BR112015009989B1 - Formulação líquida de hialuronidase - Google Patents

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Abstract

ESTABILIZANTE PARA A HIALURONIDASE E FORMULAÇÃO LÍQUIDA QUE COMPREENDE HIALURONIDASE. A presente invenção refere-se a uma formulação líquida estável que compreende hialuronidase e um estabilizante para a hialuronidase e, mais particularmente, a uma formulação líquida estável pela adição do estabilizante à hialuronidase.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a uma formulação líquida estável que compreende hialuronidase e um estabilizante para a hialuronidase, a qual tem vantagens uma vez que pode manter estavelmente a sua atividade enzimática no estado líquido por um período de tempo prolongado e é administrada simplesmente de modo que pode ser utilizada de modo útil.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A hialuronidase, que é um termo genérico para enzimas de ácido hialurônico degradante, era no início conhecida como um fator de difusão por Duran-Reynals mas mais tarde, uma vez que foi observado que ela exibe uma atividade forte ao ácido hialurônico (HA), ela veio a ser chamada de hialuronidase (HAase). Esta enzima é classificada, de acordo com seu mecanismo de ação, em hialuronato de 4-glicano-hidrolase (EC 3.2.1.35) distribuído nos testículos, lisossomas e venomas de abelhas; hialuronato de 3-glicano-hidrolase (EC 3.2.1.36) na sanguessuga; e liase de hialuronato (EC 4.2.2.1) presente em bactérias.
[003] Em particular, uma vez que as hialuronidases (Ph-20) nos testículos são ligadas a um sítio de âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) na parte do acrossoma de um esperma, elas são enzimas essenciais da causa da fertilização pela degradação de uma camada exterior grossa da parede fora do óvulo. Era conhecido que a ligação β(1-4) entre N-acetil-D-glucosamina e o ácido D-glucurônico presente no ácido hialurônico (HA), condroitina, e sulfatos de condroitina é hidrolisada pela ação de PH-20. A fórmula molecular geral destas enzimas é C2455H3775N617O704S21 e a sua massa molecular é de 53870,9 g/mol. Nos seres humanos, seis genes incluindo HYAL1, HYAL2, HYAL3, e PH-20/SPAM1 são associados com as enzimas.
[004] Desde os anos 50, as aplicações amplas de hialuronidases têm sido revistas de modo amplo. A primeira aplicação era a injeção subcutânea de fluidos parenterais e, além disso, elas têm sido usadas para a infiltração e bloqueiam a anestesia para aumentar a dispersão dos esteroides e anestésicos locais em ortopedia, oftalmologia, cirurgia plástica, odontologia, cirurgia oral, ginecologia, e cirurgia de otolaringologia, e usadas para a dispersão de fluidos do corpo de modo não a não formar aglomeração tal como hematoma, a prevenção de aderência peritoneal, a prevenção da formação de cálculos, e o tratamento da infertilidade.
[005] As hialuronidases atualmente disponíveis no mercado são aquelas extraídas dos testículos de ovinos e então são liofilizadas. Tais hialuronidases não processadas são derretidas em uma concentração apropriada, colocadas em frascos e então liofilizadas para a sua manufatura. As hialuronidases manufaturadas desse modo contêm quantidades em excesso de proteínas estranhas. Portanto, as hialuronidases obtidas pelos métodos prévios têm não somente problemas com a sua estabilidade quando convertidas em uma solução, mas também deixam problemas enormes com sua aplicação de uma perspectiva prática porque a sua atividade fisiológica é reduzida devido a uma diminuição em sua estabilidade com o passar do tempo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Os autores da presente invenção elaboraram a presente invenção para obter uma formulação líquida que substituísse as formulação de hialuronidase liofilizadas anteriores que têm não somente problemas com a sua estabilidade quando convertidas em uma solução mas também deixam problemas enormes com a sua aplicação de uma perspectiva prática porque a sua atividade fisiológica é reduzida devido a uma diminuição em sua estabilidade com o passar do tempo.
[007] A presente invenção refere-se a uma formulação líquida que contém hialuronidase, para resolver os problemas das formulações liofilizadas anteriores devido à sua estabilidade e impurezas, e à redução em sua atividade fisiológica devido a uma diminuição em sua estabilidade com o passar do tempo quando preparadas em uma forma líquida a partir dos materiais existentes.
[008] Um outro objetivo da invenção consiste na provisão de um método de preparação de uma formulação líquida que contém hialuronidase com uma estabilidade melhorada.
[009] Um outro objetivo ainda da invenção consiste na provisão de um método de purificação para aumentar a pureza e a estabilidade da hialuronidase.
[0010] Ainda um outro objetivo da invenção consiste na provisão de um estabilizante para uma formulação que contém hialuronidase.
[0011] A presente invenção refere-se a uma formulação líquida que contém hialuronidase de elevada pureza e com mais preferência a uma formulação líquida que compreender hialuronidase cuja pureza é 95% ou mais e a atividade específica é de 70.000 IU/mg ou mais.
[0012] A formulação líquida da invenção pode compreender um estabilizante que compreende (a) cerca de 1 a 50 mM de um agente tampão para obter um pH de 4,5 a 6,0, (b) de 0,001 a 0,5% em v/v de um tensoativo não iônico, e (c) de 0,1 a 5 mM de um agente de quelação ou um cloreto de metal alcalino e metal alcalino-terroso.
[0013] Além disso, a invenção refere-se a um estabilizante para melhorar a estabilidade de uma formulação que contém hialuronidase, de preferência uma hialuronidase de elevada pureza.
[0014] A hialuronidase pode ser tanto uma hialuronidase não purificada quanto uma hialuronidase purificada. O estabilizante para a hialuronidase de acordo com a presente invenção contém (a) cerca de 1 a 50 mM de um agente tampão para obter um pH de 4,5 a 6,0, (b) de 0,001 a 0,5% em v/v de um tensoativo não iônico, e (c) de 0,1 a 5 mM de um agente de quelação ou um cloreto de metal alcalino e metal alcalino-terroso.
[0015] Além disso, a invenção refere-se a um método para obter uma hialuronidase com pureza e estabilidade melhoradas mediante a purificação de um material contendo hialuronidase com um ou mais métodos selecionados do grupo que consiste em cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de íons, e filtração com gel.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0016] A Figura 1 mostra um gráfico de purificação de cromatografia de afinidade usando Blue Sepharose de acordo com o Exemplo 1 da presente invenção.
[0017] A Figura 2 mostra um gráfico de purificação de cromatografia de troca de cátions usando Mono S de acordo com o Exemplo 2 da presente invenção.
[0018] A Figura 3 mostra um gráfico de purificação de cromatografia de troca de ânions usando DEAE Sepharose de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
[0019] A Figura 4 mostra um gráfico de purificação de cromatografia de afinidade de afinidade usando heparina Sepharose de acordo com o Exemplo 4 da presente invenção.
[0020] A Figura 5 mostra a análise de GPC (cromatografia de permeação com gel) após a quinto purificação do primeiro material salgado de acordo com o Exemplo 5 da presente invenção.
[0021] A Figura 6 mostra a análise de GPC (cromatografia de permeação com gel) após a quinta purificação do segundo material salgado de acordo com o Exemplo 5 da presente invenção.
[0022] A Figura 7 mostra a análise de GPC (cromatografia de permeação com gel) após a quinta purificação do material de Hdase de acordo com o Exemplo 5 da presente invenção.
