CN103060291A - 一种玻璃酸酶的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种玻璃酸酶的提取方法，采用酸液提取和硫酸铵盐析得玻璃酸酶粗品，粗品再经透析、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品。本发明选用羊睾丸为原材料，采用高速离心提取方法，对玻璃酸酶进行分离和纯化，使玻璃酸酶效价可以达到340iu/mg。

Description

一种玻璃酸酶的提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及从新鲜动物睾丸中提取玻璃酸酶的方法。
背景技术
玻璃酸酶又名透明质酸酶，在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时精子进入卵子。也存在于精子、颌下腺、蜂毒、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。
玻璃酸酶的稳定性较好，42℃加热60分钟活力不损失；100℃加热5分钟，活力可保留80％。受热失活后进行冷却可恢复部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍较稳定。在低浓度水溶液中较易失活，但可加入0.2％或0.5％阿拉伯胶或0.2％明胶保护。Fe2+、Cu2+对酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等对酶活性没有明显影响。硫酸软骨素B(皮肤素)、硫酸类肝素、硫酸角质素、肝素及高浓度玻璃酸酶对酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化钠或硫酸鱼精蛋白所逆转。
药用玻璃酸酶为白色或微黄色粉末，无气味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有机溶剂。生化制药主要用牛、羊睾丸为原料进行提取制备。羊睾丸玻璃酸酶有4个亚基，每个亚基的相对分子质量为14000。
国外50年代初已投入生产，并收载于英国和日本药典中，商品名Rondas。我国1965年正式投入生产，从羊睾丸中提取，收入1977版中国药典。王彦，周淑敏等曾在2002年15卷(1)期的《黑龙江医药》上发表了一篇名为《透明质酸酶提取工艺的研究》的论文，较详细的介绍了工业生产中从羊睾丸中提取玻璃酸酶的传统工艺以及在此基础上由他们改良的新工艺，但其效价仅能达到320iu/mg，本公司在传统工艺的基础上，通过改变提取酸液的配方等工艺，使玻璃酸酶的效价达到了340iu/mg。
发明内容
本发明提供了一种玻璃酸酶的提取方法，采用酸液提取和硫酸铵盐析得玻璃酸酶粗品，粗品再经透析、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品。具体步骤如下：1提取：
将羊睾丸除内外皮层及付睾丸，绞成糜浆。称取糜浆，按每1kg糜浆加酸液1.0-1.5L的比例，加酸液搅拌，浸出4小时后，将浸出液过滤，滤液调pH3.0～4.5。
取滤渣，按每1kg开始加入的糜浆加酸液0.2-0.3L的比例，加酸液搅拌1小时后，再次过滤，滤液调pH3.0～4.5。
2粗制：
合并两次过滤液，在不断搅拌下，以每1L加硫酸铵200-230克的比例，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置12小时，过滤，留固体。量取滤液，在不断搅拌下，按1L滤液加硫酸铵270-300克的比例，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置12小时，过滤，合并两次固体，得粗品。
3精制：
3.1透析
粗品溶于少量水中，调pH3.5～5.0，以透析袋包扎，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时。
3.2热原处理：
将透析液离心20-60分钟，转速3000-4000r/mi n，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入滤液0.1体积的15％磷酸三钠(Na3PO4·12H2O)溶液，在不断搅拌下，缓缓加入滤液0.06体积的20％醋酸钙(Ca(CH3COO)2·H2O)溶液，并以NaOH溶液调pH8-9，离心，时间20分钟～60分钟，转速3000-4000r/min。收集上清液，之后上清液调pH6.5～7.0。
3.3冻干
将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
玻璃酸酶的传统工艺收率低，效价低，本发明通过改进工艺，生产的玻璃酸酶具有更高的效价。该项成果有明显的经济效益和社会效益，它不但解决国内外医疗用药的需求，还为畜产品的综合利用开拓了新路，对畜牧业的发展有积极意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1提取：
称取糜浆5kg加酸液6.5L，搅拌浸出4小时后，将浸出液过滤，滤液调pH3.20。
取滤渣加酸液1.2L，搅拌1小时后，再次过滤，滤液调pH3.18。
2粗制：
合并两次过滤液7.8L，在不断搅拌下，加入固体硫酸铵1638g，完全溶解后静置12小时，过滤，留固体。量取滤液6.6L，在不断搅拌下，加入硫酸铵1914g，完全溶解后静置12小时，过滤，合并两次固体，得粗品646.35g。
3精制：
