JP2014502608A - テネクテプラーゼの医薬組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は急性虚血性脳卒中の治療のための、公知の粗製物よりも安全で効果的なテネクテプラーゼ医薬組成物を提供する。
【解決手段】本発明の医薬組成物は、異なる量のＴＮＫについて試験を行い、そして急性虚血性脳卒中の治療において好ましい特定量を同定することにより完成された。
【選択図】なし

Description

本発明はテネクテプラーゼ（ＴＮＫ）として知られるヒト組織プラスミノゲン活性化因子の誘導体の医薬組成物に関し、急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）のような重度のまたは軽度の脳卒中を引き起こす脳動脈の閉塞の治療に用いられるものである。

本発明はまた、有効成分として特定量のＴＮＫを含む医療組成物であるとして、臨床試験で特定された、公知の治療剤よりも有効でかつ安全な製剤にも関する。

ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）は、血液循環システムにおける非特異性の血液の凝塊の分解に関与している。ＴＮＫは天然配列のうちの７つのアミノ酸基が修飾されたＴＰＡの誘導体であり、かかる新規分子によりフィブリン・タンパク質に対する特異性が変化し、また薬物動態特性が変化することで、薬力学的な効果の変化に影響を与えるものである。

ＴＮＫは、７０ＫＤａの分子量の５２７−アミノ酸グリコプロテインである。それは急性心筋梗塞および血栓症並びに他の臓器における血管の破損に関連した塞栓症の治療に用いられる医薬製品として承認されている。

最近、急性虚血性脳卒中の治療について検討がなされ、そしていくつかの臨床試験が行われたが、これらの臨床試験ではＡＩＳのためのＴＮＫの安全で効果的な投与量について決定的証拠は得られていなかった。

プラスミノゲン活性剤は、プラスミノゲンを活性化させる酵素であり、セリン・プロテアーゼ・プラスミンを生成し、それが次々にフィブリンを分解する。

プラスミノゲン活性剤の中で、薬として使用される活性剤としては、ａ）ストレプトキナーゼ［細菌性のタンパク質］；ｂ）ウロキナーゼ［腎臓において合成される酵素］；およびｃ）ヒト組織プラスミノゲン活性化因子［脈管内皮によって生産される酵素］がある。フィブリン溶解薬として潜在的な候補として開発中の酵素が他にもある。

これらの活性剤の作用の機構は異なる。即ち、ストレプトキナーゼは複合体をプラスミン活動を生成しているプラスミノゲンにより形成し、ウロキナーゼは直接プラスミノゲンを裂き、またＴＰＡは三成分の複合体をフィブリンとプラスミノゲンと共に形成して、プラスミノゲンを活性化しそして凝塊の溶解をその場で引き起こす。

通常の人間のＴＰＡは、概ね８−１０分のプラスマ半減期を有する。しかし、フィブリン溶解性治療の効果が短時間で、またより有益な効果と共に確認されるようにするために、それらの半減期を二分の一にすることが求められている。そのため、いくつかのアミノ酸およびタンパク質の欠失変異体が作られて、ＴＰＡよりも改良された特徴を見つけるために試験が行われた。ＴＮＫは６つの突然変異体を有し、それらはＴＰＡと比較して半減期が二倍であり［２０−２４分]、改善された特徴、例えばフィブリン凝塊への高い特異性と併せてプラスミノゲン活性剤抑制剤との親和性が低いという特徴を有する。

ＴＮＫは特許文献１に最初に開示され、そこでは確立した哺乳類の細胞系を使用する組み換えＤＮＡ技術によってＴＮＫが調製されたことが開示されている。他のいくつかの特許、即ち特許文献２〜７には、ＴＮＫの製造および使用の異なる態様が開示されている。特許文献８には、アミノ酸配列の特定のアミノ酸の置換によって、ＴＰＡ変種の製造方法が開示されている。

特許文献９にはＴＰＡ変種が開示されており、それは１０３−１０５のいずれかの位置がグリコシル化され、野生型の人間ＴＰＡ配列の１１７の位置において、機能的な炭水化物構造が欠けている。特許文献１０には、ＴＰＡ変種をコード化するためのＤＮＡ配列の製造方法が開示されている。特許文献１１には、変異体または野生型のＤＨＦＲ遺伝子とｔＰＡ遺伝子と結合して細胞を形質変換することによる、ＴＰＡの生産方法が開示されている。

これらの文献および他のいくつかの文献には、種々の医学的条件、即ちＴＮＫは凝塊の治療に用いられ得る薬品であることが示唆されている。特許文献１２により開示された条件の１つはＡＩＳである。しかし、この特許文献１２には、人間のＡＩＳを治療するためのＴＮＫの安全で効果的な投与量を示唆する方法は開示されていない。その代わりに、効果的な投与量を試験し確認する特定の方法を何ら示唆することもなく、既存のデータ・マトリックスの理論モデルに基づいて安全な投与量を使用することが示唆されている。

