CN113774044B - 一种高纯度玻璃酸酶的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，采用亲和层析梯度法纯化，通过不同粒径的改性成分处理制得的改性琼脂糖凝胶CL‑4B作为凝胶载体，将多粘菌素B承载于其中，大幅提升了亲和层析柱的有效吸附量；超滤浓缩步骤中采用微孔滤膜进行除菌过滤，细菌截留率高，同时，针对目前微孔滤膜频繁使用易出现孔隙增大，截留量降低的问题，采用1,5,7‑三叠氮双环(4.4.0)癸‑5‑烯、胶木粉、芦荟提取物为原料的改性剂处理制备铸膜液，大幅提高了常规苯胺、聚醚酰亚氨制备的滤膜的拉伸强度，延长了滤膜的耐用性；同时针对拉伸强度提高导致抗冲击强度一般的问题，发明人通过研究改进致孔剂，在致孔效果不影响的情况下，拉伸强度和抗冲击强度也同时达到平衡。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高纯度玻璃酸酶的制备工艺。
背景技术
玻璃酸酶又名透明质酸酶，是从哺乳动物睾丸中提取的一种能水解玻璃黏多糖的酶，是一种白色或微黄色粉末，在水中易溶，在乙醇、丙酮或乙醚中不溶。无臭。稳定性较好，42℃持续加热60min活力不损失，100℃持续加热5min活力可保留80％。在低浓度的水溶液中较易失活，一般可用明胶或阿拉伯胶保护防止失活。Fe2+、Cu2+离子对酶有可逆抑制作用。Pb2+、Hg2+、Ni 2+、等离子对酶活性没有明显影响。在氯化钠(0.15mol/L)或硫酸鱼精蛋白的存在下，硫酸软骨素B(皮肤素)、硫酸类肝素、硫酸角质素、肝素钠及高浓度玻璃酸对玻璃酸酶的抑制作用可被逆转。
玻璃酸是存在于人体组织间基质中的粘多糖，能限制细胞外液的扩散。玻璃酸酶作用于玻璃酸分子中的葡萄糖胺键，使之水解和解聚，降低体液的粘度，使细胞间液易流动扩散，故可使局部积贮的药液、渗出液或血液扩散，加速药物吸收，减轻局部组织张力和疼痛，并有利于水肿、炎性渗出物的吸收、消散。
然而，随着国家药品标准的进一步提高，玻璃酸酶的质量标准也更加的严格。中国药典2010版规定玻璃酸酶酸度在4.5-7.5；干燥失重<5.0％；酪氨酸含量<0.1ug；玻璃酸酶效价≥300单位；细菌内毒素为每1单位玻璃酸酶中含内毒素的量应小于0.20EU。因此，如何开发获取高纯度医用级玻璃酸酶产品成了众多生物制品厂商的研究重点。
发明内容
本发明的第一目的：提供一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺；
本发明的另一目的：提供一种用于高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺中的PMB亲和层析柱；本发明的第三目的：提供一种用于高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺中的微孔滤膜；
本发明通过如下技术方案实现：一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，具体为：
(1)、玻璃酸酶粗品溶解：取玻璃酸酶粗品，用15-25倍纯化水溶解，搅拌1小时，2000-4000r/min离心，取上清，调PH至7.0，上清液备用。
(2)、巴氏法消毒：取以上上清液，按每升体积加入100-300g蔗糖，用8M氢氧化钠调节PH至7.0，置50-70℃水浴箱中，搅拌保温8-12小时；转移至2-8℃环境中冷却，得冷却液。
(3)、PMB亲和层析去热原：将以上冷却液过PMB亲和层析柱，再用5倍柱床的0.15MNaAC PH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液。
(4)、亲和层析梯度法纯化：将以上洗脱流出液经过亲和层析吸附，并用0.02MNaAC/HAC PH7.0的溶液洗涤，再用0.02M NaAC/HAC以及0.02M NaAC/HAC-0.6M NaCl、PH7.0溶液采用梯度洗脱法进行在线洗脱，依据OD280蛋白峰值，按每CV(柱床)进行分段收集并测定各段玻璃酸酶的效价、蛋白，计算其比活，合并高纯度玻璃酸酶产品的收集液。
(5)、超滤浓缩、过滤：将以上收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液。
(6)、冷冻干燥：玻璃酸酶无菌溶液倒入消毒的冻干盘内，采用-45℃预冷3-6h；干燥箱真空度≤30Mpa，25℃升华至产品干燥为止，即得高纯度医用级玻璃酸酶。
所述PMB亲和层析柱的制备方法为，
(1)、取改性琼脂糖凝胶CL-4B 0.5-1.5L，用5-15L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1-2L，得悬浮液a；
(2)、将悬浮液a置于2-6℃环境冰浴，边搅拌边滴加50-150ml环氧氯丙烷滴加速度为15-25ml/min、100-300ml二甲亚砜滴加速度为20-30ml/min，滴加完毕后静置反应4-8h，产物用纯水滤洗3-5次，用纯水悬浮至1-2L，得悬浮液b；
(3)、取多粘菌素B 8-16g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，23-27℃温度下搅拌10-14h，静置2h，产物先用5-15L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤3-5次，按需求规格装柱，即得。
所述改性琼脂糖凝胶CL-4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶CL-4B 80-90份、改性成分3-9份；
(1)、取改性成分浸渍于液氮中，低温冷冻10-20min，取出立即粉碎，分别过2000目、1000目、500目分子筛，混合，得预处理改性成分，备用；其中2000目、1000目、500目的质量比为3-7：2-4：1；
(2)、琼脂糖凝胶CL-4B以4-8℃/min升温至65-75℃，恒温2-6min，加入预处理改性成分，搅拌均匀，转移至模具中，20s内降至常温，20-60Mpa加压40-60s成型，得改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品；