3.1透析
粗品溶于少量水中，调pH4.5，以透析袋包扎，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时。
3.2热原处理：
将透析液离心30分钟，转速3700r/min，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入15％磷酸三钠(Na3PO4·12H2O)溶液10ml，在不断搅拌下，缓缓加入20％醋酸钙(Ca(CH3COO)2·H2O)溶液6ml，并以N aOH溶液调pH8.5，离心，收集上清液，之后上清液调pH6.70。
3.3冻干
将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品246.76g。
实施例2
1提取：
称取糜浆400g加酸液0.5L，搅拌浸出4小时后，将浸出液过滤，滤液调pH3.96。
取滤渣加酸液0.1L，搅拌1小时后，再次过滤，滤液调pH4.05。
2粗制：
合并两次过滤液618mL，在不断搅拌下，加入固体硫酸铵130g，完全溶解后静置12小时，过滤，留固体。量取滤液523mL，在不断搅拌下，加入硫酸铵152g，完全溶解后静置12小时，过滤，合并两次固体，得粗品52.13g。
3精制：
3.1透析
粗品溶于少量水中，调pH4.5，以透析袋包扎，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时。
3.2热原处理：
将透析液离心30分钟，转速3800r/min，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入15％磷酸三钠(Na3PO4·12H2O)溶液0.8ml，在不断搅拌下，缓缓加入20％醋酸钙(Ca(CH3COO)2·H2O)溶液0.5ml，并以NaOH溶液调pH8.5，离心，收集上清液，之后上清液调pH6.82。
3.3冻干
将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品19.91g。
经测算，实施例1中玻璃酸酶精品效价为342.15iu/mg，收率4.94％；实施例2中玻璃酸酶精品效价为343.54iu/mg，收率4.98％。与王彦，周淑敏等在2002年15卷(1)期的《黑龙江医药》上发表的《透明质酸酶提取工艺的研究》中提到的改良工艺相比，该工艺在收率上相差不大，但效价却更高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一种提取玻璃酸酶精品的方法，其特征在于，采用酸液提取和硫酸铵盐析得玻璃酸酶粗品，粗品再经透析、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品，所述玻璃酸酶精品的效价可以达到340iu/mg。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)提取：
将羊睾丸除内外皮层及付睾丸，绞成糜浆，称取糜浆加酸液，搅拌、浸渍，过滤，滤液调pH；取滤渣再加酸液，搅拌、过滤，滤液调pH；所述酸液为冰醋酸，盐酸和水的混合酸液；
(二)粗制：
合并两次过滤液，在不断搅拌下，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置12小时，过滤，留固体；量取滤液，在不断搅拌下，加入固体硫酸铵，溶解，静置12小时，过滤，合并两次固体，得粗品；
(三)精制：
(1)透析
粗品溶于少量水中，调pH，以透析袋包扎，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时；
(2)热原处理：
将透析液离心，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入滤液0.1体积的15％磷酸三钠(Na3PO4·12H2O)溶液，在不断搅拌下，缓缓加入滤液0.06体积的20％醋酸钙(Ca(CH3COO)2·H2O)溶液，并以NaOH溶液调pH8-9，离心，收集上清液，之后上清液调pH6.5～7.0；
(3)冻干
将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品。
3.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，第一次每1kg糜浆加酸液1.0-1.5L，第二次酸液仍根据开始糜浆量加入，每1kg糜浆加酸液0.2-0.3L。
4.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，酸液提取后调节滤液的pH值均为3.0～4.5。
5.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(二)中，第一次每1L滤液加固体硫酸铵200-230克，第二次每1L滤液加固体硫酸铵270-300克。
6.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤(三)的(1)中的pH值调为3.5～5.0。
7.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤(三)的(2)中的透析液在过滤前以及调pH值至8-9后都要进行离心，离心时间：20分钟～60分钟，转速：3000～4000r/min。
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