したがって、現在までの従来技術では、ＡＩＳの治療のための安全で効果的なＴＮＫの投与量およびＡＩＳの治療のための効果的な医薬組成物（製剤）については言及されていない。

本発明は上述の必要性について言及すると共に、安全かつ短時間で投与が容易である、人間のＡＩＳの治療のために、改良されたより効果的なＴＮＫの投与量を開示するものである。

ＡＩＳの治療のためのＴＮＫを使用することについて言及された論文はいくつかあるが、それらの文献には、本願明細書において副作用の範囲として開示されるような、安全で効果的なＴＮＫの量を備えるＴＮＫの製剤は何ら開示されていない。また、製剤の調製に使用されるＴＮＫは、従来ＴＮＫタンパク質の調製に用いられていなかった、灌流連続発酵システムを用いることで調製される。

ＡＩＳの治療のためにＴＮＫを使用する種々の製剤が知られている。しかしながら、これまでは、リスク便益分析において安全で効果的であると、医薬品監査機関によって承認された製剤はない。この点を認識した上で、ＡＩＳの治療のために安全で効果的な薬として求められてきた、ＴＮＫのいくらかの製剤が本願明細書において開示される。高い純度のＴＮＫを調製するために本明細書において使用された幾つかの使用態様は、従来技術において公知なものである。

しかしながら、この技術分野におけるＡＩＳの治療のためのＴＮＫの製造、調製、選択、試験、特に臨床試験において、公知となっていない幾つかの新しい要素が本明細書において使用されている。

米国特許第５３８５７３２号 米国特許第５７２８５６７号 米国特許第５７１４１４５号 米国特許第５３６６８８６号 米国特許第５０９４９５３号 米国特許第５４０７８１９号 米国特許第６５０６５９８号 米国特許第５４０７８１９号 米国特許第５６１２０２９号 米国特許第５５２０９１１号 米国特許第５４２４１９８号 米国特許出願公開第２００８／０１０７６４１号明細書

本発明の主たる目的は、人間のＡＩＳの治療のためのＴＮＫの効果的で安全な量を明らかにすることである。

本発明の他の目的は、人間のＡＩＳの治療に効果的であるＴＮＫの製剤を明らかにすることである。

本発明のもう一つの目的は、臨床試験を行いＡＩＳの治療のために安全で効果的なＴＮＫの量を同定することである。

本発明の更なる目的は、灌流発酵技術を使用して、ＴＮＫの組み替え物を生産し、上記目的を達成することにある。

ＴＮＫの生産は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用する組み換えＤＮＡ技術を用いて、灌流連続発酵システムにより行われた。この方法によれば高い品質と量を有するタンパク質を大規模に生産することもできるし、産業上の用途に合わせて拡大縮小することも可能である。

分泌されたタンパク質としてＴＮＫを生産する組替え細胞系が調製され、所望の性質のＴＮＫが選ばれ、そして人間のＡＩＳの治療のためのＴＮＫの製剤に使われた。

異なる量のＴＮＫを有するこれらの製剤は臨床試験において試験され、人間のＡＩＳの最適な治療のために必要なＴＮＫの安全で効果的な量が明らかにされた。

ＡＩＳの治療のために安全で効果的なＴＮＫの量が掲載された臨床試験データが開示されている。また、ＴＮＫは灌流連続発酵システムを使用して調製される。

第一部において、哺乳類の細胞系（ＣＨＯ）が、分子および生物学的技術を使用して調製された。これらの細胞系はその後、分泌されたＴＮＫの表現レベルについてスクリーニングされ、そして高い表現レベルのＴＮＫ細胞系が分離され、製薬等級のＴＮＫ製品の開発に用いられた。

第二部において、細胞を生産するＴＮＫは、大規模な生産のために灌流連続発酵システムにおいて培養され、そして集められ、更なる処理に備えて培地中に貯蔵された。

第三部において、採取物はクロマトグラフィ・ステップに供されて、非常に純粋で効能があるＴＮＫ塊が、臨床用製剤を調製するための有効成分として得られた。

第四部において、一組のＴＮＫの製剤が調製され、安定性、効力、および薬理学的特性といった種々のパラメータについて研究された。

第五部において、調製されたＴＮＫの製剤について臨床試験が行われ、ＡＩＳの治療のために必要とされる安全で効果的なＴＮＫの量が、所定の条件下で明らかにされた。これらの研究により、注射可能な製剤において必要とされる、ＡＩＳの治療のために安全で効果的なＴＮＫの使用に必要な一組のパラメータが明らかにされた。