(3)、将改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品置于5倍质量的溶剂中，300-400rpm转速搅拌1h，静置2h，搅拌静置循环6-10次，每两个循环更换溶剂，得改性琼脂糖凝胶CL-4B。
所述改性成分为质量比为1：1-3的N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺、聚碳化二亚胺的混合物；
所述溶剂为质量比为1：1：1的甲苯、苯、硫酸二甲酯的混合物。
所述微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料55-85份、有机溶剂60-120份、致孔剂3-9份、塑化剂0.5-1.5份；
(1)、制备铸膜液：将铸膜液主料与有机溶剂混合搅拌至完全溶解，升温至45-55℃，保温5-15min，1-3℃/min升温75-85℃，加入致孔剂，400～800r/min搅拌10-20min，转移至脱泡机中脱泡处理，冷却至常温，得铸膜液；
(2)、制备滤膜：通过刮涂或喷涂的方式将铸膜液均匀的涂覆在洁净的平板玻璃上，控制湿膜的厚度为220-360um，然后在常温状态下自然晾置1-3min，浸入15-25℃的水中进行相转化，浸泡0.5-1.5h，取出，先垂直挂沥至无滴水，再转移至烘箱中，30-40℃烘干，即得微孔滤膜。
所述有机溶剂为质量比为1-3：1的四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺的混合溶液；所述塑化剂为磷酸二苯基异辛酯；
所述铸膜液主料的制备方法为，原料按重量份计算包括聚苯胺35-55份、聚醚酰亚氨20-40份、改性剂20-30份；将聚苯胺、聚醚酰亚氨放入研磨机中研磨粉碎至均匀颗粒，装入反应罐中，10-20℃/min升温至340-400℃，保温5-10min，自然降温至160-180℃，加入改性剂，再以1-3℃/min重新升温至340-400℃，保温反应5-10min，自然降温100-120℃，趁热用造粒机挤出造粒，研磨粉碎过200目筛网，即得；
所述改性剂的制备原料为质量比为1：6-10：2-6的1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯、胶木粉、芦荟提取物，将胶木粉与1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合，得胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物备用；将芦荟提取物分散于5倍质量的水中，加入胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物，升温至40-60℃，搅拌均匀，抽滤，滤渣干燥至恒温，超微粉碎至2000目即得。
所述致孔剂的制备原料按重量份计算包括聚乙二醇5-10份、聚丙二醇3-7份、二甲苯2-6份、纤维石膏10-20份，(1)、纤维石膏预处理：取纤维石膏粉碎，过50目筛网，浸泡于10倍质量、5-10％质量浓度的醋酸钠溶液中，时长5-10min，抽滤，滤渣用纯水洗涤3-5次，得纤维石膏粉；
(2)、纤维石膏强化处理：将纤维石膏粉置于温度为50-70℃的真空干燥箱中烘至恒温，迅速转移至高温炉中，7-11℃/min升温至130-160℃，保温10min，2-4℃/min降至常温，升温-保温-降温循环3-5次，取出粉碎，过1000目筛，得强化纤维石膏微粉；(3)、制得致孔剂：将强化纤维石膏微粉与聚乙二醇、聚丙二醇、二甲苯共混，100-200rpm转速搅拌分散0.5-1.5h，即得。
所述纤维石膏为竹炭纤维石膏或麦秆纤维石膏。
本发明的优势在于：
1、采用亲和层析梯度法纯化，通过PMB亲和层析柱吸附处理玻璃酸酶粗品，纯化后的高纯度医用级玻璃酸酶效价高达1.43万IU/mg；吸光度280nm为0.025；吸光度260nm为0.018；酪氨酸为0.001ug/IU；蛋白为0.701mg/mg；比活为2.03万IU/mg.pr；细菌内毒素为0.05EU/IU；2、本发明制备的PMB亲和层析柱针对细菌内毒素的吸附效果明显，通过不同粒径的改性成分处理制得的改性琼脂糖凝胶CL-4B作为凝胶载体，将多粘菌素B承载于其中，大幅提升了亲和层析柱的有效吸附量，高达10000EU/L胶以上，此外，亲和层析柱耐用稳定性也得到一定的提升；
3、超滤浓缩步骤中采用微孔滤膜进行除菌过滤，细菌截留率高，同时，针对目前微孔滤膜频繁使用易出现孔隙增大，截留量降低的问题，采用1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯、胶木粉、芦荟提取物为原料的改性剂处理制备铸膜液，大幅提高了常规苯胺、聚醚酰亚氨制备的滤膜的拉伸强度，延长了滤膜的耐用性；
4、引入改性剂处理制备滤膜，拉伸强度大幅提高导致其抗冲击强度一般，发明人经过多次验证，调整改性剂的使用量始终无法使拉伸强度和抗冲击强度同时达到理想效果，因此，引入发明人通过研究改进的致孔剂，致孔效果不影响的情况下，拉伸强度和抗冲击强度也同时达到平衡。
为了使发明所述的一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的描述。
具体实施例
实施例1
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，具体为：
(1)、玻璃酸酶粗品溶解：取玻璃酸酶粗品，用20倍纯化水溶解，搅拌1小时，3000r/min离心，取上清，调PH至7.0，上清液备用。
(2)、巴氏法消毒：取以上上清液，按每升体积加入200g蔗糖，用8M氢氧化钠调节PH至7.0，置60℃水浴箱中，搅拌保温10小时；转移至5℃环境中冷却，得冷却液。
(3)、PMB亲和层析去热原：将以上冷却液过PMB亲和层析柱，再用5倍柱床的0.15MNaAC PH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液。
(4)、亲和层析梯度法纯化：将以上洗脱流出液经过亲和层析吸附，并用0.02MNaAC/HAC PH7.0的溶液洗涤，再用0.02M NaAC/HAC以及0.02M NaAC/HAC-0.6M NaCl、PH7.0溶液采用梯度洗脱法进行在线洗脱，依据OD280蛋白峰值，按每CV(柱床)进行分段收集并测定各段玻璃酸酶的效价、蛋白，计算其比活，合并高纯度玻璃酸酶产品的收集液。