[0023] A Figura 8 mostra um diagrama do método de purificação de hialuronidase e do processo de preparação para a formulação líquida ao usar hialuronidase não purificada ou purificada de acordo com a invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0024] Daqui por diante, a invenção será descrita em mais detalhes.
[0025] A invenção refere-se a uma formulação líquida que compreende hialuronidase cuja pureza é 95% ou mais e a atividade específica é de 70.000 IU/mg ou mais.
[0026] As hialuronidases de acordo com a invenção podem ser enzimas normalmente derivadas dos testículos de mamíferos, por exemplo, de seres humanos, bovinos, ovinos e suínos. As hialuronidases geralmente disponíveis no mercado são aquelas obtidas ao salgar testículos de mamíferos e então ao liofilizar ou despirogenar os mesmos após o salgamento e então elas são liofilizadas. Por exemplo, um material do testículo de mamífero que é salgado uma vez e então liofilizado, um material do testículo que é salgado duas vezes e então liofilizad, ou um material do testículo que é salgado duas vezes, despirogenado e então liofilizado pode ser usado como um material de pesquisa para o processo de purificação. As hialuronidases anteriores são extraídas através do salgamento por duas vezes dos testículos de ovinos, liofilização, diálise, despirogenação e então a liofilização, e aqueles extraídos são misturados com uma grande quantidade de proteínas com exceção de hialuronidases.
[0027] As hialuronidases liofilizadas disponíveis no mercado em um estado bruto incluem uma grande quantidade de impurezas e a sua pureza é desse modo baixa e, quando preparadas em uma formulação líquida, a sua estabilidade é baixa. Além disso, a formulação liofilizada é inconveniente porque ela deve ser preparada em uma forma líquida antes de ser usada. Portanto, há uma necessidade urgente quanto a uma formulação líquida que compreenda hialuronidase, de preferência uma hialuronidase de elevada pureza com excelente estabilidade.
[0028] A hialuronidase incluída na formulação líquida de acordo com a invenção compreende uma hialuronidase cuja pureza é 95% ou mais e a atividade específica é de 70.000 IU/mg ou mais mediante a purificação de um material bruto de enzimas ao usar um ou mais métodos combinados selecionados do grupo que consiste em cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de íons, e filtração com gel.
[0029] A medição da atividade das hialuronidases purificadas de acordo com a invenção é executada pelo Ensaio apresentado em "Hyaluronidase for injection" por British Pharmacopoeia Monograph. A estabilidade das hialuronidases neste relatório descritivo pode ser considerada como mantida quando a atividade (teor ou atividade específica) das hialuronidases medidas de acordo com o Ensaio apresentado em "Hyaluronidase for injection" por British Pharmacopoeia Monograph é de pelo menos 90% ou mais, por exemplo, de 90% a 115%, em comparação com a sua atividade inicial (100%) que é medida antes da sua armazenagem. Quanto aos padrões para avaliar a estabilidade, embora o Ensaio em "Hyaluronidase for injection" por British Pharmacopoeia Monograph determinasse uma temperatura padrão de medição de 37°C, um pH de 6,4, e um tempo de 20 min. como condições para medir a atividade das hialuronidases, a medição neste relatório descritivo pode ser executada a uma temperatura em uma faixa de 36,5°C a 37,5°C em uma faixa de pH de 6,39 a 6,41 por um tempo de armazenagem de 20 min ou algo assim.
[0030] A hialuronidase obtida ao executar o processo de purificação de acordo com a presente invenção garante que uma proteína que tem uma atividade enzimática biológica elevada pode ser obtida. Por conseguinte, a invenção provê uma enzima de elevada pureza que tem uma atividade específica tal que a atividade biológica da hialuronidase é de 70.000 IU/mg ou mais, de preferência de 90.000 IU/mg ou mais.
[0031] A formulação líquida que compreende a hialuronidase de acordo com a invenção não somente assegura a estabilidade de acordo com os padrões acima de medição do Ensaio, mas também pode ser mantida estavelmente por um período de tempo prolongado de tal maneira que o teor da hialuronidase é mantido em 90% ou mais quando armazenada em uma condição de temperatura de 2 a 8°C por 0 a 29 semanas.
[0032] Além disso, foi confirmado que a hialuronidase altamente purificada da invenção é segura através do teste de resposta a choque anafilático e do teste de reação à anafilase cutânea passiva como testes antigenicidade ao usar ratos.
[0033] Tal como para um material de pesquisa usado para o método de purificação de acordo com a invenção, pode ser usado o próprio material separado dos testículos de mamífero, um produto obtido ao salgar o material, um produto obtido ao salgar o material e então ao despirogenar o mesmo, ou uma forma liofilizada do material ou do produto. Por exemplo, um material de testículo de mamífero que é salgado uma vez e então liofilizado, um material de testículo que é salgado duas vezes e então liofilizado, ou um material de testículo que é salgado duas vezes, despirogenado e então liofilizado pode ser usado como um material de pesquisa para o processo de purificação.
[0034] Em uma modalidade do método de purificação de acordo com a invenção, as hialuronidases podem ser aquelas obtidas ao purificar o material com cromatografia de afinidade ao usar Blue Sepharose, cromatografia de troca de cátions, cromatografia de troca de ânions, e cromatografia de afinidade ao usar heparina Sepharose. De preferência, elas podem ser aquelas purificadas ao executar a cromatografia de afinidade usando Bluie Sepharose, a cromatografia de troca de cátions, a cromatografia de troca de ânions, a cromatografia de afinidade ao usar heparina Sepharose, e a filtração com gel.
[0035] De preferência, a cromatografia de troca de cátions pode ser a cromatografia de troca de cátions ao usar Mono S ou SP Sepharose e CM Sepharose, e o cromatografia de troca de ânions pode ser a cromatografia de troca de ânions ao usar DEAE Sepharose ou Q Sepharose.
[0036] A cromatografia de afinidade e a cromatografia de troca de íons podem ser executadas por métodos comuns e, por exemplo, elas compreende os processos de carga, equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração. Tal como para uma solução usada para cada processo, há uma solução (solução básica) de equilíbrio, e as soluções de lavagem, eluição e regeneração, que são preparadas ao adicionar outros componentes à solução de equilíbrio. Os exemplos preferidos da solução de equilíbrio e das soluções de lavagem, eluição e regeneração usadas para cada processo são indicados na tabela a seguir. Tabela 1 Soluções Aplicáveis à Cromatografia
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[0037] Para o método de purificação de acordo com a invenção, de preferência a filtração com gel pode ser executada depois que a cromatografia é executada, e os exemplos de filtração com gel podem incluir filtrações com gel ao usar a resina Sephacryl, superdex e superose. Em uma modalidade da invenção, a filtração com gel pode ser executada por métodos comuns e, por exemplo, pode ser executada com 1 a 50 mM de acetato de sódio, 0,1 a 5 mM de metal alcalino ou metal alcalino-terroso, 0,001 ~ 0,5% em v/v de um tensoativo não iônico e uma solução de equilíbrio com um pH 4,5 ~ 5,5.
