 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.4

Val Gin Ala Gin Ser Pro Asn Ser Gly Leu Asp Phe Gin Asp Asn 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.5

Glu Thr Leu Phe Gin Thr Gly Asp Tyr Ala Tyr Arg 1 5 10 12 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.6

Ile Pro Ala Leu Ile Tyr Leu Ser Lys 15 9 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.7

Ala Asp Ala Leu Asp Val Trp Leu Leu Tyr Thr Kis Pro Thr Asp 15 10 15

Ser Arg 17 61 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.8:

Glu Thr Leu Phe Gin Thr Gly Asp Tyr Ala Tyr Arg Ile Pro Ala 15 10 15

Leu Xle Tyr Leu Ser Lys 20 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.9:

Leu Gly His Phe Vai Ser Gin Asn Ser Leu Glu 1 5 10 11 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 43 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.10

Vai Gly Pro Gly His Cys Leu Gin Leu Arg Asn Thr Ala Gly Ser 1 5 10 15

Leu Leu Vai Pra Ala Tyr. Ala Tyr Arg Lys Gin Pro Pro Ile His 20 25 30

Xaa Pro Ala Pro Ser Ala Phe Xaa Phe Leu Ser His Asp 35 40 43 62 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 51 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.11 His His Gin Leu Gin Thr Gly Vai Asn Vai Thr Arg Leu Cye His 15 10 15

Ile Thr Ser Thr Asp His Gly Lys Thr Trp Ser Ala Vai Gin Asp 20 25 30

Leu Thr Asp Thr Thr Ile Gly Ser Ser Asp Gin Asp Xaa Ala Xaa 35 40 45

Phe Gly Vai Gly Pro Phe 50 51 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.12

Thr Asp Glu His Ala Asp Leu Phe Vai Leu Arg Arg Gly Ser Tyr 15 10 15

Asn Ala Asp Thr His Gin Vai Gin Trp Gin Ala Glu Glu Vai Vai 20 25 30

Thr 31 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.13

Cys Arg Vai Gin Ala Gin Ser Pro Asn Ser Gly Leu Asp Phe Gin 1 5 10 15

Asp Asn 17 63 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.14

Vai Gin Ala Gin Ser Pro Asn Ser Gly Leu Asp Phe Gin Asp Asn 15 10 15

Xaa Gly Vai Ser Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.15

Thr Asp Glu His Ala Asp Leu Phe Vai Leu Arg 1 5 10 11 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.16

Gly Ser Tyr Asn Ala Asp Thr His Gin Vai Gin Xaa Gin Ala Glu 1 S 10 15

Glu Vai Vai Thr 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ 6 4 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.17

Lys Gin Pro Pro Ile His Xaa Pro Ala Pro Ser Ala Phe Xaa Phe l 5 10 15

Leu Ser His Asp 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.18

Ala Asp Ala Leu Asp Vai Trp Leu Leu Tyr Thr His Pro Thr Asp 15 10 15

Ser Arg 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.19

Ala Asp Ala Leu Asp Vai Trp Leu Leu Tyr Thr His Pro Thr Asp 15 10 15

Ser Arg Lys 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.20

Thr Asp Glu His Ala Asp Leu Phe Vai Leu Arg Arg Gly Ser Tyr 1 5 10 IS

Asn Ala Asp Thr His Gin Vai Gin Xaa Gin Ala Xaa Glu Vai Vai 20 25 30 65 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 28 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.21

Thr Trp Ser Ala Vai Gin Asp Leu Thr Asp Thr Thr lie Gly Ser 15 10 is

Ser Asp Gin Ala Xaa Ala Xaa Phe Gly vai Gly Pro Phe 20 25 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 22

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.22

Kis Ala Asp Leu Phe Vai Leu Arg Arg Gly Ser Tyr Asn Ala Asp 15 10 15

Thr Kis Gin Vai Gin Trp Gin Ala 20 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 23

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.23

Kis Kis Gin Leu Gin Thr Gly Vai Asn Vai Thr Arg Leu Cys His 15 10 15 lie Thr Ser Thr Asp His Gly Lys Thr Xaa Ser Ala Vai Gin 20 25 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 24

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 35 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 66 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.24