(5)、超滤浓缩、过滤：将以上收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液。
(6)、冷冻干燥：玻璃酸酶无菌溶液倒入消毒的冻干盘内，采用-45℃预冷4.5h；干燥箱真空度≤30Mpa，25℃升华至产品干燥为止，即得高纯度医用级玻璃酸酶。
所述PMB亲和层析柱的制备方法为，
(1)、取改性琼脂糖凝胶CL-4B 1.0L，用10L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1.5L，得悬浮液a；
(2)、将悬浮液a置于4℃环境冰浴，边搅拌边滴加50-150ml环氧氯丙烷滴加速度为20ml/min、200ml二甲亚砜滴加速度为25ml/min，滴加完毕后静置反应6h，产物用纯水滤洗4次，用纯水悬浮至1.5L，得悬浮液b；
(3)、取多粘菌素B12g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，25℃温度下搅拌12h，静置2h，产物先用10L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤4次，按需求规格装柱，即得。
所述改性琼脂糖凝胶CL-4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶CL-4B 85份、改性成分6份；
(1)、取改性成分浸渍于液氮中，低温冷冻15min，取出立即粉碎，分别过2000目、1000目、500目分子筛，混合，得预处理改性成分，备用；其中2000目、1000目、500目的质量比为5：3：1；
(2)、琼脂糖凝胶CL-4B以6℃/min升温至70℃，恒温4min，加入预处理改性成分，搅拌均匀，转移至模具中，20s内降至常温，40Mpa加压50s成型，得改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品；
(3)、将改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品置于5倍质量的溶剂中，350rpm转速搅拌1h，静置2h，搅拌静置循环8次，每两个循环更换溶剂，得改性琼脂糖凝胶CL-4B。
所述改性成分为质量比为1：2的N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺、聚碳化二亚胺的混合物；
所述溶剂为质量比为1：1：1的甲苯、苯、硫酸二甲酯的混合物。
所述微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
(1)、制备铸膜液：将铸膜液主料与有机溶剂混合搅拌至完全溶解，升温至50℃，保温10min，2℃/min升温80℃，加入致孔剂，600r/min搅拌15min，转移至脱泡机中脱泡处理，冷却至常温，得铸膜液；
(2)、制备滤膜：通过刮涂或喷涂的方式将铸膜液均匀的涂覆在洁净的平板玻璃上，控制湿膜的厚度为290um，然后在常温状态下自然晾置2min，浸入20℃的水中进行相转化，浸泡1h，取出，先垂直挂沥至无滴水，再转移至烘箱中，35℃烘干，即得微孔滤膜。
所述有机溶剂为质量比为2：1的四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺的混合溶液；所述塑化剂为磷酸二苯基异辛酯；
所述铸膜液主料的制备方法为，原料按重量份计算包括聚苯胺45份、聚醚酰亚氨30份、改性剂25份；将聚苯胺、聚醚酰亚氨放入研磨机中研磨粉碎至均匀颗粒，装入反应罐中，15℃/min升温至370℃，保温8min，自然降温至170℃，加入改性剂，再以2℃/min重新升温至370℃，保温反应8min，自然降温110℃，趁热用造粒机挤出造粒，研磨粉碎过200目筛网，即得；
所述改性剂的制备原料为质量比为1：8：4的1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯、胶木粉、芦荟提取物，将胶木粉与1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合，得胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物备用；将芦荟提取物分散于5倍质量的水中，加入胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物，升温至50℃，搅拌均匀，抽滤，滤渣干燥至恒温，超微粉碎至2000目即得。
所述致孔剂的制备原料按重量份计算包括聚乙二醇8份、聚丙二醇5份、二甲苯4份、纤维石膏15份，(1)、纤维石膏预处理：取纤维石膏粉碎，过50目筛网，浸泡于10倍质量、8％质量浓度的醋酸钠溶液中，时长8min，抽滤，滤渣用纯水洗涤4次，得纤维石膏粉；
(2)、纤维石膏强化处理：将纤维石膏粉置于温度为60℃的真空干燥箱中烘至恒温，迅速转移至高温炉中，9℃/min升温至145℃，保温10min，3℃/min降至常温，升温-保温-降温循环4次，取出粉碎，过1000目筛，得强化纤维石膏微粉；(3)、制得致孔剂：将强化纤维石膏微粉与聚乙二醇、聚丙二醇、二甲苯共混，150rpm转速搅拌分散1h，即得。
所述纤维石膏为竹炭纤维石膏。
实施例2
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，具体为：
(1)、玻璃酸酶粗品溶解：取玻璃酸酶粗品，用15倍纯化水溶解，搅拌1小时，2000r/min离心，取上清，调PH至7.0，上清液备用。
(2)、巴氏法消毒：取以上上清液，按每升体积加入300g蔗糖，用8M氢氧化钠调节PH至7.0，置70℃水浴箱中，搅拌保温12小时；转移至8℃环境中冷却，得冷却液。
(3)、PMB亲和层析去热原：将以上冷却液过PMB亲和层析柱，再用5倍柱床的0.15MNaAC PH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液。
