JP2015535278A - ヒアルロニダーゼの安定化製剤およびこれを含む液状製剤 - Google Patents
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Abstract
本発明はヒアルロニダーゼを含む安定な液状製剤およびヒアルロニダーゼの安定化剤に関するものであって、さらに具体的には前記ヒアルロニダーゼに安定化剤を添加して安定な液状製剤に関するものである。【選択図】 図８
Description
本発明はヒアルロニダーゼを含む安定な液状製剤およびヒアルロニダーゼの安定化剤に関するものであって、長時間液状で安定的に酵素活性を維持することができ、投与方法が簡単であるという長所があるので有用に使用することができる。
ヒアルロン酸を低分子化する酵素の総称であるヒアルロニダーゼは、デュランレノルズ（Ｄｕｒａｎ−Ｒｅｙｎａｌｓ）によって、最初は拡散因子として知らされたが、その後、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）に強力な活性を示すことが観察され、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ、ＨＡａｓｅ）と呼ばれるようになった。この酵素は、その作用機序によって、睾丸、リソソームおよび蜂の毒に分布するヒアルロネート４−グリカノヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）、ヒルに存在するヒアルロネート３−グリカノヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）と細菌に存在するヒアルロネートリアーゼ（ＥＣ４．２．２．１）に分類される。
特に、睾丸でのヒアルロニダーゼ（ＰＨ−２０）は精子の先体部分のグリコシルホスファチジルイノシトール固定部位（Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ、ＧＰＩ ａｎｃｈｏｒ）に付着されていて、卵子外部の厚い外壁層を分解して受精を起こす重要な酵素である。ＰＨ−２０の作用でヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）とコンドロイチン、コンドロイチンサルフェートに存在するＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのβ（１−４）結合を加水分解すると知られている。これら酵素の一般的な分子式はＣ２４５５Ｈ３７７５Ｎ６１７Ｏ７０４Ｓ２１であり、分子量（Ｍｏｌ．ｍａｓｓ）は５３８７０．９ｇ／ｍｏｌである。ヒトの場合、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、およびＰＨ−２０／ＳＰＡＭ１などを含む６個の遺伝子がこの酵素と関連している。
１９５０年代からヒアルロニダーゼの広範囲な使用に対して包括的に検討され、最初の使用は輸液剤の皮下注入であり、その他の整形外科、眼科、成形外科、歯科、口腔外科、婦人科および耳鼻咽喉科の手術で局所麻酔剤およびステロイドの拡散を増加させるために浸潤および遮断麻酔に使用、血腫のように体液が集まったものを分散、腹膜癒着の防止、結石生成防止および不妊の治療などに使用されている。
現在市販されているヒアルロニダーゼは、羊（ｏｖｉｎｅ）の睾丸から抽出した後、凍結乾燥して原料として使用している。このような加工されていないヒアルロニダーゼを適正濃度で溶かしてバイアルに充填して凍結乾燥する方法で製品化している。製品化されたヒアルロニダーゼには異物タンパク質が過量含まれているのが実情である。したがって、従来の方法で得られたヒアルロニダーゼは、溶液にした場合の安定性にも問題があるだけでなく、時間による安定性の低下によって生理活性が減少し、これによってその利用には実用的な観点から見た時に多くの問題を残していた。
本発明者らは、溶液にした場合、安定性にも問題があるだけでなく、時間による安定性の低下によって生理活性が減少し、これによってその利用には実用的な観点から見た時に多くの問題点を有する従来のヒアルロニダーゼの凍結乾燥製剤の代わりをする液状製剤を提供しようと思って本発明を発明するようになった。
本発明は、従来の安定性および不純物などの理由で凍結乾燥製剤の問題点、および既存原料を液状に製造時、時間による安定性の低下によって生理活性が減少する問題点を解消するための、ヒアルロニダーゼを含有する液状製剤に関する。
本発明の他の目的は、安定性の改善されたヒアルロニダーゼを含有する液状製剤を製造する方法に関する。
本発明の他の目的は、ヒアルロニダーゼの純度および安定性を増加させる精製方法を提供しようとする。
本発明の他の目的は、ヒアルロニダーゼを含有する製剤の安定化剤に関する。
本発明は高純度ヒアルロニダーゼを含有する液状製剤に関するものであって、さらに好ましくは、純度９５％以上であり、比活性度が７０，０００ＩＵ／ｍｇ以上であるヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を含む液状製剤である。
本発明の液状製剤は、（ａ）ｐＨ４．５乃至６．０を提供する約１乃至５０ｍＭの緩衝剤、（ｂ）０．００１乃至０．５％の非イオン性界面活性剤および（ｃ）０．１乃至５ｍＭキレート剤またはアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩化物を含む安定化剤を追加的に含むことができる。
また、本発明は、ヒアルロニダーゼ、好ましくは、高純度ヒアルロニダーゼを含有する製剤の安定性を向上させた安定化剤に関するものである。
前記ヒアルロニダーゼは、精製されていないヒアルロニダーゼ、または精製されたヒアルロニダーゼであり得る。本発明によるヒアルロニダーゼの安定化剤は、（ａ）ｐＨ４．０乃至６．０を提供する約１乃至５０ｍＭの緩衝剤、（ｂ）０．００１乃至０．５％の非イオン性界面活性剤、および（ｃ）０．１乃至５ｍＭのキレート剤またはアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩化物を含む。
また、本発明は、ヒアルロニダーゼを含有する原料をアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過法からなる群より選択された１種以上の方法で精製し純度および安定性が向上したヒアルロニダーゼを得た方法に関するものである。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、純度９５％以上であり、比活性度が７０，０００ＩＵ／ｍｇ以上であるヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を含む液状製剤に関するものである。
