CN106967700A - 一种从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法 - Google Patents

一种从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，该方法将牛脾脏先经过一定浓度的生理盐水浸泡后加入提取液提取捣碎提取，然后离心取上清液加入氯化钠除杂，再加入盐盐析，最后经过透析制得精制透明质酸酶，本发明方法用于从牛脾脏中提取透明质酸酶，简化了步骤，易操作，透明质酸酶提取率高，纯度好，酶活力高，为透明质酸酶的提取探索了新的途径。

Description

一种从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是涉及一种从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法。
技术背景
透明质酸酶(Hyaluronidase，HAase)是一种粘多糖内切酶，能够降低体内透明质酸活性，提高组织中液体渗透能力的酶，在控制癌细胞侵袭、抑制血管再生、促进创伤修复等过程中发挥重要作用。透明质酸酶在哺乳动物，无脊椎动物(甲壳类、昆虫类、蛭类)，致病菌(念珠菌属Candida、链霉菌属Streptomyce)，细菌和噬菌体中广泛存在，来自于不同生物组织中的大量透明质酸酶已被确认。HAase在医药领域应用广泛，其主要功能为：降低水解透明质酸(Hyaluronic acid，HA)相对分子质量的同时消HA的黏滞性，增强机体对外来物质的通透性。在医学上，HAase能够促进药物在机体内的扩散，因此，重要的药用价值使得HAase在医药领域具有良好的市场前景。
不同来源的透明质酸酶作用效果不尽相同，目前，已有文献报道从蜂毒、蝎毒、羊睾丸、牛睾丸、牛肝脏中提取了透明质酸酶，然而从牛脾脏中提取透明质酸酶的文章报道较少。脾脏作为一类家畜副产物，资源丰富，因此，如何实现牛脾脏的高值化利用成为牛副产物加工利用中急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，该方法将牛脾脏先经过一定浓度的生理盐水浸泡后加入提取液提取捣碎提取，然后离心取上清液加入氯化钠除杂，再加入盐盐析，最后经过透析制得精制透明质酸酶，本发明方法用于从牛脾脏中提取透明质酸酶，简化了步骤，易操作，透明质酸酶提取率高，纯度好，酶活力高。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，所诉方法包括以下步骤：
(1)取新鲜牛脾脏，去除表皮包膜后，切成小块，加入2.0％生理盐水浸泡25-35min，然后加入提取液，用组织捣碎机捣碎，放入-8℃恒温箱中，用机械搅拌器搅拌，搅拌转速500-600r/min，40-60min后，-3℃-0℃静置1h，取上清液，加入氯化钠，0℃搅拌30-50min后静置1-2h，6000r/min离心15min，取上清液，加入盐，0℃搅拌50-60min，然后静置8-10h，9000r/min离心10min，取沉淀得透明质酸酶粗品；
(2)取步骤(1)中的沉淀，装入透析袋中，放入柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中，5-7℃透析12-14h，8000r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥，得透明质酸酶精品。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)取新鲜牛脾脏，去除表皮包膜后，切成小块，加入2.0％生理盐水浸泡30min，然后加入提取液，用组织捣碎机捣碎，放入-8℃恒温箱中，用机械搅拌器搅拌，搅拌转速550r/min，50min后，-2℃静置1h，取上清液，加入氯化钠，0℃搅拌45min后静置1.5h，6000r/min离心15min，取上清液，加入盐，0℃搅拌55min，然后静置9h，9000r/min离心10min，取沉淀得透明质酸酶粗品；
(2)取步骤(1)中的沉淀，装入透析袋中，放入柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中，6℃透析13h，8000r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥，得透明质酸酶精品。