(4)、亲和层析梯度法纯化：将以上洗脱流出液经过亲和层析吸附，并用0.02MNaAC/HAC PH7.0的溶液洗涤，再用0.02M NaAC/HAC以及0.02M NaAC/HAC-0.6M NaCl、PH7.0溶液采用梯度洗脱法进行在线洗脱，依据OD280蛋白峰值，按每CV(柱床)进行分段收集并测定各段玻璃酸酶的效价、蛋白，计算其比活，合并高纯度玻璃酸酶产品的收集液。
(5)、超滤浓缩、过滤：将以上收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液。
(6)、冷冻干燥：玻璃酸酶无菌溶液倒入消毒的冻干盘内，采用-45℃预冷3h；干燥箱真空度≤30Mpa，25℃升华至产品干燥为止，即得高纯度医用级玻璃酸酶。
所述PMB亲和层析柱的制备方法为，
(1)、取改性琼脂糖凝胶CL-4B 0.5L，用5L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1L，得悬浮液a；
(2)、将悬浮液a置于6℃环境冰浴，边搅拌边滴加150ml环氧氯丙烷滴加速度为25ml/min、300ml二甲亚砜滴加速度为30ml/min，滴加完毕后静置反应8h，产物用纯水滤洗5次，用纯水悬浮至2L，得悬浮液b；
(3)、取多粘菌素B 8g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，23℃温度下搅拌10h，静置2h，产物先用5L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤3次，按需求规格装柱，即得。
所述改性琼脂糖凝胶CL-4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶CL-4B 80份、改性成分3份；
(1)、取改性成分浸渍于液氮中，低温冷冻10min，取出立即粉碎，分别过2000目、1000目、500目分子筛，混合，得预处理改性成分，备用；其中2000目、1000目、500目的质量比为3：2：1；
(2)、琼脂糖凝胶CL-4B以8℃/min升温至75℃，恒温6min，加入预处理改性成分，搅拌均匀，转移至模具中，20s内降至常温，60Mpa加压60s成型，得改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品；
(3)、将改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品置于5倍质量的溶剂中，400rpm转速搅拌1h，静置2h，搅拌静置循环10次，每两个循环更换溶剂，得改性琼脂糖凝胶CL-4B。
所述改性成分为质量比为1：1的N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺、聚碳化二亚胺的混合物；
所述溶剂为质量比为1：1：1的甲苯、苯、硫酸二甲酯的混合物。
所述微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料55份、有机溶剂60份、致孔剂3份、塑化剂0.5份；
(1)、制备铸膜液：将铸膜液主料与有机溶剂混合搅拌至完全溶解，升温至45℃，保温5min，1℃/min升温75℃，加入致孔剂，400r/min搅拌10min，转移至脱泡机中脱泡处理，冷却至常温，得铸膜液；
(2)、制备滤膜：通过刮涂或喷涂的方式将铸膜液均匀的涂覆在洁净的平板玻璃上，控制湿膜的厚度为360um，然后在常温状态下自然晾置3min，浸入25℃的水中进行相转化，浸泡1.5h，取出，先垂直挂沥至无滴水，再转移至烘箱中，40℃烘干，即得微孔滤膜。
所述有机溶剂为质量比为1：1的四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺的混合溶液；所述塑化剂为磷酸二苯基异辛酯；
所述铸膜液主料的制备方法为，原料按重量份计算包括聚苯胺55份、聚醚酰亚氨40份、改性剂30份；将聚苯胺、聚醚酰亚氨放入研磨机中研磨粉碎至均匀颗粒，装入反应罐中，20℃/min升温至400℃，保温10min，自然降温至180℃，加入改性剂，再以3℃/min重新升温至400℃，保温反应10min，自然降温120℃，趁热用造粒机挤出造粒，研磨粉碎过200目筛网，即得；
所述改性剂的制备原料为质量比为1：6：2的1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯、胶木粉、芦荟提取物，将胶木粉与1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合，得胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物备用；将芦荟提取物分散于5倍质量的水中，加入胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物，升温至40℃，搅拌均匀，抽滤，滤渣干燥至恒温，超微粉碎至2000目即得。
所述致孔剂的制备原料按重量份计算包括聚乙二醇10份、聚丙二醇7份、二甲苯6份、纤维石膏20份，(1)、纤维石膏预处理：取纤维石膏粉碎，过50目筛网，浸泡于10倍质量、10％质量浓度的醋酸钠溶液中，时长10min，抽滤，滤渣用纯水洗涤5次，得纤维石膏粉；
(2)、纤维石膏强化处理：将纤维石膏粉置于温度为50℃的真空干燥箱中烘至恒温，迅速转移至高温炉中，7℃/min升温至130℃，保温10min，2℃/min降至常温，升温-保温-降温循环3次，取出粉碎，过1000目筛，得强化纤维石膏微粉；(3)、制得致孔剂：将强化纤维石膏微粉与聚乙二醇、聚丙二醇、二甲苯共混，100rpm转速搅拌分散0.5h，即得。
所述纤维石膏为麦秆纤维石膏。
实施例3
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，具体为：
(1)、玻璃酸酶粗品溶解：取玻璃酸酶粗品，用25倍纯化水溶解，搅拌1小时，4000r/min离心，取上清，调PH至7.0，上清液备用。
(2)、巴氏法消毒：取以上上清液，按每升体积加入100g蔗糖，用8M氢氧化钠调节PH至7.0，置50℃水浴箱中，搅拌保温8小时；转移至2℃环境中冷却，得冷却液。
(3)、PMB亲和层析去热原：将以上冷却液过PMB亲和层析柱，再用5倍柱床的0.15MNaAC PH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液。