本発明によるヒアルロニダーゼは、通常、哺乳類動物由来、例えば、ヒト、牛、羊、豚などの睾丸に由来した酵素であり得る。通常市販されるヒアルロニダーゼは、哺乳類の睾丸を塩析処理を行って凍結乾燥するか、塩析処理後に発熱物質を除去し凍結乾燥した形態である。例えば、哺乳類睾丸で１回塩析処理後に凍結乾燥した原料、睾丸で２回塩析処理後に凍結乾燥した原料、睾丸で２回塩析処理し発熱物質を除去した後に凍結乾燥した原料などを精製工程に原料として使用することができる。従来のヒアルロニダーゼは、羊（ｏｖｉｎｅ）の睾丸で二回の塩析処理（ｓａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ）を行った後、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、発熱物質除去（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）および凍結乾燥の過程を経て抽出され、抽出されたものにはヒアルロニダーゼ以外に多量のタンパクが混合されている。
市販される凍結乾燥された粗原料（ｃｒｕｄｅ）状態のヒアルロニダーゼは、不純物を多量含んで純度が低く、液状製剤への製造時に安定性が低く、凍結乾燥製剤は使用時に液状に製造しなければならない面倒さがあるので、ヒアルロニダーゼの液状製剤、好ましくは高純度のヒアルロニダーゼを含む安定性に優れた液状製剤が切実に必要であるのが実情である。
本発明による液状製剤に含まれているヒアルロニダーゼは、酵素の粗原料をアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過法からなる群より選択された１種または２種以上の組み合わせられた方法で精製され、純度９５％以上であり比活性度が７０，０００ＩＵ／ｍｇ以上であるヒアルロニダーゼを含む。
本発明によって精製されたヒアルロニダーゼの活性測定は、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ “Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ”のＡｓｓａｙによって試験する。本明細書でヒアルロニダーゼの安定性は、前記Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ “Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ”のＡｓｓａｙによって測定されたヒアルロニダーゼの活性（含量または比活性度）が貯蔵前初期状態の活性基準（＝１００％）に少なくとも９０％以上、例えば、９０％乃至１１５％である時に安定であるのを維持することを意味する。前記安定性を評価するための基準としてヒアルロニダーゼの活性測定条件は、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ “Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ”のＡｓｓａｙ測定基準に、温度３７℃、ｐＨ６．４および時間２０分であるが、本明細書では温度３６．５℃乃至３７．５℃の範囲、ｐＨ６．３９乃至６．４１の範囲および貯蔵時間２０分内外で測定することができる。
本発明による精製工程を行って得られたヒアルロニダーゼは、高い生物学的酵素活性を有するタンパク質が収得されるように保障する。したがって、本発明は、ヒアルロニダーゼの生物学的活性が７０，０００ＩＵ／ｍｇ以上、好ましくは９０，０００ＩＵ／ｍｇ以上に示される比活性を有する高純度の酵素を提供する。
本発明によるヒアルロニダーゼを含む液状製剤は、前記Ａｓｓａｙ測定基準により安定性を確保するだけでなく、２乃至８℃の温度条件で０乃至２９週保管時にヒアルロニダーゼの含量が９０％以上維持して、長期間安定的に維持される。
また、本発明の高度に精製されたヒアルロニダーゼは、ラットを用いた抗原性試験としてアナフィラキシーショック反応試験および受動皮膚アナフィラキシー反応試験を行って安全性（ｓａｆｅｔｙ）が確認されたものである。
本発明による精製方法に使用される原料は、哺乳類の睾丸から分離された原料自体、前記原料を塩析処理して得られた産物、前記原料を塩析処理し発熱物質を除去した後に得られた産物であり得、また前記原料または産物の凍結建造物であり得る。例えば、哺乳類の睾丸で１回塩析処理後に凍結乾燥した原料、睾丸で２回塩析処理後に凍結乾燥した原料、睾丸で２回塩析処理し発熱物質を除去した後に凍結乾燥した原料などを精製工程に原料として使用することができる。
本発明による精製法の一例で、前記ヒアルロニダーゼは、順次に原料をブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製されたものであり得る。好ましくは、前記原料をブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過法を行って精製されたものであり得る。
前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、好ましく、Ｍｏｎｏ ＳまたはＳＰセファロースおよびＣＭセファロースを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーであり得、前記陰イオン交換クロマトグラフィーはＤＥＡＥセファロースまたはＱセファロースを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。
前記アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーは通常の方法で行うことができ、例えば、試料搭載（ｌｏａｄｉｎｇ）、平衡化（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）、洗浄、溶出および再生過程を含む。前記クロマトグラフィー法の各工程に使用可能な溶液としては平衡化溶液（基本溶液）と洗浄、溶出および再生溶液は前記平衡化溶液に成分を追加して製造して使用する。各工程に使用可能な平衡化溶液、洗浄、溶出および再生溶液の好ましい例を次の表に示す。
本発明による精製方法は、好ましくは、クロマトグラフィーを行った後にゲルろ過法を行うことができ、ゲルろ過法の例としてはセファクリル樹脂、スーパーデックスおよびスーパーロースを用いたゲルろ過法であり得る。本発明の一例で、ゲルろ過法は通常の方法で行うことができ、例えば、酢酸ナトリウム１乃至５０ｍＭ、アルカリ金属およびアルカリ土類金属０．１乃至５ｍＭ、非イオン性界面活性剤０．００１〜０．５％およびｐＨ４．５〜５．５の平衡化溶液で行うことができる。
