CN102925421A - 一种蚓激酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚓激酶的制备方法，步骤为：冷冻蚯蚓解冻，加乙醇水溶液，闪式提取；分离得沉淀1和上清液1；向沉淀1中加去离子水，闪式提取，分离，得上清液2；向上清液2中，加入聚丙烯酸钠水溶液，搅拌，分离，得上清液3；向上清液3中加硫酸铵，分离，得上清液4；向上清液4中补加硫酸铵，离心分离得沉淀2；向沉淀2中加入去离子水溶解，用新型重金属离子去除剂TMTH-15调节pH，离心得上清液5；将上清液5进行超滤浓缩，得浓缩液；调pH；干燥，得到蚓激酶。本发明的方法工艺简单，产率高，有效成分含量高，质量易控。原料来源广，前处理简单，成本低廉。废水，废液的无害化回收处理，不污染环境，产品重金属离子含量低。
Description
技术领域
本发明涉及一种蚓激酶的制备方法。
背景技术
地龙又名蚯蚓，在我国已有四千多年入药历史，临床应用广泛，疗效显著，无毒副作用。。现代药理研究认为地龙有抗凝血、溶血双重作用，有降压，抗心律失常，镇静，抗惊厥，平咳，抗脑缺血，促进伤口愈合等作用，可治疗细菌病毒感染，烧烫伤，癌症，免疫性等疾病。
近二十年来，世界上许多国家，如美国、日本、加拿大、英国、德国、澳大利亚等，都比较重视蚯蚓的养殖应用和研究工作日本宫崎医科大学美原恒教授Mihara于1982年报道了从蚯蚓（Lumbricus rubellus）中提取一组具有纤溶活性的蚓激酶。韩国Ryu用日本Mihara的方法从蚯蚓（Lumbricus rubellus）中提取出由六个成分组成的具有强纤溶活性的蚓激酶成分。北京大学生命科学院、清华大学、中国科学院生物物理研究所等单位的科研人员通过国家“八五”科技攻关计划，历时十余年的艰苦努力，采取现代生物技术从蚯蚓中分离提取有效组分蚓激酶。中国农业大学孙振钧教授等对蚯蚓的抗菌肽进行了深入研究。
珠海博康药业有限公司及北京百奥药业有限公司先后研制出治疗心脑血管疾病国家Ⅱ类新药“蚓激酶肠溶胶囊”，突破了抗栓溶栓药物不能口服的禁区，成为唯一被国内外认可、首个具有特异性的口服抗栓溶栓生物技术药物。
我国科研人员在国家自然科学基金、国家重点基础研究发展计划“973”计划的支持下，开始在分子层面上探索这种酶制剂的溶栓机制，以从根本上阐明其作用机理，与日本、韩国等发达国家展开了激烈地竞争。2003年，我国科研人员经过五年多的努力在世界上率先测定了一种具有溶栓活性的蛋白质——蚓激酶的三维结构，从而为在分子层面上了解这一蛋白药物开启了大门。这不仅为进一步的药物设计奠定基础，也使蚓激酶成为我国最早被测定三维结构的蛋白药物之一。
在已有的蚓激酶的研究方法和生产工艺中，都存在着蚯蚓原材料的选取较单一，只能用鲜活的蚯蚓作为原材料，工艺过程较复杂，且只能单一的分离提取一种物质，产品的有效成分较低，所含重金属离子较高，生产的废渣废液回收利用率较低，生产成本较高等诸多问题，本方法针对以上问题做了研究和改进，实现了规模化生产所必须的条件。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种蚓激酶的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种蚓激酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）冷冻蚯蚓解冻，加入所述蚯蚓质量3-5倍的体积浓度为50%-95%的乙醇水溶液，调节pH＝5.5-6.5，闪式提取2min-5min；
（2）采用离心机对步骤（1）获得的提取液进行分离得到沉淀1和上清液1；
（3）向步骤（2）分离得到的沉淀1中加入所述沉淀1质量3-5倍的去离子水，调节pH＝7.0-7.5，闪式提取2min-5min，离心分离，得到上清液2；
（4）向上清液2中，加入所述上清液2质量15%-25%的质量浓度为0.1%-0.5%的聚丙烯酸钠水溶液，调节pH＝6.5-7.5，搅拌15-30min，离心分离，得到上清液3；
(5)向上清液3中加硫酸铵，使硫酸铵在上清液3中的质量浓度为17%-23%，调节pH＝6.5-7.5，离心分离，得到上清液4；
