JP2021509809A - コロナウイルス感染症の治療または予防に使用するためのプロテアーゼ活性を有するペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に使用するためのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。具体的には、本発明は、トリプシンを使用する、ヒトにおけるコロナウイルス感染症の治療または予防に関する。【選択図】図1
Description
本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症の治療および予防のためのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの使用に関する。具体的には、本発明は、トリプシン(例えば、海洋由来の、例えば、タイセイヨウダラ由来のトリプシンなど)を使用する哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に関する。
タイセイヨウダラ(Gadus morhua)トリプシンは、インビトロでヒトライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびインフルエンザウイルスなどのウイルスの感染力を低下させることが示されている(Fornbacke and Clarsund 2013、Gudmundsdottir,Hilmarsson et al.2013)。これは、類似の酵素と比較したその高い触媒効率に部分的に基づいていると考えられている(Asgeirsson,Fox et al.1989、Asgeirsson and Cekan 2006、Stefansson,Helgadottir et al.2010)。トリプシンは、それらの推定されるアミノ酸配列同一性に基づいて、I、II、およびIIIの3つの主要なグループに分類される(Spilliaert and Gudmundsdottir 1999)。最近同定されたタラトリプシンZT(WO2017/017012および出版のために提出された原稿の未発表データ:Sandholt GB,Stefansson B,Gudmundsdottir Aを参照)が、グループIIIのトリプシンのメンバーである一方で、タラトリプシンIおよびXは、多くの他のトリプシンのようにグループIに属している(Asgeirsson,Fox et al.1989、Gudmundsdottir,Gudmundsdottir et al.1993、Stefansson,Helgadottir et al.2010、Stefansson,Sandholt et al.2017)。
コロナウイルスは、Nidovirales目のCoronaviridae科のCoronavirinae亜科に属するウイルスの種である。コロナウイルスは、プラスセンス一本鎖RNAゲノムおよびらせん対称のヌクレオカプシドを有するエンベロープウイルスである。コロナウイルスのゲノムサイズは、約26〜32キロベースで、RNAウイルスに対して最大である。「コロナウイルス」という名前は、王冠またはハローを意味するラテン語のコロナに由来し、王冠または日光冠を連想させるイメージを作る大きい球状の表面突出部のフリンジを伴う、電子顕微鏡法(E.M.)の下でのビリオンの特徴的な外観を指す。この形態は、ウイルススパイク(S)ペプロマーによって作られ、これは、ウイルスの表面に集中し、宿主指向性を決定するタンパク質である。全てのコロナウイルスの全体的な構造に寄与するタンパク質は、スパイク(S)、エンベロープ(E)、膜(M)、およびヌクレオカプシド(N)タンパク質である。SARSコロナウイルス(以下を参照)の特定の場合において、S上の定義された受容体結合ドメインは、ウイルスの、その細胞受容体であるアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)への付着を仲介する。一部のコロナウイルス(具体的にはベータコロナウイルスサブグループAのメンバー)はまた、ヘマグルチニンエステラーゼ(HE)と呼ばれるより短いスパイク状タンパク質を有する。
コロナウイルスは主に、哺乳動物および鳥類の気道および胃腸管に感染する。それらは、ライノウイルス、インフルエンザ、および呼吸器合胞体ウイルスと共に、風邪の根底にある感染因子の1つであることが知られている(Heikkinen and Jarvinen 2003、Hull,Rennie et al.2007)。風邪の症例の約10〜15%は、コロナウイルスによって引き起こされると推定されている(Hull,Rennie et al.2007、Jonsdottir and Dijkman 2016)。6つの既知のコロナウイルスのうちの4つは順に、健常者において上気道疾患および風邪を引き起こす(即ち、229E、OC43、NL63、およびHKU1)(Bradburne,Bynoe et al.1967、Kraaijeveld,Reed et al.1980)。他の2つのコロナウイルスは、重症肺炎を引き起こす可能性がある重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルスおよび中東呼吸器症候群(MERS)コロナウイルスである(Park,Li et al.2016)。コロナウイルス感染症は、スパイクタンパク質とその同族細胞受容体の付着で始まる(Jonsdottir and Dijkman 2016、Lim,Ng et al.2016)。SARS−CoVおよびMERS−CoVは、細胞侵入にそれらのスパイクタンパク質を使用することによって上皮細胞に感染することが知られている(Park,Li et al.2016)。コロナウイルスの細胞指向性および宿主域は、コロナウイルススパイク(S)タンパク質によって部分的に決定され、これは細胞受容体に結合し、膜融合を仲介する(Graham and Baric 2010)。
MERSおよびSARSは、大流行(WHO)を引き起こす可能性が高いため、緊急の研究を必要とするWHOの疾患優先順位リストのトップにある。CoVファミリーの流行の可能性は、ワクチンおよび抗ウイルス剤の必要性を強調している。現在、ヒトにおけるコロナウイルス誘発性疾患を治療するための一般的な療法はなく、市販のワクチンも入手可能ではない(Jonsdottir and Dijkman 2016)。したがって、コロナウイルスを不活性化することが可能な新しい療法を見つけることが重要である。
したがって、本発明は、コロナウイルスによる感染症を治療および予防するための新しい療法の必要性に取り組もうとする。
本発明の第1の態様は、哺乳動物または鳥類などの対象におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に使用するためのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
「プロテアーゼ活性を有するポリペプチド」とは、哺乳動物(例えば、ヒト)の体内においてインビボでタンパク質分解を触媒することが可能である任意のポリペプチド(自然発生的および非自然発生的の両方)を含む。したがって、セリンプロテアーゼ(トリプシン/キモトリプシンなど)、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを含むがこれらに限定されない、任意のタイプのプロテアーゼが本発明で利用され得る。
「コロナウイルス感染症」とは、Coronaviridae科(Coronavirinae亜科)の、対象におけるコロナウイルスの成長によって引き起こされるか、または別様にそれに関連する感染症を意味する。
「治療」には、コロナウイルス感染症の症状(例えば、咽頭痛、鼻づまりおよび/もしくは鼻水、咳、ならびに/または風邪に関連する体温の上昇)の緩和が含まれる。そのような治療は、炎症に関連する微生物因子の根絶、または人口増加の遅延を含み得る。
「予防」には、患者におけるコロナウイルス感染症のリスクの低減が含まれる。しかしながら、そのような予防は絶対的ではない可能性があり、すなわち、それは、そのような全ての患者がコロナウイルス感染を発症することを予防しない可能性があるか、または単一の個体における感染症を部分的にのみ予防し得ることが理解される。したがって、「予防(prevention)」および「予防法(prophylaxis)」という用語は、互換的に使用され得る。
一実施形態では、コロナウイルス感染症は、上気道および/または下気道感染症である。あるいはまたはさらに、コロナウイルス感染症は、胃腸管にあり得る。MERSなどの特定のコロナウイルスは、腎上皮細胞にも感染し得る。
「上気道」には、口、鼻、副鼻腔、中耳、喉、喉頭、および気管が含まれる。
「下気道」には、気管支(bronchial tube)(気管支(bronchi))および肺(気管支(bronchi)、細気管支、および肺胞)、ならびに肺の間質組織が含まれる。
「胃腸管」とは、口、食道、胃、および腸を含む、口から肛門までの管を意味する。
別の実施形態では、コロナウイルス感染症は、腎感染症である。
一実施形態では、コロナウイルス感染症は、風邪、肺炎、肺臓炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群(SARS)、中東呼吸器症候群(MERS)、副鼻腔炎、耳炎、および咽頭炎から群から選択される。
コロナウイルス感染症に関連する他の兆候は、Gralinski&Baric,2015、J.Pathol.235:185−195 and Cavanagh,2005、“Coronaviridae:a review of coronaviruses and toroviruses”,Coronaviruses with Special Emphasis on First Insights Concerning SARS 1(A.Schmidt,M.H.Wolff and O.Weber編集)Birkhauser Verlag Basel,Switzerlandに記載されている(これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
したがって、好ましい一実施形態では、コロナウイルス感染症は、風邪である。
コロナウイルスは、以下から選択され得る。
(a)アルファコロナウイルス(ヒトコロナウイルス229Eなど)、
(b)ベータコロナウイルス(ヒトコロナウイルスHKU1など)、
(c)ガンマコロナウイルス(トリコロナウイルスなど)、および
(d)デルタコロナウイルス(ヒヨドリコロナウイルスなど)。
(a)アルファコロナウイルス(ヒトコロナウイルス229Eなど)、
(b)ベータコロナウイルス(ヒトコロナウイルスHKU1など)、
(c)ガンマコロナウイルス(トリコロナウイルスなど)、および
(d)デルタコロナウイルス(ヒヨドリコロナウイルスなど)。
アルファコロナウイルスの例としては、アルファコロナウイルス1、コウモリコロナウイルスCDPHE15、コウモリコロナウイルスHKU10、ヒトコロナウイルス229E、ヒトコロナウイルスNL63、ミニオプトラスコウモリコロナウイルス1、ミニオプトラスコウモリコロナウイルスHKU8、ミンクコロナウイルス1、ブタ流行性下痢ウイルス、リノロフスコウモリコロナウイルスHKU2、およびスコトフィラスコウモリコロナウイルス512が挙げられる。
ベータコロナウイルスの例としては、マウスコロナウイルス、ベータコロナウイルス1、ハリネズミコロナウイルス1、ヒトコロナウイルスHKU1、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、アブラコウモリコロナウイルスHKU5、ルーセットコウモリコロナウイルスHKU9、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、およびタケコウモリコロナウイルスHKU4が挙げられる。
ガンマコロナウイルスの例としては、トリコロナウイルスおよびシロイルカコロナウイルスSW1が挙げられる。
デルタコロナウイルスの例としては、ヒヨドリコロナウイルスHKU11、バンコロナウイルスHKU21、コロナウイルスHKU15、ムニアコロナウイルスHKU13、ゴイサギコロナウイルスHKU19、ツグミコロナウイルスHKU12、メジロコロナウイルスHKU16、およびヒドリガモHKU20が上げられる。
したがって、例示的な実施形態では、コロナウイルスは、ヒトコロナウイルスである。
例えば、コロナウイルスは、以下から選択され得る。
(a)ヒトコロナウイルス229E、
(b)ヒトコロナウイルスOC43、
(c)重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS−CoV)
(d)ヒトコロナウイルスNL63(HCoV−NL63、ニューヘブンコロナウイルス)、
(e)ヒトコロナウイルスHKU1、および
(f)中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS−CoV)。
(a)ヒトコロナウイルス229E、
(b)ヒトコロナウイルスOC43、
(c)重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS−CoV)
(d)ヒトコロナウイルスNL63(HCoV−NL63、ニューヘブンコロナウイルス)、
(e)ヒトコロナウイルスHKU1、および
(f)中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS−CoV)。
したがって、一実施形態では、治療される対象は、ヒトである。
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択される。
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、セリンプロテアーゼである。「セリンプロテアーゼ」とは、タンパク質中のペプチド結合を開裂することが可能な自然発生的および非自然発生的の両方の触媒ポリペプチドを含み、セリンは、ポリペプチドの活性部位で求核性アミノ酸として機能する(EC番号3.4.21に従って定義されるように)。セリンプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼ活性(すなわち、トリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼ)、またはサブチリシン様プロテアーゼ活性を有し得る。
したがって、一実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である。
したがって、本発明のポリペプチドは、トリプシン活性を示し得る。「トリプシン活性」とは、ポリペプチドがトリプシン酵素(EC 3,4,21,4)または関連ペプチダーゼ(キモトリプシン酵素、EC 3,4,21,1など)のペプチダーゼ活性を示すことを意味する。例えば、プロテアーゼは、真核生物または原核生物起源の自然発生的なトリプシン、またはそのようなトリプシンの変異型であり得る。
本発明のポリペプチドは、自然発生的または非自然発生的であってもよい。
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、自然発生的なプロテアーゼ(海洋、例えば、タラ、または哺乳動物、例えば、ウシ源由来など)のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。例えば、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、真核生物または原核生物起源のいずれかの、自然発生的なトリプシンのアミノ酸配列からなり得る。