本発明の一例により、前記ブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーは緩衝液として平衡化、洗浄、溶出、再生緩衝液を用いることができる。平衡化緩衝液としてグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）を用いることができ、好ましくは、１乃至５０ｍＭのグリシンを平衡化緩衝液として用いることができ、好ましいｐＨは８．０乃至１１．０である。洗浄緩衝液としてはイオン性界面活性剤（Ｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を用いることができ、好ましくは、０．１乃至０．５％の界面活性剤を用いることができ、最も好ましくは０．３％の界面活性剤を用いることができる。溶出緩衝液としては塩化ナトリウムを用いることができ、好ましくは３５乃至２００ｍＭの塩化ナトリウムを用いることができる。
本発明の一例により、前記陽イオン交換クロマトグラフィーでは緩衝液を用いることができ、緩衝液として平衡化、溶出、再生緩衝液を用いることができる。平衡化緩衝液としてリン酸ナトリウム、キレート剤および非イオン性界面活性剤を含む平衡化緩衝液を用いることができ、好ましくは、１乃至５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１乃至５ｍＭのキレート剤、０．００１乃至０．５％の非イオン性界面活性剤を含むことができ、好ましいｐＨは５．５乃至６．５である。溶出緩衝液としては塩化ナトリウムを用いることができ、最も好ましくは３５乃至２００ｍＭの塩化ナトリウムを用いることができる。
本発明の一例により、前記陰イオン交換クロマトグラフィーで、緩衝液として平衡化、搭載後平衡化、再生緩衝液を用いることができる。平衡化緩衝液としてリン酸カリウムを用いることができ、好ましくは１乃至５０ｍＭのリン酸カリウムを用いることができ、好ましいｐＨは６．５乃至７．５である。搭載後平衡化緩衝液として塩化ナトリウムを用いることができ、好ましくは５０乃至１００ｍＭの塩化ナトリウムを用いることができる。
本発明の一例により、前記ヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーで、緩衝液として平衡化、洗浄、溶出、再生緩衝液を用いることができる。平衡化緩衝液として酢酸ナトリウム、キレート剤および非イオン性界面活性剤を含む平衡化緩衝液を用いることができ、好ましくは１乃至５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１乃至５ｍＭキレート剤、０．００１乃至０．５％非イオン性界面活性剤を用いることができ、好ましいｐＨは４．０乃至５．５である。溶出緩衝液としては塩化ナトリウムを用いることができ、好ましくは２００乃至７００ｍＭ塩化ナトリウムを用いることができる。
それぞれの精製後に得られた原液の酵素の比活性度の範囲は次の表２に示す。
本発明による液状製剤は非経口投与経路で投与することができ、例えば、注射剤として非経口で投与することができる。
前記液状製剤にはヒアルロニダーゼ以外に賦形剤として塩化ナトリウムおよび乳糖などを追加的に含むことができ、これに限定されず、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤などを含むことができる。
また、本発明の他の実施形態はヒアルロニダーゼの安定化剤に関するものであって、さらに詳しくはｐＨ４．５乃至６．０を提供する約１乃至５０ｍＭの緩衝剤、０．００１乃至０．５％の非イオン性界面活性剤および０．１乃至５ｍＭキレート剤またはアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩化物を含む安定化剤である。
前記安定化剤が適用可能なヒアルロニダーゼは、精製されていないヒアルロニダーゼ、または精製されたヒアルロニダーゼであり得、好ましくは精製されたヒアルロニダーゼイである。
前記ヒアルロニダーゼは、通常哺乳類動物由来、例えば、ヒト、牛、羊、豚などの睾丸に由来した酵素であるか、哺乳類由来ヒアルロニダーゼを微生物または動物細胞または植物細胞に導入して発現された組み換えヒアルロニダーゼであり得る。組み換えヒアルロニダーゼの生産方法は、通常の哺乳類遺伝子の組み換え方法によって微生物または動物細胞または植物細胞で生産する方法と同一であり、例示的な方法はＦｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， ＢＢＲＣ， ２３６， １０−１５；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， １００７１−１００７５；Ｒｅｉｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ５７， ２２６−２３３；Ｋｏｒｄｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｐａｔｅｎｔ， ＷＯ２０００／０７７２２１などに記述されている。
前記ヒアルロニダーゼは、哺乳類の睾丸を１回塩析処理後に凍結乾燥した酵素、睾丸で２回塩析処理後に凍結乾燥した酵素、睾丸で２回塩析処理し発熱物質を除去した後に凍結乾燥した酵素などを含む。前記ヒアルロニダーゼを追加的にアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過法からなる群より選択された１種または２種以上の組み合わせられた方法で精製された酵素であり得、好ましくは前記精製方法で精製されて純度９５％以上であり比活性度が７０，０００ＩＵ／ｍｇ以上であるヒアルロニダーゼであり得る。精製方法については前述の通りである。
本発明による液状製剤の安定化は、ｐＨ条件が主要な因子の一つであり、これは使用される緩衝剤に関係なく、ｐＨは約４．０乃至約７、０、好ましくは約４．５乃至約６．０を含む値、例えば、４．５、４．７、５．０、５．５、５．７、および６．０からなる群より選択された値に調節される。前記ｐＨは、当該分野に公知された酸または塩基を用いた調整によって、または緩衝剤成分の適切な混合物使用によって、または二つともによって収得することができる。
本発明による適した薬学的に許容される緩衝液は、サクシネート緩衝液、アセテート緩衝液、ホスフェート緩衝液、シトレート緩衝液、マロン酸塩緩衝液、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液およびグリシン緩衝液からなる群より選択された１種以上を組み合わせた緩衝剤を含むが、これに限定されない。緩衝剤の好ましい濃度は使用対象溶液の目的するｐＨ条件と使用する緩衝剤の種類を考慮して適切に設定することができ、例えば、１乃至５０ｍＭ、好ましくは１０乃至３０ｍＭである。
