CN103789288A - 一种盐解法提取分离玻璃酸酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种盐解法提取分离玻璃酸酶的方法，包括以下步骤：清洗并去除牛睾丸内外皮层，绞碎成糜浆；加入等体积的水，调节pH值至8.0～9.0，按照每1kg糜浆加入5～10mL盐解液的比例，加盐解液搅拌，4～8℃保温2～4小时，过滤取上清液；按每1L过滤液加400g硫酸铵的比例，加入硫酸铵搅拌溶解，静置24小时，过滤，将所得玻璃酸酶粗品溶于水中，调pH值为4.0～7.0，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时；除热原；过滤取上清液调节pH值6.5～7.0，冷冻干燥得玻璃酸酶精品。采用盐解的方法能够提高产品效价，生产工序的每一步滤液均能得到回收利用，适用于工业生产。

Description

一种盐解法提取分离玻璃酸酶的方法
技术领域
本发明涉及有机高分子化合物的制备方法，特别是一种盐解法提取分离玻璃酸酶的方法。
背景技术
玻璃酸酶是一种由哺乳动物如牛、羊睾丸提取或微生物发酵制得的糖苷内切酶。白色无定形粉末或颗粒，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇和乙醚。最适pH值为4.0～7.5.液态常温可稳定24h，5℃下可稳定一周，100℃加热30min失活。玻璃酸酶是一种能水解透明质酸的酶，用于能暂时降低人体细胞间质的粘性，可促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收，为一种重要的药物扩散剂。临床用作药物渗透剂，促进药物的吸收，促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。
传统的玻璃酸酶生产工艺采用酸液提取和硫酸铵盐析的方法制得玻璃酸酶粗品，粗品再经过透析、除热原、冻干工序得到玻璃酸酶精品。产品的效价通常仅能达到320IU/mg，效价低，杂质含量高，同时生产过程中的残液回收利用率低，不利于环境的保护。
发明内容
本发明的目的在于提供一种回收率高，废料少的盐解法提取分离玻璃酸酶的方法。
实现本发明目的的技术解决方案为：
一种盐解法提取分离玻璃酸酶的方法，包括以下步骤：
步骤一、原料处理；清洗并去除牛睾丸内外皮层，绞碎成糜浆；
步骤二、盐解；糜浆中加入等体积的水，用NaOH溶液，调节pH值为8.0～9.0，按照每1kg糜浆加入5～10mL盐解液的比例，加盐解液搅拌，4～8℃保温2～4小时，过滤取上清液，所得固体重复盐解工序一次，收集全部上清液，备用。
步骤三、硫酸铵盐析；按每1L上清液加400g硫酸铵的比例，加入硫酸铵搅拌溶解，静置24小时，过滤，上清液重复盐析工序一次，所得固体即玻璃酸酶粗品；
步骤四、透析；取玻璃酸酶粗品溶于水中，用HCl溶液，调pH值为4.0～7.0，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时，收集透析液，备用；
步骤五、除热原；将透析液4℃离心30～60分钟，转速3000～4000r/min,过滤收集上清液，备用；
步骤六、冻干；调节上清液pH值至6.5～7.0，冷冻干燥得玻璃酸酶精品。
其中步骤二盐解过程中加盐解液4℃保温可优选2小时。
盐解工序中盐解液包括10～20wt%氯化钠、20～40wt%氯化钾、40～70wt%磷酸盐。其中磷酸盐为磷酸二氢钙、磷酸三钠或磷酸氢二胺。
本发明与现有技术相比，其显著优点：与传统工艺酸解玻璃酸酶的方法不同，采用盐解的方法，能够改善产品效价低、收率低的问题，提高产品效价；采用盐解的方法，生产工序的每一步滤液均能得到回收利用，符合环境保护的要求，有利于生产与环境的可持续发展。
具体实施方式
实施例一
步骤一、原料处理。清洗并去除牛睾丸内外皮层，绞碎成糜浆10kg。配制盐解液各组分含量百分比为20wt%氯化钠、40wt%氯化钾、40wt%磷酸二氢钙。
步骤二、盐解。糜浆中加入等体积的水，用NaOH溶液，调节pH值为8.0～9.0，按照每1kg糜浆加入5～10mL盐解液的比例，加盐解液约80mL搅拌，4℃保温2小时。过滤取上清液，所得固体重复盐解工序一次，收集全部上清液，备用。
步骤三、硫酸铵盐析。共收集得到12L上清液，按每1L上清液加400g硫酸铵的比例，加入硫酸铵搅拌溶解，静置24小时，过滤，上清液重复盐析工序一次。共收得玻璃酸酶粗品5.78kg。
步骤四、透析。取粗品溶于水中，用HCl溶液，调pH值至4.0～7.0，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时。
步骤五、除热原。将透析液4℃离心30～60分钟，转速3000～4000r/min,过滤收集上清液，备用。
步骤六、冻干。调节上清液pH值至6.5～7.0，冷冻干燥得玻璃酸酶精品3.18kg。测得产品效价为378IU/mg。
实施例二
步骤一、原料处理。清洗并去除牛睾丸内外皮层，绞碎成糜浆8kg。配制盐解液各组分含量百分比为10wt%氯化钠、20wt%氯化钾、70wt%磷酸氢二胺。
步骤二、盐解。糜浆中加入等体积的水，用NaOH溶液，调节pH值为8.0～9.0，按照每1kg糜浆加入5～10mL盐解液的比例，加盐解液约65mL搅拌，4℃保温2小时。过滤取上清液，所得固体重复盐解工序一次，收集全部上清液，备用。
步骤三、硫酸铵盐析。共收集得到10.7L上清液，按每1L上清液加400g硫酸铵的比例，加入硫酸铵搅拌溶解，静置24小时，过滤，上清液重复盐析工序一次。共收得玻璃酸酶粗品4.83kg。
步骤四、透析。取粗品溶于少量水中，用HCl溶液，调pH值为4.0～7.0，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时。
步骤五、除热原。将透析液4℃离心30～60分钟，转速3000～4000r/min,过滤取上清液调节pH值6.5～7.0。
步骤六、冻干。调节上清液pH值至6.5～7.0，冷冻干燥得玻璃酸酶精品2.58kg。测得产品效价为389IU/mg。