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、低温適応性であり、すなわち、ポリペプチドは好冷性である。「低温適応性」とは、ポリペプチドが低温環境からの生物に由来し、したがって低温で機能するように適応されていることを意味する。例えば、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、25℃または37℃などのより高い温度よりも15℃でより長い期間、プロテアーゼ活性を示し得る(Stefansson et al.,2010,Comparative Biochem.Physiol:Part B−Biochem.& Mol.Biol.,155(2):186−194を参照(その開示は参照により組み込まれる))。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、海洋セリンプロテアーゼである。海洋セリンプロテアーゼは、例えば、タラ、スケトウダラ、サケ、またはオキアミから入手可能であり得る。海洋プロテアーゼの他の可能な供給源としては、ナマズ、コダラ、ホキ、メルルーサ、レッドフィッシュ、ラフィー、ティラピア、ホワイティング、チリシーバスが上げられる。具体的には、タイセイヨウダラ(Gadus morhua)、タイセイヨウおよびタイヘイヨウサケ(例えば、Salmo salarおよびOncorhynchusの種)、ならびにアラスカスケトウダラ(Theragra chalcogramma)のトリプシンなどの低温適応性トリプシンが含まれる。例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下に列記されるように、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸を含むかまたはそれからなってもよい。
したがって、好ましい実施形態では、海洋セリンプロテアーゼは、タイセイヨウダラから入手可能である。
自然発生的なセリンプロテアーゼは、供給源の生物(例えば、タイセイヨウダラ)から精製もしくは単離され得るか、または組換え発現され得る。
したがって、本発明のそのような自然発生的なセリンプロテアーゼポリペプチドが、それらが自然界に見られるものとは異なる形態で提供されることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、本発明のポリペプチドは、組成物またはそれが自然界に見られる形態から、全体的または部分的に単離され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、自然発生的な真核生物トリプシンのアミノ酸配列からなり得るが、それが自然界で発現されるとき、タンパク質と比較して変化した翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)を有するように、組換え手段によって発現される。
好ましい実施形態では、海洋セリンプロテアーゼは、トリプシン、例えばトリプシンI、トリプシンX、トリプシンY、またはトリプシンZTである(例えば、以下を参照)。
トリプシンの3つの主要なアイソザイムは、元々タイセイヨウダラから特徴付けられ、トリプシンI、II、およびIIIと指定された(Asgeirsson et al.,1989,Eur.J.Biochem.180:85−94を参照(その開示は参照により本明細書に組み込まれる))。例えば、タイセイヨウダラのトリプシンIは、GenBankアクセッション番号ACO90397で定義されている(Stefansson et al.,2010,Comp.Biochem.Physiol.B,Biochem.Mol.Biol.155(2),186−194を参照(その開示は参照により本明細書に組み込まれる))。その後、タイセイヨウダラによって産生されたトリプシンはさらに特徴付けられ、今ではトリプシンI、トリプシンZT、トリプシンX、およびトリプシンYを含む多数の異なるアイソフォームが特徴付けられている(以下を参照)。
加えて、タイセイヨウダラは、キモトリプシンAおよびBと指定されたキモトリプシンの2つの主要なアイソザイムを発現する(Asgeirsson&Bjarnason,1991,Comp.Biochem.Physiol.B 998:327−335を参照(その開示は参照により本明細書に組み込まれる))。例えば、GenBankアクセッション番号CAA55242.1を参照されたい。
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ(Gadus morhua)由来のトリプシンIのアミノ酸配列、すなわち、配列番号1もしくは配列番号2、
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSRIEVRLGEHHIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLSKPATLNQYVQPVALPTECAADGTMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[配列番号1]
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[配列番号2]
.B 998:327−335(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持する、配列番号1または2のそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物(またはフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物)を含むかまたはそれからなる。
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSRIEVRLGEHHIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLSKPATLNQYVQPVALPTECAADGTMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[配列番号1]
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[配列番号2]
.B 998:327−335(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持する、配列番号1または2のそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物(またはフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物)を含むかまたはそれからなる。
トリプシンIのさらなる詳細は、Gudmundsdоttir et al.,1993,Eur J Biochem.217(3):1091−7およびStefansson et al.,2010,Comp.Biochem.Physiol.B,Biochem.Mol.Biol.155(2),186−194に見られる(それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
あるいは、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ(Gadus morhua)由来のトリプシンZTアイソフォームのアミノ酸配列、例えば、配列番号3〜7を含み得るかまたはそれからなり得る(Enzymatica ABのWO 2017/017012を参照(その開示は参照により本明細書に組み込まれる))。
配列番号3は、以下に示されるZT−アイソフォーム、ZT−1〜ZT−4のコンセンサス配列である。
IX1GGX2X3CEPX4SRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHEX5YDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEX6VX7CX8AX9YPGMISPRMX10CX11GX12MDGGRDX13CNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGX14GCAX15PNX16PGVYVKVYEX17LSWIQTTLDANP
[配列番号3]
ここで、
X1は、IおよびVから選択され、
X2は、QおよびHから選択され、
X3は、DおよびEから選択され、
X4は、RおよびNから選択され、
X5は、Lであり、
X6は、TおよびPから選択され、
X7は、DおよびAから選択され、
X8は、EおよびQから選択され、
X9は、AおよびSから選択され、
X10は、VおよびMから選択され、
X11は、AおよびVから選択され、
X12は、YおよびFから選択され、
X13は、AおよびVから選択され、
X14は、QおよびRから選択され、
X15は、LおよびEから選択され、
X16は、YおよびSから選択され、
X17は、YおよびFから選択される。
タイセイヨウダラトリプシンZT−1アイソフォーム:
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
[配列番号4]
タイセイヨウダラトリプシンZT−2アイソフォーム:
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号5]
タイセイヨウダラトリプシンZT−3アイソフォーム:
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
[配列番号6]
タイセイヨウダラトリプシンZT−4アイソフォーム:
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号7]
IX1GGX2X3CEPX4SRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHEX5YDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEX6VX7CX8AX9YPGMISPRMX10CX11GX12MDGGRDX13CNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGX14GCAX15PNX16PGVYVKVYEX17LSWIQTTLDANP
[配列番号3]
ここで、
X1は、IおよびVから選択され、
X2は、QおよびHから選択され、
X3は、DおよびEから選択され、
X4は、RおよびNから選択され、
X5は、Lであり、
X6は、TおよびPから選択され、
X7は、DおよびAから選択され、
X8は、EおよびQから選択され、
X9は、AおよびSから選択され、
X10は、VおよびMから選択され、
X11は、AおよびVから選択され、
X12は、YおよびFから選択され、
X13は、AおよびVから選択され、
X14は、QおよびRから選択され、
X15は、LおよびEから選択され、
X16は、YおよびSから選択され、
X17は、YおよびFから選択される。
タイセイヨウダラトリプシンZT−1アイソフォーム:
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
[配列番号4]
タイセイヨウダラトリプシンZT−2アイソフォーム:
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号5]
タイセイヨウダラトリプシンZT−3アイソフォーム:
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
[配列番号6]
タイセイヨウダラトリプシンZT−4アイソフォーム:
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号7]
ポリペプチドは、任意にトリプシンI、X、および/またはYと組み合わせて、上記のトリプシンZTアイソフォームのうちの1つ以上の混合物として存在し得ることが、当業者によって理解されるであろう。
あるいは、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ由来のトリプシンXのアミノ酸配列、例えば、配列番号8〜11を含み得るかまたはそれからなり得る(Stefansson et al.,2017,Biochim Biophys Acta.1865(1):11−19を参照(その開示は参照により本明細書に組み込まれる))。
タイセイヨウダラトリプシンX:
IVGGYECTRHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEGTEQFISSSSVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLTEPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSGWGNTMSSVDDGDKLQCLNLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDNPGVYAKVCVLSGWVRDTMASY
[配列番号8]
タイセイヨウダラトリプシンX−1:
IVGGYECTRHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSRIEVRLGEHHIRVNEGTEQFISSSSVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLSEPATLNQYVQPVALPTECAADGTMCTVSGWGNTMSSVDDGDKLQCLNLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDNPGVYAKVCVLSGWVRDTMASY
[配列番号9]
タイセイヨウダラトリプシンX−2:
IVGGYECTRHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSRIEVRLGEHHIRVNEGTEQFISSSSVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLSKPATLNQYVQTVALPTECAADGTMCTVSGWGNTMSSVDDGDKLQCLNLPILSHADCSNSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDNPGVYAKVCVLSGWVRDTMASY
[配列番号10]
タイセイヨウダラトリプシンX−3:
IVGGYECTRHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSRIEVRLGEHHIRVNEGTEQFISSSSVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLSEPATLNQYVQTVALPTECAADGTMCTVSGWGNTMSSVDDGDKLQCLNLPILSHADCSNSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDNPGVYAKVCVLSGWVRDTMASY
[配列番号11]
タイセイヨウダラトリプシンX:
IVGGYECTRHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEGTEQFISSSSVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLTEPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSGWGNTMSSVDDGDKLQCLNLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDNPGVYAKVCVLSGWVRDTMASY
[配列番号8]
タイセイヨウダラトリプシンX−1:
IVGGYECTRHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSRIEVRLGEHHIRVNEGTEQFISSSSVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLSEPATLNQYVQPVALPTECAADGTMCTVSGWGNTMSSVDDGDKLQCLNLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDNPGVYAKVCVLSGWVRDTMASY
[配列番号9]