前記安定化剤の非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ツイーン、Ｔｗｅｅｎ）であり得る。例えば、ポリソルベート２０（ツイーン２０）、ポリソルベート８０（ツイーン８０）およびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００などからなる群より選択されたものであり得る。
前記キレート剤は、単一金属イオンに対して配位結合を形成することができる２つ以上の電子供与原子を含む分子を意味するものであって、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であり得る。前記キレート剤の濃度は０．１ｍＭ乃至５ｍＭ濃度、好ましくは０．５ｍＭ乃至１ｍＭであり得る。
前記アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩化物は、ＭｇＣｌ２であり得る。前記ＭｇＣｌ２は０．１ｍＭ乃至５ｍＭ濃度、好ましくは０．５ｍＭ乃至５ｍＭであり得る。
前記安定化剤の実施形態としては、ＭｇＣｌ２、非イオン性界面活性剤、ｐＨ４．０乃至６．０を提供する緩衝剤を含むか、ＥＤＴＡ、非イオン性界面活性剤、ｐＨ４．０乃至６．０を提供する緩衝剤を含むことができる。
前記１次精製のアフィニティークロマトグラフィーでは緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）を使用することができ、緩衝液として平衡化、洗浄、溶出、再生緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液としてグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）を使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭのグリシンを平衡化緩衝液として使用することができ、好ましいｐＨは８．０乃至１１．０である。洗浄緩衝液としてはイオン性界面活性剤を使用することができ、好ましくは０．１乃至０．５％の界面活性剤を使用することができ、最も好ましくは０．３％の界面活性剤を使用することができる。溶出緩衝液としては塩化ナトリウムを使用することができ、好ましくは３５乃至２００ｍＭの塩化ナトリウムを使用することができる。
前記２次精製の陽イオン交換クロマトグラフィーでは緩衝液を使用することができ、緩衝液として平衡化、溶出、再生緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液としてリン酸ナトリウム、ＥＤＴＡおよびツイーン８０を含む平衡化緩衝液を使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１乃至５ｍＭのＥＤＴＡ、０．００１乃至０．５％のツイーン８０を含むことができ、好ましいｐＨは５．５乃至６．５である。溶出緩衝液としては塩化ナトリウムを使用することができ、最も好ましくは３５乃至２００ｍＭの塩化ナトリウムを使用することができる。
前記３次精製の陰イオン交換クロマトグラフィーでは緩衝液を使用することができ、緩衝液として平衡化、搭載後平衡化、再生緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液としてリン酸カリウムを使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭのリン酸カリウムを使用することができ、好ましいｐＨは６．５乃至７．５である。搭載後平衡化緩衝液として塩化ナトリウムを使用することができ、好ましくは５０乃至１００ｍＭの塩化ナトリウムを使用することができる。
前記４次精製のアフィニティークロマトグラフィーでは緩衝液を使用することができ、緩衝液として平衡化、洗浄、溶出、再生緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液として酢酸ナトリウム、ＥＤＴＡおよびツイーン８０を含む平衡化緩衝液を使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１乃至５ｍＭのＥＤＴＡ、０．００１乃至０．５％のツイーン８０を使用することができ、好ましいｐＨは４．０乃至５．５である。溶出緩衝液としては塩化ナトリウムを使用することができ、好ましくは２００乃至７００ｍＭの塩化ナトリウムを使用することができる。
前記５次精製のゲルろ過法では緩衝液を使用することができ、緩衝液としては平衡化緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液として酢酸ナトリウム、ＭｇＣｌ２およびツイーン８０を含む平衡化緩衝液を使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１乃至５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００１乃至０．５％のツイーン８０を使用することができ、好ましいｐＨは４．５乃至５．５である。前記液状製剤は任意の形態の水溶液および任意の種類の懸濁液を意味し、皮下投与経路で投与されることを特徴とする。
本発明の一実施形態による液状製剤は、２乃至８℃温度条件で２９週まで保管してもヒアルロニダーゼの含量が９０％以上維持し、長時間安定的に活性を維持することができる長所があるため、時間による安定性の低下によって生理活性が減少する従来の問題点を解決することができる。
本発明の一実施形態で、ヒアルロニダーゼの精製方法は、羊（ｏｖｉｎｅ）の睾丸から抽出した後に凍結乾燥されたヒアルロニダーゼ原料を用意する段階；前記原料をブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて１次精製する段階；前記１次精製後に陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて２次精製する段階；前記２次精製後に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて３次精製する段階；前記３次精製後にアフィニティークロマトグラフィーを用いて４次精製する段階；および前記４次精製後にゲルろ過法で５次精製する段階を含むヒアルロニダーゼの精製方法に関するものであって、各段階の具体的な緩衝液の種類および好ましい範囲については前記液状製剤で説明した通りである。
本発明による液状製剤は非経口投与経路で投与でき、例えば、注射剤として非経口で投与することができる。