(4)、亲和层析梯度法纯化：将以上洗脱流出液经过亲和层析吸附，并用0.02MNaAC/HAC PH7.0的溶液洗涤，再用0.02M NaAC/HAC以及0.02M NaAC/HAC-0.6M NaCl、PH7.0溶液采用梯度洗脱法进行在线洗脱，依据OD280蛋白峰值，按每CV(柱床)进行分段收集并测定各段玻璃酸酶的效价、蛋白，计算其比活，合并高纯度玻璃酸酶产品的收集液。
(5)、超滤浓缩、过滤：将以上收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液。
(6)、冷冻干燥：玻璃酸酶无菌溶液倒入消毒的冻干盘内，采用-45℃预冷6h；干燥箱真空度≤30Mpa，25℃升华至产品干燥为止，即得高纯度医用级玻璃酸酶。
所述PMB亲和层析柱的制备方法为，
(1)、取改性琼脂糖凝胶CL-4B 1.5L，用15L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至2L，得悬浮液a；
(2)、将悬浮液a置于2℃环境冰浴，边搅拌边滴加50ml环氧氯丙烷滴加速度为15ml/min、100ml二甲亚砜滴加速度为20ml/min，滴加完毕后静置反应4h，产物用纯水滤洗3次，用纯水悬浮至1L，得悬浮液b；
(3)、取多粘菌素B16g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，27℃温度下搅拌14h，静置2h，产物先用15L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤5次，按需求规格装柱，即得。
所述改性琼脂糖凝胶CL-4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶CL-4B 90份、改性成分9份；
(1)、取改性成分浸渍于液氮中，低温冷冻20min，取出立即粉碎，分别过2000目、1000目、500目分子筛，混合，得预处理改性成分，备用；其中2000目、1000目、500目的质量比为7：4：1；
(2)、琼脂糖凝胶CL-4B以4℃/min升温至65℃，恒温2min，加入预处理改性成分，搅拌均匀，转移至模具中，20s内降至常温，20Mpa加压40s成型，得改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品；
(3)、将改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品置于5倍质量的溶剂中，300rpm转速搅拌1h，静置2h，搅拌静置循环6次，每两个循环更换溶剂，得改性琼脂糖凝胶CL-4B。
所述改性成分为质量比为1：3的N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺、聚碳化二亚胺的混合物；
所述溶剂为质量比为1：1：1的甲苯、苯、硫酸二甲酯的混合物。
所述微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料85份、有机溶剂120份、致孔剂9份、塑化剂1.5份；
(1)、制备铸膜液：将铸膜液主料与有机溶剂混合搅拌至完全溶解，升温至55℃，保温15min，3℃/min升温85℃，加入致孔剂，800r/min搅拌20min，转移至脱泡机中脱泡处理，冷却至常温，得铸膜液；
(2)、制备滤膜：通过刮涂或喷涂的方式将铸膜液均匀的涂覆在洁净的平板玻璃上，控制湿膜的厚度为220um，然后在常温状态下自然晾置1min，浸入15℃的水中进行相转化，浸泡0.5h，取出，先垂直挂沥至无滴水，再转移至烘箱中，30℃烘干，即得微孔滤膜。
所述有机溶剂为质量比为3：1的四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺的混合溶液；所述塑化剂为磷酸二苯基异辛酯；
所述铸膜液主料的制备方法为，原料按重量份计算包括聚苯胺35份、聚醚酰亚氨20份、改性剂20份；将聚苯胺、聚醚酰亚氨放入研磨机中研磨粉碎至均匀颗粒，装入反应罐中，10℃/min升温至340℃，保温5min，自然降温至160℃，加入改性剂，再以1℃/min重新升温至340℃，保温反应5min，自然降温100℃，趁热用造粒机挤出造粒，研磨粉碎过200目筛网，即得；
所述改性剂的制备原料为质量比为1：10：6的1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯、胶木粉、芦荟提取物，将胶木粉与1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合，得胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物备用；将芦荟提取物分散于5倍质量的水中，加入胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物，升温至60℃，搅拌均匀，抽滤，滤渣干燥至恒温，超微粉碎至2000目即得。
所述致孔剂的制备原料按重量份计算包括聚乙二醇5份、聚丙二醇3份、二甲苯2份、纤维石膏10份，(1)、纤维石膏预处理：取纤维石膏粉碎，过50目筛网，浸泡于10倍质量、5％质量浓度的醋酸钠溶液中，时长5min，抽滤，滤渣用纯水洗涤3次，得纤维石膏粉；
(2)、纤维石膏强化处理：将纤维石膏粉置于温度为70℃的真空干燥箱中烘至恒温，迅速转移至高温炉中，11℃/min升温至160℃，保温10min，4℃/min降至常温，升温-保温-降温循环5次，取出粉碎，过1000目筛，得强化纤维石膏微粉；(3)、制得致孔剂：将强化纤维石膏微粉与聚乙二醇、聚丙二醇、二甲苯共混，200rpm转速搅拌分散1.5h，即得。
所述纤维石膏为麦秆纤维石膏。
实施例4
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中PMB亲和层析柱的制备方法为，
(1)、取琼脂糖凝胶CL-4B 1L，用10L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1.5L，得悬浮液a；