タイセイヨウダラトリプシンX−2:
IVGGYECTRHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSRIEVRLGEHHIRVNEGTEQFISSSSVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLSKPATLNQYVQTVALPTECAADGTMCTVSGWGNTMSSVDDGDKLQCLNLPILSHADCSNSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDNPGVYAKVCVLSGWVRDTMASY
[配列番号10]
タイセイヨウダラトリプシンX−3:
IVGGYECTRHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSRIEVRLGEHHIRVNEGTEQFISSSSVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLSEPATLNQYVQTVALPTECAADGTMCTVSGWGNTMSSVDDGDKLQCLNLPILSHADCSNSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDNPGVYAKVCVLSGWVRDTMASY
[配列番号11]
あるいは、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ由来のトリプシンYのアミノ酸配列、例えば、配列番号12を含み得るかまたはそれからなり得る(Palsdottir&Gudmundsdottir,2008,FoodChem.111(2):408−14を参照(その開示は参照により本明細書に組み込まれる))。
タイセイヨウダラトリプシンY:
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHEQYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号12]
タイセイヨウダラトリプシンY:
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHEQYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号12]
したがって、例示的な実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号1〜12のいずれか1つによるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。そのようなポリペプチドは、例えば、Asgeirsson et al.,1989,Eur.J.Biochem.180:85−94(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるように、タイセイヨウダラから精製され得る。
本発明の好適で例示的なポリペプチド、およびそれらの製造方法はまた、欧州特許第1 202 743 B号(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)にも記載されている。
多くのプロテアーゼと同様に、タイセイヨウダラ由来のトリプシンIは、開裂されて成熟した活性トリプシンを生成するプロペプチド(または「活性化」)配列を含む、不活性前駆体またはチモーゲンとして産生される。トリプシンの最初の発現産物は、発現後に除去されるシグナル配列も含む。
シグナル配列を含む、配列番号1に対応するタイセイヨウダラ由来のトリプシンIの変異体のチモーゲン配列が、配列番号13として以下に示される(Genbankデータベースアクセッション番号ACO90397.1に対応する)。
ここで、
シグナルペプチド=アミノ酸1〜13(下線)
プロペプチド=アミノ酸14〜19(太字斜体)
成熟トリプシン=アミノ酸20〜241
ここで、
シグナルペプチド=アミノ酸1〜13(下線)
プロペプチド=アミノ酸14〜19(太字斜体)
成熟トリプシン=アミノ酸20〜241
シグナル配列を含む、配列番号2に対応するタイセイヨウダラ由来の変異体トリプシンIのチモーゲン配列が、配列番号14として以下に示される(Uniprotデータベースアクセッション番号P16049−1に対応する)。
ここで、
シグナルペプチド=アミノ酸1〜13(下線)
プロペプチド=アミノ酸14〜19(太字斜体)
成熟トリプシン=アミノ酸20〜241
ここで、
シグナルペプチド=アミノ酸1〜13(下線)
プロペプチド=アミノ酸14〜19(太字斜体)
成熟トリプシン=アミノ酸20〜241
シグナル配列を含む、配列番号8に対応する変異体トリプシンXのチモーゲン配列が、配列番号15として以下に示される(Genbankアクセッション番号No.Q91041.2に対応する)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
シグナル配列を含む、配列番号9に対応する変異体トリプシンX−1のチモーゲン配列が、配列番号16として以下に示される(Genbankアクセッション番号No.AOX15769.1に対応する)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
シグナル配列を含む、配列番号10に対応する変異体トリプシンX−2のチモーゲン配列が、配列番号17として以下に示される(Genbankアクセッション番号No.AOX15770.1に対応する)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
シグナル配列を含む、配列番号11に対応する変異体トリプシンX−3のチモーゲン配列が、配列番号18として以下に示される(Genbankアクセッション番号No.AOX15771.1に対応する)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
シグナル配列を含む、配列番号12に対応する変異体トリプシンYのチモーゲン配列が、配列番号19として以下に示される(Genbankアクセッション番号No.CAD30563.1に対応する)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
(ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である)。
配列番号3〜7によって表されるトリプシンZTアイソフォームは、これらのトリプシンの活性変異体、すなわち、トリプシンのN末端の開裂によって活性化された変異体を表す。これらのトリプシンは、幽門垂/膵臓(魚の膵臓組織)で発現されるタンパク質であり、細胞外への分泌および酵素を不活性化に保持することに重要である多くのアミノ酸が、N末端上にある。
例えば、全長トリプシンZTアイソフォームはまた、本明細書において以下のように開示される:
非開裂タイセイヨウダラトリプシンZT−1アイソフォーム:
MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
[配列番号20]
非開裂タイセイヨウダラトリプシンZT−2アイソフォーム:
MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号21]
非開裂タイセイヨウダラトリプシンZT−3アイソフォーム:
MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
[配列番号22]
非開裂タイセイヨウダラトリプシンZT−4アイソフォーム:
MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号23]
非開裂タイセイヨウダラトリプシンZT−1アイソフォーム:
MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
[配列番号20]
非開裂タイセイヨウダラトリプシンZT−2アイソフォーム:
MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号21]
非開裂タイセイヨウダラトリプシンZT−3アイソフォーム:
MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
[配列番号22]
非開裂タイセイヨウダラトリプシンZT−4アイソフォーム:
MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
[配列番号23]
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語には、標準の20の遺伝的にコードされたアミノ酸およびそれらの対応する「D」型(天然の「L」型と比較して)の立体異性体、オメガアミノ酸、およびその他の自然発生的なアミノ、非従来型アミノ酸(例えば、α,α−二置換アミノ酸、N−アルキルアミノ酸など)、ならびに化学的に誘導体化されたアミノ酸が含まれる(以下を参照)。
「アラニン」または「Ala」または「A」など、アミノ酸が具体的に列挙されている場合、この用語は、特に明記しない限り、L−アラニンおよびD−アラニンの両方を指す。所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、他の非従来型アミノ酸も本発明のポリペプチドに適した構成成分であり得る。示されるペプチドについて、各コードされたアミノ酸残基は、適切な場合、従来型アミノ酸の慣用名に対応する1文字表記によって表される。
慣例に従って、本明細書に開示されるアミノ酸配列は、N末端からC末端の方向で提供される。
典型的には、本発明のポリペプチドは、L−アミノ酸を含むかまたはそれからなる。
当業者は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、上記のアミノ酸配列の1つ、例えば配列番号1〜12のそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物(または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物)を含むかまたはそれからなり、ただし、前述のフラグメント、変異体、誘導体、または融合物が、前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を(少なくとも部分的に)保持することを条件とすることを理解するであろう。
トリプシン活性は、当該技術分野で周知の方法を使用して決定され得る。例えば、トリプシンアッセイキットは、Abcam,Cambridge,UK(カタログ番号ab102531を参照)および他の供給元から市販されている。一実施形態では、トリプシン活性は、基質としてCbz−Gly−Pro−Arg−p−ニトロアニリド(Cbz−GPR−pNA)を使用して測定される(EP1,202,743 BおよびStefansson et al.,2010,Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.155(2):186−94を参照(それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる))。
典型的には、プロテアーゼポリペプチドは、少なくとも1U/mg、例えば少なくとも10U/mg、少なくとも50U/mg、少なくとも100U/mg、少なくとも200U/mg、または500U/mgのポリペプチドの比活性を有する。本明細書で使用される場合、「U」は、酵素単位を意味する(1Uは、1分当たりの1マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量である)。
したがって、ポリペプチドが配列番号1〜12のいずれか1つによるアミノ酸配列を含む場合、それは、そのN末端および/またはC末端に、配列番号1〜12のものを超える追加のアミノ酸を含み得る。同様に、ポリペプチドが配列番号1〜12によるアミノ酸配列のフラグメント、変異体、または誘導体を含む場合、それは、そのN末端および/またはC末端に追加のアミノ酸を含み得る。
あるいは、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号1〜12などのそのような野生型トリプシンのフラグメントに対応し得、ただし、前述のフラグメントが、それが得られる自然発生的なトリプシンタンパク質のトリプシン活性を(少なくとも部分的に)保持することを条件とする。したがって、ポリペプチドは、配列番号1〜12の少なくとも10連続アミノ酸、例えば、配列番号1〜12のいずれか1つの少なくとも15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、または240連続アミノ酸を含み得かまたはそれからなり得る。
例えば、フラグメントは、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸残基61〜77を含み得るかまたはそれからなり得る。あるいはまたはさらに、フラグメントは、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸残基225〜241を含み得るかまたはそれらからなり得る。
本発明のポリペプチドが、配列番号1〜12のいずれか1つによるアミノ酸配列(またはそのフラグメント)の変異体を代替的に含み得るかまたはそれらからなり得ることは、当業者によって理解されるであろう。そのような変異体は、非自然発生的な変異体であり得る。
ポリペプチドの「変異体」とは、保存的または非保存的のいずれかの挿入、欠失、および置換を含む。特に、そのような変化が前述のポリペプチドのトリプシン活性を少なくとも部分的に保持するポリペプチドの変異体を含む。
そのような変異体は、組換えポリヌクレオチドを使用した、当該技術分野で周知のタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を使用して作製され得る(Molecular Cloning:a Laboratory Manual,4th edition,Green&Sambrook,2012,Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照(これは参照により本明細書に組み込まれる))。
一実施形態では、変異体は、配列番号1〜12のいずれか1つによるアミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも50%の同一性、例えば少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
2つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、好適なコンピュータプログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのGAPプログラムを使用して決定され得、同一性パーセントが、その配列が最適にアライメントされたポリペプチドに関して計算されることが理解されるであろう。
あるいは、アラインメントは、Clustal Wプログラム(Thompson et al.,1994,Nuc.Acid Res.22:4673−4680に記載されるような(これは参照により本明細書に組み込まれる))を使用して実施されてもよい。
使用されるパラメータは、以下のとおりであってもよい。
高速ペアワイズアライメントパラメータ:Kタプル(ワード)サイズ;1、ウィンドウサイズ;5、ギャップペナルティ;3、トップダイアゴナル数;5。スコアリング方法:xパーセント。
複数のアライメントパラメータ:ギャップオープンペナルティ;10、ギャップ延長ペナルティ;0.05である。
スコアリングマトリックス:BLOSUM。
高速ペアワイズアライメントパラメータ:Kタプル(ワード)サイズ;1、ウィンドウサイズ;5、ギャップペナルティ;3、トップダイアゴナル数;5。スコアリング方法:xパーセント。
複数のアライメントパラメータ:ギャップオープンペナルティ;10、ギャップ延長ペナルティ;0.05である。
スコアリングマトリックス:BLOSUM。