前記液状製剤にはヒアルロニダーゼ以外に賦形剤として塩化ナトリウムおよび乳糖などを追加的に含むことができ、これに限定されず、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤などを含むことができる。
また、本発明の他の実施形態はヒアルロニダーゼの安定化剤に関するものであって、さらに詳しくは、ｐＨ４．５乃至６．０を提供する約１乃至５０ｍＭの緩衝剤、０．００１乃至０．５％の非イオン性界面活性剤、および０．１乃至５ｍＭのキレート剤またはアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩化物を含む安定化剤である。
前記安定化剤が適用可能なヒアルロニダーゼは、精製されていないヒアルロニダーゼ、または精製されたヒアルロニダーゼであり得、好ましくは精製されたヒアルロニダーゼイである。
前記ヒアルロニダーゼは、通常哺乳類動物由来、例えば、ヒト、牛、羊、豚などの睾丸に由来した酵素であるか、哺乳類由来ヒアルロニダーゼを微生物または動物細胞または植物細胞に導入して発現された組み換えヒアルロニダーゼであり得る。組み換えヒアルロニダーゼの生産方法は、通常の哺乳類遺伝子の組み換え方法により微生物または動物細胞または植物細胞で生産する方法と同一であり、例示的な方法は、Ｆｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， ＢＢＲＣ， ２３６， １０−１５；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， １００７１−１００７５；Ｒｅｉｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ５７， ２２６−２３３；Ｋｏｒｄｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｐａｔｅｎｔ， ＷＯ２０００／０７７２２１などに記述されている。
前記ヒアルロニダーゼは、哺乳類の睾丸を１回塩析処理後に凍結乾燥した酵素、睾丸で２回塩析処理後に凍結乾燥した酵素、睾丸で２回塩析処理し発熱物質を除去した後に凍結乾燥した酵素などを含む。前記ヒアルロニダーゼを追加的にアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過法からなる群より選択された１種または２種以上の組み合わせられた方法で精製された酵素であり得、好ましくは前記精製方法で精製されて純度９５％以上であり、比活性度が７０，０００ＩＵ／ｍｇ以上であるヒアルロニダーゼであり得る。精製方法については前述の通りである。
本発明による液状製剤の安定化は、ｐＨ条件が主要な因子の一つであり、これは使用される緩衝剤に関係なく、ｐＨは約４．０乃至約７．０、好ましくは約４．５乃至約６．０を含む値、例えば、４．５、４．７、５．０、５．５、５．７、および６．０からなる群より選択された値に調節される。前記ｐＨは当該分野に公知された酸または塩基を用いた調整によって、または緩衝剤成分の適切な混合物使用によって、または二つともによって収得することができる。
本発明による適した薬学的に許容される緩衝液は、サクシネート緩衝液、アセテート緩衝液、ホスフェート緩衝液、シトレート緩衝液、マロン酸塩緩衝液、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液およびグリシン緩衝液からなる群より選択された１種以上を組み合わせた緩衝剤を含むが、これに限定されない。緩衝剤の好ましい濃度は、使用対象溶液の目的するｐＨ条件と使用する緩衝剤の種類を考慮して適切に設定することができ、例えば、１乃至５０ｍＭ、好ましくは１０乃至３０ｍＭである。
前記安定化剤の非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ツイーン、Ｔｗｅｅｎ）であり得る。例えば、ポリソルベート２０（ツイーン２０）、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、およびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００などからなる群より選択されたものであり得る。
前記キレート剤は、単一金属イオンに対して配位結合を形成することができる２つ以上の電子供与原子を含む分子を意味するものであって、好ましくは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であり得る。前記キレート剤の濃度は０．１ｍＭ乃至５ｍＭ濃度、好ましくは０．５ｍＭ乃至１ｍＭであり得る。
前記アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩化物はＭｇＣｌ２であり得る。前記ＭｇＣｌ２は０．１ｍＭ乃至５ｍＭ濃度、好ましくは０．５ｍＭ乃至５ｍＭであり得る。
前記安定化剤の実施形態は、ＭｇＣｌ２、非イオン性界面活性剤、ｐＨ４．０乃至６．０を提供する緩衝剤を含むか、ＥＤＴＡ、非イオン性界面活性剤、ｐＨ４．０乃至６．０を提供する緩衝剤を含むことができる。
前記１次精製のアフィニティークロマトグラフィーでは緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）を使用することができ、緩衝液として平衡化、洗浄、溶出、再生緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液としてグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）を使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭのグリシンを平衡化緩衝液として使用することができ、好ましいｐＨは８．０乃至１１．０である。洗浄緩衝液としてはイオン性界面活性剤を使用することができ、好ましくは０．１乃至０．５％の界面活性剤を使用することができ、最も好ましくは０．３％の界面活性剤を使用することができる。溶出緩衝液としては塩化ナトリウムを使用することができ、好ましくは３５乃至２００ｍＭの塩化ナトリウムを使用することができる。
前記２次精製の陽イオン交換クロマトグラフィーでは緩衝液を使用することができ、緩衝液として平衡化、溶出、再生緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液としてリン酸ナトリウム、ＥＤＴＡおよびツイーン８０を含む平衡化緩衝液を使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１乃至５ｍＭのＥＤＴＡ、０．００１乃至０．５％のツイーン８０を含むことができ、好ましいｐＨは５．５乃至６．５である。溶出緩衝液としては塩化ナトリウムを使用することができ、最も好ましくは３５乃至２００ｍＭの塩化ナトリウムを使用することができる。
