KR20080053256A - 크링글 도메인 １ 및 ２ 로 이루어진 비-글리코실화 재조합단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 비-글리코실화 재조합 단백질 에 관한 것으로, 보다 구체적으로 티슈 타입 플라스미노겐 활성인자로부터 유래된 것으로서 상기 활성인자의 117번째와 184번째 아미노산인 아스파라긴이 모두 글루타민으로 치환된 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 비-글리코실화 재조합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질은 혈관내피 세포의 증식 및 이동을 억제하는 활성을 가지고 있으므로 혈관신생 억제제로서 매우 유용하다. 또한, 본 발명에 따른 제조방법은 진핵세포 발현 시스템을 이용하여 별도의 리폴딩 단계 없이 고수율로 재조합 단백질을 용이하게 수득할 수 있다.

크링글 도메인, 비-글리코실화, 혈관신생

Description

크링글 도메인 １ 및 ２ 로 이루어진 비-글리코실화 재조합 단백질{Non-glycosylated recombinant protein consisting of kringle domain １ and ２}

본 발명은 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 비-글리코실화 재조합 단백질 에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 티슈 타입 플라스미노겐 활성인자(tissue type plasminogen activator)로부터 유래된 것으로서 상기 t-PA의 117번째와 184번째 아미노산인 아스파라긴이 모두 글루타민으로 치환된 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 비-글리코실화 재조합 단백질에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정으로 배아의 발생, 조직 재생, 기관의 성장, 상처 치유 및 여성의 생식기 계통의 주기적인 변화인 황체의 발달 등을 위해 건강한 신체에서 진행되는 작용이다. 이러한 혈관신생과정은 다양한 음성 및 양성 조절인자에 의해 엄격하게 조절된다(Folkman and Cotran, Int . Rev . Exp . Patho ., 16:207-248, 1976). 일반적으로 혈관신생은 단백질 분해효소에 의한 혈관 기저막의 분해, 혈관벽을 형성하는 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 단계를 포함하는 일련의 순차적인 단계를 통해 일어난다.

한편, 이러한 혈관신생과정을 조절하는 생체 내 음성 및 양성 조절인자가 비정상적으로 조절되게 되면 여러 질환이 유발된다. 특히 비정상적인 혈관신생은 종양의 성장과 전이에 매우 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 따라서 혈관신생의 기전에 대한 연구 및 이를 억제할 수 있는 물질의 개발은 암을 포함한 여러 질환의 예방 및 치료에 있어서 중요한 관심의 초점이 되고 있다. 현재 혈관신생 억제에 관한 연구는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)와 bFGF(basic fibroblast growth factor) 등과 같은 혈관신생 활성인자를 하향조절하고 혈관신생 억제인자는 상향조절하는 방법이 중요한 전략이 되고 있다. 이는 이러한 혈관신생 억제인자들이 통상의 화학치료제에 비해 상대적으로 독성이 낮고 약제 저항성의 위험이 낮아서 혈관신생과 관련된 각종 질환의 진단, 치료 및/또는 예방에 적용될 수 있는 가능성이 매우 높기 때문이다.

흥미롭게도, 이러한 내재성 혈관신생 억제인자들이 세포외 기질(extracellular matrix) 또는 혈액응고 시스템 단백질(hemostatic system proteins)에서 발견되고 있다. 혈액응고 시스템과 관련된 단백질 중 하나인 티슈 타입 플라스미노겐 활성인자(이하 t-PA라 함)는 멀티-도메인 세린 프로테아제(multi-domain serine protease)로서 섬유소 용해(fibrinolysis)와 종양세포 전 이에 관여하는 것으로 알려져 있다(Rijken, D. C. J. Biol . Chem., 257, 2920-2925, 1982; Mignatti P., Cell, 47, 487-498, 1986). 상기 t-PA는 크게 N-말단으로부터 핑거 도메인(F), 상피세포증식인자 도메인(G), 2개의 크링글 도메인(kringle Ⅰ domain, kringle Ⅱ domain) 및 세린 프로테아제(serin protease, P)의 5개의 도메인으로 구성되어 있다. 이 중에서 크링글 도메인은 70 내지 80개의 아미노산들로 이루어져 있으며 3중의 이황화 결합으로 연결된 루프 구조가 특징적이다.

최근, 본 발명자들은 상기 t-PA의 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 재조합 단백질 TK1-2가 혈관신생 억제제로서의 활성을 가지고 있음을 규명하였으며(Y.A. Joe et al., Biochem . Biophys . Res . Commun. 327, 1155-1162, 2005;Y. A. Joe, Biochem . Biophys . Res . Commun . 304, 740-746, 2003), 상기 재조합 단백질 TK1-2를 각각 대장균(E. coli)과 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 불용성 및 가용성 형태로 제조한 바 있다. 상기 두 종류의 재조합 단백질 TK1-2는 모두 시험관 내에서 혈관내피세포의 증식을 억제하며 생체 내에서 종양 성장을 억제하는 활성을 가지고 있다. 그러나 상기 두 종류의 재조합 단백질 TK1-2는 다음과 같은 몇 가지 문제점이 있다. 즉, 대장균 유래의 재조합 단백질 TK1-2의 경우에는 대장균으로부터 재조합 단백질을 발현시킨 후 단백질에 활성을 부여하기 위해 시험관 내 리폴딩 과정을 반드시 거쳐야 하기 때문에 절차가 복잡하고 시간이 많이 소비되는 단점이 있으며, 피키아 유래의 재조합 단백질 TK1-2의 경우에는 생성된 재조합 단 백질의 글리코실화(glycoslyation)로 인해 N-결합 글리칸(N-linked glycan)을 가지고 있어서 인체 내에서 항원성(antigenicity)을 나타내 면역반응을 유발하는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 인체 내에서 면역반응을 유발하지 않으면서 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있는 비-글리코실화 단백질을 보다 용이하게 제조할 수 있는 방법을 연구하던 중 t-PA의 117번째와 184번째 아미노산인 아스파라긴을 모두 글루타민으로 치환시킨 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 비-글리코실화 재조합 단백질을 제조하고 상기 재조합 단백질이 혈관 내피세포의 증식과 이동을 효과적으로 억제함으로써 혈관신생 및 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있으며 종래의 방법에 비해 재조합 단백질을 보다 더 용이하게 고수율로 수득할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 t-PA의 117번째와 184번째 아미노산인 아스파라긴이 모두 글루타민으로 치환된 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 비-글리코실화 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 t-PA의 117번째와 184번째 아미노산인 아스파라긴이 모두 글루타민으로 치환된 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 비-글리코실화 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 재조합 단백질은 t-PA의 117번째와 184번째 아미노산인 아스파라긴이 모두 글루타민으로 치환된 크링글 도메인 1 및 2로 이루어져 있으며 비-글리코실화된 것임을 특징으로 한다. 바람직하게는 본 발명의 재조합 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다.