あるいは、局所配列アライメントを決定するために、BESTFITプログラムが使用されてもよい。
プロテアーゼ活性を有する変異体ポリペプチドの例は、Enzymatica ABのWO2015/150799に開示されており、その開示は参照により組み込まれる。
本発明の第1の態様のさらなる実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、融合タンパク質を含むかまたはそれからなる。
ポリペプチドの「融合」とは、他の任意のポリペプチドに融合したプロテアーゼ活性を有するポリペプチドに対応するアミノ酸配列(配列番号1〜12などまたはそのフラグメントもしくは変異体)を含む。例えば、前述のポリペプチドは、前述のポリペプチドの精製を容易にするために、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)またはプロテインAなどのポリペプチドに融合されてもよい。そのような融合の例は、当業者に周知である。同様に、前述のポリペプチドは、His6などのオリゴ−ヒスチジンタグ、または周知のMycタグエピトープなどの抗体によって認識されるエピトープに融合されてもよい。前述のポリペプチドの任意の変異体または誘導体への融合もまた、本発明の範囲に含まれる。
融合物は、本発明の前述のポリペプチドに望ましい特徴を与えるさらなる部分を含んでもよく、例えば、その部分は、治療効果を増大または延長するのに有用であり得る。例えば、一実施形態では、融合物は、ヒト血清アルブミンまたは類似のタンパク質を含む。
あるいは、融合部分は、当業者に周知のように、例えば、ビオチン部分、放射性部分、蛍光部分、例えば、小フルオロフォアまたは緑色蛍光タンパク質(GFP)フルオロフォアであってもよい。その部分は、当業者に既知のように、免疫原性タグ、例えば、Mycタグであってもよく、または当業者に既知のように、ポリペプチドの細胞取り込みを促進することが可能である親油性分子またはポリペプチドドメインであってもよい。
本発明の第1の態様のさらなる実施形態では、ポリペプチド、またはそのフラグメント、変異体、融合物、もしくは誘導体は、修飾または誘導体化された1つ以上のアミノ酸を含むかまたはそれからなる。
1つ以上のアミノ酸の化学的誘導体は、官能性側基との反応によって達成され得る。そのような誘導体化分子には、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、p−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、t−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成した分子が含まれる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて塩、メチル、およびエチルエステル、または他のタイプのエステルおよびヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されてO−アシルまたはO−アルキル誘導体を形成し得る。化学的誘導体としては、20の標準アミノ酸の自然発生的なアミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、4−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してもよく、5−ヒドロキシリジンでリジンを置換してもよく、3−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換してもよく、ホモセリンでセリンを、オルニチンでリジンを置換してもよい。誘導体には、必要な活性が維持される限り、1つ以上の付加または欠失を含むペプチドも含まれる。他に含まれる修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化(例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化)、末端カルボキシルアミド化(例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる)、および同様の末端修飾である。
ペプチド模倣化合物もまた有用であり得ることが当業者によってさらに理解されるであろう。したがって、「ポリペプチド」には、配列番号1〜12のいずれかのポリペプチドのプロテアーゼ活性を有するペプチド模倣化合物が含まれる。「ペプチド模倣物」という用語は、治療薬としての特定のペプチドの配座および望ましい特徴を模倣する化合物を指す。
例えば、本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド(−CO−NH−)結合によって結合されている分子だけでなく、ペプチド結合が逆転されている分子も含む。そのようなレトロ−インベルソペプチド模倣物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるMeziere et al.(1997)J.Immunol.159,3230−3237に記載されているものなど、当該技術分野で既知の方法を使用して作製され得る。このアプローチは、側鎖の配向ではなく、主鎖を伴う変化を含む疑似ペプチドを作製することを含む。CO−NHペプチド結合の代わりにNH−CO結合を含むレトロ−インバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかに耐性がある。あるいは、本発明のポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸残基が従来のアミド結合の代わりに−y(CH2NH)−結合によって結合されているペプチド模倣化合物であってもよい。
さらなる代替において、ペプチド結合は、完全に省かれてもよく、ただし、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分が使用されるということを条件とし、リンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ平面性を有することが有利であり得る。
ポリペプチドは、N−またはC−末端で好都合にブロックされて、エキソタンパク質分解消化に対する感受性の低下を助け得ることが理解されるであろう。
ポリペプチドを修飾するために、d−アミノ酸およびN−メチルアミノ酸などの様々な非コードまたは修飾アミノ酸も使用されている。加えて、推定される生物活性配座は、環化などの共有結合修飾によって、またはラクタムもしくは他のタイプの架橋の組み込みによって安定化され得、例えば、Veber et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:2636およびThorsett et al.,1983,Biochem.Biophys.Res.Comm.111:166を参照されたい(これらは参照により本明細書に組み込まれる)。
しかしながら、好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドは、PEG化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、および/またはアルキル化によって修飾または誘導体化された1つ以上のアミノ酸を含む。
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、任意の適切な長さであり得ることが、当業者によって理解されるであろう。一実施形態では、ポリペプチドは、10〜30アミノ酸長、例えば10〜20、12〜18、12〜16、または15〜20アミノ酸長である。あるいは、ポリペプチドは、150〜250アミノ酸長、例えば、200〜250、210〜240、220〜230、または220〜225アミノ酸長であり得る。
典型的には、ポリペプチドは直鎖状である。
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドが自然発生的なプロテアーゼである場合、タンパク質は、当該技術分野で既知の方法を使用して、その天然源から抽出および/または精製(例えば、単離)され得る。
例えば、タイセイヨウダラ由来のトリプシンなどの海洋由来のトリプシンは、Jon Bragi BjarnasonのEP1 202 743 B(その開示は参照により組み込まれる)に記載される抽出方法を使用して産生され得る。
代替の実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、組換え法によって産生され得る。
したがって、本発明で使用するためのポリペプチド、ならびにそれを産生するための核酸分子、ベクター、および宿主細胞は、当該技術分野で周知の方法を使用して作製され得る(例えば、Green & Sambrook,2012,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Fourth Edition,Cold Spring Harbor,New Yorkを参照(その文書内の関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる))。
トリプシンなどのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを産生するための組換え方法は、EnzymaticaのWO2015/150799に開示されており、その開示は参照により組み込まれる。
さらなる代替の実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、液相および固相合成(例えば、t−Boc固相ペプチド合成およびBOP−SPPS)などの既知の手段によって合成されてもよい。
本発明はまた、上記のポリペプチドの薬学的に許容される酸または塩基付加塩の使用を含むことが、当業者によって理解されるであろう。本発明において有用な上記のベース化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するために使用される酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち、薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩、例えば、とりわけ、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、重酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩[すなわち、1,1’−メチレン−ビス−(2−ヒドロキシ−3ナフトエート)]塩を形成するものである。
薬学的に許容される塩基付加塩はまた、ポリペプチドの薬学的に許容される塩形態を産生するために使用され得る。本来酸性である本化合物の薬学的に許容される塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、そのような化合物と非毒性の塩基塩を形成するものである。そのような非毒性の塩基塩としては、とりわけ、アルカリ金属カチオン(例えば、カリウムおよびナトリウム)ならびにアルカリ土類金属カチオン(例えば、カルシウムおよびマグネシウム)などの薬理学的に許容されるカチオン、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、例えば、N−メチルグルカミン−(メグルミン)、ならびに低級アルカノールアンモニウムおよび薬学的に許容される有機アミンの他の塩基塩由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチドは、保存のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構成され得ることがさらに理解されるであろう。任意の好適な凍結乾燥方法(例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥)および/または再構成技術が用いられ得る。凍結乾燥および再構成は、様々な程度の活性損失をもたらす可能性があり、補償するために使用レベルを上方に調整する必要があり得ることは、当業者によって理解されるであろう。好ましくは、凍結乾燥(フリーズドライ)ポリペプチドは、再水和した場合にその活性(凍結乾燥前)の約20%以下、または約25%以下、または約30%以下、または約35%以下、または約40%以下、または約45%以下、または約50%以下を損失する。
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、典型的には、ポリペプチドが薬学的に許容される緩衝液、希釈剤、担体、補助剤、または賦形剤と一緒に製剤化される治療用組成物の形態で提供される。EDTA、クエン酸塩、EGTA、またはグルタチオンなどのキレート剤を含む追加の化合物が、組成物に含まれ得る。抗菌用/治療用組成物は、十分に貯蔵安定性があり、ヒトおよび動物への投与に適している、当該技術分野で既知の方法で調製され得る。治療用組成物は、例えば、フリーズドライ、噴霧乾燥、噴霧冷却を通して、または超臨界粒子形成からの粒子形成の使用を通して凍結乾燥され得る。
本発明のポリペプチドはまた、製品(例えば、点耳剤、洗浄組成物など)に治療的、予防的および/または美容的利点を与えるために、局所適用のための製剤に、例えば、化粧品組成物、医薬組成物、または医療デバイスとして加えられてもよい。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」および「薬剤」という用語は、それに応じて解釈されるべきである。
「薬学的に許容される」とは、本発明のポリペプチドのトリプシン活性の有効性を低下させない非毒性物質を意味する。そのような薬学的に許容される緩衝液、担体、または賦形剤は、当該技術分野でよく知られている(Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.R Gennaro,Ed.,Mack Publishing Company(1990)およびhandbook of Pharmaceutical Excipients,3rd edition,A.Kibbe,Ed.,Pharmaceutical Press(2000)を参照(それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる))。
「緩衝液」という用語は、pHを安定化する目的で酸−塩基混合物を含有する水溶液を意味することを意図している。緩衝液の例は、トリズマ、ビシン、トリシン、MOPS、MOPSO、MOBS、トリス、ヘペス、HEPBS、MES、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ACES、ADA、酒石酸塩、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、カコジル酸塩、CHES、DIPSO、EPPS、エタノールアミン、グリシン、HEPPSO、イミダゾール、イミダゾール乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO、およびTESである。
「希釈剤」という用語は、治療用調製物中のペプチドを希釈する目的で水性または非水性溶液を意味することを意図している。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油(ベニバナ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、もしくはゴマ油など)のうちの1つ以上であり得る。
「補助剤」という用語は、本発明のポリペプチドの生物学的効果を増大させるために製剤に添加される任意の化合物を意味することを意図している。補助剤は、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、および異なるアシル組成物の酢酸塩を含むがこれらに限定されない、異なるアニオンを有する亜鉛、銅、または銀塩のうちの1つ以上であり得る。補助剤はまた、カチオン性ポリマー、例えば、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、カチオン性合成ポリマー、例えば、ポリ(ビニルイミダゾール)、ならびにカチオン性ポリペプチド、例えば、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、およびこれらのアミノ酸を含有するペプチドであり得る。
賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質、およびミネラルのうちの1つ以上であり得る。炭水化物の例としては、例えば、凍結乾燥を容易にするために組成物に添加される、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、およびシクロデキストリンが挙げられる。ポリマーの例は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール/ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド/ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール/ポリビニルアセテート、ならびにポリビニルピロリドンであり、全て分子量が異なり、これらは例えば、粘度制御のため、生体接着を達成するため、または化学分解およびタンパク質分解から脂質を保護するために、組成物に添加される。脂質の例は、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、および糖脂質(全てアシル鎖長および飽和が異なる)、卵レシチン、大豆レシチン、水素添加卵および大豆レシチンであり、これらは、ポリマーと同様の理由で組成物に添加される。ミネラルの例は、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンであり、これらは、液体蓄積の低減または有利な顔料特性などの利点を得るために組成物に添加される。
一実施形態では、ポリペプチドは、塩化カルシウムなどの安定剤と共に提供されてもよい。
本発明のポリペプチドは、ポリペプチド剤の送達に適していることが当該技術分野で既知の任意のタイプの治療用組成物に製剤化されてもよい。
一実施形態では、ポリペプチドは、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油(ベニバナ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、もしくはゴマ油など)、トラガカントガム、および/または様々な緩衝液中に単純に溶解され得る。
一実施形態では、本発明は、浸透活性溶液中で上記のプロテアーゼポリペプチドを提供する。例えば、ポリペプチドは、グリセロールまたはグリセリン中で製剤化され得る。
さらなる実施形態では、本発明の治療用組成物は、リポソームの形態であってもよく、ポリペプチドは、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単層、および液晶として凝集形態で存在する、脂質などの両親媒性薬剤と組み合わされる。リポソーム製剤に適した脂質としは、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるが、これらに限定されない。好適な脂質はまた、血流循環時間を延長するために極性頭部基のポリ(エチレングリコール)によって修飾された上記の脂質を含む。そのようなリポソーム製剤の調製は、例えばUS4,235,871に見られ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の治療用組成物はまた、生分解性ミクロスフェアの形態であり得る。ポリ乳酸(PLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、PLAとPGAのコポリマー(PLGA)、またはポリ(カプロラクトン)(PCL)などの脂肪族ポリエステル、およびポリ無水物は、ミクロスフェアの産生において生分解性ポリマーとして広く使用されている。そのようなミクロスフェアの調製は、US5,851,451およびEP0 213 303に見られ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる実施形態では、本発明の治療用組成物は、ポリマーゲルの形態で提供され、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール/ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド/ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール/ポリビニルアセテート、およびポリビニルピロリドンなどのポリマーは、ペプチドを含有する溶液の増粘に使用される。ポリマーはまた、ゼラチンまたはコラーゲンを含み得る。
本発明の治療用組成物は、ポリペプチドの作用を増強するためのイオンおよび規定のpHを含み得ることが理解されるであろう。加えて、組成物は、滅菌などの従来の治療操作に供されてもよく、かつ/または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、充填剤などの従来の補助剤を含有してもよい。
好ましい一実施形態では、治療用組成物は、EDTA、キシリトール、ソルビトール、プロピレングリコール、およびグリセロールのうちの1つ以上と共に、トリスまたはリン酸緩衝液中にポリペプチドを含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、グリセロールおよび緩衝液と組み合わせて投与するためのものである。
本発明による治療用組成物は、当業者に既知の任意の好適な経路を介して投与され得る。したがって、可能な投与経路としては、経口、口腔、非経口(静脈内、皮下、および筋肉内)、局所、眼、鼻、肺、非経口、膣、および直腸が含まれる。また、インプラントからの投与も可能である。ポリペプチドは、投与のためのスプレー、ゲル、クリーム、または液体もしくは従来の液体として製剤化され得る。
好ましい一実施形態では、治療用組成物は、中咽頭への送達に適した形態で局所投与される。例えば、ポリペプチドは、マウススプレー、薬用キャンディ、トローチ、錠剤、シロップ、またはチューインガムとして製剤化され得る。
代替の実施形態では、治療用組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、脳室内、関節内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、もしくは皮下に投与されるか、または注入技術によって投与され得る。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態で都合よく使用される。水溶液は、必要に応じて好適に緩衝化されるべきである(好ましくは3〜9のpHに)。滅菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の無菌注射液;ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供されてもよく、使用直前に、例えば注射用水などの滅菌液体担体の添加のみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存され得る。即時注射液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
治療用組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「有効量」または「治療上有効な」は、所与の条件および投与レジメンに対して治療効果を提供する量を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルに関連して所望の治療効果をもたらすように計算された、活性材料の所定の量である。さらに、宿主の活性、機能、および応答の臨床的に有意な欠損を低減させ、最も好ましくは防止するために十分な量を意味することが意図される。あるいは、治療有効量は、宿主の臨床的に有意な状態を改善させるために十分である。当業者によって理解されるように、化合物の量は、その特異的活性に応じて変化し得る。好適な投与量は、必要とされる希釈剤に関連して、所望される治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の化合物の製造のための方法および使用において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当該技術分野において周知であるように、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて、通常の技能を有する医療または獣医学従事者によって決定され得る。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位または複数のより小さい用量単位の形態における単回投与によって、または特定の間隔での細分用量の複数回投与によって行われ得る。あるいは、用量は、長期間にわたる連続注入として提供されてもよい。
プロテアーゼポリペプチドは、使用されているポリペプチドの有効性/毒性に応じて、様々な濃度で製剤化され得る。
一実施形態では、製剤は、プロテアーゼポリペプチドを、製剤の0.01〜100U/g、例えば製剤の1〜10U/gの濃度で含む。例えば、製剤(例えば、マウスウォッシュ、ゲル、軟膏など)は、製剤中に少なくとも0.1U/g、少なくとも0.5U/g、少なくとも1U/g、少なくとも5U/g、少なくとも10U/g、または少なくとも50U/gのプロテアーゼポリペプチドを含んでもよい。したがって、製剤(例えば、マウスウォッシュ、ゲル、軟膏など)は、製剤中に50U/g以下、20U/g以下、10U/g以下、5U/g以下、1U/g以下、または0.1U/g以下のプロテアーゼポリペプチドを含んでもよい。
したがって、治療製剤は、耳内のウイルス、細菌、および酵母などの微生物を死滅させるか、またはその成長を遅らせるのに十分な量のポリペプチド、またはそのフラグメント、変異体、融合物、もしくは誘導体を含み得る。
ポリペプチドが中咽頭への投与のために(例えば、スプレーまたはゲルとして)製剤化される場合、治療用組成物は、水およびグリセロール中に溶解されたポリペプチドを含んでもよい。例示的なマウススプレーおよびゲル製剤は、Coldzyme(登録商標)(Enzymatica AB,Lund,Sweden製)およびPreCold(登録商標)(Zymetech ehf,Reykjavik,Iceland製)として販売されている。
一実施形態では、ポリペプチドは、中咽頭への送達を容易にするように構成され得る、送達デバイス、例えばスプレー容器で提供され得る。
一実施形態では、ポリペプチドは、1つ以上の追加の活性剤と組み合わせて使用するためのものである。
例えば、追加の活性剤は、抗菌剤(抗生物質、抗ウイルス剤、および抗真菌剤を含む)、抗炎症剤(ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症剤を含む)、ならびに防腐剤からなる群から選択され得る。
一実施形態では、活性剤は、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、フルオロキノロン、アミノグリコシド、モノバクタム、カルバペネム、およびマクロライドからなる群から選択される1つ以上の抗菌剤である。
例えば、抗生物質は、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、アジスロマイシン、カルベニシリン、カルバペネム、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、ダラシン、ダルホプリスチン、ダプトマイシン、ドキシシクリン、エンロフロキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、フルオロキノロン、ゲンタマイシン、マルボフロキサシン、メロペネム、メトロニダゾール、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ナフシリン、オフロキサシン、オキサシリン、ペニシリン、キヌプリスチン、リファンピン、スルファジアジン銀、スルファメトキサゾール、テイコプラニン、テトラサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、バンコマイシン、バシトラシン、およびポリミキシンB、またはそれらの混合物からなる群から選択され得る。
好ましい一実施形態では、1つ以上の抗生物質化合物は、テトラサイクリン、セフォタキシム、バンコマイシン、エリスロマイシン、およびオキサシリンからなる群から選択される。
本発明の併用療法は、単一の抗生物質化合物または複数の抗生物質化合物を含み得ることが当業者によって理解されるであろう。
本発明の併用療法で使用される抗生物質の濃度は、当該分野の一般的な知識に従って、使用される特定の抗生物質ならびに治療されるバイオフィルムの兆候および/または位置に依存するであろう。典型的には、抗生物質は、0.1〜5%(重量で)、例えば0.1〜1%(重量で)の濃度で製剤化される。
一実施形態では、追加の抗生物質は、局所または経口投与用であってもよい。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドで含浸、コーティング、または別様に処理される埋め込み型医療デバイスを提供する。
本発明の第2の関連する態様は、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための薬剤の調製に使用するための、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
プロテアーゼ活性を有する好適なポリペプチドの例は、本発明の第1の態様に関連して上記で詳述されている。特に、ポリペプチドは、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分であり得る。
本発明の第2の態様の一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸配列、あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物(または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物)を含むかまたはそれからなる。
したがって、一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸配列からなる。
一実施形態では、コロナウイルス感染症は、風邪、肺炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群(SARS)、中東呼吸器症候群(MERS)、副鼻腔炎、耳炎、および咽頭炎から群から選択される。
本発明の第3の関連する態様は、プロテアーゼ活性を有する治療的有効量のポリペプチドを対象に投与することを含む、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための方法を提供する。
プロテアーゼ活性を有する好適なポリペプチドの例は、本発明の第1の態様に関連して上記で詳述されている。特に、ポリペプチドは、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分であり得る。
本発明の第3の態様の一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸配列、あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物(または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物)を含むかまたはそれからなる。