銀染色還元されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製された画分中のＴＮＫ濃度を表す：１）分子量マーカ（最下部から：２１、３１、４５、６６及び９６ｋＤａ）;２）採取された培養液；３）ＤＡＣの後のＥ−ｌ；４）ＬＡＣの後のＥ−２；５）ＩＥＣ後のＥ−３；および６）標準の試料。 銀染色還元されていないＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製された画分中のＴＮＫ濃度を表す：１）分子量マーカ（最下部から：２１、３１、４５、６６および９６ｋＤａ）；２）採取された培養液；３）ＤＡＣの後のＥ−ｌ；４）ＬＡＣの後のＥ−２；５）ＩＥＣ後のＥ−３;および６）標準の試料。 クロマトグラフィ最終ステップの後の還元されていないＴＮＫのＨＰＳＥＣグラフを表す。ＴＮＫペプチド（保持時間：２６．６５３分）は、９９％以上純粋である。 クロマトグラフィ最終ステップの後の還元されたＴＮＫのＨＰＳＥＣグラフを表す。ＴＮＫペプチドは、単鎖（保持時間：２５．０９３分）、およびＴＫペプチド、二重鎖（保持時間：２９．２４７分）。 ＴＮＫ生物活性測定のための標準曲線を表す。

薬および薬学の当業者にとって、安全で効果的な医薬組成物を得るためには、以下のことが知られている。有効成分と数種の賦形剤を含有する製剤をいくつか開発し、所望の条件でそれらについて試験を行い、新薬にとって安全で効果的な投与量を明らかにすることは良い戦略である。安定性、飲みやすさ、体積等の付加価値を提供する上で、賦形剤の役割は重要である。

本発明の主要な目的は、公知の製剤よりも安全で効果的な、人間の急性虚血性脳卒中の治療のための医薬組成物として使用するためのＴＮＫの改良された調製方法を開発することである。

本発明はまた、特定量のＴＮＫを使用する臨床試験により、ＡＩＳの治療のＴＮＫの安全で効果的な量を決定することに関する。

さらに、生産性および最終的な製品の特性に影響を及ぼす、組み換えＤＮＡ技術、プロセス開発および製造といった多くの態様に関する。

したがって、既存の方法および技術よりも改良された、新規なｒＤＮＡ技術製品の製造方法の必要性がある。

本発明の目的は人間の急性虚血性脳卒中の治療のための安全で効果的な医薬組成物/製剤を開発することにある。そして、ＴＮＫがＣＨＯ細胞系から新規に作り出されて、ＴＮＫの大規模な生産の灌流連続発酵システムにおいて使われる。

第一部において、高レベルで分泌されたタンパク質としてＴＮＫを表現するＣＨＯ細胞系が調製された。使用された分子生物学、生化学および解析手法は、この技術分野において一般的なものであり、ごく普通に使われてきたものである。表現細胞系の作成のために使用される哺乳類の表現プラスミドは、ＣＭＶプロモータ/エンハンサ要素を、転写終了のためのＳＶ４０ポリＡ尾部が後に続くＴＮＫの人工遺伝子の前に含んでいた。

同じプラスミドはＳＶ４０プロモータの制御中で、ＳＶ４０ポリＡ尾部により終了されたＤＨＦＲ遺伝子も含んでいた。このプラスミドは、天然のＤＨＦＲ遺伝子（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ-細胞系）に対して陰性のＣＨＯ細胞に導入した。高いレベルのＴＮＫ表現を有する1つの細胞系が、分離されて、更に使われた［実施例１および２］。

第二部において、ＴＮＫを表現するＣＨＯ細胞が、灌流連続発酵システムのＴＮＫの大規模な調製に使われた。約６〜１２×１０^９の細胞が灌流バイオリアクタのリアクタの中心に固定された。これらの細胞は、ケモスタットモードにおいて約１〜２ｇｍ/Ｌの一定のブドウ糖濃度下で、所望の細胞量が成長するまで、ＦＢＳが添加されたＩＭＤＭ培地中で約２、３日間培養された。

生産段階において、培地はＦＢＳを含まないＣＨＯ−Ｓ ＳＦＭ ＩＩに変えられた、そして、ブドウ糖を供給する条件下で数ヶ月培養し続けられた。その間に、粗製ＴＮＫ製品の濃縮液がさらなる下流工程の培地内で生産された。培地が滅菌された容器に集められ、続く精製工程に供されるまで４℃で保管された［実施例３、５および７］。

第三部において、粗ＴＮＫを含む採取された培地は、連続する一組のクロマトグラフィ・ステップに供された。この工程には染料アフィニティステップが含まれ、続いてリジンアフィニティ精製ステップそして最終的にイオン交換精製ステップが行われた。

表Ａは、クロマトグラフィ精製の異なるステップにより、精製されたタンパク質が増加したことが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ濃度測定／ＨＰＳＥＣにより確認されたことを表している。採取した培養液を精製方法に供する前に、その培養液は約８０％のＴＮＫタンパク質を含んでいた。最終的なイオン交換クロマトグラフィ・ステップ（ＩＥＣ）において、タンパク質の純度は、少なくとも９５％であった。