단백질의 글리코실화는 진핵세포에서 단백질이 분비기관을 통과하여 분비될 때 유도되는 것으로서 특히, 단백질의 아스파라긴 잔기에 탄수화물 사슬이 부가되면 단백질은 폴딩, 구조, 분비, 운반, 안정성, 용해도 및 항원성에 영향을 받는다. 한편, 본 발명자들은 최근에 HCT116 이종이식 마우스에서 대장균 유래 비-글리코실 화 재조합 단백질 TK1-2가 피키아 유래 글리코실화 재조합 단백질인 TK1-2에 비해 생체 내에서 종양 성장을 억제하는 활성이 더 높은 것으로 확인한 바 있다(Y. A. Joe et al., Int . J. Oncol . 28, 361-367, 2006). 이는 진핵세포인 피키아에서 TK1-2가 분비될 때 글리코실화되어 재조합 단백질 TK1-2의 활성에 영향을 준 것이라 추정된다. 따라서 재조합 단백질 TK1-2가 높은 활성을 갖기 위해서는 비-글리코실화되는 것이 바람직함을 알 수 있다. 그러나 대장균으로부터 재조합 단백질 TK1-2를 제조하기 위해서는 시험관내 리폴딩 과정을 반드시 거쳐야 되는 단점이 있다. 따라서 이를 해결하기 위해서는 재조합 단백질을 제조하는 데 있어서 진핵세포 발현 시스템을 이용하되 단백질의 글리코실화를 억제할 수 있는 방법을 규명하여야 한다.

본 발명은 이와 같은 문제점을 해결한 것으로서 본 발명자들은 t-PA에서 글리코실화되는 아미노산 잔기를 규명하고 이를 돌연변이시킴으로써 글리코실화를 억제하였다. 즉, 본 발명은 진핵세포 발현 시스템을 이용하여 시험관내 리폴딩 과정 없이 보다 용이하게 재조합 단백질을 제조하되 TK1-2 재조합 단백질의 모분자(mother molecule)인 t-PA의 117번째와 184번째 아미노산인 아스파라긴을 글루타민으로 치환시켜 글리코실화를 억제하였다는 데에 큰 특징이 있다.

한편, 상기 아스파라긴의 글루타민으로의 치환은 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 부위 특이적 돌연변이화를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 t-PA의 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 재조합 단백질 TK1-2를 발현하는 공지의 재조합 플라스미드를 주형으로 하고 돌연변이 서열을 포함하고 있는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭함으로써 원하는 부위에 돌연변이가 유도되는 것을 특징으로 하는 부위 특이적 돌연변이화를 수행함으로써 t-PA의 117번째 및 184번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된 플라스미드를 수득하였다(실시예 <1-1> 참조).

한편, 본 발명의 재조합 단백질이 비-글리코실화 단백질이라는 것은 본 발명의 일 실시예를 통해 뒷받침된다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 단백질의 분자량을 SDS-PAGE 및 질량분석기를 이용하여 분석하였으며(실시예 <2-1> 참조), 그 결과 본 발명의 돌연변이 단백질이 야생형 TK1-2 단백질의 분자량에 비해 2-4kDa 정도 작음을 알 수 있었다(도 4 참조). 이러한 결과는 본 발명의 NQ-TK1-2의 경우 돌연변이에 의해 N-글리칸이 제거되었기 때문이라 사료된다.

나아가 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 재조합 단백질이 비-글리코실화된 것임을 확인하기 위하여 단백질의 N-결합 글리칸 부분을 절단하는 활성을 가진 엔도글리코시다아제 H(endoglycosidease H)를 처리하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(실시예 <2-2> 참조). 그 결과, 야생형 TK1-2 단백질이 엔도글리코시다아제 H에 의해 절단되는 반면 본 발명의 재조합 단백질은 그렇지 않음을 확인할 수 있었다. 이로부터, 본 발명의 재조합 단백질이 글리코실 잔기를 가지고 있지 않는 비-글리코실화 단백질임을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 상기 핵산 서열은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 게놈 DNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 서열은 서열번호 5에 표시된 서열을 갖는다.

