CN109929824A - 一种亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶的方法，采用尼龙膜为基质，键合壳聚糖的方法对尼龙膜进行改性，使膜的非特异性吸附大大降低，得到一种新的染料亲和膜，对玻璃酸酶有较好的吸附性，纯化倍数很高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及用亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶的方法。
背景技术
玻璃酸酶又名透明质酸酶，在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时精子进入卵子。也存在于精子、颌下腺、蜂毒、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。
玻璃酸酶的稳定性较好，42℃加热60分钟活力不损失；100℃加热5分钟，活力可保留80%。受热失活后进行冷却可恢复部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍较稳定。
药用玻璃酸酶为白色或微黄色粉末，无气味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有机溶剂。生化制药主要用牛、羊睾丸为原料进行提取制备。
亲和膜色谱技术是一种20世纪80年代末发展起来的生物大分子分离纯化的新技术，把膜分离与亲和分离结合起来，使之兼具膜分离与亲和分离的特点。亲和膜色谱与传统的膜分离、亲和色谱相比，不仅具有纯化倍数高、压降小，分析时间短、生物大分子在分离过程中变性机率小，允许较快的加料速度等特点，而且比柱亲和色谱更易实现规模化纯化分离。
王彦，周淑敏等曾在2002年15卷（1）期的《黑龙江医药》上发表了一篇名为《透明质酸酶提取工艺的研究》的论文，较详细的介绍了工业生产中从羊睾丸中提取玻璃酸酶的传统工艺以及在此基础上由他们改良的新工艺；李丹，郭育涛等曾在2011年8月第40卷第8期的《应用化工》上发表了一篇名为《牛睾丸中透明质酸酶提取工艺研究》的论文，介绍了用盐酸和乙酸的混合液溶解、硫酸铵盐析方法，从牛睾丸中提取玻璃酸酶的实验研究。中国专利201310643506.X《一种提取玻璃酸酶精品的方法》只是通过普通的色谱分离来对玻璃酸酶进行纯化，本专利采用亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶，纯化倍数更高，在国内尚属首创，国内相关论文、专利等文献资料没有亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶的相关介绍。
发明内容
本发明提供了一种亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶的方法，采用尼龙膜为基质，键合壳聚糖的方法对尼龙膜进行改性，使膜的非特异性吸附大大降低，得到一种新的染料亲和膜，对玻璃酸酶有较好的吸附性，纯化倍数很高。具体步骤如下：
1.亲和膜的制备
1.1 尼龙膜的活化
尼龙膜先在40℃，1mol/L的HCL中水解4h，然后用甲醛进行活化.然后将10张水解的尼龙膜浸入20mL甲醛溶液（>36.5%），加入0.2ml 85%的磷酸，于60℃反应7h，40-50℃热水水洗5-8次。
1.2 尼龙膜的壳聚糖改性处理
将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10ml质量分数为1.5%的壳聚糖溶液（以体积分数为1%醋酸溶解），室温反应1h，然后转入80℃烘箱，1h后取出，分别以1%醋酸和去离子水洗去未反应的壳聚糖。
1.3 染料亲和膜的制备
20张上述改性的尼龙膜浸入200ml的10mg/ml的Cibacron Blue F3GA的水溶液，在60℃下密封搅拌30min，然后加入50ml质量分数为20%的NaCl溶液，反应30min后升温到80℃，加入20ml质量分数为25%的Na2CO3进行固色，继续反应4h后冷却，依次用热水、甲醇、2mol/LNaCl、6mol/L尿素、去离子水充分洗涤，直到洗涤液为无色，保存于pH8.0的0.05mol/LTris-HCl缓冲液中。
2.亲和膜对玻璃酸酶的静态吸附
采用静态吸附法，称取0.1g干燥的膜放入玻璃酸酶溶液中，调pH3.2-4.0，在室温25℃下震荡吸附2-4小时。
3.色谱过程