[0038] De acordo com uma modalidade da invenção, a cromatografia de afinidade usando Blue Sepharose pode usar tampões de equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração como tampões. A glicina pode ser usada como um tampão de equilíbrio, e de preferência 1 a 50 mM de glicina podem ser usados como um tampão de equilíbrio e um pH preferido do mesmo é de 8,0 a 11,0. Um tensoativo iônico pode ser usado como um tampão de lavagem, e de preferência pode ser usado em uma quantidade de 0,1 a 0,5% em v/v, e com mais preferência pode ser usado na quantidade de 0,3%. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de eluição, e de preferência 35 a 200 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0039] De acordo com uma modalidade da invenção, a cromatografia de troca de cátions pode usar um tampão, e tampões de equilíbrio, eluição e regeneração podem ser usados como tampões. Um tampão de equilíbrio que compreende o fosfato de sódio, um agente de quelação e um tensoativos não iônico pode ser usado como o tampão do equilíbrio, e de preferência 1 a 50 mM de fosfato de sódio, 0,1 a 5 mM de agente de quelação, e 0,001 a 0,5% em v/v de tensoativo não iônico podem ser incluídos e um pH preferido do mesmo é de 5,5 a 6,5. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de eluição, e com mais preferência 35 a 200 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0040] De acordo com uma modalidade da invenção, para a cromatografia de troca de ânions, os tampões de equilíbrio, equilíbrio pós-carga e regeneração podem ser usados como tampões. O fosfato de potássio pode ser usado como um tampão de equilíbrio, de preferência 1 a 50 mM de fosfato de potássio podem ser usados, e um pH preferido do mesmo é de 6,5 a 7,5. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de equilíbrio pós-carga, e de preferência 50 a 100 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0041] De acordo com uma modalidade da invenção, para a cromatografia de afinidade usando heparina Sepharose, os tampões de equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração podem ser usados como tampões. Um tampão de equilíbrio que compreende o acetato de sódio, um agente de quelação e um tensoativo não iônico pode ser usado como o tampão do equilíbrio, e de preferência 1 a 50 mM de acetato do sódio, 0,1 a 5 mM de agente de quelação e 0,001 a 0,5% em v/v de tensoativo não iônico podem ser usados e um pH preferido do mesmo é de 4,0 a 5,5. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de eluição, e de preferência 200 a 700 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0042] As faixas de atividades específicas das enzimas nos concentrados obtidos após a respectiva purificação são mostradas na Tabela 2 a seguir.
Figure img0003
[0043] A formulação líquida de acordo com a presente invenção pode ser administrada através de rotas de administração parenteral e, por exemplo, pode ser administrada parenteralmente através de injeção.
[0044] A formulação líquida também pode cloreto de sódio e lactose como excipientes além da hialuronidase e pode compreender, mas sem ficar a eles limitada, um excipiente farmaceuticamente aceitável, um agente de diluição, etc.
[0045] Além disso, um outro aspecto da invenção refere-se a um estabilizante para o hialuronidase e, mais detalhadamente, a um estabilizante que compreende cerca de 1 a 50 mM de um agente tampão para obter um pH de 4,5 a 6,0, de 0,001 a 0,5% de um tensoativo não iônico, e de 0,1 a 5 mM de um agente de quelação ou um cloreto de metal alcalino e metal alcalino-terroso.
[0046] As hialuronidases às quais o estabilizante é aplicável podem ser uma ou outra hialuronidase não purificada ou hialuronidases purificadas e de preferência elas são hialuronidases purificadas.
[0047] As hialuronidases podem ser enzimas normalmente derivadas dos testículos de mamíferos, por exemplo, de seres humanos,bovinos, ovinos e suínos, ou as hialuronidases recombinantes expressas pela transdução de hialuronidases derivadas de mamíferos em micróbios ou nas células de animais ou nas célula de plantas. Os métodos de produção das hialuronidases recombinantes são idênticos aos métodos de produção comuns nos micróbios, ou nas células de animal ou de plantas de acordo com métodos recombinantes para genes de mamíferos, e os métodos ilustrativos são descritos em Frost et al., 1997, BBRC, 236, 10-15; Lin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90, 10071-10075; Reitinger et al., 2008, Protein Expression and Purification, 57, 226-233; Kordowicz et al., patente europeia, WO2000/077221.
[0048] As hialuronidases compreendem as enzimas obtidas ao salgar os testículos de mamíferos uma vez e ao liofilizar os mesmos, as enzimas obtidas ao salgar os testículos duas vezes e então ao liofilizar os mesmos, as enzimas obtidas ao salgar os testículos duas vezes, ao despirogenar e então liofilizar os mesmos, etc. Além disso, as hialuronidases podem ser enzimas purificadas por um ou dois métodos adicionais combinados selecionados do grupo que consiste em cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de íons e filtração com gel e, de preferência, podem ser as hialuronidases que são purificadas pelos métodos de purificação acima e cuja pureza é 95% ou mais e a atividade específica é de 70.000 IU/mg ou mais. Os métodos de purificação são tal como descrito acima.
[0049] Para a estabilização da formulação líquida de acordo com a invenção, uma condição do pH é um dos fatores principais e, independente dos agentes tampão aqui usados, o pH é ajustado dentro dos valores incluindo cerca de 4,0 a cerca de 7,0, de preferência de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, por exemplo, os valores selecionados do grupo que consiste em 4,5, 4,7, 5,0, 5,5, 5,7 e 6,0. O pH pode ser obtido por um ajuste ao usar um ácido ou uma base conhecidos no campo pertinente, ou pelo uso de uma mistura apropriada de componentes do agente tampão, ou por ambos.
[0050] Os tampões farmaceuticamente aceitáveis apropriados para a invenção podem incluir, mas sem ficar a eles limitados, um ou mais agentes tampão combinados selecionados do grupo que consiste em tampão de succinato, tampão de acetato, tampão de fosfato, tampão de citrato, tampão de malonato, tampão de ácido MES(2-(N- morfolino)etanossulfônico), tampão de Tris e tampão de glicina. Uma concentração preferida dos agentes tampão pode ser determinada apropriadamente ao levar em consideração a condição pretendida do pH de uma solução alvo e o tipo dos agentes tampão a ser usados e, por exemplo, pode ser de 1 a 50 mM, e de preferência de 10 a 30 mM.
[0051] O tensoativo não iônico do estabilizante pode ser um éster de ácido graxo de polioxietileno sorbitan (Tween). Por exemplo, podem ser aqueles selecionados do grupo que consiste em polissorbato 20 (Tween 20), polissorbato 80 (Tween 80) e Triton X-100.
[0052] O agente de quelação refere-se a uma molécula que contém dois ou mais átomos doadores de elétrons que podem formar uma ligação coordenada com um único íon de metal, e de preferência pode ser o ácido etileno diamina tetra-acético (EDTA). A concentração do agente de quelação pode ser de 0,1 mM a 5 mM, e de preferência de 0,5 mM a 1 mM.
[0053] O cloreto de metal alcalino e metal alcalino-terroso pode ser o MgCl2. A concentração do MgCl2 pode ser de 0,1 mM a 5 mM, e de preferência de 0,5 mM a 5 mM.