상기 본 발명의 핵산 서열은 적합한 발현 벡터 내로 삽입되어 숙주세포를 형질전환 할 수 있다. "발현 벡터"라는 용어는 본 발명의 핵산 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명의 핵산 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 말한다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

따라서 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터와 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 별도의 시험관 내 리폴딩 과정을 필요로 하지 않는 진핵세포, 더욱 바람직하게는 효모세포, 더욱 더 바람직하게는 피키아 속(Pichia sp.) 세포, 가장 바람직하게는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다. 상기 피키아 속 세포 이외에도 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 클루애로마이세스 락티스(Kluyeromyces lactis), 한세눌라 폴리모파(H. polymorpha)와 같은 효모 세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 t-PA의 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 재조합 단백질 TK1-2를 발현하는 공지의 재조합 플라스미드를 부위 특이적 돌연변이화시킴으로써 t-PA의 117번째 및 184번째 아미노산인 아스파라긴이 모두 글루타민으로 치환된 핵산 서열을 포함하는 플라스미드를 수득하였다(도 1 참조).

나아가, 본 발명자들은 수득된 플라스미드를 동형 재조합법에 의해 피키아 파스토리스에 형질전환하고 본 발명의 재조합 단백질을 가장 높은 수준으로 발현하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 피키아 파스토리스 X-33/NQ-TK1-2/pPICZα-C로 명명하였으며, 2006년 11월 27일자로 한국생명공학연구소 유전자은행(KCTC, 대전 광역시 유성구 어은동 52번지)에 기탁번호 KCTC 11036BP로 기탁하였다(실시예 <1-3> 참조).

또한, 본 발명은 상기 숙주세포를 이용하여 본 발명의 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 재조합 단백질의 제조방법은 진핵세포 발현 시스템을 이용하여 단백질의 활성화를 위한 별도의 리폴딩 단계 없이 고수율로 재조합 단백질을 용이하게 수득할 수 있는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로 본 발명은 숙주세포를 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고 배양물로부터 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 단백질의 분리 및 정제는 당 업계에 공지된 방법 예를 들면, 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 재조합 단백질의 합성을 위한 유전공학적 방법은 공지된 문헌을 참고할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol . Chem., 255:12073-12080, 1990). 본 발명의 일 실시예에서는 SP-세파로즈, Q-스핀 및 UNO-S1 FPLC 컬럼(Fast protein liquid chromatography)을 이용하여 순차적으로 이온교환 크로마토그래피를 수행함으로써 불순물이 제거된 순수한 형태의 재조합 단백질을 수득하였다(실시예 <1-4> 참조). 나아가, 본 발명에 따른 재조합 단백질의 제조방법은 t-PA의 117번째 및 184번째 아미노산인 아스파라긴을 글루타민이 아닌 다른 종류의 아미노산으로 치환한 경우에 비해 보다 더 높은 발현율 및 정제수율로 재조합 단백질을 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 t-PA의 117번째 및 184번째 아미노산인 아스파라긴을 모두 글루탐산으로 치환시키고 이를 본 발명의 재조합 단백질의 발현율 및 정제수율과 비교하였다(실시예 4 참조). 그 결과, 본 발명에 따라 t-PA의 117번째 및 184번째 아미노산인 아스파라긴을 글루타민으로 치환시킨 경우 글루탐산으로 치환한 경우에 비해 재조합 단백질의 발현율 및 정제수율이 보다 더 우수함을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

한편, 본 발명의 재조합 단백질은 특정 부위가 돌연변이되어 이의 생리활성이 동일한 진핵세포 발현 시스템을 이용하여 제조된 재조합 단백질에 비해 보다 더 우수한 특징이 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 비-글리코실화 재조합 단백질이 시험관내에서 bFGF 및 VEGF와 같은 자극에 의한 내피세포 증식 및 이동을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7 참조).

한편 대장균 유래 비-글리코실화 TK1-2가 피키아 유래 글리코실화 TK1-2에 비해 생체 내에서 종양 성장을 억제하는 활성이 더 우수한 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에서 본 발명에 따른 피키아 유래 비-글리코실화 재조합 단백질의 내피세포 이동 억제 활성을 대장균 유래 비-글리코실화 TK1-2 단백질 및 피키아 유래 글리코실화 TK1-2 단백질의 활성과 비교하여 조사하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 피키아 유래 비-글리코실화 TK1-2 단백질은 종래의 피키아 유래 글리코실화 TK1-2 단백질에 비해 내피세포 이동 억제 활성이 명백하게 높게 나타났으며, 시험관내 리폴딩과정을 거쳐 생산된 종래의 대장균 유래 비-글리코실화 TK1-2 단백질과 유사한 수준으로 나타났다(도 7 참조).

따라서 본 발명은 본 발명의 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 혈관신생관련 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에서 혈관신생과 관련된 질환은 각종 암(종양)을 비롯하여 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증 등과 같은 혈관 질환 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염 등과 같은 안과 질환, 류마티스성 관절염, 골관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 갑상선염 등과 같은 염증성 질환 및 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름 등과 같은 피부과 질환을 포함한다(미국특허 제5,994,292호 대한민국 공개특허 특2001-66967; D'Amato R. J. et al ., Ophtahlmol., 102:1261-1262, 1995; Arbiser J. L. J. Am . Acad . Derm., 34(3):486-497, 1996; O'Brien K. D. et al ., Circulation, 93(4):672-682, 1996; Hanahan D. et al ., Cell , 86:353-364, 1996). 보다 바람직하게는 암, 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 당뇨병성 망막증 및 동맥 경화일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 다양한 비경구 또는 경구 투여용 담체를 추가로 포함함으로써 당업계에 공지된 방법으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트 라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명의 재조합 단백질의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 재조합 단백질의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투 여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 재조합 단백질의 혈관신생 억제제 또는 혈관신생 관련 질환의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 재조합 단백질은 혈관내피 세포의 증식 및 이동을 억제하는 활성을 가지고 있으므로 혈관신생 억제제로서 매우 유용하다. 또한, 본 발명에 따른 제조방법은 진핵세포 발현 시스템을 이용하여 별도의 리폴딩 단계 없이 고수율로 재조합 단백질을 고수율로 용이하게 수득할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

본 발명에 따른 비- 글리코실화 재조합 단백질의 제조

<1-1> TK1 -2의 부위 특이적 돌연변이화( site - directed mutagenesis )

인간 티슈타입 플라스미노겐 활성인자(tissue type plasminogen activator, t-PA)에서 N-결합 글리코실화되는 것으로 추정되는 부위(t-PA의 117번째 아미노산인 아스파리긴 및 184번째 아미노산인 아스파라긴)를 각각 글루타민으로 치환하여 비-글리코실화를 유도하였다(도 1).