将20张亲和膜叠成膜堆，装入膜桥，首先以0.05mol/L，pH8.0的Tris-Hcl缓冲液配成溶液65ml（10.0mg/mL），以2.0ml/min的流速上样，然后以30ml平衡缓冲液冲洗膜堆，以除去膜上未被吸附的蛋白，直至流出液的吸光度接近0.最后用pH6.0，0.05mol/L的含1.0mol/LNaSCN的Tris-HCl缓冲液洗脱被吸附的玻璃酸酶。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
国内现有技术只是通过普通的色谱分离来对玻璃酸酶进行纯化，本专利采用亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶，纯化倍数更高，在国内尚属首创，国内相关论文、专利等文献资料没有亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶的相关介绍。
该项成果有良好的经济效益和社会效益，它不但解决国内外医疗用药的需求，还为养殖产品的综合利用开拓了新路， 对养殖业的发展有积极意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1.1 尼龙膜的活化
尼龙膜先在40℃，1mol/L的HCL中水解4h，然后用甲醛进行活化.然后将10张水解的尼龙膜浸入20mL甲醛溶液（>36.5%），加入0.2ml 85%的磷酸，于60℃反应7h，40-50℃热水水洗6次
1.2 尼龙膜的壳聚糖改性处理
将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10ml质量分数为1.5%的壳聚糖溶液（以体积分数为1%醋酸溶解），室温反应1h，然后转入80℃烘箱，1h后取出，分别以1%醋酸和去离子水洗去未反应的壳聚糖。
1.3 染料亲和膜的制备
20张上述改性的尼龙膜浸入200ml的10mg/ml的Cibacron Blue F3GA的水溶液，在60℃下密封搅拌30min，然后加入50ml质量分数为20%的NaCl溶液，反应30min后升温到80℃，加入20ml质量分数为25%的Na2CO3进行固色，继续反应4h后冷却，依次用热水、甲醇、2mol/LNaCl、6mol/L尿素、去离子水充分洗涤，直到洗涤液为无色，保存于pH8.0的0.05mol/LTris-HCl缓冲液中。
2.亲和膜对玻璃酸酶的静态吸附
采用静态吸附法，称取0.1g干燥的膜放入玻璃酸酶溶液中，调pH3.64，在室温25℃下震荡吸附3小时。
3.色谱过程
将20张亲和膜叠成膜堆，装入膜桥，首先以0.05mol/L，pH8.0的Tris-Hcl缓冲液配成溶液65ml（10.0mg/mL），以2.0ml/min的流速上样，然后以30ml平衡缓冲液冲洗膜堆，以除去膜上未被吸附的蛋白，直至流出液的吸光度接近0.最后用pH6.0，0.05mol/L的含1.0mol/LNaSCN的Tris-HCl缓冲液洗脱被吸附的玻璃酸酶。
实施例2
1.1 尼龙膜的活化
尼龙膜先在40℃，1mol/L的HCL中水解4h，然后用甲醛进行活化.然后将10张水解的尼龙膜浸入20mL甲醛溶液（>36.5%），加入0.2ml 85%的磷酸，于60℃反应7h，40-50℃热水水洗6次
1.2 尼龙膜的壳聚糖改性处理
将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10ml质量分数为1.5%的壳聚糖溶液（以体积分数为1%醋酸溶解），室温反应1h，然后转入80℃烘箱，1h后取出，分别以1%醋酸和去离子水洗去未反应的壳聚糖。
1.3 染料亲和膜的制备
20张上述改性的尼龙膜浸入200ml的10mg/ml的Cibacron Blue F3GA的水溶液，在60℃下密封搅拌30min，然后加入50ml质量分数为20%的NaCl溶液，反应30min后升温到80℃，加入20ml质量分数为25%的Na2CO3进行固色，继续反应4h后冷却，依次用热水、甲醇、2mol/LNaCl、6mol/L尿素、去离子水充分洗涤，直到洗涤液为无色，保存于pH8.0的0.05mol/LTris-HCl缓冲液中。
2.亲和膜对玻璃酸酶的静态吸附
采用静态吸附法，称取0.1g干燥的膜放入玻璃酸酶溶液中，调pH3.58，在室温25℃下震荡吸附2小时。
3.色谱过程
将20张亲和膜叠成膜堆，装入膜桥，首先以0.05mol/L，pH8.0的Tris-Hcl缓冲液配成溶液65mL（10.0mg/mL），以2.0ml/min的流速上样，然后以30ml平衡缓冲液冲洗膜堆，以除去膜上未被吸附的蛋白，直至流出液的吸光度接近0.最后用pH6.0，0.05mol/L的含1.0mol/LNaSCN的Tris-HCl缓冲液洗脱被吸附的玻璃酸酶。
实施例3
1.1 尼龙膜的活化
尼龙膜先在40℃，1mol/L的HCL中水解4h，然后用甲醛进行活化.然后将10张水解的尼龙膜浸入20mL甲醛溶液（>36.5%），加入0.2ml 85%的磷酸，于60℃反应7h，40-50℃热水水洗6次