(2)、将悬浮液a置于4℃环境冰浴，边搅拌边滴加100ml环氧氯丙烷滴加速度为20ml/min、200ml二甲亚砜滴加速度为25ml/min，滴加完毕后静置反应6h，产物用纯水滤洗4次，用纯水悬浮至1.5L，得悬浮液b；
(3)、取多粘菌素B12g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，25℃温度下搅拌12h，静置2h，产物先用10L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤4次，按需求规格装柱，即得。
其余同实施例1。
实施例5
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中PMB亲和层析柱的制备方法为，
(1)、取改性琼脂糖凝胶CL-4B 0.2L，用10L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1.5L，得悬浮液a；
(2)、将悬浮液a置于4℃环境冰浴，边搅拌边滴加100ml环氧氯丙烷滴加速度为20ml/min、200ml二甲亚砜滴加速度为25ml/min，滴加完毕后静置反应6h，产物用纯水滤洗4次，用纯水悬浮至1.5L，得悬浮液b；
(3)、取多粘菌素B12g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，25℃温度下搅拌12h，静置2h，产物先用10L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤4次，按需求规格装柱，即得。
其余同实施例1。
实施例6
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中PMB亲和层析柱的制备方法为，
(1)、取改性琼脂糖凝胶CL-4B 2L，用10L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1.5L，得悬浮液a；
(2)、将悬浮液a置于4℃环境冰浴，边搅拌边滴加100ml环氧氯丙烷滴加速度为20ml/min、200ml二甲亚砜滴加速度为25ml/min，滴加完毕后静置反应6h，产物用纯水滤洗4次，用纯水悬浮至1.5L，得悬浮液b；
(3)、取多粘菌素B12g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，25℃温度下搅拌12h，静置2h，产物先用10L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤4次，按需求规格装柱，即得。
其余同实施例1。
实施例7
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中PMB亲和层析柱的制备原料改性琼脂糖凝胶CL-4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶CL-4B 85份、改性成分2份；
其余同实施例1。
实施例8
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中PMB亲和层析柱的制备原料改性琼脂糖凝胶CL-4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶CL-4B 85份、改性成分10份；
其余同实施例1。
实施例9
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中PMB亲和层析柱的制备原料改性琼脂糖凝胶CL-4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶CL-4B 85份、改性成分6份；
(1)、琼脂糖凝胶CL-4B以6℃/min升温至70℃，恒温4min，加入改性成分，搅拌均匀，转移至模具中，20s内降至常温，40Mpa加压50s成型，得改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品；
(2)、将改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品置于5倍质量的溶剂中，350rpm转速搅拌1h，静置2h，搅拌静置循环8次，每两个循环更换溶剂，得改性琼脂糖凝胶CL-4B。
其余同实施例1。
实施例10
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中步骤PMB亲和去热原步骤为：将冷却液过市售普通亲和层析柱再用5倍柱床的0.15M NaAC PH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液；
其余同实施例1。
实施例11
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中超滤浓缩、过滤步骤为：将收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液。
所述微孔滤膜为市售普通微孔滤膜。
其余同实施例1。
实施例12
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料54份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
其余同实施例1。
实施例13
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料86份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
其余同实施例1。
实施例14
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
所述铸膜液主料的制备方法为，原料按重量份计算包括聚苯胺45份、聚醚酰亚氨30份；将聚苯胺、聚醚酰亚氨放入研磨机中研磨粉碎至均匀颗粒，装入反应罐中，15℃/min升温至370℃，保温8min，自然降温110℃，趁热用造粒机挤出造粒，研磨粉碎过200目筛网，即得；
其余同实施例1。
实施例15
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