（6）向上清液4中补加硫酸铵，使硫酸铵在上清液4中的质量浓度为50%-70%，调节pH＝5.5-6.5；离心分离得到沉淀2；
（7）向沉淀2中加入所述质量2-4倍的去离子水溶解，用新型重金属离子去除剂TMTH-15调节pH＝8.5-9.5，离心得到上清液5；
（8）将上清液5进行超滤浓缩，以除去上清液5中的硫酸铵，得到超滤浓缩液；
（9）调节超滤浓缩液pH＝7-7.5；冷冻干燥，得到蚓激酶。
所述步骤（1）优选为：冷冻蚯蚓解冻，加入所述蚯蚓质量4倍的体积浓度为75%的乙醇水溶液，调节pH＝6.0，闪式提取3min。
所述步骤（3）优选为：向步骤（2）分离得到的沉淀中加入所述沉淀质量4倍的去离子水，调节pH＝7.3，闪式提取3min，离心分离，得到上清液2。
所述步骤（4）优选为：向上清液2中，加入所述上清液2质量20%的质量浓度为0.3%的聚丙烯酸钠水溶液，调节pH＝7.0，搅拌20min，离心分离，得到上清液3。
所述步骤（5）优选为：向上清液3中加硫酸铵，使硫酸铵在上清液3中的质量浓度为20%，调节pH＝7.0，离心分离，得到上清液4。
所述步骤（6）优选为：向上清液4中补加硫酸铵，使硫酸铵在上清液4中的质量浓度为60%，调节pH＝6.0；离心分离得到沉淀2。
所述步骤（7）优选为：向沉淀2中加入所述质量3倍的去离子水溶解，用新型重金属离子去除剂TMTH-15调节pH＝9.0，离心得到上清液5。
本发明的优点：
（1）本发明的方法工艺简单，产率高，有效组分含量高，质量易控制。
（2）原料来源广泛，前处理简单，成本低廉。
（3）本发明能有效的达到废水，废液的无害化回收处理，不污染环境，且有效的降低生产成本。
(4)本发明的方法获得的产品重金属离子含量较低。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种蚓激酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）冷冻蚯蚓解冻，加入所述蚯蚓质量4倍的体积浓度为75%的乙醇水溶液，调节pH＝调节pH＝6.0，闪式提取3min；
（2）采用离心机对步骤（1）获得的提取液进行分离得到沉淀1和上清液1；
（3）向步骤（2）分离得到的沉淀1中加入所述沉淀1质量4倍的去离子水，调节pH＝7.3，闪式提取3min，离心分离，得到上清液2；
（4）向上清液2中，加入所述上清液2质量20%的质量浓度为0.3%的聚丙烯酸钠水溶液，调节pH＝7.0，搅拌20min，离心分离，得到上清液3；
(5)向上清液3中加硫酸铵，使硫酸铵在上清液3中的质量浓度为20%，调节pH＝7.0，离心分离，得到上清液4；
（6）向上清液4中补加硫酸铵，使硫酸铵在上清液4中的质量浓度为60%，调节pH＝6.0；离心分离得到沉淀2；
（7）向沉淀2中加入所述质量3倍的去离子水溶解，用新型重金属离子去除剂TMTH-15调节pH＝9.0，离心得到上清液5；
（8）将上清液5进行超滤浓缩，以除去上清液5中的硫酸铵，得到超滤浓缩液；
（9）调节超滤浓缩液pH＝7.3；冷冻干燥，得到蚓激酶。
蚓激酶产率达到冷冻蚯蚓质量的0.95%，效价大于22000μ/mg。
实施例2
一种蚓激酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）冷冻蚯蚓解冻，加入所述蚯蚓质量3倍的体积浓度为95%的乙醇水溶液，调节pH＝5.5，闪式提取2min；
（2）采用离心机对步骤（1）获得的提取液进行分离得到沉淀1和上清液1；
（3）向步骤（2）分离得到的沉淀1中加入所述沉淀1质量3倍的去离子水，调节pH＝7.0，闪式提取5min，离心分离，得到上清液2；
（4）向上清液2中，加入所述上清液2质量15%的质量浓度为0.5%的聚丙烯酸钠水溶液，调节pH＝6.5，搅拌30min，离心分离，得到上清液3；
(5)向上清液3中加硫酸铵，使硫酸铵在上清液3中的质量浓度为17%，调节pH＝7.5，离心分离，得到上清液4；
（6）向上清液4中补加硫酸铵，使硫酸铵在上清液4中的质量浓度为50%，调节pH＝5.5；离心分离得到沉淀2；
（7）向沉淀2中加入所述质量2倍的去离子水溶解，用新型重金属离子去除剂TMTH-15调节pH＝8.5，离心得到上清液5；
（8）将上清液5进行超滤浓缩，以除去上清液5中的硫酸铵，得到超滤浓缩液；