ここで記載された方法のアフィニティ、イオン交換およびゲル濾過ステップにおいて使用された樹脂の種類は、同様の特徴を有する他の樹脂と置換えることができる。ここで記載された浄化方法は、ＡＩＳの治療のためのＴＮＫの調製のために使用される浄化法の一例であり、ここに開示されたクロマトグラフィ樹脂に制限されるものではなく、同様の作用効果が得られるのであれば他の同様の分離媒体を用いても構わない。ＴＮＫ塊は、約５ｍｇ／ｍＬの濃度で−８０℃に貯蔵された［実施例４、５及び７］。

第四部において、バルクなＴＮＫ溶液を含む幾つかの製剤が、１０ｍＬの小びんにつき、０．１０から０．２４のｍｇ／ｍＬの範囲で凍結乾燥状態で調製された。これらの製剤のうちの１つの構成要素の比率は、ＴＮＫが１部、Ｌ−アルギニンが１１部、リン酸が３部および凍結乾燥された粉末としてのポリソルベート−２０が０．０８６部であった。これらの製剤が、ルーティンな試験を受けて、ＡＩＳの治療のためのＴＮＫの臨床評価において使われた［実施例６］。

第五部において、ＡＩＳの治療におけるＴＮＫ製剤の臨床試験および有効性は、約３５人に投与するという、マルチセントリックでオープンラベルな研究により評価された。この研究において得られたデータから、ＡＩＳの治療のために必要な安全で効果的なＴＮＫの量が求められた［実施例８］。

上述の本発明は、本発明の有用性を示す目的で、以下の実施例を用いて説明される。後述の実施の形態は、ＴＮＫと同様のタンパク質の組成物や製剤の製造といった幅広い応用例において、いかなる方法によっても本発明を制限するものではない。本発明で教示された内容が、ｔＰＡに類似するタンパク質の調製においても使用され得る。図は、図示に用いられるものであって、調製および製剤されたタンパク質の品質および純度に関して、本発明のより幅広い使用を制限するものではない。

実施例１：分子生物学、生化学および分析法
一連の手順において用いられた、一般的な分子生物学、生化学および分析法は、この技術分野において知られている。ルーティン技術は予測可能であり、それらの技術は公知文献から入手可能であるため、ここには記載されていない。

細菌性宿主細胞として使用された菌は、大腸菌Ｋ−１２に由来するものであり、また表現ベクターの調製に使用されたプラスミドおよびＤＮＡ断片は一般に入手可能なプラスミドから回収されたか、または、栽培室中で設計もしくは合成され、そして所望の断片に統合された。人工的なＴＮＫ遺伝子の調製に使用されたペプチド・配列は、アミノ酸を有する天然のヒトｔＰＡ配列であり、Thrl03Asn、Asnll7Gln、Lys296Ala、His297Ala、Age298AlaおよびAge299Alaのように変化させるものである。

［MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGARSYQVICRDEKTQMIYQQHQSWLRPVLRSNRVEYCWCNSGRAQCHSVPVKSCSEPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAGKCCEIDTRATCYEDQGISYRGTWSTAESGAECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGNHNYCRNPDRDSKPWCYVFKAGKYSSEFCSTPACSEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGNVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP］.

全ての合成ＤＮＡ断片は、この配列に基づき、そして一般的な方法を用いることにより、クローニングおよび哺乳類の表現ベクターに統合された。これらの要素の同一性と完全性を確かめるために、ＤＮＡ塩基配列決定が実行されて、そして、配列を手動で決定した。

実施例２：
ＴＮＫを表現する哺乳類細胞系の調製
上記の６つの突然変異を有する人間のｔＰＡ遺伝子の人工ＴＮＫ ＤＮＡ配列は、人工的に合成された。この配列は、培地中で分泌されたタンパク質として、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のタンパク質を表現するのに十分な要素を有するプラスミド・ベクター中で複製された。

ベクターでは、ＣＭＶエンハンサー／プロモータ要素の後にＴＮＫ人工遺伝子が続き、さらにＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ転写終了要素が続いた。同一のプラスミドはまた、ＳＶ４０初期プロモーターにより制御されたＤＨＦＲ遺伝子、および別々のシストロンとしてのＳＶ４０ ｐｏｌｙＡターミネータを表す。ＤＨＦＲ遺伝子は、また、ＴＮＫ肯定細胞の検出のために再結合されたＣＨＯ細胞の表現マーカとして使われた。

ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）ネガティブＣＨＯ細胞系（ＤＵＫｘＢｌｌ）に移植され、そして、分泌されたＴＮＫの強い表現を有する、ゲノム的に統合され安定したクローンは分離された。さまざまな選択されたクローンのＴＮＫの表現レベルはウエスタンブロッドおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で試験され、続いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、タンパク質の安定で強い発現を有する細胞系を決めた。