进一步的，所述的提取液由2-4重量份20％甘油、1-3重量份葡萄糖、130-150重量份柠檬酸、50-70重量份柠檬酸钠混合制成。
进一步的，所述的提取液由3重量份20％甘油、2重量份葡萄糖、140重量份柠檬酸、60重量份柠檬酸钠混合制成。
进一步的，所述的盐为氯化铵。
进一步的，所述的牛脾脏和2.0％生理盐水、提取液的质量比为：1∶1∶2-3。
进一步的，所述的牛脾脏和氯化钠、盐的质量比为：1∶0.3-0.4∶0.8-1.2。
进一步的，所述牛脾脏和柠檬酸-氢氧化钠缓冲液的质量比为：1∶0.5。
由于采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
本发明将牛脾脏先经过一定浓度的生理盐水浸泡后加入提取液提取捣碎提取，然后离心取上清液加入氯化钠除杂，再加入盐盐析，最后经过透析制得精制透明质酸酶，具有如下特点：
(1)本发明采用先将牛脾脏用2.0％生理盐水浸泡，再加入提取液捣碎提取，保存了牛脾脏中透明质酸酶的活力，且更利于牛脾脏细胞的破碎和透明质酸酶的提出。此外，本发明采用将一定配比的甘油、葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠混合制得提取液，透明质酸酶甘油和葡萄糖作为酶保护剂和稳定剂，更好的保证了提取过程中的酶活力，同时和柠檬酸、柠檬酸钠混合，增加了透明质酸酶的提取率。
(2)本发明采用低浓度的氯化钠去除透明质酸酶粗提取液中的杂质，然后再用氯化铵盐析，最后用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中透析，采用此操作过程可得到高纯度透明质酸酶，酶活力进一步提升，此纯化步骤简便，经济性强，更适合大规模生产。
本发明为了更好的阐述发明创造的有益效果，还列举了部分试验例，旨在说明本发明的技术效果，绝不限定本发明的范围。
工艺参数研究
试验例1：从牛脾脏中提取透明质酸酶工艺参数研究
实验方法：采用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定透明质酸酶的活力。酶解条件为:50℃，时间15min，pH 4，于波长540nm测定。以每分钟引起透明质酸酶溶液吸光度上升0.02％的酶量为一个酶活力单位。
1.1搅拌转速、搅拌时间、盐析时间、透析时间对提取透明质酸酶的影响
在其他因素不变条件下，考察不同搅拌转速、搅拌时间、盐析时间、透析时间对提取透明质酸酶的影响，结果见表1-表4：
表1 不同搅拌转速对提取透明质酸酶的影响
搅拌转速(r/min) 450 500 550 600 650
酶活力(U/mL) 311.2 318.7 323.5 322.6 321.0
表2 不同搅拌时间对提取透明质酸酶的影响
搅拌时间(min) 30 40 50 60 70
酶活力(U/mL) 316.4 323.2 327.8 328.2 328.4
表3 不同盐析时间对提取透明质酸酶的影响
盐析时间(h) 7 8 9 10 11
酶活力(U/mL) 315.4 322.5 328.9 328.2 327.3
表4 不同透析时间对提取透明质酸酶的影响
透析时间(h) 11 12 13 14 15
酶活力(U/mL) 315.9 321.7 326.3 325.8 325.4
从上表中可知，搅拌转速、搅拌时间、盐析时间、透析时间增加，透明质酸酶活力增加，但是当温度搅拌转速增加到650r/min，搅拌时间到70min，盐析时间11h，透析时间15h时，透明质酸酶活力略有降低，表明此时再提高搅拌转速、搅拌时间、盐析时间、透析时间对提取透明质酸酶已没有效果，因此，本发明提取透明质酸酶最佳搅拌转速为550r/min，搅拌时间为50min，盐析时间为9h，透析时间为13h。
1.2本发明提取液对提取透明质酸酶的影响
1.2.1不同配比提取液对提取透明质酸酶的影响
配置不同配比的提取液，考察不同配比提取液对提取透明质酸酶的影响。
试验组1：1g 20％甘油、0.8g葡萄糖、120g柠檬酸、40g檬酸钠混合制成的提取液；
试验组2：2g 20％甘油、1g葡萄糖、130g柠檬酸、50g柠檬酸钠混合制成的提取液；
试验组3：3g 20％甘油、2g葡萄糖、140g柠檬酸、60g柠檬酸钠混合制成的提取液；
试验组4：4g 20％甘油、3g葡萄糖、150g柠檬酸、70g柠檬酸钠混合制成的提取液；
试验组5：5g 20％甘油、4g葡萄糖、160g柠檬酸、80g柠檬酸钠混合制成的提取液；
试验组6：160柠檬酸、80g柠檬酸钠混合制成的提取液；