이를 위해 t-PA의 89번째 아미노산인 아르기닌부터 263번째 아미노산인 트레오닌까지를 암호화하는 DNA 단편(서열번호 1)을 포함하며 t-PA의 크링글 도메인 1 및 2를 발현하는(재조합 단백질 TK1-2) 공지된 재조합 플라스미드 pPICZα-C/TK1-2(H. K. Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 304, 740-746, 2003)를 주형으로 하고 상업적으로 판매되고 있는 부위 특이적 돌연변이 키트(Quickchange Site-Directed Mutagenesis kit, Stratagene)를 이용하여 제조사에서 지시한 방법에 따라 부위 특이적 돌연변이화를 수행하였다. 이때 프라이머로는 t-PA의 117번째 아미노산인 아스파리긴 및 184번째 아미노산인 아스파라긴을 각각 글루타민으로 치환시킬 수 있는 돌연변이 부위(밑줄친 부위)를 포함하는 프라이머 N117Q(서열번호 2) 및 N184Q(서열번호 3)를 사용하였다.

프라이머 N117Q: 센스 프라이머(서열번호 2)

5'-GTGCACCAACTGGCAGAGCAGCGCGTTGG-3'

프라이머 N184Q: 센스 프라이머(서열번호 3)

5'-CTGCTACTTTGGGCAGGGGTCAGCCTACCG-3'

상기 과정을 통해 돌연변이화된 플라스미드를 E. coli TOP10(Invitrogen)에 전기영동법으로 형질전환한 다음 양성 클론을 선별하고 이들의 DNA 서열을 자동서열분석기를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 117번째 아스파라긴이 글루타민 잔기로 치환된 경우(NQ1-TK1-2), 184번째 아스파라긴이 글루타민 잔기로 치환된 경우(NQ2-TK1-2), 또는 상기 두 개의 아스파라긴이 모두 글루타민 잔기로 치환된 경우(NQ-TK1-2)의 3 종류의 돌연변이를 수득하였다.

<1-2> 효모세포로의 형질전환

상기 실시예 <1-1>에 수득한 돌연변이 플라스미드를 효모세포에 동형 재조합법(homologous recombination)으로 도입하였다. 이를 위해, 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 아스파라긴이 모두 글루타민 잔기로 치환된 돌연변이 플라스미드(NQ-TK1-2)에 제한 효소 SacI(Roche Moelcular Biochemicals)을 처리하여 플라스미드 DNA를 선형화한 다음 이를 이용하여 피키아 파스토리스 X-33(P. pastoris X-33, Invitrogen)를 전기천공법으로 형질전환하였다. 전기천공은 진펄서(Gene Pulser, Bio-Rad)와 0.2cm 큐벳(Bio-Rad)을 사용하여, 400Ω, 25㎌, 1.5kV의 조건으로 수행하였다. 전기적 충격을 준 후 바로 차가운 1M의 솔비톨 용액 1ml를 큐벳에 첨가하고 상기 혼합물을 교반하지 않고 30℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 제오신(zeocin, Invitrogen) 0.5mg/ml 또는 1mg/ml가 포함된 YPDS 플레이트(효모 추출액 1%, 펩톤 2%, 덱스트로스 2%, 솔비톨 1M 및 아가 2%)에 도말하여 배양한 후 항생제 저항성을 나타내는 양성 클론 52개를 선별하였다.

<1-3> 재조합 단백질 NQ - TK1 -2를 고발현하는 균주의 선별

재조합 단백질 NQ-TK1-2를 고발현하는 균주를 스크리닝하기 위해 상기 실시예 <1-2>에서 선별된 양성 클론을 YPD 브로쓰에서 배양한 다음 BMM 배지에서 메탄올을 첨가하면서 배양한 후 발현된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하여 NQ-TK1-2를 고발현하는 균주를 선별하였다.

상기 실시예 <1-2>에서 선별된 양성 클론 52개를 각각 10ml BMG 배지(완충된 최소 글리세롤 배지: 100mM 인산칼륨 완충액, pH 6.0, 1.34% 효모 질소 염기, 4× 10^-5% 비오틴 및 1% 글리세롤)에서 3일간 배양하였다. 그 다음, 상기 세포를 회수하고 2ml의 BMM 배지(완충된 최소 메탄올 배지: 100mM 인산칼륨 완충액, pH 6.0, 1.34% 효모 질소 염기, 4× 10^-5% 비오틴 및 1% 메탄올)에서 다시 배양하였다. 순수 메탄올을 24시간 마다 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하였다. 96시간 후에 배양액을 원심분리하고 배양 상등액을 회수하였다. 상기 배양 상등액 중에 함유된 단백질을 분석하기 위해 상기 각 배양 상등액 20㎕를 SDS-PAGE한 다음 단백질 밴드를 시각화 하기 위해 코마시 블루 염색을 수행하였다. SDS-PAGE는 제조사의 지시에 따라 14% SDS-폴리아크릴 겔(Bio-Rad)을 이용하여 수행하였고 코마시 블루 염색은 코마시 브릴리언트 블루 R-250(Coomassie brilliant blue R-250, Bio-Rad)을 사용하였다.