前記３次精製の陰イオン交換クロマトグラフィーでは緩衝液を使用することができ、緩衝液として平衡化、搭載後平衡化、再生緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液としてリン酸カリウムを使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭのリン酸カリウムを使用することができ、好ましいｐＨは６．５乃至７．５である。搭載後平衡化緩衝液として塩化ナトリウムを使用することができ、好ましくは５０乃至１００ｍＭの塩化ナトリウムを使用することができる。
前記４次精製のアフィニティークロマトグラフィーでは緩衝液を使用することができ、緩衝液として平衡化、洗浄、溶出、再生緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液として酢酸ナトリウム、ＥＤＴＡおよびツイーン８０を含む平衡化緩衝液を使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１乃至５ｍＭのＥＤＴＡ、０．００１乃至０．５％のツイーン８０を使用することができ、好ましいｐＨは４．０乃至５．５である。溶出緩衝液としては塩化ナトリウムを使用することができ、好ましくは２００乃至７００ｍＭの塩化ナトリウムを使用することができる。
前記５次精製のゲルろ過法では緩衝液を使用することができ、緩衝液としては平衡化緩衝液を使用することができる。平衡化緩衝液として酢酸ナトリウム、ＭｇＣｌ２およびツイーン８０を含む平衡化緩衝液を使用することができ、好ましくは１乃至５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１乃至５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００１乃至０．５％のツイーン８０を使用することができ、好ましいｐＨは４．５乃至５．５である。前記液状製剤は任意の形態の水溶液および任意の種類の懸濁液を意味し、皮下投与経路で投与されることを特徴とする。
本発明の一実施形態による液状製剤は、２乃至８℃温度条件で２９週まで保管してもヒアルロニダーゼの含量を９０％以上維持して、長時間安定的に活性を維持することができる長所があるため、時間による安定性の低下によって生理活性が減少する従来の問題点を解決することができる。
本発明の一実施形態で、ヒアルロニダーゼの精製方法は、羊（ｏｖｉｎｅ）の睾丸から抽出した後に凍結乾燥されたヒアルロニダーゼ原料を用意する段階；前記原料をブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて１次精製する段階；前記１次精製後に陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて２次精製する段階；前記２次精製後に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて３次精製する段階；前記３次精製後にアフィニティークロマトグラフィーを用いて４次精製する段階；および前記４次精製後にゲルろ過法で５次精製する段階を含むヒアルロニダーゼの精製方法に関するものであって、各段階の具体的な緩衝液の種類および好ましい範囲については前記液状製剤で説明した通りである。
本発明による高度精製ヒアルロニダーゼの高度精製方法によれば、既存の製品化されたヒアルロニダーゼの純度を高めることができるという効果が得られる。
また、本発明による高度精製ヒアルロニダーゼ注射剤によれば、既存の製品化されたヒアルロニダーゼが持っていた問題点である異物タンパク質を除去することによって安全性を確保することができるという効果も得られる。
また、前記精製されたヒアルロニダーゼに安定化剤を追加的に含む液状製剤は、長時間間安定的に活性を維持することができ、投与方法が簡単であるという長所がある。
以下、本発明を次の実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらは本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるわけではない。
＜実施例１＞ブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー（１次精製法）
本実験でヒアルロニダーゼ精製に用いた原料は下記表３に示されているように、１）前記従来の過程中、睾丸で１次塩析処理後に凍結乾燥した原料（１次塩析処理原料）、２）２次塩析処理後に凍結乾燥した原料（２次塩析処理原料）、３）発熱物質を除去した後に凍結乾燥した原料（原料名：Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（以下、Ｈｄａｓｅ）、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉａｍｉｍ社）であり、以後５段階の精製過程に投入した。
クロマトグラフィー工程は、試料搭載（ｌｏａｄｉｎｇ）、平衡化（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）、洗浄、溶出および再生過程からなる。１次精製はアフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いており、用いた緩衝液は下記表４の通りである。
ヒアルロニダーゼを１次精製するために、レジン（ｒｅｓｉｎ）としてブルーセファロース６ファストフロー（Ｂｌｕｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）を使用し、カラムとして内径１．６ｃｍにレジンを高さ１０ｃｍになるように充填して使用した。ヒアルロニダーゼ原料１ｇを平衡化緩衝液５００ｍＬ（１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１０．０）に溶解（２ｍｇ／ｍＬ）しろ過した後のフィルター濾液を分析試料として使用した。
前記ヒアルロニダーゼ試料をカラムに搭載し、この時、搭載流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎで適用した。その後に、平衡化緩衝液で前記カラムを平衡化させ、洗浄緩衝液（０．３％ Ｓｏｄｉｕｍ ｃａｐｒｙｌａｔｅ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄した。平衡化以後の段階は３．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で分析した。前記洗浄後に、平衡化緩衝液でレジンを再び平衡化させ、溶出緩衝液（１３５ｍＭ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）で溶出して流れ出る溶液を収集した。塩基性条件でヒアルロニダーゼの活性を失いやすいので、収集した溶液にｐＨ調節剤を添加してｐＨ６．０乃至７．０に調節し、溶出が完了すると、再生緩衝液（１Ｍ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）でカラムを再生させた。分析結果は図１に示された通りである。精製後に得られる収率および比活性度は下記表８に示した。