试验组7：6g氯化钠、160柠檬酸、80g柠檬酸钠混合制成的提取液；
在其他因素不变条件下，考察不同配比提取液对提取透明质酸酶的影响，结果见表5：
表5 不同配比提取液对提取透明质酸酶的影响
从上表中可看出，试验组2-4提取的透明质酸酶活力最高，试验组1和试验组5为低、高配比，提取效果不佳，因此，按照2-4重量份20％甘油、1-3重量份葡萄糖、130-150重量份柠檬酸、50-70重量份柠檬酸钠配比的提取液对透明质酸酶的提取效果最好；此外，不添加甘油和葡萄糖到提取液中或是用氯化钠代替甘油和葡萄糖，提取透明质酸酶的酶活力均低于试验组1-5，因此，甘油和葡萄糖加入到提取液中，可以增加透明质酸酶的酶活力，更适于提取透明质酸酶。
1.2.2不同提取液添加量对提取透明质酸酶的影响
在其他因素不变条件下，考察不同提取液添加量对提取透明质酸酶的影响，结果见表6：
表6 不同提取液添加量对提取透明质酸酶的影响
牛脾脏∶提取液 1∶1.5 1∶2 1∶2.5 1∶3 1∶3.5
酶活力(U/mL) 319.8 322.7 325.4 325.6 324.9
从上表中可以看出，提取液添加量为1∶2-3时，提取的透明质酸酶活力最高，因此，此提取液最佳添加量。
1.3本发明物料添加量对提取透明质酸酶的影响
在其他因素不变条件下，考察2.0％生理盐水、氯化铵、氯化钠的添加量对提取透明质酸酶的影响，结果见表7-9：
表7 不同2.0％生理盐水添加量对提取透明质酸酶的影响
牛脾脏∶2.0％生理盐水 1∶0.8 1∶1 1∶1.2 不添加生理盐水
酶活力(U/mL) 325.3 326.6 326.6 322.4
表8 不同氯化铵添加量对提取透明质酸酶的影响
牛脾脏∶氯化铵 1∶0.6 1∶0.8 1∶1 1∶1.2 1∶1.4
酶活力(U/mL) 323.4 325.7 327.2 326.1 325.2
表9 不同氯化钠添加量对提取透明质酸酶的影响
牛脾脏∶氯化铵 1∶0.25 1∶0.3 1∶0.35 1∶0.4 1∶0.45
酶活力(U/mL) 322.7 324.2 325.8 324.6 323.4
从上表中可以看出，2.0％生理盐水添加量为1∶1时最优，不添加生理盐水，则酶活力降低，氯化铵添加量为1∶0.8-1.2时，透明质酸酶活力比较高，为最优质量比，氯化钠添加量为1∶0.3-0.4时，去除杂质的有效率最高，透明质酸酶的酶活力较高，为最优质量比。
具体实施方式
提取液的制备：300g 20％甘油、200g葡萄糖、14.0kg柠檬酸、6.0kg柠檬酸钠混合制成
实施例1：从牛脾脏中提取透明质酸酶
(1)取新鲜牛脾脏100g，去除表皮包膜后，切成小块，加入2.0％生理盐水100g浸泡25min，然后加入提取液250g，用组织捣碎机捣碎，放入-8℃恒温箱中，用机械搅拌器搅拌，搅拌转速550r/min，50min后，-3℃静置1h，取上清液，加入氯化钠35g，0℃搅拌30min后静置1h，6000r/min离心15min，取上清液，加入盐100g，0℃搅拌50min，然后静置9h，9000r/min离心10min，取沉淀得透明质酸酶粗品；
(2)取步骤(1)中的沉淀，装入透析袋中，放入50g柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中，5℃透析13h，8000r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥，得透明质酸酶精品；测定透明质酸酶活力为329.0U/mL。
实施例2：从牛脾脏中提取透明质酸酶
(1)取新鲜牛脾脏100g，去除表皮包膜后，切成小块，加入2.0％生理盐水100g浸泡30min，然后加入提取液250g，用组织捣碎机捣碎，放入-8℃恒温箱中，用机械搅拌器搅拌，搅拌转速550r/min，50min后，-1℃静置1h，取上清液，加入氯化钠35g，0℃搅拌40min后静置1.5h，6000r/min离心15min，取上清液，加入盐100g，0℃搅拌55min，然后静置9h，9000r/min离心10min，取沉淀得透明质酸酶粗品；
(2)取步骤(1)中的沉淀，装入透析袋中，放入50g柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中，6℃透析13h，8000r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥，得透明质酸酶精品。测定透明质酸酶活力为329.2U/mL。