1.2 尼龙膜的壳聚糖改性处理
将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10ml质量分数为1.5%的壳聚糖溶液（以体积分数为1%醋酸溶解），室温反应1h，然后转入80℃烘箱，1h后取出，分别以1%醋酸和去离子水洗去未反应的壳聚糖。
1.3 染料亲和膜的制备
20张上述改性的尼龙膜浸入200ml的10mg/ml的Cibacron Blue F3GA的水溶液，在60℃下密封搅拌30min，然后加入50ml质量分数为20%的NaCl溶液，反应30min后升温到80℃，加入20ml质量分数为25%的Na2CO3进行固色，继续反应4h后冷却，依次用热水、甲醇、2mol/LNaCl、6mol/L尿素、去离子水充分洗涤，直到洗涤液为无色，保存于pH8.0的0.05mol/LTris-HCl缓冲液中。
2.亲和膜对玻璃酸酶的静态吸附
采用静态吸附法，称取0.1g干燥的膜放入玻璃酸酶溶液中，调pH3.55，在室温25℃下震荡吸附4小时。
3.色谱过程
将20张亲和膜叠成膜堆，装入膜桥，首先以0.05mol/L，pH8.0的Tris-Hcl缓冲液配成溶液65ml（10.0mg/mL），以2.0ml/min的流速上样，然后以30ml平衡缓冲液冲洗膜堆，以除去膜上未被吸附的蛋白，直至流出液的吸光度接近0.最后用pH6.0，0.05mol/L的含1.0mol/LNaSCN的Tris-HCl缓冲液洗脱被吸附的玻璃酸酶。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (6)
1.一种亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶的方法，其特征在于，本发明提供了一种亲和膜色谱法提取玻璃酸酶的方法，采用尼龙膜为基质，键合壳聚糖的方法对尼龙膜进行改性，使膜的非特异性吸附大大降低，得到一种新的染料亲和膜，对玻璃酸酶有较好的吸附性，纯化倍数很高。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）亲和膜的制备
尼龙膜的活化：
尼龙膜先在40℃，1mol/L的HCL中水解4h，然后用甲醛进行活化.然后将10张水解的尼龙膜浸入20mL甲醛溶液（>36.5%），加入0.2ml 85%的磷酸，于60℃反应7h，40-50℃热水水洗5-8次；
尼龙膜的壳聚糖改性处理：
将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10ml质量分数为1.5%的壳聚糖溶液（以体积分数为1%醋酸溶解），室温反应1h，然后转入80℃烘箱，1h后取出，分别以1%醋酸和去离子水洗去未反应的壳聚糖；
染料亲和膜的制备：
20张上述改性的尼龙膜浸入200ml的10mg/ml的Cibacron Blue F3GA的水溶液，在60℃下密封搅拌30min，然后加入50ml质量分数为20%的NaCl溶液，反应30min后升温到80℃，加入20ml质量分数为25%的Na2CO3进行固色，继续反应4h后冷却，依次用热水、甲醇、2mol/LNaCl、6mol/L尿素、去离子水充分洗涤，直到洗涤液为无色，保存于pH8.0的0.05mol/lTris-HCl缓冲液中；
（二）亲和膜对玻璃酸酶的静态吸附
采用静态吸附法，称取0.1g干燥的膜放入玻璃酸酶溶液中，调pH，震荡吸附一定时间；
（三）色谱过程
将20张亲和膜叠成膜堆，装入膜桥，首先以0.05mol/L，pH8.0的Tris-Hcl缓冲液配成溶液65ml（10.0mg/mL），以2.0ml/min的流速上样，然后以30ml平衡缓冲液冲洗膜堆，以除去膜上未被吸附的蛋白，直至流出液的吸光度接近0.最后用洗脱液洗脱被吸附的玻璃酸酶。
3.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤（二）中调pH 3.2-4.0。
4.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤（二）中震荡吸附的温度为室温。
5.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤（二）中震荡吸附的时间为2-4小时。
6.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤（三）中所用洗脱液为pH6.0，0.05mol/L的含1.0mol/L NaSCN的Tris-HCl缓冲液。
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