したがって、一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸配列からなる。
一実施形態では、コロナウイルス感染症は、風邪、肺炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群(SARS)、中東呼吸器症候群(MERS)、副鼻腔炎、耳炎、および咽頭炎から群から選択される。
本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータの選好およびオプションは、文脈がそうでないことを示さない限り、本発明の他の全ての態様、特徴、およびパラメータのありとあらゆる選好およびオプションと組み合わせて開示されたと見なされるべきである。例えば、一実施形態では、本発明は、ヒトにおけるコロナウイルス感染症の治療に使用するための、配列番号1〜7のいずれか1つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
本明細書内の明らかに以前に発行された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が、先端技術の一部であるか、または一般共通の知識であると認識されるべきではない。
請求項および/または本明細書において「含む」という用語と組み合わせて使用される場合の「a」または「an」という単語の使用は、「1つ」を意味し得るが、「1つ以上」、「少なくとも1つ」、および「2つ以上」の意味とも一致する。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、上記の説明と併せて考慮した場合、よりよく認識および理解されるであろう。しかしながら、上記の説明は、本発明の様々な実施形態およびその多くの特定の詳細を示しているが、限定ではなく例示として与えられていることを理解されたい。本発明の精神から逸脱することなく、本発明の範囲内で多くの置換、修正、追加、および/または再配置が行われ得、本発明は、そのような置換、修正、追加、および/または再配置を全て含む。
ここで、本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例が説明される。
本明細書内の明らかに以前に発行された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が、先端技術の一部であるか、または一般共通の知識であると認識されるべきではない。
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照して説明する。
材料および方法
細胞、ウイルス、および酵素
Huh7細胞およびCoV−229E−luc(van den Worm,Eriksson et al.2012)を、Institute of Virology and Immunology,University of Bern,SwitzerlandのProf.Dr.Volker Thielから入手した。ベンズアミジン精製タラトリプシンを、Zymetech(Reykjavik,Iceland)から入手した。トリプシンZT(出版のために提出された原稿の未発表データ:Sandholt GB,Stefansson B,Gudmundsdottir A)およびトリプシンIを、以前に記載されたように精製した(Stefansson,Helgadottir et al.2010)。タラトリプシンの活性は、基質CBZ−GPR−pNAを使用して測定した(Stefansson,Helgadottir et al.2010)。
細胞、ウイルス、および酵素
Huh7細胞およびCoV−229E−luc(van den Worm,Eriksson et al.2012)を、Institute of Virology and Immunology,University of Bern,SwitzerlandのProf.Dr.Volker Thielから入手した。ベンズアミジン精製タラトリプシンを、Zymetech(Reykjavik,Iceland)から入手した。トリプシンZT(出版のために提出された原稿の未発表データ:Sandholt GB,Stefansson B,Gudmundsdottir A)およびトリプシンIを、以前に記載されたように精製した(Stefansson,Helgadottir et al.2010)。タラトリプシンの活性は、基質CBZ−GPR−pNAを使用して測定した(Stefansson,Helgadottir et al.2010)。
タラトリプシンによるCoV−229E−lucの不活性化およびウミシイタケルシフェラーゼアッセイ
ウシ胎児血清(FBS)を含まないダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で希釈したタラトリプシンを、1mL当たりCoV−229E−luc(ORF 4はウミシイタケルシフェラーゼによって置き換えられる)と33℃で3時間インキュベートした。前もって、1ウェル当たり約15.000のHuh7細胞を96ウェルプレートに播種し、5%FBSを含むDMEM中、37℃および5%CO2でインキュベートした。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、タラトリプシン処理CoV−229E−lucの0.1の感染の多重度(MOI)で感染させた。ウイルスを細胞に2時間吸着させ、細胞をPBSおよび細胞培地で洗浄した。細胞を5%FBSを含むDMEM中でインキュベートした。細胞生存率を、感染の22時間、10%(v/v)AlamarBlueアッセイ(Fisher Scientific,Inc.)を使用することによって評価した。AlamarBlueを、595nmにおいてルミノメーターで評価する前に、33℃および5%CO2でさらに24時間インキュベートした。ウイルス複製のレベルを、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイキット(Promega,USA)を使用して、製造元の指示に従い、推奨される基質濃度の半分およびルミノメーターを使用して決定した。対数スケールを、測定されたルミネセンスの対数を計算することによって構築した。
ウシ胎児血清(FBS)を含まないダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で希釈したタラトリプシンを、1mL当たりCoV−229E−luc(ORF 4はウミシイタケルシフェラーゼによって置き換えられる)と33℃で3時間インキュベートした。前もって、1ウェル当たり約15.000のHuh7細胞を96ウェルプレートに播種し、5%FBSを含むDMEM中、37℃および5%CO2でインキュベートした。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、タラトリプシン処理CoV−229E−lucの0.1の感染の多重度(MOI)で感染させた。ウイルスを細胞に2時間吸着させ、細胞をPBSおよび細胞培地で洗浄した。細胞を5%FBSを含むDMEM中でインキュベートした。細胞生存率を、感染の22時間、10%(v/v)AlamarBlueアッセイ(Fisher Scientific,Inc.)を使用することによって評価した。AlamarBlueを、595nmにおいてルミノメーターで評価する前に、33℃および5%CO2でさらに24時間インキュベートした。ウイルス複製のレベルを、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイキット(Promega,USA)を使用して、製造元の指示に従い、推奨される基質濃度の半分およびルミノメーターを使用して決定した。対数スケールを、測定されたルミネセンスの対数を計算することによって構築した。
タラトリプシンによるCoV−229Eの非活性化
タラトリプシンを、殺ウイルス効果懸濁液試験の2つの時点、10分および60分における懸濁液中の、攻撃ウイルス(ヒトコロナウイルス、株229E、ATCC VR−740)に対して評価した。試験は、E1052−11“Standard Test Method to Assess the Activity of Microbicides against Viruses in Suspension”と指定されたASTM International試験方法に従った。各実行について、2つの別個の希釈物を作製した。1部のトリプシンおよび1部の希釈剤(1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS))による1つの希釈物、ならびに1部のトリプシンおよび3部の希釈剤によるもう1つの希釈物。各希釈物(2.7mL)を0.3mLの攻撃ウイルス懸濁液(0%血清を含む)と混合し、ボルテックスで混合した。反応混合物を35〜37℃で10分間および60分間(接触時間)インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物のアリコートを直ちに等体積の中和剤と混合した。中和剤は、最小必須培地(MEM)+10% FBS+1%ポリソルベート80であった。中和剤による中和後、試験物質およびウイルス回収対照(以下を参照)について、ウイルスをタラトリプシンから分離するためにセファクリルカラムを使用した。カラムからのクエンチした試料を培地で10倍ずつ段階希釈し、宿主細胞(MRC−5細胞、ATCC CCL−171)に接種して、感染性ウイルスについてアッセイした。接種したプレートを33±2℃で5±1%CO2において5〜7日間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス誘発性細胞変性効果(CPE)を決定することによって、ウイルス感染について培養物をスコアリングした。ウイルスの力価(log10 TCID50/mL)を、スピアマン―カーバー式(Karber 1931)を使用して計算した。ウイルス負荷(log10 TCID50)は、ウイルス力価(log10 TCID50/mL)をlog10(mLでの反応混合物の体積×体積補正)に追加することによって計算した。体積補正は、接触時間後の試料の中和を説明した。log10減少係数を、入力ウイルス負荷(log10)から出力ウイルス負荷(log10)を引くことによって計算した。入力負荷は5.92であったが、これは接種前に培地でウイルスをインキュベートした後に回収されたウイルス単位(log10 TCID50)を表す(ウイルス回収対照、以下を参照)。出力負荷は、ウイルスをタラトリプシンと混合およびインキュベートした後に回収されたウイルス単位(log10 TCID50)を表す。
タラトリプシンを、殺ウイルス効果懸濁液試験の2つの時点、10分および60分における懸濁液中の、攻撃ウイルス(ヒトコロナウイルス、株229E、ATCC VR−740)に対して評価した。試験は、E1052−11“Standard Test Method to Assess the Activity of Microbicides against Viruses in Suspension”と指定されたASTM International試験方法に従った。各実行について、2つの別個の希釈物を作製した。1部のトリプシンおよび1部の希釈剤(1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS))による1つの希釈物、ならびに1部のトリプシンおよび3部の希釈剤によるもう1つの希釈物。各希釈物(2.7mL)を0.3mLの攻撃ウイルス懸濁液(0%血清を含む)と混合し、ボルテックスで混合した。反応混合物を35〜37℃で10分間および60分間(接触時間)インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物のアリコートを直ちに等体積の中和剤と混合した。中和剤は、最小必須培地(MEM)+10% FBS+1%ポリソルベート80であった。中和剤による中和後、試験物質およびウイルス回収対照(以下を参照)について、ウイルスをタラトリプシンから分離するためにセファクリルカラムを使用した。カラムからのクエンチした試料を培地で10倍ずつ段階希釈し、宿主細胞(MRC−5細胞、ATCC CCL−171)に接種して、感染性ウイルスについてアッセイした。接種したプレートを33±2℃で5±1%CO2において5〜7日間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス誘発性細胞変性効果(CPE)を決定することによって、ウイルス感染について培養物をスコアリングした。ウイルスの力価(log10 TCID50/mL)を、スピアマン―カーバー式(Karber 1931)を使用して計算した。ウイルス負荷(log10 TCID50)は、ウイルス力価(log10 TCID50/mL)をlog10(mLでの反応混合物の体積×体積補正)に追加することによって計算した。体積補正は、接触時間後の試料の中和を説明した。log10減少係数を、入力ウイルス負荷(log10)から出力ウイルス負荷(log10)を引くことによって計算した。入力負荷は5.92であったが、これは接種前に培地でウイルスをインキュベートした後に回収されたウイルス単位(log10 TCID50)を表す(ウイルス回収対照、以下を参照)。出力負荷は、ウイルスをタラトリプシンと混合およびインキュベートした後に回収されたウイルス単位(log10 TCID50)を表す。
対照は、ウイルス回収対照、中和剤有効性/ウイルス干渉対照、細胞毒性対照、細胞生存率対照、ウイルスストック力価対照、および参照生成物対照を含んだ。中和剤有効性/ウイルス干渉対照を実施して、中和後に残留有効成分が存在したかどうか、および中和された試験物質がウイルス感染力を妨げたかどうかを判断した。1.35mLのタラトリプシンと1.35mLの1xPBSの混合物を0.3mLの培地(攻撃ウイルスの代わりに)と完全に混合し、60分間保持し、中和し、セファクリルカラムに通した。クエンチした試料を、1つは中和剤有効性/ウイルス干渉対照、およびもう1つは細胞毒性対照の2つの部分に分け、各部分を10倍に段階希釈した。中和剤有効性/ウイルス干渉対照のために、0.1mLの低力価ウイルスを4.5mLの各希釈物に添加し、60分以上の期間にわたって保持した。インキュベーション後、ウイルスをスパイクした希釈物を宿主細胞に接種した。細胞毒性対照について、中和剤有効性/ウイルス干渉対照実行から得られた試料を段階希釈し、宿主細胞に接種した。宿主細胞の状態を、インキュベーション期間の終わりに記録した。ウイルス回収対照について、2.7mLの希釈培地(MEM+5%FBS)を0.3mLの攻撃ウイルス懸濁液と混合した。混合物を60分間保持し、中和し、試験生成物の実行に関してセファクリルカラムに通した。クエンチした試料を希釈培地で10倍ずつ段階希釈し、選択した希釈物を宿主細胞に接種して、感染性ウイルスについてアッセイした。細胞生存率対照について、各アッセイで少なくとも4つのウェルに培地を接種して、細胞が生存可能なままであり、培地がアッセイ全体を通して滅菌であったことを実証した。ウイルスストック力価対照について、ウイルスのアリコートを段階希釈し、宿主細胞に直接接種した。これは、ストックウイルスの力価が使用に適していたこと、およびウイルス感染力アッセイを適切に実施したことを実証するためであった。参照生成物対照について、約1000ppm NaOCl含有漂白剤溶液の2.7mLアリコートを0.3mLの攻撃ウイルス懸濁液と混合した。混合物を2回の接触時間にわたって保持し、次いで中和した。クエンチした試料を希釈培地で10倍ずつ段階希釈し、選択した希釈物を宿主細胞に接種して、感染性ウイルスについてアッセイした。各アッセイのウイルスストック力価対照は、実験で適切な力価が使用され、ウイルス回収対照のために十分な量のウイルスが回収されたことを確認した。細胞生存率対照ウェルにおいてウイルスは検出されず、細胞は生存可能なままであり、培地は滅菌であった。全ての中和剤有効性/ウイルス干渉対照ウェルにおいて、ウイルスは検出されなかった。細胞毒性は、試験したいかなる希釈物または細胞株においても検出されなかった。ウイルス誘発性CPEは、非感染細胞と区別可能であった。したがって、全ての対照が有効な試験の基準を満たした。参照試験物質である1000ppm NaOClは、試験した全てのウイルスに対して4.31以上の対数減少を有した。