실험 결과, 52개의 클론 중 31개의 클론이 NQ-TK1-2를 발현하는 것으로 나타났고 그 중에서도 4개의 클론이 높은 발현을 보였다. 이 중에서 가장 높은 발현을 나타내는 하나의 클론을 선별하고 피키아 파스토리스 X-33/NQ-TK1-2/pPICZα-C로 명명하였으며, 2006년 11월 27일자로 한국생명공학연구소 유전자은행(KCTC, 대전 광역시 유성구 어은동 52번지)에 기탁번호 KCTC 11036BP로 기탁하였다.

<1-4> NQ - TK1 -2의 발현 및 정제

상기 실시예 <1-3>에서 선별된 형질전환체 피키아 파스토리스 X-33/NQ-TK1-2/pPICZα-C(기탁번호 KCTC 11036BP)를 500ml YPD(효모 추출액 1%, 펩톤 2% 및 덱스트로스 2%)에서 OD₆₀₀값이 3-6이 될 때까지 30℃에서 교반하면서(220rpm) 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액을 1500g로 10분간 원심분리하여 세포를 수집하고 100ml의 BMM에 재현탁하였다. 순수 메탄올을 최종 농도가 1%가 되도록 24시간 마다 첨가하였다. 96시간 후에 현탁액을 5000g에서 15분간 원심분리하고 배양 상등액을 4℃에서 사용 전까지 보관하였다. 상기 NQ-NK1-2 단백질을 포함하는 미정제 배양액을 14,000g에서 20분간 원심분리하고 YM-2 멤브레인 및 한외여과 셀(Millipore, Billerica, MA)을 이용한 한외여과(ultrafitration)에 의해 농축하 였다. 농축된 시료를 완충액 1(20mM 인산칼륨 완충액, pH 6.0)로 희석하고 재농축하였다.

상기에서 발현된 단백질을 정제하기 위하여 SP-세파로즈, Q-스핀 및 UNO-S1 FPLC(Fast protein liquid chromatography) 컬럼을 이용하여 다음과 같은 방법으로 이온교환 크로마토그래피를 수행하였다. 먼저, 상기 농축 시료를 SP-세파로즈 컬럼(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 로딩하고 레진의 5배 부피의 완충액 1로 세척한 다음 20, 200, 500 및 1000mM NaCl을 함유한 완충액 1을 사용하여 그래디언트 방법으로 단백질을 용출시켰다. 용출된 분획을 16시간 동안 투석하고 농축한 다음 Q-스핀 컬럼(Sartoius AG, Goettingen, Germany)을 이용하여 정제하였다. 상기 Q-스핀 컬럼은 완충액 2(20mM 인산칼륨 완충액, pH 7.0)로 평형화한 후 단백질 용액을 통과시켰다. 완충액 2로 세척하고 500mM NaCl를 포함한 완충액 2로 단백질을 용출시켰다. 정제된 단백질을 16시간 동안 투석하고 농축하였다. 최종적으로 단백질의 순도를 증가시키기 위해 UNO-S1 컬럼(Bio-Rad), 완충액 1과 1M NaCl를 함유한 완충액 1을 이용하여 FPLC를 수행하였다. FPLC 정제 프로파일은 도 2에 나타낸 바와 같다. 정제된 단백질 시료를 YM-3 멤브레인 및 한외여과 셀(Amicon)을 이용한 한외여과에 의해 농축하고 PBS(pH 7.2)로 투석하였다.

단백질 시료로부터 내독소를 제거하기 위해 트립톤 X-114로 추출하고 SM-2 비드를 처리하였다. 그 결과, 정제된 단백질의 내독소 수준은 전체 단백질에 대해 0.01EU/mg 이하였다.

상기와 같은 정제 과정을 통해 수득된 단백질의 정제수율은 정제에 사용된 총 단백질에 대해 약 15% 수준이었다(표 1).

NQ-TK1-2의 정제

단계	부피(ml)	농축(mg/ml)	총 단백질(mg)	수율(%)	단계 수율(%)
발현 및 농축	40.00	4.92	196.78	100.00	100.00
SP-세파로즈	40.00	1.39	55.75	28.33	28.33
Q-패스	42.00	1.26	52.85	26.86	94.80
UNO-S1 및 완충액 교환	26.00	1.13	29.40	14.94	55.62

< 실시예 2>

본 발명에 따른 재조합 단백질 NQ - TK1 -2의 특성 조사

본 발명에 따른 재조합 단백질의 분자량을 확인하고, 상기 재조합 단백질이 비-글리코실화되었는지 여부를 조사하였다.

<2-1> 분자량 확인

실시예 1에서 제조된 본 발명의 재조합 단백질 NQ-TK1-2의 분자량을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 질량분석기를 이용하여 질량분석을 수행하였다. 이때 야생형 TK1-2 단백질도 함께 사용하여 비교분석하였다. 상기 SDS-PAGE는 상기 실시예 <1-3>과 동일한 방법으로 수행하되 단백질 시료를 각각 환원 조건(메캅토에탄올 함유) 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE 시료 완충액에 용해하였다. 질량분석기를 이용한 질량분석은 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight) 질량분석기 및 보이저-DE STR 바이오스펙트로메트리 워크스테이션(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)을 사용하여 공지의 방법(H. J. Kim et al., Bull . Korean Chem . Soc . 20, 370-372, 1999)으로 수행하였다.

SDS-PAGE 결과, 본 발명의 재조합 단백질 NQ-TK1-2는 높은 순도를 가진 단백질 분획임을 확인할 수 있었으며, 비-환원 조건 하에서 더 빠른 속도로 이동함을 알 수 있었다. NQ-TK1-2의 크기는 약 20kDa인 것으로 나타났다(도 3).