[0054] Os exemplos de estabilizante podem incluir MgCl2, um tensoativo não iônico, e um agente tampão para obter um pH de 4,0 a 6,0, ou incluir EDTA, um tensoativo não iônico, e um agente tampão para obter um pH de 4,0 a 6,0
[0055] A cromatografia de afinidade da primeira purificação pode usar um tampão, e os tampões de equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração podem ser usados como tampões. A glicina pode ser usada como um tampão de equilíbrio, de preferência 1 a 50 mM de glicina podem ser usados como um tampão de equilíbrio, e um pH preferido do mesmo é de 8,0 a 11,0. Um tensoativo iônico pode ser usado como um tampão de lavagem, e de preferência pode ser usado em uma quantidade de 0,1 a 0,5%, e com mais preferência pode ser usado na quantidade de 0,3%. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de eluição e, de preferência, 35 a 200 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0056] A cromatografia de troca de cátions da segunda purificação pode usar um tampão, e os tampões deequilíbrio, eluição e regeneração podem ser usados como tampões. O tampão de equilíbrio pode incluir fosfato de sódio, EDTA, e Tween 80, e de preferência 1 a 50 mM de fosfato de sódio, 0,1 a 5 mM de EDTA, e 0,001 a 0,5% de Tween 80 podem ser incluídos, e um pH preferido do mesmo é de 5,5 a 6,5. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de eluição e com mais preferência, 35 a 200 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0057] A cromatografia de troca de ânions da terceira purificação pode usar um tampão, e os tampões de equilíbrio, equilíbrio pós-carga e eluição podem ser usados como tampões. O fosfato de potássio pode ser usado como um tampão de equilíbrio, de preferência 1 a 50 mM de fosfato de potássio podem ser usados, e um pH preferido do mesmo é de 6,5 a 7,5. O cloreto do sódio pode ser usado como um tampão de equilíbrio pós-carga e, de preferência, 50 a 100 mM de cloreto do sódio podem ser usados.
[0058] A cromatografia de afinidade da quarta purificação pode usar um tampão, e os tampões de equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração podem ser usados como tampões. O tampão de equilíbrio pode incluir acetato de sódio, EDTA e Tween 80, e de preferência 1 a 50 mM de acetato de sódio, 0,1 a 5 mM de EDTA e 0,001 a 0,5% de Tween 80 podem ser usados, e um pH preferido do mesmo é de 4,0 a 5,5. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de eluição e, de preferência, 200 a 700 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0059] A filtração com gel da quinta purificação pode usar um tampão, e um tampão de equilíbrio pode ser usado como um tampão. O tampão de equilíbrio pode incluir acetato de sódio, MgCl2 e Tween 80, e de preferência 1 a 50 mM de acetato do sódio, 0,1 a 5 mM de MmgCl2 e 0,001 a 0,5% de Tween 80 podem ser usados, e um pH preferido do mesmo é de 4,5 a 5,5. A formulação líquida refere-se a todas as formas de soluções aquosas e a quaisquer tipos de suspensões, e é caracterizada por ser administrado através de uma rota subcutânea.
[0060] Uma vez que a formulação líquida de acordo com uma modalidade específica da invenção pode manter a sua atividade por um longo período de tempo de maneira tal que o teor de hialuronidase é mantido em 90% ou mais até mesmo quando armazenada em uma condição de temperatura de 2 a 8°C por até 29 semanas, pode resolver o problema anterior em que a sua atividade fisiológica é reduzida devido a uma diminuição na estabilidade com o passar do tempo.
[0061] Em uma modalidade específica da invenção, o método de purificação de hialuronidase compreende uma etapa de preparação de um material de pesquisa ao extrair dos testículos de ovinos e liofilizar a hialuronidase; uma primeira etapa de purificação do material de pesquisa ao usar a cromatografia de afinidade usando Blue Sepharose; uma segunda etapa de purificação ao usar a cromatografia de troca de cátions após a primeira purificação; uma terceira etapa de purificação ao usar a cromatografia de troca de ânions após a segunda purificação; uma quarta etapa de purificação ao usar a cromatografia de afinidade após a terceira purificação; e uma quinta etapa de purificação ao usar a filtração com gel após a quarta purificação, e os tipos de tampões particulares usados em cada etapa e as suas faixas preferidas são tal como descrito no que diz respeito à formulação líquida acima.
[0062] A formulação líquida de acordo com a presente invenção pode ser administrada através de rotas de administração parenteral e, por exemplo, pode ser administrada parenteralmente através de injeção.
[0063] A formulação líquida também pode compreender cloreto de sódio e lactose como excipientes além da hialuronidase, e pode compreender, mas sem ficar a eles limitada, um excipiente farmaceuticamente aceitável, um agente de diluição, etc.
[0064] Além disso, um outro aspecto da invenção refere-se a um estabilizante para a hialuronidase e, mais detalhadamente, a um estabilizante que compreende de cerca de 1 a 50 mM de um agente tampão para obter um pH de 4,5 a 6,0, de 0,001 a 0,5% em v/v de um tensoativo não iônico e de 0,1 a 5 mM de um agente de quelação ou um cloreto de metal alcalino e metal alcalino-terroso.
[0065] As hialuronidases às quais o estabilizante é aplicável podem ser uma ou outro hialuronidase não purificada ou hialuronidases purificadas e, de preferência, elas são hialuronidases purificadas.
[0066] As hialuronidases podem ser enzimas normalmente derivadas dos testículos de mamíferos, por exemplo, de seres humanos, bovinos, ovinos e suínos, ou as hialuronidases recombinantes expressas pela transdução de hialuronidases derivadas de mamíferos em micróbios ou nas células de animais ou nas célula de plantas. Os métodos de produção de hialuronidases recombinantes são idênticos aos métodos de produção comuns nos micróbios, ou nas células de animal ou de plantas de acordo com métodos recombinantes para genes de mamíferos, e os métodos ilustrativos são descritos em Frost et al., 1997, BBRC, 236, 10-15; Lin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90, 10071-10075; Reitinger et al., 2008, Protein Expression and Purification, 57, 226-233; Kordowicz et al., patente europeia, WO2000/077221.
[0067] As hialuronidases compreendem as enzima obtidas ao salgar os testículos de mamíferos uma vez e ao liofilizar os mesmos, as enzimas obtidas ao salgar os testículos duas vezes e então ao liofilizar os mesmos, as enzimas obtidas ao salgar os testículos duas vezes, ao despirogenar e então liofilizar os mesmos, etc. Além disso, as hialuronidases podem ser as enzimas purificadas por um ou dois métodos adicionais combinados selecionados do grupo que consiste em cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de íons e filtração com gel, e de preferência podem ser as hialuronidases que são purificadas pelos métodos de purificação acima e cuja pureza é de 95% ou mais e a atividade específica é de 70.000 IU/mg ou mais. Os métodos de purificação são tal como descrito acima.
[0068] Para a estabilização da formulação líquida de acordo com a invenção, uma condição do pH é um dos fatores principais e, independente dos agentes tampão aqui usados, o pH é ajustado dentro dos valores incluindo cerca de 4,0 a cerca de 7,0, e de preferência cerca de 4,5 a cerca de 6,0, por exemplo, de valores selecionados do grupo que consiste em 4,5, 4,7, 5,0, 5,5, 5,7 e 6,0. O pH pode ser obtido por um ajuste ao usar um ácido ou uma base conhecidos no campo pertinente, ou pelo uso de uma mistura apropriada de componentes do agente tampão, ou por ambos.
[0069] Os tampões farmaceuticamene aceitáveis apropriados para a invenção podem incluir, mas sem ficar a eles limitados, um ou mais agentes tampão combinados selecionados do grupo que consiste em tampão de succinato, tampão de acetato, tampão de fosfato, tampão de citrato, tampão de malonato, tampão de ácido MES(2-(N- morfolino)etanossulfônico), tampão de Tris e tampão de glicina. Uma concentração preferida dos agentes tampão pode ser determinada apropriadamente ao levar em consideração a condição pretendida do pH de uma solução alvo e o tipo dos agentes tampão a ser usados e, por exemplo, pode ser de 1 a 50 mM, e de preferência de 10 a 30 mM.