ＴＮＫの良好な生産性を有する１細胞系がマスター細胞バンクをつくるために用いられた。このようにして、細胞バンクが調製されて、灌流連続発酵システムにおいて、大量生産に用いられた。それぞれのクローンによって分泌されるＴＮＫは、タンパク質の保全と品質用に試験された。また、医薬用途のための調剤書基準当たりの、このタンパク質と関連する酵素活性を決定するための試験が行われた。

実施例３：ＣＨＯ細胞のＴＮＫ表現
ＴＮＫアミノ酸配列は、ＣＨＯ細胞におけるＣＭＶプロモータ/エンハンサ構成する表現システムを制御することで表現された。ここで、灌流バイオリアクタと呼ばれている新規の連続発酵技術が、タンパク質の大規模な生産のために使用された。ＣＨＯ細胞を生産するＴＮＫは、胎児のウシ血清（ＦＢＳ）を有するＩＭＤＭ培地［INVITROGEN］中で育てられた。

数日間に渡たる組織培養フラスコおよびローラー瓶中での連続的増産よって、約１×１０^６の再結合物細胞の培地から、最終的な量として約６〜１２×１０^９細胞が得られた。

細胞を大量に増殖する際の全ての工程において維持された培養条件は、以下の通りである：温度：３６．５℃、ＣＯ_２：５％およびＦＢＳ：１０％。

細胞の合流は、細胞が次の工程に供される前において、フラスコおよび瓶中の成長表面領域の＞９０％に維持された。周期的な顕微鏡検査および生化学試験を行うことにより、成長する細胞の健康および完全な状態を確認した。

その後、それらはバイオリアクタへの移動のための軽度のトリプシン処置によって除去された。バイオリアクタはｐＨおよびＤＯ探針、および、リアクター内に細胞を保持するためのリアクター中央に配置された細胞を保持するための培地を備える。

殺菌された５Ｌのバイオリアクタに、その後６〜１２×１０^９の細胞が接種されて、そして３−４日間、約１〜２ｇｍ／Ｌのブドウ糖濃度に置かれた。この方法によりバイオリアクタ中の細胞が健康な状況に保たれた。バイオリアクタパラメータは、以下の通りであった：温度：３６．６℃、通気：１．０Ｌ／ｍｉｎ.、ｐＨ：７．２−７．４［ＣＯ_２を使用することを維持して、飽和重炭酸ナトリウム溶液を使用し続けた］、振動：１００ｒｐｍ、溶存酸素：３０％。

一旦細胞が支持マトリックスに置かれると、培地はＦＢＳを有するＩＭＤＭからＦＢＳのないＣＨＯ−Ｓ ＳＦＭ ＩＩ［INVITROGEN］に置換えられた。

この培地が、製品段階の全体にわたって使われた。バイオリアクタを用いる工程の開始時に、当初培地の内の約１００Ｌが、取り出され、放棄された。

その後、バイオリアクタ温度は生産工程の間３３．５℃に保たれ、また採取物の約１００Ｌが毎日集められた。その間のバイオリアクタのブドウ糖濃度は０．３−１．５ｇｍ／Ｌの間に維持された。これらの条件において、灌流バイオリアクタは、３−４月の期間に渡って採取物は、１０,０００Ｌであった。

採取物のバッチはそれぞれ０．４５μｍフィルタでろ過され、そして、滅菌容器に集められて、更に処理されるまで２−８℃で格納された。採取した培養液のプールは、確立した方法［図１および２］を伴う、周期的にＴＮＫ濃度および不毛用に試験された。採取物のプールは共にＴＮＫ濃度および無菌であるかについて確率された方法により定期的に試験された。

実施例４：ＴＮＫの精製
採取された培養液のバッチは、ＴＮＫ濃度内容、その完全性および無菌か否かについて試験した。
［図１および２］ シングル１０００Ｌバッチの精製のために、一連のクロマトグラフィ・ステップが使われた。第１のステップにおいて、ＴＮＫ濃度が約１０ｍｇ/Ｌの採取された約１０００Ｌの培養液バッチが、１１Ｌの活性化された染料親和性樹脂を備える高速液体クロマトグラフィ（ＦＬＣ）システムのカラム（３００ｍｍ×５００ｍｍ）に充填された（ブルーステファローズ ６ＦＦ樹脂;ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。