（9）调节超滤浓缩液pH＝7；冷冻干燥，得到蚓激酶。
蚓激酶产率达到冷冻蚯蚓质量的1.02%，效价大于20200μ/mg。
实施例3
一种蚓激酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）冷冻蚯蚓解冻，加入所述蚯蚓质量5倍的体积浓度为50%的乙醇水溶液，调节pH＝6.5，闪式提取5min；
（2）采用离心机对步骤（1）获得的提取液进行分离得到沉淀1和上清液1；
（3）向步骤（2）分离得到的沉淀1中加入所述沉淀1质量5倍的去离子水，调节pH＝7.5，闪式提取2min，离心分离，得到上清液2；
（4）向上清液2中，加入所述上清液2质量25%的质量浓度为0.1%的聚丙烯酸钠水溶液，调节pH＝7.5，搅拌15，离心分离，得到上清液3；
(5)向上清液3中加硫酸铵，使硫酸铵在上清液3中的质量浓度为23%，调节pH＝6.5，离心分离，得到上清液4；
（6）向上清液4中补加硫酸铵，使硫酸铵在上清液4中的质量浓度为70%，调节pH＝6.5；离心分离得到沉淀2；
（7）向沉淀2中加入所述质量4倍的去离子水溶解，用新型重金属离子去除剂TMTH-15调节pH＝9.5，离心得到上清液5；
（8）将上清液5进行超滤浓缩，以除去上清液5中的硫酸铵，得到超滤浓缩液；
（9）调节超滤浓缩液pH＝7.5；冷冻干燥，得到蚓激酶。
蚓激酶产率达到冷冻蚯蚓质量的0.90%，效价大于23200μ/mg。
Claims (7)
1.一种蚓激酶的制备方法，其特征是包括如下步骤：
（1）冷冻蚯蚓解冻，加入所述蚯蚓质量3-5倍的体积浓度为50%-95%的乙醇水溶液，调节pH＝5.5-6.5，闪式提取2min-5min；
（2）采用离心机对步骤（1）获得的提取液进行分离得到沉淀1和上清液1；
（3）向步骤（2）分离得到的沉淀1中加入所述沉淀1质量3-5倍的去离子水，调节pH＝7.0-7.5，闪式提取2min-5min，离心分离，得到上清液2；
（4）向上清液2中，加入所述上清液2质量15%-25%的质量浓度为0.1%-0.5%的聚丙烯酸钠水溶液，调节pH＝6.5-7.5，搅拌15-30min，离心分离，得到上清液3；
(5)向上清液3中加硫酸铵，使硫酸铵在上清液3中的质量浓度为17%-23%，调节pH＝6.5-7.5，离心分离，得到上清液4；
（6）向上清液4中补加硫酸铵，使硫酸铵在上清液4中的质量浓度为50%-70%，调节pH＝5.5-6.5；离心分离得到沉淀2；
（7）向沉淀2中加入所述质量2-4倍的去离子水溶解，用新型重金属离子去除剂TMTH-15调节pH＝8.5-9.5，离心得到上清液5；
（8）将上清液5进行超滤浓缩，以除去上清液5中的硫酸铵，得到超滤浓缩液；
（9）调节超滤浓缩液pH＝7-7.5；冷冻干燥，得到蚓激酶。
2.根据权利要求1所述的一种蚓激酶的制备方法，其特征是所述步骤（1）为：冷冻蚯蚓解冻，加入所述蚯蚓质量4倍的体积浓度为75%的乙醇水溶液，调节pH＝6.0，闪式提取3min。
3.根据权利要求1所述的一种蚓激酶的制备方法，其特征是所述步骤（3）为：向步骤（2）分离得到的沉淀中加入所述沉淀质量4倍的去离子水，调节pH＝7.3，闪式提取3min，离心分离，得到上清液2。
4.根据权利要求1所述的一种蚓激酶的制备方法，其特征是所述步骤（4）为：向上清液2中，加入所述上清液2质量20%的质量浓度为0.3%的聚丙烯酸钠水溶液，调节pH＝7.0，搅拌20min，离心分离，得到上清液3。
5.根据权利要求1所述的一种蚓激酶的制备方法，其特征是所述步骤（5）为：向上清液3中加硫酸铵，使硫酸铵在上清液3中的质量浓度为20%，调节pH＝7.0，离心分离，得到上清液4。
6.根据权利要求1所述的一种蚓激酶的制备方法，其特征是所述步骤（6）为：向上清液4中补加硫酸铵，使硫酸铵在上清液4中的质量浓度为60%，调节pH＝6.0；离心分离得到沉淀2。
7.根据权利要求1所述的一种蚓激酶的制备方法，其特征是所述步骤（7）为：向沉淀2中加入所述质量3倍的去离子水溶解，用新型重金属离子去除剂TMTH-15调节pH＝9.0，离心得到上清液5。
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