[0070] O tensoativo não iônico do estabilizante pode ser um éster de ácido graxo de polioxietileno sorbitan (Tween). Por exemplo, pode ser aqueles selecionados do grupo que consiste em polissorbato 20 (Tween 20), polissorbato 80 (Tween 80) e Triton X-100.
[0071] O agente de quelação refere-se a uma molécula que contém dois ou mais átomos doadores de elétrons que podem formar uma ligação coordenada com um único íon de metal e, de preferência, pode ser o ácido etileno diamina tetra-acético (EDTA). A concentração do agente de quelação pode ser de 0,1 mM a 5 mM, e de preferência de 0,5 mM a 1 mM.
[0072] O cloreto de metal alcalino e metal alcalino-terroso pode ser o MgCl2. A concentração de MgCl2 pode ser de 0,1 mM a 5 mM, e de preferência de 0,5 mM a 5 mM.
[0073] Os exemplos do estabilizante podem incluir MgCl2, um tensoativo não iônico e um agente tampão para obter um pH de 4,0 a 6,0, ou incluir EDTA, um tensoativo não iônico e um agente tampão para obter um pH de 4,0 a 6,0
[0074] A cromatografia de afinidade da primeira purificação pode usar um tampão, e os tampões de equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração podem ser usados como tampões. A glicina pode ser usada como um tampão de equilíbrio, e de preferência de 1 a 50 mM de glicina podem ser usados como um tampão de equilíbrio, e um pH preferido do mesmo é de 8,0 a 11,0. Um tensoativo iônico pode ser usado como um tampão de lavagem, e de preferência pode ser usado em uma quantidade de 0,1 a 0,5% em v/v, e com mais preferência pode ser usado na quantidade de 0,3%. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de eluição e, de preferência, 35 a 200 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0075] A cromatografia de troca de cátions da segunda purificação pode usar um tampão, e os tampões de equilíbrio, eluição e regeneração podem ser usados como tampões. O tampão de equilíbrio pode incluir fosfato de sódio, EDTA, e Tween 80, de preferência 1 a 50 mM de fosfato de sódio, 0,1 a 5 mM de EDTA e 0,001 a 0,5% de Tween 80 podem ser incluídos, e um pH preferido do mesmo é de 5,5 a 6,5. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de eluição, e com mais preferência, 35 a 200 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0076] A cromatografia de troca de ânions da terceira purificação pode usar um tampão, e os tampões de equilíbrio, equilíbrio pós-carga e eluição podem ser usados como tampões. O fosfato de potássio pode ser usado como um tampão de equilíbrio, de preferência, 1 a 50 mM de fosfato de potássio podem ser usado, e um pH preferido do mesmo é de 6,5 a 7,5. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de equilíbrio pós-carga e, de preferência, 50 a 100 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0077] A cromatografia da afinidade da quarta purificação pode usar um tampão, e os tampões de equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração podem ser usados como tampões. O tampão de equilíbrio pode incluir acetato de sódio, EDTA e Tween 80, de preferência 1 a 50 mM de acetato de sódio, 0,1 a 5 mM de EDTA e 0,001 a 0,5% de Tween 80 podem ser usados, e um pH preferido do mesmo é de 4,0 a 5,5. O cloreto de sódio pode ser usado como um tampão de eluição e, de preferência, 200 a 700 mM de cloreto de sódio podem ser usados.
[0078] A filtração com gel da quinta purificação pode usar um tampão, e um tampão de equilíbrio pode ser usado como um tampão. O tampão de equilíbrio pode incluir acetato de sódio, MgCl2 e Tween 80, de preferência, 1 a 50 mM de acetato de sódio, 0,1 a 5 mM de MgCl2 e 0,001 a 0,5% de Tween 80 podem ser usados, e um pH preferido do mesmo é de 4,5 a 5,5. A formulação líquida refere-se a todas as formas de soluções aquosas e a quaisquer tipos de suspensões, e é caracterizada por ser administrado através de uma rota subcutânea.
[0079] Uma vez que a formulação líquida de acordo com uma modalidade específica da invenção pode manter a sua atividade por um longo período de tempo de maneira tal que o teor da hialuronidase é mantido em 90% ou mais até mesmo quando armazenada em uma condição de temperatura de 2 a 8°C por até 29 semanas, pode resolver o problema anterior em que a sua atividade fisiológica é reduzida devido a uma diminuição na estabilidade com o passar do tempo.
[0080] Em uma modalidade específica da invenção, o método de purificação de hialuronidase compreende uma etapa de preparação de um material de pesquisa mediante a extração dos testículos de ovinos e liofilização da hialuronidase; uma primeira etapa de purificação do material de pesquisa ao usar cromatografia de afinidade usando Blue Sepharose; uma segunda etapa de purificação ao usar a cromatografia de troca de cátions após a primeira purificação; uma terceira etapa de purificação ao usar a cromatografia de troca de ânions após a segunda purificação; uma quarta etapa de purificação ao usar a cromatografia de afinidade após a terceira purificação; e uma quinta etapa de purificação ao usar a filtração com gel após a quarta purificação, e os tipos de tampões particulares usados em cada etapa e as suas faixas preferidas são tal como descrito no que diz respeito à formulação líquida acima.
[0081] De acordo com o método de elevada purificação da hialuronidase de pureza elevado de acordo com a invenção, a pureza das hialuronidases previamente manufaturadas pode ser realçada.
[0082] Além disso, de acordo com a injeção de hialuronidase de pureza elevada de acordo com a invenção, a estabilidade da mesma pode ser fixada pela remoção das proteínas estranhas que são os problemas das hialuronidases previamente manufaturadas.
[0083] Além disso, a formulação líquida que também compreende o estabilizante além da hialuronidase purificada tem vantagens, uma vez que pode manter estavelmente a sua atividade durante um longo período de tempo e pode simplesmente ser administrada.
[0084] Daqui por diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos exemplos a seguir. No entanto, eles servem meramente para ilustrar a invenção, e o âmbito da invenção não é limitado por estes exemplos de nenhuma maneira.
Exemplo 1: Cromatografia de Afinidade usando Blue Sepharose (primeira purificação)
[0085] Os materiais usados para a purificação das hialuronidases neste experimento são, tal como mostrado na Tabela 3 a seguir: 1) um material liofilizado depois do primeiro salgamento dos testículos entre os processos precedentes (o primeiro material salgado), 2) um material liofilizado depois do segundo salgamento (o segundo material salgado), e 3) um material liofilizado após a despirogenação (nome do material: Hialuronidase (Hdase, abaixo) Shanghai Liamim Co.), e eles foram usados em métodos de purificação de 5 etapas subsequentes.
Figure img0004
[0086] O processo de cromatografia consiste em processos de carga, equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração. A primeira purificação usou a cromatografia de afinidade e os tampões usados na mesma são tal como na Tabela 4 a seguir.
Figure img0005
[0087] Para a primeira purificação de hialuronidase, Blue Sepharose 6 Fast Flow foi usada como uma resina, e foi usada para preencher colunas com um diâmetro interno de 1,6 cm até que a altura da resina ficasse igual a 10 cm. 1 g do material de hialuronidase foi dissolvido em 500 ml (2 mg/ml) do tampão de equilíbrio (10 mM de glicina, pH 10,0), e o filtro continuou depois que a filtração foi usada como um espécime para a análise.