所述铸膜液主料的制备原料按重量份计算包括聚苯胺45份、聚醚酰亚氨30份、改性剂19份；其余同实施例1。
实施例16
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
所述铸膜液主料的制备原料按重量份计算包括聚苯胺45份、聚醚酰亚氨30份、改性剂31份；其余同实施例1。
实施例17
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
所述铸膜液主料的制备方法为，原料按重量份计算包括聚苯胺35-55份、聚醚酰亚氨30份、改性剂25份；
所述改性剂的制备原料为质量比为1：5：7的1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯、胶木粉、芦荟提取物；
其余同实施例1。
实施例18
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
所述铸膜液主料的制备方法为，原料按重量份计算包括聚苯胺35-55份、聚醚酰亚氨30份、改性剂25份；
所述改性剂的制备原料为质量比为1：11：1的1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯、胶木粉、芦荟提取物；
其余同实施例1。
实施例19
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂2份、塑化剂1份；
其余同实施例1。
实施例20
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂10份、塑化剂1份；
其余同实施例1。
实施例21
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
所述致孔剂的制备原料按重量份计算包括聚乙二醇8份、聚丙二醇5份、二甲苯4份、纤维石膏9份；
其余同实施例1。
实施例22
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
所述致孔剂的制备原料按重量份计算包括聚乙二醇8份、聚丙二醇5份、二甲苯4份、纤维石膏21份；
其余同实施例1。
实施例23
一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，其中微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料70份、有机溶剂90份、致孔剂6份、塑化剂1份；
所述致孔剂的制备原料按重量份计算包括聚乙二醇8份、聚丙二醇5份、二甲苯4份、纤维石膏15份，(1)、纤维石膏预处理：取纤维石膏粉碎，过50目筛网，浸泡于10倍质量、8％质量浓度的醋酸钠溶液中，时长8min，抽滤，滤渣用纯水洗涤4次，得纤维石膏粉；
(2)、制得致孔剂：将纤维石膏微粉与聚乙二醇、聚丙二醇、二甲苯共混，150rpm转速搅拌分散1h，即得。
其余同实施例1。
试验
试验1玻璃酸酶质量参数检测
对上述各实施例方法制备的玻璃酸酶以及玻璃酸酶粗品进行质量检测，具体如下表1：
表1玻璃酸酶质量参数情况表
从上表1可知：
(1)、各实施例制备的玻璃酸酶对比玻璃酸酶粗品的品质提升明显，其中以实施例1-3较突出，尤其以实施例1最佳；
(2)、对比实施例4-10与实施例1，实施例4的琼脂糖凝胶CL-4B未改性处理，实施例5、6的改性琼脂糖凝胶CL-4B使用量不符合技术要求，实施例7、8改性琼脂糖凝胶CL-4B的改性成分用量不符合技术要求，实施例9改性琼脂糖凝胶CL-4B的改性成分未按技术要求进行颗粒梯度处理，以上均影响多粘菌素B在凝胶载体上的承载量，从而影响PMB亲和层析柱对细菌内毒素的吸附效果，此外实施例10采用普通层析柱吸附，效果明显不如本发明的其它实施例；
(3)、对比实施例11-23和实施例1，实施例11选用市售普通微孔滤膜替代本发明提供的微孔滤膜，实施例12、13的铸膜液主料使用量不在本发明技术范围，结果不如前者；实施例14的铸膜液主料为经过本发明改性处理，实施例15、16的铸膜液主料改性时改性剂使用量不在本发明技术范围，实施例17、18则是改性剂的制备原料配比不符合技术要求，实施例19、20致孔剂使用量不符合技术要求，实施例21、22的致孔剂制备原料纤维石膏使用量不符合技术要求，实施例23则是纤维石膏使用前未做强化处理，对比发现，微孔滤膜的品质对玻璃酸酶效价和比活影响较大，同时优质的微孔滤膜，可以有效的滤去微量细菌内毒素，此外，品质的变化使吸光度与酪氨酸值相应也受一定的影响；
试验2微孔滤膜性能对比
对比实施例1-3和实施例11-23的微孔滤膜机械性能，具体结果如下表2：
表2微孔滤膜性能情况表
从上表2可知：
(1)、各实施例的微孔滤膜性能数据以实施例1-3较优，实施例1最佳；
(2)、对比实施例1与实施例11-18，实施例11选用市售普通微孔滤膜替代本发明滤膜；实施例12、13的铸膜液主料使用量不在本发明技术范围，结果不如前者；实施例14的铸膜液主料为经过本发明改性处理，实施例15、16的铸膜液主料改性时改性剂使用量不在本发明技术范围，实施例17、18则是改性剂的制备原料配比不符合技术要求，均影响拉伸强度和抗冲击强度；
(3)、对比实施例1与实施例19-23，实施例19、20致孔剂使用量不符合技术要求，实施例21、22的致孔剂制备原料纤维石膏使用量不符合技术要求，实施例23则是纤维石膏使用前未做强化处理，结果均不如前者。
Claims (1)
1.一种高纯度玻璃酸酶的制备工艺，其特征在于：具体步骤如下，
(1)、玻璃酸酶粗品溶解：取玻璃酸酶粗品，用15-25倍纯化水溶解，搅拌1小时，2000-4000r/min离心，取上清，调PH至7.0，备用；
(2)、巴氏法消毒：取以上上清液，按每升体积加入100-300g蔗糖，用8M氢氧化钠调节PH至7.0，置50-70℃水浴箱中，搅拌保温8-12小时；转移至2-8℃环境中冷却，得冷却液；
(3)、PMB亲和层析去热原：将以上冷却液过PMB亲和层析柱，再用5倍柱床的0.15M NaACPH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液；