カラムは、緩衝溶液−１（ＥＢ−１、リン酸ナトリウム：２０ｍＭ（ＮａＣＩ）：０．１５Ｍ、ｐＨ７．２）により、約１００−１５０ｃｍ／ｈ.の流速で、２カラム体積（ＣＶ）を通過させることにより、平衡に保たれた。採取物は約１００−１５０ｃｍ／ｈの線形流速を有するカラムに充填され、続いて約１００ｃｍ／ｈの流速で、２ＣＶのＥＢ−１を通過させた。この後に、１００−１５０ｃｍ／ｈ．の流速で２−３ＣＶの洗浄バッファを通過させた（ＷＢ−１、リン酸ナトリウム：２０ＮａＣｌ：２Ｍ、ｐＨ７．２）。バウンドターゲットタンパク質は、約４ＣＶの溶出バッファ１（ＥＵＢ−１、リン酸ナトリウム：２０ｍＭ、ＮａＣｌ：１Ｍ、尿素：３Ｍ、ｐＨ７．２）を通過させることにより抽出され、そして２８０ナノメートルの吸光度に基づいて集めた。溶離液（Ｅｌ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によってタンパク質量および純度を分析した。このステップにおいて、全タンパク質中のＴＮＫ濃度は、約９０％であった。

第２のステップにおいて、バッファはゲル濾過クロマトグラフィを使用して交換された。Ｅ-１は、２５Ｌのゲル濾過樹脂（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５）を有するカラム（３００ｍｍ×７５０ｍｍ）に充填された。カラムは、その後約１００−１５０ｃｍ／ｈの線形流速を伴う２ＣＶの交換バッファ（リン酸ナトリウム：２０ｍＭ、ｐＨ７．２）で洗浄され、そして溶離液（Ｅ−２）は滅菌された容器に集められた。

第３のステップにおいて、Ｅ−２が４．５Ｌの活性化されたＬ−リジン親和性樹脂を伴うカラム（２００ｍｍ×５００ｍｍ）に充填された（リジンハイパーＤ樹脂; Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ）。カラムは、その後、約１００−１５０ｃｍ／ｈの線形速度で２カラム体積（ＣＶ）の平衡バッファ２（ＥＢ−２、リン酸ナトリウム：２０ｍＭ（ポリソルベート−２０）：０．０４３％、ｐＨ７．２）を通過させ、続いて２ＣＶのＷＢ−２（リン酸ナトリウム：２０ｍＭ、ＮａＣＩ：１Ｍ、ポリソルベート−２０：０．０４３％、ｐＨ７．２）を約１００のｃｍ／ｈ．の流速で通過させることにより、平衡に保たれた。

バウンドターゲットタンパク質は、２ＣＶの溶離バッファ２（ＥＵＢ−２、アルギニン：０．５Ｍ、ＥＡＣＡ（エプシロン−アミノカプロン酸）：０．２Ｍ、ポリソルベート−２０：０．０４３%、リン酸によってｐＨ７．８に調整された）を通過させることにより溶離され、そして、２８０ナノメートルの吸光度に基づいて集められた。溶離液（Ｅ−３）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、タンパク質量および純度のために分析された［図１および２］。

このステップにおいて、全タンパク質のＴＮＫ濃度は、９５％よりも高かった。これに続いて、ＧＦＣにより、バルクな貯蔵バッファ（Ｌ−アルギニン：５５ｇ／Ｌ、リン酸：１７ｇ／Ｌ、ポリソルベート−２０：４３０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．６±０．２）へとバッファが交換された。

溶液中のＴＮＫの最終的な濃度は、約２ｍｇ／ｍＬであり、更なる使用まで溶液は凍結状態で保管された。このＴＮＫ溶液は、製剤準備の前に陰イオン交換器樹脂（Ｃａｐｔｏ Ｑ.樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して、５ｍｇ／ｍＬまで更に濃縮された。

実施例５：分析的アッセイ
製造および精製工程の間、試料中のＴＮＫ濃度は、標準的な還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法により決定された［図１および２］。１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ ゲルが調製された、そして、５０ｇのタンパク質試料がそれぞれ各ウェルに充填された。

試料中の一本鎖およびモノマー濃度を決定するために、還元および還元されていないＨＰＳＥＣ ［高性能なサイズの排除クロマトグラフィ］方法が、それぞれ使用された。ＨＰＳＥＣ法に使用されたカラムは、１０−５００Ｋｄａの分子を分離できるレンジのシリカベースの大きさの排除クロマトグラフィカラムであった［図４および５］。標準試料および試験試料は、同一の分析状況で分析された。周期的な製造過程の生物活性分析が、タンパク質の品質および完全な状態をモニタするために行なわれた。

実施例６：ＴＮＫの製剤
ＴＮＫのさまざまな製剤が調製され、ＡＩＳの治療において、ＴＮＫの安全性と有効性が試験された。製剤は、凍結乾燥された製品として、ＴＮＫが１部、Ｌ−アルギニンが１１部、リン酸が３．４部、およびポリソルベート-２０が０．０８６部の比率であった。

この調製に使用されたバルクなＴＮＫ溶液の濃度は、５ｍｇ／ｍＬのＴＮＫであった。溶液中のＴＮＫを沈殿させることなく、成分を混合した後に、製剤は安定した粉状の形式に冷凍乾燥させていた。