[0088] O espécime de hialuronidase foi carregado nas colunas, e a taxa de carga aplicada foi de 2,0 ml/min. Em seguida, as colunas foram equilibradas com o tampão de equilíbrio e foram lavadas com um tampão de lavagem (0,3% de caprilato de sódio no tampão base). As etapas subsequentes ao equilíbrio foram analisadas a uma vazão de 3,0 ml/min. Após a lavagem, as resinas foram equilibradas outra vez com o tampão de equilíbrio e eluídas com um tampão de eluição (135 mM de sal no tampão base) para coletar as soluções que estavam fluindo para fora. Uma vez que a hialuronidase deve muito provavelmente perder a sua atividade na condição básica, o pH das soluções coletadas foi ajustado de 6,0 a 7,0 pela adição de um ajustador de pH e, com a conclusão da eluição, as colunas foram regeneradas com um tampão de regeneração (1 M de sal no tampão base). Os resultados da análise são tal como mostrado na Figura 1. O rendimento e a atividade específica obtidos após a purificação são mostrados na Tabela 8 a seguir.
Exemplo 2: Cromatografia de Troca de Cátions usando Mono S (segunda purificação)
[0089] A cromatografia de troca de cátions foi usada como segunda purificação. Ao usar os tampões indicados na Tabela 5, processos de carga do espécime, equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração foram executados.
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[0090] Para a segunda purificação de hialuronidase, S mono foi usado como uma resina, e foi usado para preencher as colunas com um diâmetro interno de 1,6 cm até que a altura da resina ficasse igual a 10 cm. O espécime purificado em primeiro lugar do Exemplo 1 foi diluído por 3 vezes com um tampão de equilíbrio (10 mM de EDTA dibásico, 1 mM de fosfato de sódio, 0,1% de Tween 80, pH 6,0) e então usado como um espécime para a análise.
[0091] O espécime do hialuronidase foi carregado nas colunas, e a taxa de carga aplicada foi de 2,0 ml/min. Em seguida, as colunas foram equilibradas com o tampão de equilíbrio, e as etapas subsequentes ao equilíbrio foram analisadas a uma vazão de 3,0 ml/min. Após o equilíbrio, as resinas foram lavadas com um tampão de lavagem (80 mM de sal no tampão base). Após a lavagem das resinas, elas foram eluídas com um tampão de eluição (125 mM de sal no tampão base) para coletar as soluções que estavam fluindo para fora. Com a conclusão da eluição, as colunas foram regeneradas com um tampão de regeneração (1 M de sal no tampão base). Os resultados da análise são tal como mostrado na Figura 2. O rendimento e a atividade específicos obtidos após a purificação são mostrados na Tabela 8 a seguir.
Exemplo 3: Cromatografia de Troca de Ânions usando DEAE Sepharose (terceira purificação)
[0092] A cromatografia da troca de ânions foi usada como terceira purificação. Ao usar os tampões indicados na Tabela 6, processos de carga de espécime, equilíbrio e regeneração foram executados.
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[
[0093] Para a terceira purificação de hialuronidase, DEAE Sepharose foi usada como uma resina, e foi usada para preencher colunas com um diâmetro interno de 1,6 cm até que a altura da resina ficasse igual a 5 cm. O espécime purificado em segundo lugar no Exemplo 2 foi diluído 1,67 vez com um tampão de equilíbrio (5 mM de fosfato de potássio dibásico, pH 7,1) e então usado como um espécime para a análise.
[0094] O espécime de hialuronidase foi carregado nas colunas, e a taxa de carga aplicada foi de 2,0 ml/min. Em seguida, as colunas foram equilibradas com um tampão de equilíbrio pós-carga (75 mM de sal no tampão base), e as etapas subsequentes ao equilíbrio foram analisadas a uma vazão de 3,0 ml/min. Após o equilíbrio, as resinas foram regeneradas com um tampão de regeneração (1 M de sal no tampão base) sem nenhuma etapa de eluição separada. Na terceira purificação, as soluções que estavam fluindo para fora sem ficar ligadas às resinas durante a carga sem nenhuma etapa de eluição separada (fluxo através da solução (F/T)) foram consideradas como eluatos de hialuronidase purificados. Os resultados da análise são tal como mostrado na Figura 3. O rendimento e a atividade específicos obtidos após a purificação são mostrados na Tabela 8 a seguir. Exemplo 4: Cromatografia de Afinidade usando Heparina Sepharose (quarta purificação)
[0095] A cromatografia de afinidade foi usada como quarta purificação. Ao usar os tampões indicados na Tabela 7, processos de carga de espécime, equilíbrio, lavagem, eluição e regeneração foram executados.
Figure img0008
[0096] Para a quarta purificação de hialuronidase purificada em terceiro lugar pela cromatografia de troca de ânions, Heparina Sepharose 6 Fast Flow foi usada como resina e foi usada para preencher colunas com um diâmetro interno de 1,0 cm até que a altura da resina ficasse igual a 10 cm. Uma concentração de 10x de um tampão de equilíbrio (200 mM de acetato de sódio,10 mM de EDTA, 1,0% de Tween 80, pH 4,5) foi adicionada ao espécime purificado em terceiro lugar do Exemplo 3 em 1/9 em volume do espécime purificado em terceiro lugar e usado então como um espécime para a análise.
[0097] O espécime de hialuronidase foi carregado nas colunas, e a taxa de carga aplicada foi de 0,5 ml/min. Em seguida, as colunas foram equilibradas com um tampão de equilíbrio (20 mM de acetato de sódio, 1 mM de EDTA, 0,1% de Tween 80, pH 4,5) e foram lavadas com um tampão de lavagem (200 mM de sal no tampão base). As etapas subsequentes ao equilíbrio foram analisadas a uma vazão de 1,0 ml/min. Após a lavagem, as resinas foram eluídas com um tampão de eluição (500 mM de sal no tampão base) para coletar as soluções que estavam fluindo para fora. Com a conclusão da eluição, as colunas foram regeneradas com um tampão de regeneração (1 M de sal no tampão base). O gráfico de purificação resultante deste experimento é mostrado na Figura 4. O rendimento e a atividade específicos obtidos após a purificação são mostrados na Tabela 8 a seguir.
Exemplo 5: Filtração com gel usando Resina Sephacryl (quinta purificação)
[0098] A filtração com gel foi usada como quinta purificação, e a solução de equilíbrio aqui usada é uma solução que contém 10 mM de acetato de sódio, 1 mM de MgCl2, 0,01% de Tween 80, e um pH 5,0.
[0099] Para a quinta purificação, por meio de filtração com gel, da hialuronidase purificada em quarto lugar, Sephacryl S-200 foi usada como uma resina e foi usada para preencher colunas com um diâmetro interno de 1,6 cm até que a altura da resina ficasse igual a 90 cm. A solução do espécime purificada em quarto lugar no Exemplo 4 foi concentrada a 1% ou algo do gênero do volume da resina e então usada como um espécime para a análise.
[00100] O espécime de hialuronidase foi carregado nas colunas, e a taxa de carga aplicada foi de 0,1 ml/min. Em seguida, o processo de classificação foi executado com um tampão de equilíbrio (10 mM de acetato de sódio, 1 mM de MgCl2, 0,01% de Tween 80, pH 5,0) fluindo para fora. Ele foi analisado a uma vazão de 0,1 ml/min, e as soluções que estavam fluindo para fora pela eluição foram coletadas. O rendimento e a atividade específicos obtidos após a purificação são mostrados na Tabela 8 a seguir.