(4)、亲和层析梯度法纯化：将以上洗脱流出液经过亲和层析吸附，并用0.02M NaAC/HAC PH7.0的溶液洗涤，再用0.02M NaAC/HAC PH7.0以及0.02M NaAC/HAC-0.6M NaClPH7.0溶液采用梯度洗脱法进行在线洗脱，依据OD280蛋白峰值，按亲和层析吸附剂的体积进行分段收集并测定各段玻璃酸酶的效价、蛋白，计算其比活，合并高纯度玻璃酸酶产品的收集液；
(5)、超滤浓缩、过滤：将以上收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液；
(6)、冷冻干燥：玻璃酸酶无菌溶液倒入消毒的冻干盘内，采用-45℃预冷3-6h；干燥箱真空度≤30Mpa，25℃升华至产品干燥为止，即得高纯度玻璃酸酶；
所述PMB亲和层析柱的制备方法为，
(1)、取改性琼脂糖凝胶CL-4B 0.5-1.5L，用5-15L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1-2L，得悬浮液a；
(2)、将悬浮液a置于2-6℃环境冰浴，边搅拌边滴加50-150ml环氧氯丙烷滴加速度为15-25ml/min、100-300ml二甲亚砜滴加速度为20-30ml/min，滴加完毕后静置反应4-8h，产物用纯水滤洗3-5次，用纯水悬浮至1-2L，得悬浮液b；
(3)、取多粘菌素B 8-16g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，23-27℃温度下搅拌10-14h，静置2h，产物先用5-15L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤3-5次，按需求规格装柱，即得；
所述改性琼脂糖凝胶CL-4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶CL-4B80-90份、改性成分3-9份；
(1)、取改性成分浸渍于液氮中，低温冷冻10-20min，取出立即粉碎，分别过2000目、1000目、500目分子筛，混合，得预处理改性成分，备用；其中2000目、1000目、500目的质量比为3-7：2-4：1；
(2)、琼脂糖凝胶CL-4B以4-8℃/min升温至65-75℃，恒温2-6min，加入预处理改性成分，搅拌均匀，转移至模具中，20s内降至常温，20-60Mpa加压40-60s成型，得改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品；
(3)、将改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品置于5倍质量的溶剂中，300-400rpm转速搅拌1h，静置2h，搅拌静置循环6-10次，每两个循环更换溶剂，得改性琼脂糖凝胶CL-4B；
所述改性成分为质量比为1：1-3的N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺、聚碳化二亚胺的混合物；所述溶剂为质量比为1：1：1的甲苯、苯、硫酸二甲酯的混合物；
所述微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料55-85份、有机溶剂60-120份、致孔剂3-9份、塑化剂0.5-1.5份；
(1)、制备铸膜液：将铸膜液主料与有机溶剂混合搅拌至完全溶解，升温至45-55℃，保温5-15min，1-3℃/min升温75-85℃，加入致孔剂，400～800r/min搅拌10-20min，转移至脱泡机中脱泡处理，冷却至常温，得铸膜液；
(2)、制备滤膜：通过刮涂或喷涂的方式将铸膜液均匀的涂覆在洁净的平板玻璃上，控制湿膜的厚度为220-360um，然后在常温状态下自然晾置1-3min，浸入15-25℃的水中进行相转化，浸泡0.5-1.5h，取出，先垂直挂沥至无滴水，再转移至烘箱中，30-40℃烘干，即得微孔滤膜；
所述有机溶剂为质量比为1-3：1的四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺的混合溶液；所述塑化剂为磷酸二苯基异辛酯；
所述铸膜液主料的制备方法为，原料按重量份计算包括聚苯胺35-55份、聚醚酰亚氨20-40份、改性剂20-30份；将聚苯胺、聚醚酰亚氨放入研磨机中研磨粉碎至均匀颗粒，装入反应罐中，10-20℃/min升温至340-400℃，保温5-10min，自然降温至160-180℃，加入改性剂，再以1-3℃/min重新升温至340-400℃，保温反应5-10min，自然降温100-120℃，趁热用造粒机挤出造粒，研磨粉碎过200目筛网，即得；
所述改性剂的制备原料为质量比为1：6-10：2-6的1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯、胶木粉、芦荟提取物，将胶木粉与1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合，得胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物备用；将芦荟提取物分散于5倍质量的水中，加入胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物，升温至40-60℃，搅拌均匀，抽滤，滤渣干燥至恒温，超微粉碎至2000目即得；
所述致孔剂的制备原料按重量份计算包括聚乙二醇5-10份、聚丙二醇3-7份、二甲苯2-6份、纤维石膏10-20份，(1)、纤维石膏预处理：取纤维石膏粉碎，过50目筛网，浸泡于10倍质量、5-10％质量浓度的醋酸钠溶液中，时长5-10min，抽滤，滤渣用纯水洗涤3-5次，得纤维石膏粉；(2)、纤维石膏强化处理：将纤维石膏粉置于温度为50-70℃的真空干燥箱中烘至恒温，迅速转移至高温炉中，7-11℃/min升温至130-160℃，保温10min，2-4℃/min降至常温，升温-保温-降温循环3-5次，取出粉碎，过1000目筛，得强化纤维石膏微粉；(3)、制得致孔剂：将强化纤维石膏微粉与聚乙二醇、聚丙二醇、二甲苯共混，100-200rpm转速搅拌分散0.5-1.5h，即得；所述纤维石膏为竹炭纤维石膏或麦秆纤维石膏。
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