＜実施例２＞モノＳを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー（２次精製法）
２次精製としては陽イオン交換クロマトグラフィーを用いており、下記表５の緩衝液を使用して試料搭載、平衡化、洗浄、溶出および再生過程を行った。
ヒアルロニダーゼを２次精製するために、レジン（ｒｅｓｉｎ）としてモノＳ（Ｍｏｎｏ Ｓ）を使用しており、カラムとして内径１．６ｃｍにレジンを高さ１０ｃｍになるように充填して使用した。実施例１で１次精製した試料を平衡化緩衝液（１０ｍＭの第二リン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｂａｓｉｃ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．０）で３倍希釈して分析試料として使用した。
前記ヒアルロニダーゼ試料をカラムに搭載し、この時、ローディング流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎで適用した。その後に、平衡化緩衝液で前記カラムを平衡化させ、平衡化以後段階は３．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で分析した。前記平衡化後に、洗浄緩衝液（８０ｍＭ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄した。レジンを洗浄した後に溶出緩衝液（１２５ｍＭ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）で溶出して流れ出る溶液を収集した。溶出が完了すると、再生緩衝液（１Ｍ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）でカラムを再生させた。分析結果は図２に示された通りである。精製後に得られる収率および比活性度は下記表８に示した。
＜実施例３＞ＤＥＡＥセファロースを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（３次精製法）
３次精製としては陰イオン交換クロマトグラフィーを用いており、下記表６の緩衝液を使用して試料搭載、平衡化および再生過程を行った。
ヒアルロニダーゼを３次精製するために、レジン（ｒｅｓｉｎ）としてＤＥＡＥセファロース（ＤＥＡ Ｅｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使用しており、カラムとして内径１．６ｃｍにレジンを高さ５ｃｍになるように充填して使用した。実施例２で２次精製した試料を平衡化緩衝液（５ｍＭの第二リン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｂａｓｉｃ）、ｐＨ７．１）で１．６７倍希釈して分析試料として使用した。
前記ヒアルロニダーゼ試料をカラムに搭載し、この時、ローディング流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎで適用した。その後に、搭載後平衡化緩衝液（７５ｍＭ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを平衡化させ、平衡化以後段階は３．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で分析した。前記平衡化後に別途の溶出段階なく再生緩衝液（１Ｍ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）で再生した。３次精製では別途の溶出段階なく搭載中に樹脂に結合されず流れ出る溶液（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ（Ｆ／Ｔ）溶液）を精製されたヒアルロニダーゼ溶出液と見なした。分析結果は図３に示された通りである。精製後に得られる収率および比活性度は下記表８に示した。
＜実施例４＞ヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー（４次精製法）
４次精製としてはアフィニティークロマトグラフィーを用いており、下記表７の緩衝液を使用して試料搭載、平衡化、洗浄、溶出および再生過程を行った。
前記３次陰イオン交換クロマトグラフィーで精製されたヒアルロニダーゼを４次精製するために、レジン（ｒｅｓｉｎ）としてヘパリンセファロース６ファストフロー（Ｈｅｐａｒｉｎ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）を使用しており、カラムとして内径１．０ｃｍにレジンを高さ１０ｃｍになるように充填して使用した。実施例３で３次精製した試料に１０ｘ ｃｏｎｃ．平衡化緩衝液（２００ｍＭの酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１．０％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ４．５）を３次精製した試料体積の１／９だけ添加して分析試料として使用した。
前記ヒアルロニダーゼ試料をカラムに搭載し、この時、ローディング流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎで適用した。その後に、平衡化緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ４．５）で前記カラムを平衡化させ、洗浄緩衝液（２００ｍＭ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄した。平衡化以後段階は１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で分析した。前記洗浄後に溶出緩衝液（５００ｍＭ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）で溶出して流れ出る溶液を収集した。溶出が完了すると、再生緩衝液（１Ｍ ｓａｌｔ ｉｎ ｂａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）でカラムを再生させた。本実験による精製チャートを図４に示した。