[00101] Os resultados dos testes de pureza após a quinta purificação no que diz respeito aos três espécimes diferentes de hialuronidase acima são mostrados nas Figuras 5 a 7 e na Tabela 8. O rendimento da proteína indicado na Tabela 8 refere-se ao rendimento da purificação de todas as proteínas que contêm hialuronidase. Tal como mostrado nas Figuras 5 a 7, os dímeros ou os polímeros que não hialuronidases não são mostrados no cromatograma de acordo com os documentos de GPC após a quinta purificação, e a sua atividade específica (IU/mg de proteína) era 90.000 IU/mg de proteína ou mais e a sua pureza (GPC) era 95% ou mais.
Figure img0009
Figure img0010
[00102] Tal como mostrado nas Figuras 5 a 7 e na Ta bela 8, verifica-se que mesmo quando materiais de partida diferentes (primeiro material salgado, segundo material salgado, e Hdase) foram usados na purificação de cinco etapas acima, a atividade específica dos concentrados finais obtidos depois da conclusão da quinta purificação era 90.000 IU/mg de proteína ou mais e a sua pureza era 95% ou mais. Estes resultados significam que se os materiais de hialuronidase de quaisquer etapas são usados, os resultados acima podem ser obtidos através do processo de purificação de cinco etapas acima, e os concentrados finais quase não contêm dímeros ou multímeros além de hialuronidases. Exemplo 6: Teste de estabilidade (nenhuma adição de estabilizante) 6-1: Teste de estabilidade do concentrado de eluição após a primeira purificação
[00103] O pH de cada concentrado de eluição obtido depois da primeira purificação do primeiro material salgado, do segundo material salgado e da cromatografia de afinidade usandoHdase de acordo com o Exemplo 1 foi ajustado entre 6,0 e 7,0 e então eles foram dispensados em uma determinada quantidade e armazenados a 4°. Em cada ponto do tempo, o teor de hialuronidases foi medido e os resultados são mostrados na Tabela 9 a seguir.
[00104] Em cada ponto no tempo, a atividade da enzima (ou o teor) de hialuronidases foi testada de acordo com o Ensaio indicado em "Hyaluronidase for injection" por British Pharmacopoeia Monograph. Por todo o relatório descritivo, a estabilidade dos hialuronidases refere- se à atividade (teor ou atividade específica) das hialuronidases medidos de acordo com o Ensaio indicado em "Hyaluronidase for injection" por British Pharmacopoeia Monograph.
[00105] As atividades da enzima (ou teores) em cada condição de teste são expressas como valores da porcentagem da atividade específica ou da atividade medida em cada ponto no tempo, no que diz respeito à atividade específica ou à atividade em 0 semana indicada na Tabela 8 que é ajustada em 100, e é mostrada na Tabela 9 a seguir. Taxa de Atividade de Enzima = Atividade da enzima na medição (IU/ml) x 100 Atividade Inicial da Enzima (IU/ml)
Figure img0011
[00106] Tal como visto na Tabela 9 acima, em consequência do teste da estabilidade do teor a 4°C no que diz respeito aos concentrados de eluição obtidos pela primeira purificação dos três materiais cujas atividades específicas são diferentes entre si, foi verificado que todos os três materiais mostraram pouca redução em seus teores até 29 semanas. Os eluatos obtidos depois da primeira purificação foi meramente ajustado baixo para ter um pH 6,0 a 7,0 sem nenhum outro estabilizante. Entrementes, os valores do teor excedendo 100% na Tabela 9, que foram obtidas a partir da medição da atividade fisiológica tal como a medição da atividade da enzima em comparação com produtos padrão, é considerado para como os erros da medição que são gerados pelas faixas amplas de resultados de testes, tal como visto em testes de titulação de substâncias biológicas (vacinas, proteínas recombinantes (citocina, anticorpo monoclonal, etc.), toxoide, etc.)
6-2: Teste de estabilidade da solução de baixa concentração obtida ao diluir o concentrado de eluição após a primeira purificação
[00107] Os concentrados de eluição obtidos depois da primeira purificação de materiais de Hdase de acordo com o Exemplo 1 foram diluídos de modo a ficar sendo iguais a cerca de 1.500 IU/ml (= 100%) e então, dispensados e armazenados a 4°C. Então, tal como visto na Tabela 10 a seguir, os seus teores foram medidos em cada ponto no tempo. A concentração de 1.500 IU/ml é a mesma que a concentração dos produtos que têm hialuronidases como seu material.
[00108] Os teores em cada medição são expressos como os valores da porcentagem de atividade da enzima medidos em um ponto específico do tempo de armazenagem, no que diz respeito à atividade da enzima em 0 semana que é ajustado em 100%, e mostrados na Tabela 10 a seguir. A atividade específica da enzima é calculada de acordo com a seguinte fórmula matemática: Atividade Específica da Enzima (IU/mg) = Atividade da Enzima na Medição (IU/ml) Teor de Proteína Contido no Espécime na Medição (MG/ml)
Figure img0012
[00109] Tal como visto na Tabela 10 acima, os concentrados da eluição obtidos após a primeira purificação mostraram pouca redução em seus teores em 29 semanas até mesmo à concentração de 1.500 IU/ml.
[00110] Portanto, independentemente dos teores dos materiais, os concentrados após a primeira purificação dos três materiais ficaram estáveis a 4°C por 29 semanas e, analogamente, ficaram estáveis em sua concentração baixa (1.500 IU/ml) a 4°C por 29 semanas.
6-3: Teste de estabilidade do concentrado de eluição obtido após a purificação de uma etapa pela segunda purificação e pela quarta purificação
[00111] Cada um dos materiais de Hdase foi submetido à purificação de uma etapa ou à segunda purificação ou à quarta purificação, e então cada concentrado foi testado no que diz respeito à sua estabilidade. Cada uma dentre a segunda purificação e a quarta purificação foi executada substancialmente de acordo com o Exemplo 2 e o Exemplo 4, e Hdase é um espécime antes da primeira purificação indicado no Exemplo 1. As temperaturas de armazenagem dos concentrados de eluição obtidos foram ajustadas a 4°C, 25°C e 37°C, respectivamente, e então os teores de hialuronidases foram medidos em cada ponto no tempo e seus teores de enzima (taxas de atividade de enzima) foram obtidos em cada ponto no tempo tal como mostrado na Tabela 11 a seguir. Tabela 11 Taxa de Atividade da Enzima (%, Conteúdo)
Figure img0013
[00112] Além disso, a fim de investigar as faixas de teores das hialuronidases quando armazenadas durante um longo período de tempo, os concentrados obtidos ao executar a segunda purificação foram armazenados a 4°C por 29 semanas e em cada ponto no tempo os teores das hialuronidases foram medidos. Os resultados são mostrados na Tabela 12 a seguir.
Figure img0014
[00113] Tal como visto na Tabela 1 1 e na Tabela 12, além dos concentrados após a primeira purificação, os concentrados que foram purificados uma vez pela segunda purificação ficaram estáveis a 4°C por 29 semanas.
Exemplo 7: Condições do estabilizante
[00114] Os concentrados usados para os testes das condições do estabilizante eram hialuronidases que têm uma pureza de 95% ou mais que eram os produtos obtidos após a quinta purificação do material de Hdase no Exemplo 5, os quais foram ajustados então a uma concentração de 1.500 IU/ml (= 100%) e usados para preparar as soluções de acordo com as condições indicadas nas tabelas, respectivamente. 7-1: Componentes da Estabilização
[00115] A hialuronidase que tem um pureza de 95% ou mais foi ajustada a 1.500 IU/ml (=100%) e usada para preparar as soluções de acordo com as condições indicadas na Tabela 13 a seguir, que foram armazenadas então a 4°C e testadas para medir os teores das hialuronidases em cada ponto no tempo. Em consequência disto, houve uma redução nos teores, tal como visto na Tabela 13 a seguir.