投与の際に１０ｍｌの水を加えてもとに戻される一組の凍結乾燥された製剤が、ＴＮＫ強度が１０ｍｌの１ガラス瓶当たり０．１０，０．１４，０．１８，０．２０及び０．２４ＴＮＫｍｌで調製され、更に使用されるまで約４℃で貯蔵された。これらの試験用製剤は異なる試験および安定性研究に供され、そして、濃度およびその安定性は１年間にわたって比較できる程度のものであった。凍結乾燥された製剤は、臨床試験における投与の際に１０ｍＬの滅菌水を加えてもとに戻されたときに、透明溶液１ｍｌ当たり上述量のＴＮＫを含んでいた。

実施例７：ＴＮＫのバイオアッセイ
バルクのおよび製剤化されたＴＮＫの生物学的潜在能力は、血栓溶解薬のためのヨーロッパ薬局方の承認基準のプロトコルから開発されたラピッドチュウビジメトリッククロットリシス分析（a rapid tubidimetric clot-lysis assay）によって決定された。

透明な１．５ｍＬのマルチウエルプレートにおいて、２０μｍの人間のプラスミノゲン（１ｍｇ／ｍＬ）および１ｍＬの人間のフィブリノゲン（２ｍｇ／ｍＬ）溶液がとられて、混合されそして０℃に保持された。別の１．５ｍＬのマルチウエルプレートにおいて、０．５ｍＬの人間のトロンビン（３３ｌＵ／ｍＬ）および０．５ｍＬの試験または参照ＴＮＫ（全１ｍｇ／ｍＬのタンパク質）が調製され、混合されそして３７℃まで加熱された。全ての希釈液は記載された溶媒バッファを用いて調製された。２００μＬの参照／試験混合物がプラスノミノゲン／フィブリノゲン混合物に添加され、そして３７℃で培養された。

可視可能な混濁した凝塊が３０秒以内に形成された後、続いて凝塊が溶解するに従って試験管内で泡が形成された。トロンビンが混合された時間と試験管内で最後に泡が確認された時間とが記録され、秒単位で凝塊と溶解の関係が示された。試験および参照ＴＮＫ試料の凝塊―溶解時間が決定された。また生物学的活性試験ＴＮＫバッチは、ＥＰプロトコルに従って、本実施例で用いられたバッチについて国際単位（ＩＵ）で算出された。図５は、ＴＮＫ生物活性の測定のための図示する標準曲線を示す。ここで使用されたバッチの生物活性は２０３ｌＵ／ｍｇであった。表ＢおよびＣは、凝血塊-渙散生物活性分析法で得られたＴＮＫの参照試料と試験試料の数を表している。

実施例８：ＴＮＫ製剤の試験および有効性
ＡＩＳのためのＴＮＫ製剤の臨床試験は、臨床医学において使用される確立した方法を使用して実行された。マルチセントリック（multi-centric）でオープンラベルな臨床試験において、急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）の治療におけるＴＮＫの有効性および安全性について、発症から４．５時間内の患者に対して、２種類のＴＮＫの投与量、即ち０．１ｍｇ／ｋｇのボーラスなＩＶ（静脈投与）および０．２ｍｇ／ｋｇのボーラスな静脈投与をランダムなスケジュールで行った。ＴＮＫは、５−１０の秒間にわたるＣＴスキャンによって脳内出血がないことを確認した後、ボーラスな静脈投与がなされた。

投与量０．１ｍｇ／ｋｇのＩＶが１４人の患者に投与され、そして投与量０．２ｍｇ／ｋｇのＩＶが２１人の患者に対して投与された。ＮＩＨ−ＳＳ［脳卒中重症度評価スケール（National Institute of Health Stroke Scale）］は、主要な有効パラメータであると考えられている。２４時間（表１−３）という早い段階で、ＮＩＨ−ＳＳスコアーの平均値に、統計学的に有意な改善が、両方のグループにおいて見られた。この改善は、７日後の評価においても維持された。ＮＩＨ−ＳＳスコアーが＞４に改善されたことは、臨床的に重要な改善であると思われた（表２）。０．２ｍｇ／ｋｇのグループは、このパラメータによると２４時間後に８０．９５％であったものが７日後に９５．２４％まで上昇するという、極めて高い効果が示された。

２つの投薬量グループについて、統計学的に有意性の違いが見られなかったにもかかわらず、このデータから０．２ｍｇ／ｋｇの投与が好ましいことが示唆された。ＮＩＨ−ＳＳスコアーが>8（表3）という厳しい基準においても、０．２ｍｇ／ｋｇのグループは、７日間で統計学的に顕著な改善が見られたことから（ｐ＝０．０１５）、０．２ｍｇ／ｋｇの投与が好ましいことが確認された。