또한 정제된 NQ-TK1-2의 질량 스펙트럼을 살펴보면, 주요 피크가 19,950.71Da에서 나타남을 확인할 수 있었으며 이는 야생형 TK1-2(21,938.14 및 23,942.12Da)에 비해 2-4kDa 정도 작다(도 4). 이러한 결과는 본 발명의 NQ-TK1-2의 경우 돌연변이에 의해 N-글리칸이 제거되었기 때문이라 사료된다.

<2-2> 글리코실화 여부 확인

본 발명에 따른 재조합 단백질 NQ-TK1-2가 비-글리코실화 단백질인 것을 확인하기 위하여 각 단백질에 엔도글리코시다아제 H(endoglycosidease H)를 처리하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 상기 엔도글리코시다아제 H는 단백질의 N-결합 글리칸 부분을 절단하는 활성을 가진 효소이다. 이때, 상기 실시예 1에서 제조한 돌연변이 NQ-TK1-2 단백질을 야생형 TK1-2 단백질, 돌연변이 NQ1-TK1-2 단백질 및 NQ2-TK1-2 단백질과 비교하여 분석하였다. 상기 NQ1-TK1-2 및 NQ2-TK1-2 단백질은 각각 117번째 또는 184번째 아미노산인 아스파라긴 중 어느 하나만 글루타민 잔기로 치환된 경우로서 실시예 <1-1>에서 제조된 각각의 플라스미드를 이용하여 실시예 <1-2> 및 실시예 <1-3>과 동일한 방법으로 효모에 형질전환한 후 단백질을 발현을 유도함으로써 제조하였다.

상기 각각의 단백질 발현 배양액을 100mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0)에 희석하고, 37℃에서 엔도글리코시다아제 H(Roche Molecular Biochemicals)를 처리하여 4시간 동안 반응시켰다. 상기 시료를 대상으로 환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(Schleicher & Schuell BioScience GmbH, Dassel, Germany)으로 옮겼다. 각각의 단백질은 항 인간 TK1-2 다클론 항체와 호올스래디쉬 퍼록시다아제가 태깅되어 있는 염소 항-마우스 IgG(horseradish peroxidasse tagged goat anti-mouse IgG, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) 및 ECL 플러스 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 이용하여 검출하였다. 상기 항 인간 TK1-2 다클론 항체는 공지의 인간 TK1-2 재조합 단백질 20g을 BALB/c 마우스에 4회 주사함으로써 수득하였다.

실험 결과, 효소를 처리하기 전 야생형 TK1-2의 경우 2개의 글리코실화된 단백질 밴드를 나타냈으나 효소처리에 의해 상기 단백질 밴드가 분자량이 낮은 하나의 밴드로 전환되었다. 하나의 아스파라긴(117번)만 돌연변이된 단백질 NQ1-TK1-2는 2개의 단백질 형태 즉, 글리코실화된 단백질과 비-글리코실화 단백질이 검출되었으나 효소처리에 의해 약하게 발현되는 한 개의 글리코실화된 단백질 밴드가 보다 저분자량의 밴드로 전환되었고 상기 밴드는 NQ1-TK1-2의 비-글리코실화 단백질 밴드와 겹쳐졌다. 또한, 하나의 아스파라긴(184번)만 돌연변이된 단백질 NQ2-TK1-2는 효소 처리 전에는 한 개의 글리코실화된 단백질 밴드가 나타났고 효소처리에 의해 상기 밴드가 보다 저분자량의 밴드로 전환되었다. 한편, 본 발명에 따른 재조합 단백질 NQ-TK1-2는 효소 처리 전과 후가 모두 동일한 분자량을 나타냈다(도 5).

상기 결과로부터, 본 발명의 재조합 단백질 NQ-TK1-2의 경우에는 글리코실 잔기를 가지고 있지 않기 때문에 효소 처리에 의해 분자량에 변화가 없음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

본 발명에 따른 재조합 단백질 NQ - TK1 -2의 생리적 활성 조사

본 발명에 따른 재조합 단백질 NQ-TK1-2의 내피세포 증식 및 이동 억제 활성을 실험관내에서 조사하였다.

<3-1> 내피세포 증식 억제 활성

NQ-TK1-2 단백질의 내피세포 증식 억제 활성은 인간 제대정맥 혈관내피세포(Human umbilical vein endothelial cells; HUVECs)를 대상으로 한 [³H]-티미딘 인코포레이션 분석법(thymidine incorporation assay)으로 조사하였다. 상기 HUVECs는 제왕절개수술로 수득한 사람의 탯줄에서 공지의 방법(E. A. Jaffe et al., J. Clin . Invest., 52, 2745-2756, 1973)을 이용하여 분리하였고 M199 배지[20% FBS, 30㎍/ml의 내피세포 성장 보충물(Sigma사), 90㎍/ml 헤파린, 25mM 헤피스, 2.2g/l 소듐 바이카보네이트, 2mM L-글루타민 및 1% 항생제 포함]에서 배양하였다. 상기 세포를 계대 배양하여 2 또는 4 세대의 세포를 실험에 사용하였다.

젤라틴 코팅된 24-웰 배양 플레이트에 웰 당 2×10⁴개의 HUVECs를 분주하고 M199 배지(10% FBS, 헤파린 90㎍/ml, 항생제 1% 포함)에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 배지를 혈청을 포함하지 않는 M199 0.5ml로 대체하였다. 4시간 동안 절식시킨 후 상기 배지를 M199 배지(5% FBS, 헤파린 90㎍/ml, 항생제 1% 포함) 0.25ml로 대체하고 실시예 1에서 제조한 NQ-TK1-2 단백질을 100, 500 및 1000nM씩 첨가하였다. 이를 30분간 배양한 다음 각 웰에 M199 배지(5% FBS, 헤파린 90㎍/ml, 항생제 1% 포함) 0.25ml와 bFGF 6ng/ml(최종 농도가 3ng/ml가 되도록)를 첨가하였다. 18시간 후, [³H]-티미딘(Dupont NEN, Boston, MA) 1Ci(0.037MBq)를 각 웰에 첨가하였다. 6시간 동안 추가로 배양한 후, 세포를 차가운 메탄올로 고정하고 차가운 10% TCA 용액으로 2회 세척한 다음 0.25N NaOH 및 1% SDS에 용해하였다. 방사능을 액체 섬광 계수기(β-counter)로 측정하였다. 각 실험은 3번 반복하여 수행하였다. 측정된 값은 평균±표준오차로 나타냈으며 스튜던트 T-테스트를 이용하여 통계적으로 계산하였다.