Figure img0015
* Tampão Básico: 10 mM de acetato de sódio
[00116] As mesmas hialuronidases foram ajustados a 1.500 IU/ml (=100%) e usadas para preparar as soluções de acordo com as condições da Tabela 14 a seguir, as quais foram armazenadas então a 4°C e testadas para medir os teores das hialuronidases em cada ponto no tempo. Os resultados da Tabela 15 foram, desse modo, obtidos.
Figure img0016
Tabela 15 Taxa de Atividade da Enzima (%)
Figure img0017
[00117] A partir dos resultados acima, foi verificado que os componentes da estabilização para a hialuronidase são condições combinadas de EDTA ou MgCl2 + Tween 80 + pH de 4,5 a 6,0.
7-2: Condição da Concentração do Estabilizante
[00118] As hialuronidases usadas no teste de estabilidade eram aquelas purificada a mais de 95%, e a concentração do teste foi ajustada em 1.500 IU/ml (= 100%). As condições indicadas na Tabela 16 a seguir foram usadas para a preparação, e o teste de estabilidade foi executado. As concentrações de EDTA, MgCl2 e Tween 80 foram diluídas duas vezes e dez vezes, e o teste de estabilidade foi executado em condições de armazenagem de 4°C e 25°C.
Figure img0018
[00119] Os resultados dos tes tes são mostrados na Tabela 17 a seguir. Tabela 17 Taxa de Atividade da Enzima (%)
Figure img0019
[00120] Tal como visto na tabela acima, as hialuronidases ficaram estáveis por cerca de 26 semanas sob a condição 1 e a condição 3, e a sua estabilidade mostrou uma tendência diminuída sob as outras condições.
Exemplo 8 8.1: Teste do estabilizante para o espécime de Hdase
[00121] No que diz respeito ao espécime de Hdase não purificado do qual a primeira purificação não foi nem mesmo executada, indicado no Exemplo 1, a sua estabilidade foi testada com EDTA ou MgCl2 + Tween 80 + pH 5,0. Depois que o espécime (hialuronidase, teor de cerca de 800 ~ 1.100 IU/mg) usado nos produtos existentes de hialuronidase foi dissolvido nos tampões ou na água para a injeção (WFI), respectivamente, indicados na Tabela 18 a seguir para ficar igual a 1.500 IU/ml (=100%), o seu teste de estabilidade foi executado em condições de armazenagem de 4°C, 25°C e 37°C.
Figure img0020
[00122] Os resultados dos testes são mostrados na Tabela 19 a seguir. Tabela 19 Taxa de Atividade de Enzima (%)
Figure img0021
[00123] Tal como visto na Tabela 19 acima, os materiais dissolvidos em WFI mostraram uma redução rápida nos teores quando comparados aos materiais dissolvidos em outros tampões (EDTA ou MgCl2 + Tween 80 + pH 5,0), e pode-se concluir a partir deste resultado que a composição de EDTA ou MgCl2 + Tween 80 + pH 5,0 contribui para a estabilidade das hialuronidases (4°C).
8-2: Teste do estabilizante para concentrados purificados de acordo com os Exemplos 2 a 5
[00124] Cada concentrado obtido de cada etapa que foi executada em ordem de acordo com os Exemplos 2 a 5 foi diluído até 1.500 IU/ml (=100%) ao usar o tampão de equilíbrio de cada etapa de purificação, e o seu teste de estabilidade foi executado em condições de armazenagem de 4°C e 37°C. Os resultados são mostrados na Tabela 20 a seguir. Tabela 20: Taxa de Atividade da Enzima (%)
Figure img0022
[00125] Tal como visto na Tabela 20, os teores das hialuronidases não foram reduzidos durante o período de observação,
8-3: Teste de estabilidade dos espécimes obtidos após a remoção de EDTA/MgCl2 por meio de diálise dos concentrados obtidos após a purificação de acordo com os Exemplos 2 a 5
[00126] A fim de investigar os efeitos da estabilização de EDTA ou MgCl2 após a remoção dos mesmos quando foram usados para as etapas de purificação, cada concentrado obtido depois da purificação de acordo com os Exemplos 2 a 5 foi diluído até 1.500 IU/ml (=100%), eles foram dialisados ao usar um tampão do qual EDTA/MgCl2 foi removido indicado na Tabela 21 a seguir. Em seguida, o teste de estabilidade dos mesmos foi executado em condições de armazenagem de 4°C e 37°C, e os resultados são mostrados na Tabela 22 a seguir. Ambas as temperaturas de 4°C e 37°C, os teores foram reduzidos.
Figure img0023
Tabela 22: Taxa de Atividade da Enzima (%)
Figure img0024
[00127] No que diz respeito às hialuronidases de pureza elevada, nenhum problema ocorreu na resposta ao choque anafilático e no teste de reação à anafilase cutânea passiva ao usar ratos, de modo que a sua estabilidade foi assegurada. Portanto, a hialuronidase de pureza elevada tem méritos como uma injeção uma vez que a sua pureza é maior do que as injeções atualmente disponíveis no mercado e ela tem uma excelente estabilidade.

Claims (12)

1. Formulação líquida de hialuronidase, caracterizada pelo fato de que compreende: uma hialuronidase que tem uma pureza de 95% ou mais e uma atividade específica de 70.000 IU/mg ou mais, e um estabilizante de hialuronidase consistindo de um agente tampão para obter um pH de 4,0 a 6,0; de 0,001 a 0,5% em v/v de um tensoativo não iônico; e de 0,1 a 5 mM de um agente de quelação ou MgCl2, em que a hialuronidase é derivada de um mamífero.
2. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formulação líquida é uma formulação injetável.
3. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formulação líquida tem uma estabilidade para manter a atividade da hialuronidase até 90% ou mais no que diz respeito à sua atividade enzimática inicial 100 em uma condição da temperatura de 2 a 8°C.
4. Formulação líquida hialuronidase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase é um componente ativo da formulação.
5. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o agente de quelação é EDTA.
6. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o tensoativo não iônico é selecionado dentre o grupo que consiste em éster de ácido graxo de polioxietileno-sorbitano e Triton X-100.
7. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o tensoativo não iônico é selecionado dentre o grupo que consiste em polissorbato 20, polissorbato 80 e Triton X-100.
8. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o agente tampão é selecionado dentre o grupo que consiste em tampão de succinato, tampão de acetato, tampão de fosfato, tampão de citrato, tampão de malonato, tampão de ácido (MES) 2-(N-morfolino)etanossulfônico, tampão de Tris e tampão de glicina.
9. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase é uma hialuronidase recombinante produzida pela transdução de um gene de hialuronidase de mamífero em micróbios, nas células de animais ou nas células de plantas, ou é um extrato derivado de ovinos, bovinos, suínos ou seres humanos.
10. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase é purificada a partir de um material contendo hialuronidase por um ou mais métodos selecionados dentre o grupo que consiste em cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica e filtração em gel.
11. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a cromatografia de afinidade é a cromatografia de afinidade usando Blue Sepharose, ou a cromatografia de afinidade usando heparina Sepharose.
12. Formulação líquida de hialuronidase de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase é purificada com cromatografia de afinidade usando Blue Sepharoes, a cromatografia de troca catiônica, a cromatografia de troca aniônica, e a cromatografia de afinidade usando heparina Sepharoes, em sequência.
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