Vai Gly Pro Gly His Cys Leu Gin Leu Arg Asn Thr Ala Gly Ser 15 10 IS

Leu Leu Vai Pro Ala Tyr Ala Tyr Arg Lys Gin Pro Pro Ue His 20 25 30

Xaa Pro Ala Pro Ser 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 25

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1366 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.25 CGGGGGATGG ATCATCTGCA GGGCCTCGGT TAAAAGTGAG AAAAGCCGGT 50 CCTCCCTTCT CCATTTGGAT TACAAGCTCA AAGGGACTGC TTATAACCTG 100 67 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ GAGGAATGAT CTCCGTGCTC CCGGGGGGAG «ACTGC0CAC ACFTACGCGCA 150 TAGAGAGGCT TTGAGAGGAA TTAAGATCTC AGGCCCATGG CGACTTGCCC 200 TGTCCTGCAG AAGGAGACGC TATTCCAGAC AGGAGACTAT GCTTACAGAA 250 TCCCTGCTCT GATCTACCTG TCAAAG CAGA AGACCCTGCT GGCCTTTGCG 300 GAAAAGCGTC TGACCAAGAC GGATGAGCAT GCAGATTTGT TTGTCCTACG 3S0 AAGAGGAAGC TACAATGCAG ACACCCATCA GGTCCAGTGG CAAGCTGAGG 400 AGGTGGTGAC CCAAGCCTAC CTGGAGGGCC ACCGCTCCAT GAGCCCATGT 450 CCTTTGTATG ACAAGCAGAC AAGGACCCTT ttccttttct TCATCGCTGT 500 CCGTGGGCAA ATATCAGAAC ACCACCAGCT CCAGACTGGG GTTAATGTCA 550 CACGGCTATG CCACATCACC AGTACTGACC ATGGGAAGAC CTGGAGCGCT 600 GTCCAGGACC TTACAGATAC CACCATTGGC AGCACCCATC AGGATTGGGC 650 CACATTTGGC GTGGGTCCTG GGCACTGTCT GCAGCTGCGA AACACAGCTG 700 GGAGCCTGCT GGTCCCTGCT TATGCCTATC GGAAACAACC CCCTATCCAT 750 GCACCTGCCC CCTCTGCCTT CTGCTTCCTC AGCCATGACC ATGGGAGCAC 800 ATGGGAGCTG GGCCACTTTG TGTCCCAGAA CTCGCTGGAG TGCCAGGTGG 850 CTGAGGTTGG CACTGGCGCT GAGAGGGTGG TCTATCTCAA TGCTAGGAGC 900 TGCCTGGGAG CCAGGGTCCA GGCACAAAGT CCTAACAGTG GCCTGGATTT 950 CCAGGACAAC CAGGTAGTGA GTAAACTTGT AGAGCCTCCC AAAGGCTGCC 1000 n a uunnvj 4U1 MIVTV^ WWWtWByi UA l 1Í11L CCCAACCCCA CCTCAAAGGC AGATGCCTTÃ 10S0 GATGTGTGGC TGCTCTATAC CCACCCTACA GACTCCCGGA AGAGGACCAA 1100 CCTGGGTGTG TACCTCAATC AGAAGCCACT GGACCCCACC ACCTGGTCAG 11S0 CTCCCACCCT GTTGGCAACA GGCATCTGTG CCTACTCGGA CTTGCAGAAC 1200 ATGGGGCACG GCCCTGATGG CTCCCCGCAA TTTGGGTGTC TGTATGAGTC 1250 AAATAACTAT GAAGAGATTG TTTTCCBOATi GTTCAGGCT€ AAGCAAGCTT 1300 TCCCAGCAGT GTTTGGTGCC CAGTGAT^TT GCTGCSTGCCGCCCAAAGTG 1350 CTTCAAAACC CCCCCG 1366 68 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 26

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 379 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.26