殺ウイルス効果懸濁液試験を、独立した試験機関、Microbac Laboratories,Inc.,105 Carpenter Drive,Sterling,VA 20164,USAによって実施した。
タラトリプシン処理CoV−229E−lucのウイルスタンパク質分析
DMEM(FBSなし)で希釈したタラトリプシンをCoV−229E−lucウイルスと混合した。混合物を33℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、レムリ緩衝液(4X)を添加し、混合物を95℃で5分間インキュベートした。試料を10%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)ゲル(Bachofen,Bollinger et al.2013)に装填し、ウエスタンブロット分析を実施した(以下を参照)。
DMEM(FBSなし)で希釈したタラトリプシンをCoV−229E−lucウイルスと混合した。混合物を33℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、レムリ緩衝液(4X)を添加し、混合物を95℃で5分間インキュベートした。試料を10%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)ゲル(Bachofen,Bollinger et al.2013)に装填し、ウエスタンブロット分析を実施した(以下を参照)。
組換えCoV−229E S1スパイクタンパク質のタラトリプシンによる処理
無血清DMEMで希釈したタラトリプシンを使用して、組換えCoV−229E S1スパイクタンパク質を86μg/mLの最終濃度で処理した。混合物を33℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、レムリ緩衝液(4X)を添加し、95℃で5分間インキュベートして酵素を不活性化した。試料を10%SDS−PAGEゲル(Bachofen,Bollinger et al.2013)に装填し、ウエスタンブロット分析を実施した(以下を参照)。組換えCoV−229E S1スパイクタンパク質を、Institute of Virology and Immunology,University of Bern,SwitzerlandのProf.Dr.Volker Thielから入手した。
無血清DMEMで希釈したタラトリプシンを使用して、組換えCoV−229E S1スパイクタンパク質を86μg/mLの最終濃度で処理した。混合物を33℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、レムリ緩衝液(4X)を添加し、95℃で5分間インキュベートして酵素を不活性化した。試料を10%SDS−PAGEゲル(Bachofen,Bollinger et al.2013)に装填し、ウエスタンブロット分析を実施した(以下を参照)。組換えCoV−229E S1スパイクタンパク質を、Institute of Virology and Immunology,University of Bern,SwitzerlandのProf.Dr.Volker Thielから入手した。
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析のために、SDS−PAGE(10%)を実施し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。転写後、膜を、5%ミルクと0.5%Tween−20とを含有するPBSで60分間、室温(RT)においてブロックした。一次抗体(NP−40分散CoV−229Eから産生された抗コロナウイルスポリクローナルヤギ抗体(Wentworth and Holmes 2001))を、0.5%ミルクを含むPBS−Tween(PBS−T)で1:1000に希釈し、4℃で穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートした。膜をPBSで洗浄し、続いてRTで60分間、二次抗体(西洋ワサビペルオキシダーゼに共役した抗ヤギIgG、0.5%ミルクで1:1000)とインキュベートした。免疫ブロットを、電荷結合素子(CCD)カメラを使用して行った。
ウエスタンブロット分析のために、SDS−PAGE(10%)を実施し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。転写後、膜を、5%ミルクと0.5%Tween−20とを含有するPBSで60分間、室温(RT)においてブロックした。一次抗体(NP−40分散CoV−229Eから産生された抗コロナウイルスポリクローナルヤギ抗体(Wentworth and Holmes 2001))を、0.5%ミルクを含むPBS−Tween(PBS−T)で1:1000に希釈し、4℃で穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートした。膜をPBSで洗浄し、続いてRTで60分間、二次抗体(西洋ワサビペルオキシダーゼに共役した抗ヤギIgG、0.5%ミルクで1:1000)とインキュベートした。免疫ブロットを、電荷結合素子(CCD)カメラを使用して行った。
組換えSARS−CoVスパイクタンパク質のトリプシンZTまたはトリプシンIによる処理
組換えスパイクタンパク質(Beijing02)(SARS−CoV)(eEnzyme、カタログ番号:SS−001−005P)(0.1mg/mL)を、トリプシンZTまたはトリプシンIと、17mMのTris、12.5mMのCaCl2、2.5mMのエタノールアミン中pH8.5で、33℃において10分間インキュベートした。試料を4X LDS試料緩衝液で95℃において10分間インキュベートした。陽性対照として、スパイクタンパク質を、トリプシンアイソエンザイムなしで33℃において10分間インキュベートした。混合物を、MOPS−SDSランニングバッファーを使用して、12%SDS−PAGEゲル(NuPAGE Bis−Tris,Novex by life Technologies)で泳動させた。ゲルをクマシーブルー(PageBlue Protein Staining Solution,Thermo Fisher Scientific)で染色し、Odyssey赤外線イメージングシステムで撮像した。
組換えスパイクタンパク質(Beijing02)(SARS−CoV)(eEnzyme、カタログ番号:SS−001−005P)(0.1mg/mL)を、トリプシンZTまたはトリプシンIと、17mMのTris、12.5mMのCaCl2、2.5mMのエタノールアミン中pH8.5で、33℃において10分間インキュベートした。試料を4X LDS試料緩衝液で95℃において10分間インキュベートした。陽性対照として、スパイクタンパク質を、トリプシンアイソエンザイムなしで33℃において10分間インキュベートした。混合物を、MOPS−SDSランニングバッファーを使用して、12%SDS−PAGEゲル(NuPAGE Bis−Tris,Novex by life Technologies)で泳動させた。ゲルをクマシーブルー(PageBlue Protein Staining Solution,Thermo Fisher Scientific)で染色し、Odyssey赤外線イメージングシステムで撮像した。
結果
タラトリプシンによるコロナウイルスの不活性化
タラトリプシンがコロナウイルスの感染力を低下させる能力を研究するために、ウミシイタケルシフェラーゼを利用するCoV−229E−lucを用いたアッセイを使用した(van den Worm,Eriksson et al.2012)。コロナウイルスをタラトリプシンありまたはなしでインキュベートし(180分)、ヒト肝細胞(Huh7)上に置いた。ウイルス吸着期間後、細胞を2日間インキュベートし、コロナウイルス感染のレベルを測定した(方法を参照)。感染のレベルを、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを使用して測定した(図1)。
タラトリプシンによるコロナウイルスの不活性化
タラトリプシンがコロナウイルスの感染力を低下させる能力を研究するために、ウミシイタケルシフェラーゼを利用するCoV−229E−lucを用いたアッセイを使用した(van den Worm,Eriksson et al.2012)。コロナウイルスをタラトリプシンありまたはなしでインキュベートし(180分)、ヒト肝細胞(Huh7)上に置いた。ウイルス吸着期間後、細胞を2日間インキュベートし、コロナウイルス感染のレベルを測定した(方法を参照)。感染のレベルを、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを使用して測定した(図1)。
1.4および2.8U/mLのタラトリプシンで処理すると、コロナウイルス感染のレベルが対照(未処理コロナウイルス)と比較して約3log単位低下した(図1)。
タラトリプシンがコロナウイルスを不活性化する能力をさらに試験するために、コロナウイルス229Eを使用した標準化された殺ウイルス効果懸濁液試験を使用して実験を実施した。コロナウイルスを、1.22U/mLまたは2.44U/mLの濃度のタラトリプシンと2連で10分間または60分間インキュベートした。各インキュベーションからの試料を、50%組織培養感染量(TCID50)エンドポイントアッセイで滴定した(方法を参照)。log10減少係数を計算し、平均値を報告した(図2)。
コロナウイルスのタラトリプシン処理の結果として、両方の濃度で60分間のインキュベーション後、ウイルスの感染力が4log超減少した。10分間のインキュベーションでは、1.22U/mLおよび2.44U/mLのそれぞれで2.5および3logの減少が観察された。
タラトリプシン処理コロナウイルス試料におけるウイルスタンパク質の分解
タラトリプシンが伝染性コロナウイルスを含む試料中のコロナウイルスタンパク質を分解する能力を試験した。コロナウイルスの原液を、1.4〜5.6U/mLの濃度のタラトリプシンで33℃において3時間処理し、試料をウエスタンブロット分析に供した(図3)。図3からわかるように、タラトリプシンは、1.4〜5.6U/mLの濃度において3時間でコロナウイルスタンパク質を分解することが可能である。抗体によって認識されるタンパク質のサイズ(50kDa)は、CoV−229Eヌクレオカプシドタンパク質のサイズと一致する(Lo,Lin et al.2013)。
タラトリプシンが伝染性コロナウイルスを含む試料中のコロナウイルスタンパク質を分解する能力を試験した。コロナウイルスの原液を、1.4〜5.6U/mLの濃度のタラトリプシンで33℃において3時間処理し、試料をウエスタンブロット分析に供した(図3)。図3からわかるように、タラトリプシンは、1.4〜5.6U/mLの濃度において3時間でコロナウイルスタンパク質を分解することが可能である。抗体によって認識されるタンパク質のサイズ(50kDa)は、CoV−229Eヌクレオカプシドタンパク質のサイズと一致する(Lo,Lin et al.2013)。
タラトリプシンがコロナウイルスからタンパク質を分解する能力をさらに研究するために、組換えCoV−229Eスパイクタンパク質を異なる濃度のタラトリプシンと33℃において2時間インキュベートし、ウエスタンブロット分析に供した(図4)。
図4からわかるように、タラトリプシンは、試験した全ての濃度で組換えコロナウイルススパイクタンパク質を分解する。
タラトリプシンアイソエンザイムであるトリプシンZTおよびトリプシンIが組換えSARS−CoVスパイクタンパク質を分解する能力をテストすることは興味深いことであった。両方のアイソエンザイムが研究で使用したタラトリプシン分離株に見られる。図5では、SARS−CoVスパイクタンパク質が約180kDaに見られる。スパイクタンパク質は、試験した両方の濃度(0.35および0.7U/mL)で、トリプシンZTおよびトリプシンIによって33℃において10分で分解される。
考察
この研究では、タラトリプシンがコロナウイルスの感染レベルを60分間で4log単位超、わずか10分で最大3log単位まで低下させたことが実証された(図2)。タラトリプシンがコロナウイルスを不活性化する能力を、コロナウイルス(CoV−229E−luc)を使用しても確立し、ウイルス力価を、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイで監視した(図1)。コロナウイルスに対するタラトリプシンの不活性化有効性は、コロナウイルススパイクタンパク質を分解するその能力に基づいていると考えられている。これは、コロナウイルスが感染に重要なヒト細胞受容体に結合する能力を低下させる(Lim,Ng et al.2016、Park,Li et al.2016)。この作用機序の裏付けとして、タラトリプシンによるコロナウイルスタンパク質の分解を分析した。タラトリプシンで処理したCoV−229E−lucウイルスを、CoV−229Eに対して作られたポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析に供した(図3)。結果は、ヌクレオカプシドタンパク質の分解とよく相関している50kDaのサイズ範囲のタンパク質の分解を明らかに実証している(Lo,Lin et al.2013)。さらに、図4に示されるように、精製された形態の組換えCoV−229Eスパイクタンパク質は、タラトリプシンによって分解された。コロナウイルスタンパク質分解について得られたデータは、タラトリプシンとウイルスの2時間のインキュベーションに基づいている(図3)。スパイクタンパク質は、コロナウイルスの表面に位置するため、タラトリプシン分解の影響を最も受けやすいと推測される。我々の研究結果に基づいて、タラトリプシンとコロナウイルスのインキュベーションは、スパイクタンパク質の分解から始まる(図4および図5)。しかしながら、長いインキュベーション期間の後、ヌクレオカプシドタンパク質は分解される(図3)。
この研究では、タラトリプシンがコロナウイルスの感染レベルを60分間で4log単位超、わずか10分で最大3log単位まで低下させたことが実証された(図2)。タラトリプシンがコロナウイルスを不活性化する能力を、コロナウイルス(CoV−229E−luc)を使用しても確立し、ウイルス力価を、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイで監視した(図1)。コロナウイルスに対するタラトリプシンの不活性化有効性は、コロナウイルススパイクタンパク質を分解するその能力に基づいていると考えられている。これは、コロナウイルスが感染に重要なヒト細胞受容体に結合する能力を低下させる(Lim,Ng et al.2016、Park,Li et al.2016)。この作用機序の裏付けとして、タラトリプシンによるコロナウイルスタンパク質の分解を分析した。タラトリプシンで処理したCoV−229E−lucウイルスを、CoV−229Eに対して作られたポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析に供した(図3)。結果は、ヌクレオカプシドタンパク質の分解とよく相関している50kDaのサイズ範囲のタンパク質の分解を明らかに実証している(Lo,Lin et al.2013)。さらに、図4に示されるように、精製された形態の組換えCoV−229Eスパイクタンパク質は、タラトリプシンによって分解された。コロナウイルスタンパク質分解について得られたデータは、タラトリプシンとウイルスの2時間のインキュベーションに基づいている(図3)。スパイクタンパク質は、コロナウイルスの表面に位置するため、タラトリプシン分解の影響を最も受けやすいと推測される。我々の研究結果に基づいて、タラトリプシンとコロナウイルスのインキュベーションは、スパイクタンパク質の分解から始まる(図4および図5)。しかしながら、長いインキュベーション期間の後、ヌクレオカプシドタンパク質は分解される(図3)。