실험 결과, 본 발명에 따른 NQ-TK1-2 단백질은 농도 의존적으로 bFGF의 자극에 의한 HUVECs의 증식을 억제함을 확인할 수 있었다(도 6).

<3-2> 내피세포 이동 억제 활성

NQ-TK1-2 단백질의 세포 이동 억제 활성은 인간 모세혈관 내피세포(Human microvascular endothelial cells; HMVECs, Cambrex, Walkersville, MD)를 이용하여 48-웰 주화성 챔버(Neuro Probe, Inc., Cabin John, MD)를 이용한 변형된 보이덴 챔버(modified Boyden chamber)에서 수행하였다. 상기 HMVECs는 EGM-2MV(Clonetics)에서 보관하였으며, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 배양하였다.

폴리카르보네이트 멤브레인(직경 8㎛, Neuro Porbe)을 0.01% 젤라틴으로 하룻밤 동안 실온에서 코팅하였다. 코팅된 멤브레인을 공기 중에서 건조시키고 90μg/ml 헤파린을 함유한 EBM-2(Clonetics) 27㎕ 또는 2ng/ml VEGF가 첨가된 90μg/ml 헤파린 함유 배지로 채워진 챔버의 아랫부분에 놓았다. 그 다음 챔버의 개스킷(gasket) 및 윗부분을 조립하였다. HMVECs를 EBM-2에서 4시간 동안 절식시키고, 트립신으로 분해한 다음 EBM-2에 재현탁하였다. 세포를 단백질 시료 NQ-TK1-2 100nM 또는 200nM, 피키아 유래 TK1-2 500nM 및 E. coli 유래 TK1-2 500nM로 각각 처리하고 30분간 반응시킨 다음 EBM-2 57㎕에 함유된 4×10⁴개의 세포를 챔버의 윗부분에 첨가하였다. 37℃에서 5시간 동안 배양한 다음 멤브레인 하단면의 이동된 세포를 고정하고 디프-퀵 용액(Diff-Quik, Dade Behring, Newark, DE)으로 염색하였다. 이동된 세포는 현미경으로 계수하였다(×200). 임의로 5군데를 선택하여 세포수를 계수하였으며, 모든 실험은 3회 반복 수행하였다. 측정된 값은 평균±표준오차로 나타냈으며 스튜던트 T-테스트를 이용하여 통계적으로 계산하였다.

실험 결과, 본 발명의 NQ-TK1-2의 경우 HMVECs의 이동을 유의적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명의 피키아 유래 비-글리코실화 단백질인 NQ-TK1-2의 내피세포 이동 억제 활성은 종래의 피키아 유래 글리코실화 TK1-2 보다는 더 높게 나타났으며, 대장균 유래 비-글리코실화 TK1-2와 유사하게 나타났다(도 7).

< 실시예 4>

본 발명의 NQ - TK1 -2의 발현 및 정제 수율

본 발명의 NQ-TK1-2를 발현하는 피키아 균주와 병행한 연구로서 t-PA의 117번 및 184번째 아미노산인 아스파라긴을 글루타민이 아닌 글루탐산으로 모두 치환시켜 재조합 단백질 NE-TK1-2를 발현하는 피키아 균주를 제조하였다. 글루탐산으로의 치환은 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 수행하되, 다음과 같은 프라이머를 사용하였다.

프라이머 N117E: 센스 프라이머(서열번호 6)

5'-GTGCACCAACTGG GAGAGCAGCGCGTTGG-3'

프라이머 N184E: 센스 프라이머(서열번호 7)

5'-CTGCTACTTTGGGGAGGGGTCAGCCTACCG-3'

상기와 같은 방법으로 돌연변이된 플라스미드를 실시예 <1-2> 내지 <1-4>와 동일한 방법으로 효모세포에 형질전환하고 단백질의 발현을 유도하고 정제한 후 본 발명의 NQ-TK1-2의 발현율 및 정제수율을 상기 NE-TK1-2와 비교하였다.

실험 결과, NE-TK1-2의 경우 본 발명의 NQ-TK1-2와 마찬가지로 비-글리코실화 TK1-2가 발현되었으나, 발현 수준이 글리코실화 TK1-2 보다 훨씬 낮게 나타났고, 정제시 침전이 많이 형성되었다. 보다 구체적으로 본 발명에 따라 아스파라긴을 글루타민으로 치환하는 경우 배양액 리터당 단백질의 발현율이 글루탐산으로 치환한 경우에 비해 배양액 리터 당 수율이 약 3.5-5.7배 높았고, 정제수율도 5-16% 정도 더 높았다(표 2).

본 발명의 NQ-TK1-2 재조합 단백질과 NE-TK1-2의 발현율 및 정제 수율 비교

재조합 단백질 정제 (최종 투석 조건)	배양액 리터당 발현된 단백질의 양 (mg protein/ Liter of broth)	최종 정제 수율 (Yield)
NQ-TK1-2 정제 1 (PBS)	100 mg/L	15 %
NQ-TK1-2 정제 2 (PBS)	131 mg/L	26 %
NE-TK1-2 정제 1 (PBS)	23 mg/L	10 %
NE-TK1-2 정제 2 (PBS)	28 mg/L	10 %

도 1은 티슈 타입 플라스미노겐 활성인자의 크링글 도메인 1 및 2를 발현하는 재조합 플라스미드 pPICZα-C/TK1-2의 부위 특이적 돌연변이화를 나타낸 개략도이다.