Met Ala Thr Cys Pro Vai Leu Gin Lys Glu Thr Leu Phe Gin Thr 1 S 10 · 15

Gly Asp Tyr Ala Tyr Arg lie Pro Ala Leu Xle Tyr Leu ser Lys 20 25 30

Gin Lys Thr Leu Leu Ala Phe Ala Glu Lys Arg Leu Thr Lys Thr 35 40 45

Asp Glu His Ala Asp Leu Phe Vai Leu Arg Arg Gly Ser Tyr Asn 50 55 60

Ala Asp Thr His Gin Vai Gin Trp Gin Ala Glu Glu Vai Vai Thr 65 70 75

Gin Ala Tyr Leu Glu Gly His Arg Ser Met Ser Pro Cys Pro Leu 80 85 50

Tyr Asp Lys Gin Thr Arg Thr Leu Phe Leu Phe Phe Ile Ala Vai 95 100 105

Arg Gly Gin Ile Ser Glu His His Gin Leu Gin Thr Gly Vai Asn 110 115 120

Vai Thr Arg Leu Cys His Ile Thr Ser Thr Asp His Gly Lys Thr 125 130 135

Trp Ser Ala Vai Gin Asp Leu Thr Asp Thr Thr Ile Gly Ser Thr 140 145 150

His Gin Asp Trp Ala Thr Phe Gly Vai Gly Pro Gly His Cys Leu 155 160 165

Gin Leu Arg Asn Thr Ala Gly Ser Leu Leu Vai Pro Ala Tyr Ala 170 175 180

Tyr Arg Lys Gin Pro Pro Ile His Ala Pro Ala Pro Ser Ala Phe 185 190 195

Cys Phe Leu Ser His Asp His Gly Ser Thr Trp Glu Leu Gly His 200 205 210

Phe Vai Ser Gin Asn Ser Leu Glu Cys Gin Vai Ala Glu Vai Gly 215 220 225

Thr Gly Ala Glu Arg Vai Vai Tyr Leu Asn Ala Arg Ser Cys Leu 230 235 240

Gly Ala Arg Vai Gin Ala Gin Ser Pro Asn Ser Gly Leu Asp Phe 245 250 255 69 ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ

Ser Lys Leu

Gin Asp Asn Gin Vai Vai 260

Vai Glu Pro Pro Lys Gly 265 270

Cys His Gly Ser Vai lie 275

Ala Phe Pro Asn Pro Thr Ser Lys 280

Ala 285

Asp Ala Leu Asp Vai Trp 290

Leu Leu Tyr Thr His 295

Pro Thr Asp

Ser 300

Arg Lys Arg Thr Asn Leu Gly Vai Tyr Leu Asn Gin Lys Pro Leu 305 310 315

Asp Pro Thr Thr Trp Ser Ala Pro Thr Leu Leu Ala Thr Gly Ile 320 325 330

Cys Ala Tyr Ser Asp Leu Gin Asn Met Gly His Gly Pro Asp Gly 335 340 345

Ser Pro Gin Phe Gly Cys Leu Tyr Glu Ser Asn Asn Tyr Glu Glu 350 355 360

Ile Vai Phe Leu Met Phe Thr Leu Lys Gin Ala Phe Pro Ala Vai 365 370 375

Phe Gly Ala Gin 379

Lisboa, 2010-10-19

Claims

ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de ácido nucleico isolada que codifica uma sialidase obtenível de fluido de cultura celular de uma linha celular de hamster chinês, sequência esta que é obtida por um processo compreendendo: (a) a preparação de uma sonda oligonucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos CRVQAQSPNSGLDFQDN (SEQ ID NO:13); (b) a hibridação da sonda com ácido nucleico numa biblioteca de ADN de mamífero para formar híbridos; (c) o isolamento de híbridos, desse modo obtendo uma referida sequência de ácido nucleico que codifica uma sialidase.
2. Vector de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1.
3. Célula hospedeira transformada com uma sequência de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1.
4. Processo compreendendo a transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 2 capaz de, na célula hospedeira transformada com o vector, expressar a sialidase.
5. Processo da reivindicação 4 que compreende adicionalmente os passos de cultura da célula hospedeira transformada, e recuperação da sialidase a partir da cultura da célula hospedeira.
6. Polipéptido substancialmente homogéneo que é uma sialidase e possui a sequência de aminoácidos codificada por ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou uma sua variante, por meio de inserção, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos, variante esta que é uma sialidase e à qual se liga um anticorpo obtido utilizando um péptido com a sequência de aminoácidos CRVQAQSPNSGLDFQDN (SEQ ID NO:13).
7. Sialidase de acordo com a reivindicação 6 possuindo um peso molecular de cerca de 43 kDa.
8. Sialidase de acordo com a reivindicação 6 da qual um fragmento tríptico possui a sequência de aminoácidos ΕΡ Ο 866 130/ΡΤ 2/2 CRVQAQSPNSGLDFQDN (SEQ ID ΝΟ:13).
9. Sonda oligonucleot ídica útil na obtenção de um gene que codifica sialidase e possuindo uma sequência que codifica a sequência de aminoácidos CRVQAQSPNSGLDFQDN (SEQ ID NO:13). Lisboa, 2010-10-19