研究で使用したベンズアミジン精製タラトリプシン画分は、トリプシンI、トリプシンZT、およびトリプシンXなどの異なるタラトリプシンアイソエンザイムを含有する(上記を参照)。これら全てのトリプシンアイソエンザイムは、アルギニンおよびリジンで開裂するが、トリプシンIおよびトリプシンZTは、異なるサブサイト特異性を有することが示されている(未公開データ;Sandholt GB,Stefansson B,Gudmundsdottir A)。したがって、これらのアイソエンザイムがコロナウイルスからスパイクタンパク質を開裂できるかどうかを試験することは興味深いことであった。この目的のために、SARS−CoVからの組換えスパイクタンパク質を選択した。これは、MERSおよびSARSは主要な流行を引き起こす可能性が高いため、死亡率が高く、緊急の研究を必要とするWHOの疾患優先順位リストのトップにあることから、非常に重要である(Gralinski and Baric 2015、Mackay and Arden 2015)。
SDS−PAGE分析に基づいて、組換えSARS−CoVスパイクタンパク質は、タラトリプシンIおよびトリプシンZTの両方によって低濃度においてわずか10分で効果的に分解された(図5)。研究結果は、SARSコロナウイルスが低濃度のタラトリプシンによる不活性化の影響を受けやすい可能性が高いことを示す。これは、ヒトにおける感染症を引き起こす異なるコロナウイルスがタラトリプシンによって不活生化され得ることを示唆する。トリプシンアイソエンザイムがSARS−CoVスパイクタンパク質を10分で開裂するのに効果的であったという事実(図5)は、タラトリプシンがコロナウイルスの感染レベルを10分で低下させた図2の結果とよく一致している。
タラトリプシンがコロナウイルスを不活性化する能力に関するこの研究で示された結果は、異なる呼吸器ウイルスに対するタラトリプシンの有効性を示す他の研究の結果を拡張する(Gudmundsdottir,Hilmarsson et al.2013)。興味深いことに、リジンおよびアルギニンに富むアミノ酸配列は、ウイルスタンパク質で頻繁に見られる(Suzuki,Orba et al.2010、Jiang,Cun et al.2012、Gallaher and Garry 2015)。これらの正に帯電した塩基性アミノ酸残基は、主にタンパク質表面に曝露され、静電相互作用を形成することによるタンパク質安定性に重要である(Sokalingam,Raghunathan et al.2012)。アルギニンおよびリジン残基がウイルスタンパク質によく見られるという事実は、タラトリプシンがこの研究で試験したコロナウイルススパイクタンパク質を効率的に開裂する能力を説明することができる(図4および図5)。
結論として、結果は、タラトリプシンがコロナウイルスの細胞への付着を防止する表面スパイクタンパク質の分解を介して、コロナウイルスを不活性化する能力を確認している。
参考文献
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Handbook of Pharmaceutical Excipients,3rd edition,A.Kibbe,Ed.,Pharmaceutical Press(2000)
Claims (49)
- 対象におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に使用するためのプロテアーゼ活性を有するポリペプチド。
- 前記コロナウイルス感染症が気道および/または胃腸管の感染症である、請求項1に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記コロナウイルス感染症が、風邪、肺炎、肺臓炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群(SARS)、中東呼吸器症候群(MERS)、副鼻腔炎、耳炎、または咽頭炎からなる群から選択される、請求項1または2に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記コロナウイルス感染症が、風邪である、請求項3に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記コロナウイルスが、
(a)アルファコロナウイルス、
(b)ベータコロナウイルス、
(c)ガンマコロナウイルス、および
(d)デルタコロナウイルスからなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。 - 前記コロナウイルスが、ヒトコロナウイルスである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ヒトコロナウイルスが、
(a)ヒトコロナウイルス229E、
(b)ヒトコロナウイルスOC43、
(c)重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS−CoV)
(d)ヒトコロナウイルスNL63(HCoV−NL63、ニューヘブンコロナウイルス)、
(e)ヒトコロナウイルスHKU1、および
(f)中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS−CoV)からなる群から選択される、請求項6に記載の使用のためのポリペプチド。 - 前記対象が、哺乳動物、例えばヒトである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- プロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼである、請求項9に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記プロテアーゼが、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である、請求項10に記載の使用のためのポリペプチド。
- プロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、低温適応性である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、自然発生的である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、海洋セリンプロテアーゼである、請求項13に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記海洋セリンプロテアーゼが、タラ、スケトウダラ、サケ、またはオキアミから得られるか、または入手可能である、請求項14に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記海洋セリンプロテアーゼが、タイセイヨウダラから得られるか、または入手可能である、請求項15に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記海洋セリンプロテアーゼが、トリプシン、例えばトリプシンIである、請求項14〜16のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、タイセイヨウダラ由来のトリプシンI、トリプシンX、またはトリプシンZTである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記トリプシンの活性が、前記ポリペプチドの1U/mg〜1U/g、例えば、前記ポリペプチドの50U/mg〜500U/mgの範囲である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、非自然発生的である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の前記プロテアーゼ活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物(または前記フラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物)を含むかまたはそれからなる、請求項1〜20のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1〜12のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項21に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1〜12による前記アミノ酸配列のフラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項1〜21のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記フラグメントが、配列番号1〜12のいずれか1つの少なくとも15連続アミノ酸、例えば、配列番号1〜12のいずれか1つの少なくとも16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、または240連続アミノ酸を含むかまたはそれからなる、請求項23に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1〜12のいずれか1つによる前記アミノ酸配列の変異体を含むかまたはそれからなる、請求項1〜21のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記変異体が、非自然発生的な変異体である、請求項25に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記変異体が、配列番号1〜12のいずれか1つによる前記アミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも50%の同一性、例えば少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項25または26に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、150〜250アミノ酸長、例えば200〜250、210〜240、220〜230、または220〜225アミノ酸長である、請求項1〜27のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、組換えポリペプチドである、請求項1〜28のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、浸透活性溶液中に提供される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、グリセロールおよび緩衝液と組み合わせて投与される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、中咽頭への送達に適した形態で提供される、請求項1〜31のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、マウススプレー、薬用キャンディ、トローチ、錠剤、シロップ、またはチューインガムで提供される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、1つ以上の追加の活性剤と組み合わせて使用するためのものである、請求項1〜33のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記追加の活性剤が、抗菌剤(抗生物質、抗ウイルス剤、および抗真菌剤を含む)、抗炎症剤(ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症剤を含む)、ならびに防腐剤からなる群から選択される、請求項34に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記1つ以上の抗菌剤が、ペニシリン、セファロスポリン、フルオロキノロン、アミノグリコシド、モノバクタム、カルバペネム、およびマクロライドからなる群から選択される抗生物質である、請求項35に記載の使用のためのポリペプチド。
- 哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための薬剤の調製におけるプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドが、請求項1〜36のいずれか一項に記載のとおりである、使用。
- 前記ポリペプチドが、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である、請求項37に記載の使用。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の前記トリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物(または前記フラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物)を含むかまたはそれからなる、請求項37または38に記載の使用。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1〜121のいずれか1つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項39に記載の使用。
- 前記コロナウイルス感染症が、風邪、肺炎、肺臓炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群(SARS)、中東呼吸器症候群(MERS)、副鼻腔炎、耳炎、または咽頭炎からなる群から選択される、請求項37〜40のいずれか一項に記載の使用。
- 哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための方法であって、プロテアーゼ活性を有する治療有効量のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記ポリペプチドが、請求項1〜36のいずれか一項に記載のとおりである、方法。
- 前記ポリペプチドが、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である、請求項42に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の前記トリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物(または前記フラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物)を含むかまたはそれからなる、請求項42または43に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1〜12のいずれか1つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項44に記載の方法。
- 前記コロナウイルス感染症が、風邪、肺炎、肺臓炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群(SARS)、中東呼吸器症候群(MERS)、副鼻腔炎、耳炎、または咽頭炎からなる群から選択される、請求項42〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 説明を参照して本明細書に記載されるような、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に使用するためのポリペプチド。
- 説明を参照して本明細書に記載されるような、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための薬剤の調製におけるポリペプチドの使用。
- 説明を参照した、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための方法。
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