实施例3：从牛脾脏中提取透明质酸酶
(1)取新鲜牛脾脏100g，去除表皮包膜后，切成小块，加入2.0％生理盐水100g浸泡35min，然后加入提取液250g，用组织捣碎机捣碎，放入-8℃恒温箱中，用机械搅拌器搅拌，搅拌转速550r/min，50min后，0℃静置1h，取上清液，加入氯化钠35g，0℃搅拌50min后静置2h，6000r/min离心15min，取上清液，加入盐100g，0℃搅拌60min，然后静置9h，9000r/min离心10min，取沉淀得透明质酸酶粗品；
(2)取步骤(1)中的沉淀，装入透析袋中，放入50g柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中，7℃透析13h，8000r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥，得透明质酸酶精品。测定透明质酸酶活力为329.5U/mL。

Claims (8)

1.一种从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取新鲜牛脾脏，去除表皮包膜后，切成小块，加入2.0％生理盐水浸泡25-35min，然后加入提取液，用组织捣碎机捣碎，放入-8℃恒温箱中，用机械搅拌器搅拌，搅拌转速500-600r/min，40-60min后，-3℃-0℃静置1h，取上清液，加入氯化钠，0℃搅拌30-50min后静置1-2h，6000r/min离心15min，取上清液，加入盐，0℃搅拌50-60min，然后静置8-10h，9000r/min离心10min，取沉淀得透明质酸酶粗品；
(2)取步骤(1)中的沉淀，装入透析袋中，放入柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中，5-7℃透析12-14h，8000r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥，得透明质酸酶精品。
2.根据权利要求1所述的从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取新鲜牛脾脏，去除表皮包膜后，切成小块，加入2.0％生理盐水浸泡30min，然后加入提取液，用组织捣碎机捣碎，放入-8℃恒温箱中，用机械搅拌器搅拌，搅拌转速550r/min，50min后，-2℃静置1h，取上清液，加入氯化钠，0℃搅拌45min后静置1.5h，6000r/min离心15min，取上清液，加入盐，0℃搅拌55min，然后静置9h，9000r/min离心10min，取沉淀得透明质酸酶粗品；
(2)取步骤(1)中的沉淀，装入透析袋中，放入柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中，6℃透析13h，8000r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥，得透明质酸酶精品。
3.根据权利要求1或2所述的从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，其特征在于，所述的提取液由2-4重量份20％甘油、1-3重量份葡萄糖、130-150重量份柠檬酸、50-70重量份柠檬酸钠混合制成。
4.根据权利要求3所述的提取液，其特征在于：所述的提取液由3重量份20％甘油、2重量份葡萄糖、140重量份柠檬酸、60重量份柠檬酸钠混合制成。
5.根据权利要求1或2所述的从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，其特征在于：所述的盐为氯化铵。
6.根据权利要求1或2所述的从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，其特征在于：牛脾脏和2.0％生理盐水、提取液的质量比为：1∶1∶2-3。
7.根据权利要求1或2所述的从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，其特征在于：牛脾脏和氯化钠、盐的质量比为：1∶0.3-0.4∶0.8-1.2。
8.根据权利要求1或2所述的从牛脾脏中提取透明质酸酶的方法，其特征在于：牛脾脏和柠檬酸-氢氧化钠缓冲液的质量比为：1∶0.5。
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