도 2는 본 발명에 따른 비-글리코실화 재조합 단백질의 FPLC(Fast protein liquid chromatography) 정제 프로파일을 나타낸 것이다.

a: 280nm에서 UV 흡광도(A₂₈₀)

b: 유체 내 완충액 B의 백분율(NaCl의 농도)

c: 전도도(mS/cm)

도 3은 본 발명에 따라 정제된 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과이다.

TK1-2: 종래의 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 글리코실화 재조합 단백질

NQ-TK1-2: 본 발명의 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 비-글리코실화 재조합 단백질

도 4는 본 발명의 비-글리코실화 재조합 단백질(A)과 종래의 글리코실화 재조합 단백질(B)의 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 비-글리코실화 재조합 단백질에 엔도글리코시다아제 H (endoglycosidease H)를 처리하고 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

TK1-2: 야생형 단백질

NQ1-TK1-2: 117번째 아미노산인 아스파라긴만 글루타민으로 치환된 단백질

NQ2-TK1-2: 184번째 아스파라긴만 글루타민으로 치환된 단백질

NQ-TK1-2: 117번째 및 184번째 아스파라긴이 모두 글루타민으로 치환된 본 발명에 따른 단백질

-: 엔도글리코시다아제 H를 처리하지 않음

+: 엔도글리코시다아제 H를 처리함

도 6은 본 발명에 따른 비-글리코실화 재조합 단백질(NQ-TK1-2)의 내피세포 증식 억제 활성을 측정한 결과이다.

*: p<0.05에서 유의적인 차이가 있음

도 7은 본 발명에 따른 비-글리코실화 재조합 단백질(NQ-TK1-2)의 내피세포 이동 억제 활성을 측정한 결과이다.

피키아 유래 TK1-2: 글리코실화 재조합 단백질

대장균 유래 TK1-2: 비-글리코실화 재조합 단백질

*: p<0.1에서 유의적인 차이가 있음

**: p<0.05에서 유의적인 차이가 있음

***: p<0.005에서 유의적인 차이가 있음

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Non-glycosylated recombinant protein consisting of kringle domain I and II <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 525 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agggccacgt gctacgagga ccagggcatc agctacaggg gcacgtggag cacagcggag 60 agtggcgccg agtgcaccaa ctggaacagc agcgcgttgg cccagaagcc ctacagcggg 120 cggaggccag acgccatcag gctgggcctg gggaaccaca actactgcag aaacccagat 180 cgagactcaa agccctggtg ctacgtcttt aaggcgggga agtacagctc agagttctgc 240 agcacccctg cctgctctga gggaaacagt gactgctact ttgggaatgg gtcagcctac 300 cgtggcacgc acagcctcac cgagtcgggt gcctcctgcc tcccgtggaa ttccatgatc 360 ctgataggca aggtttacac agcacagaac cccagtgccc aggcactggg cctgggcaaa 420 cataattact gccggaatcc tgatggggat gccaagccct ggtgccacgt gctgaagaac 480 cgcaggctga cgtgggagta ctgtgatgtg ccctcctgct ccacc 525 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer N117Q <400> 2 gtgcaccaac tggcagagca gcgcgttgg 29 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer N184Q <400> 3 ctgctacttt gggcaggggt cagcctaccg 30 <210> 4 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NQ-TK1-2 <400> 4 Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp 1 5 10 15 Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Gln Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu 35 40 45 Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys 50 55 60 Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys 65 70 75 80 Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Gln 85 90 95 Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser 100 105 110 Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala 115 120 125 Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys 130 135 140 Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn 145 150 155 160 Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr 165 170 175 <210> 5 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NQ-TK1-2 <400> 5 agggccacgt gctacgagga ccagggcatc agctacaggg gcacgtggag cacagcggag 60 agtggcgccg agtgcaccaa ctggcagagc agcgcgttgg cccagaagcc ctacagcggg 120 cggaggccag acgccatcag gctgggcctg gggaaccaca actactgcag aaacccagat 180 cgagactcaa agccctggtg ctacgtcttt aaggcgggga agtacagctc agagttctgc 240 agcacccctg cctgctctga gggaaacagt gactgctact ttgggcaggg gtcagcctac 300 cgtggcacgc acagcctcac cgagtcgggt gcctcctgcc tcccgtggaa ttccatgatc 360 ctgataggca aggtttacac agcacagaac cccagtgccc aggcactggg cctgggcaaa 420 cataattact gccggaatcc tgatggggat gccaagccct ggtgccacgt gctgaagaac 480 cgcaggctga cgtgggagta ctgtgatgtg ccctcctgct ccacc 525 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer N117E <400> 6 gtgcaccaac tgggagagca gcgcgttgg 29 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer N184E <400> 7 ctgctacttt ggggaggggt cagcctaccg 30

Claims (3)

1. 인간 티슈 타입 플라스미노겐 활성인자에서 유래하는 크링글도메인 1 및 2로 이루어지고, 혈관신생 억제활성을 가지며, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 비-글리코실화된 재조합 단백질.
2. 제1항의 단백질을 암호화하고, 서열번호 5로 표시되는 핵산 서열.
3. 인간 티슈 타입 플라스미노겐 활성인자에서 유래하는 크링글도메인 1 및 2로 이루어지고, 혈관신생 억제활성을 가지며, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 비-글리코실화된 재조합 단백질을 발현하는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 숙주세포 (기탁번호: KCTC 11036BP).

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