Claims (4)

1.一种盐解法提取分离玻璃酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、原料处理；清洗并去除牛睾丸内外皮层，绞碎成糜浆；
步骤二、盐解；糜浆中加入等体积的水，用NaOH溶液，调节pH值至8.0～9.0，按照每1kg糜浆加入5～10mL盐解液的比例，加盐解液搅拌，4～8℃保温2～4小时，过滤取上清液，所得固体重复盐解工序一次，收集全部上清液，备用；
步骤三、硫酸铵盐析；按每1L上清液加400g硫酸铵的比例，加入硫酸铵搅拌溶解，静置24小时，过滤，上清液重复盐析工序一次，所得固体即玻璃酸酶粗品；
步骤四、透析；取玻璃酸酶粗品溶于水中，用HCl溶液，调pH值至4.0～7.0，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时，收集透析液，备用；
步骤五、除热原；将透析液4℃离心30～60分钟，转速3000～4000r/min,过滤收集上清液，备用；
步骤六、冻干；上清液调节pH值至6.5～7.0，冷冻干燥得玻璃酸酶精品。
2.根据权利要求1所述盐解法提取分离玻璃酸酶的方法，其特征在于，步骤二盐解工序加盐解液后4℃保温2小时。
3.根据权利要求1所述盐解法提取分离玻璃酸酶的方法，其特征在于，步骤二盐解液包括10～20wt%氯化钠、20～40wt%氯化钾、40～70wt%磷酸盐。
4.根据权利要求3所述盐解法提取分离玻璃酸酶的方法，其特征在于，盐解液中磷酸盐为磷酸二氢钙、磷酸三钠或磷酸氢二胺。
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