ＮＩＨ−ＳＳ＞４に対するＴＮＫ０．２ｍｇ／ｋｇＩＶの有効性が８０．９５％の患者に見られた。それと比較して、アルテプラーゼを０．６ｍｇ／ｋｇでＩＶ（ｐ＝０．００８７）したＪＡＣＴ研究では４９．５１％［ストローク２００６；３７(７)：１８１０−５］、アルテプラーゼを０．９ｍｇ／ｋｇでＩＶ（ｐ＝０．００４３）したＮＩＮＤＳ研究では４６．５２％［ＮＥＪＭ １９９５；３３３(２４)：１５８１−８７］、アルテプラーゼを０．９ｍｇ／ｋｇでＩＶ（ｐ＝０．０１７２）したインディアン研究では６５．５％［アン・インディアンＡｃａｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２００８；１１：２２１−４］であった。これらのデータから、ＴＮＫの０．２ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与がアルテプラーゼよりかなり良い有効性を有することが示された。

ＮＩＨ−ＳＳ＞８というより厳しい基準において、ＴＮＫは２８．５７％の患者に有効性が示された。その値はヘイリー２００５のＴＮＫの０．２ｍｇ／ｋｇのデータ（２４％）［ストローク２００５；３６：６０７−６１２］よりも数値的に高かったが、ヘイリー２０１０のＴＮＫ０．２５ｍｇ／ｋｇのデータ（３５．５％）［ストローク２０１０；４１：７０７−１１］と比較すると、統計学的に重要ではなかった。

どちらのグループにも症候性脳内出血（ＩＣＨ）は見られなかった。無症候性脳内出血について、ＣＴスキャンを４８時間毎に行うことで、０．１ｍｇ／ｋｇのグループに一人の患者、そして、０．２ｍｇ／ｋｇのグループに二人の患者が確認された。全体で三人（８．５７％）の無症候性脳内出血が報告された。

ヘイリー２０１０の研究によると症候性か無症候性脳内出血の発生率は１１．２９％（＝７／６２）であり、ＴＮＫに関するヘイリー２００５の研究によれば２０％（＝１０／５０）であることが報告された。アルテプラーゼに関する先行技術によれば、最高７％の患者が症候性脳内出血であり、最高３１％の患者が無症候性脳内出血であったことが報告された（ＮＥＪＭ １９９５、３３３、２４（１５８１−７））。開示された新しいデータによれば、ＡＩＳの治療において、アルプターゼを用いた報告よりも、ＴＮＫの有効性が優れていることが示された。

Claims (15)

1. 以下の成分を有する、人間の急性虚血性脳卒中の治療のための静脈注射剤としての医薬組成物：
   ａ．灌流連続発酵プロセスにより調製された、効果的で安全な量のテネクテプラーゼ
   ｂ．薬学的に許容できる無機バッファ;
   ｃ．薬学的に許容できる安定剤；および
   ｄ．任意に、薬学的に許容できる担体。
2. 前記テネクテプラーゼの効果的で安全な投与量が、約０．１０から０．２４ｍｇ／ｋｇ体重である請求項１記載の医薬組成物。
3. 前記テネクテプラーゼの効果的で安全な投与用が、約０．２０ｍｇ／ｋｇ体重である請求項１記載の医薬組成物。
4. 前記テネクテプラーゼが、チャイニーズハムスターの卵巣細胞を用いて、灌流連続発酵システムにおいて調製されたものである請求項１記載の医薬組成物。
5. 前記バッファが、好ましくはリン酸／リン酸塩バッファである請求項１記載の医薬組成物。
6. 前記安定剤が、好ましくはＬ−アルギニンである請求項１記載の医薬組成物。
7. 他の安定剤が、好ましくはポリソルベートである請求項１記載の医薬組成物。
8. 前記成分が、凍結乾燥されて粉末形態となっており、使用前に注射薬に水を加えてもとに戻すものである請求項１記載の医薬組成物。
9. 医薬組成物の全投与量が、脳卒中が起きてから６時間以内に、１０秒間で静脈投与される請求項１記載の医薬組成物。
10. 以下から成る医薬キット：
    （ａ）凍結乾燥されたテネクテプラーゼ製剤を含有する小びん;および
    （ｂ）１０秒以内に静脈投与されるテネクテプラーゼの投与量が０．２０ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量であるという、人間の急性虚血性脳卒中を治療するための製剤の使用書。
11. 注射薬として水で戻される、テネクテプラーゼの量が、約２ｍｇ／ｍＬである請求項１０記載の医薬キット。
12. 急速静脈内投与される全投与量が、急性虚血性脳卒中が生じてから６時間以内である請求項１０記載の医薬キット。
13. 最適なテネクテプラーゼのボーラス投与量が約０．２０ｍｇ／ｋｇ体重である請求項１０記載の医薬キット。
14. ボーラス投与による全投与が、１０秒を超えないものである請求項１０記載の医薬キット。
15. 実質的に実施例に記載されたテネクテプラーゼの医薬組成物およびそれらのキット。

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