精製後に得られる収率および比活性度は下記表８に示した。
精製後に得られる収率および比活性度は下記表８に示した。
＜実施例５＞セファクリル樹脂を用いたゲルろ過法（５次精製法）
５次精製としてはゲルろ過法を用いており、使用した平衡化溶液は１０ｍＭの酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ５．０を含む溶液である。
前記４次精製されたヒアルロニダーゼをゲルろ過法で５次精製するために、レジンとしてセファクリルＳ−２００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００）を使用し、カラムとして内径１．６ｃｍにレジンを高さ９０ｃｍになるように充填して使用した。実施例４で４次精製した試料溶液を樹脂体積の１％程度に濃縮して分析試料として使用した。
前記ヒアルロニダーゼ試料をカラムに搭載し、この時、ローディング流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎで適用した。その後に、平衡化緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ５．０）を流しながら分級処理を行った。０．１ｍＬ／ｍｉｎの流速で分析し、溶出して流れ出る溶液を収集した。精製後に得られる収率および比活性度は下記表８に示した。
前記三つの異なるヒアルロニダーゼ試料に対する５次精製後の純度試験結果を図５乃至７および表８に示した。下記表８において、タンパク収率はヒアルロニダーゼを含む全てのタンパク質の精製収率である。図５乃至７に示したように、５次精製後、ＧＰＣ資料によればヒアルロニダーゼ以外に他の二量体または重合体はクロマトグラムに示されなく、比活性度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＩＵ／ｍｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ）は９０，０００ＩＵ／ｍｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、純度（ＧＰＣ）は９５％以上であった。
図５乃至７および表８に示されているように、出発物質が互いに異なる原料（１次塩析処理原料、２次塩析処理原料、Ｈｄａｓｅ）を前記５段階の精製方法で行っても５次精製完了後に得られた最終原液の比活性度は９０，０００ＩＵ／ｍｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、純度は９５％以上の結果を得ることができるのを確認した。これはいかなる段階のヒアルロニダーゼ原料を使用しても前記５段階の精製方法で前記結果を得ることができるのを意味し、最終原液にはヒアルロニダーゼ以外に二量体または多量体が殆どないのを意味する。
＜実施例６＞安定性試験（安定化剤未添加）
６−１：１次精製後溶出原液の安定性試験
前記実施例１により、１次塩析処理原料、２次塩析処理原料、およびＨｄａｓｅに対するアフィニティークロマトグラフィーで１次精製した後に得られたそれぞれの溶出原液をｐＨ６．０乃至７．０に調整した後、一定量に分注して４℃で保管し各時点でヒアルロニダーゼの含量を確認してその結果を下記表９に示した。
各時点でヒアルロニダーゼの酵素活性（または含量）は、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ “Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ”のＡｓｓａｙにより試験する。本明細書でヒアルロニダーゼの安定性は前記Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ “Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ”のＡｓｓａｙにより測定されたヒアルロニダーゼの活性（含量または比活性度）である。
各試験条件で酵素活性（または含量）は表８に記載された０週目の比活性度または活性度を１００で基準にして、各時点で測定された比活性度または活性度を対比して示したパーセント数値であり、これを下記表９に示した。
上記表９に示したように、比活性度が異なる３つの原料を１次精製した後に得られた溶出原液に対して４℃での含量安定性を確認した結果、三つの原料とも２９週まで含量の減少が殆どないのを確認した。１次精製後に得られた溶出液には他の安定化剤なくｐＨのみ６．０乃至７．０に下げた状態である。また、前記表９で、含量が１００％を超す数値は標準品と比較する酵素活性測定方法のような生理活性測定方法は生物学的製剤（ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）、組み換えタンパク（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）など）、トキソイド（ｔｏｘｏｉｄ）、など）の力価試験のように試験結果の変化幅が大きくて発生する測定上誤差と思われる。
６−２：１次精製後溶出原液を希釈して得られた低濃度溶液の安定性試験
Ｈｄａｓｅ原料を実施例１により１次精製後に得られた溶出原液を約１，５００ＩＵ／ｍＬ（＝１００％）になるように希釈して分注し、４℃で保管して下記表１０のように各時点で含量を確認した。１，５００ＩＵ／ｍＬの濃度はヒアルロニダーゼを原料にした製品の濃度と同一である。
各試験の含量は０週目のため酵素活性を１００％にしその基準に対比して示した各保管時間の特定時点の酵素活性をパーセントで示して下記表１０に示した。酵素比活性度は下記数式によって計算された。
上記表１０に示したように、１次精製後に得られた溶出原液に対して１，５００ＩＵ／ｍＬの濃度でも２９週間含量の減少がないのを確認した。
したがって、原料の含量に関係なく三つの原料の１次精製後原液は４℃で２９週間安定しているのを確認し、低濃度（１５００ＩＵ／ｍＬ）でも４℃で２９週間安定しているのを確認した。
６−３：２次精製法および４次精製法で一段階精製後に得られた溶出原液の安定性試験
Ｈｄａｓｅ原料でのそれぞれ２次精製法および４次精製法の一段階精製法のみ行った後に各原液に対する安定性を試験した。２次精製法および４次精製法はそれぞれ実質的に実施例２および実施例４により遂行し、Ｈｄａｓｅは実施例１で記載した１次精製前の試料である。得られた溶出原液の保管温度をそれぞれ４℃、２５℃、３７℃と設定し、各時点でヒアルロニダーゼの含量を測定して下記表１１のように各時点で酵素含量（酵素活性比）を確認した。
また、長期間保管した場合のヒアルロニダーゼの含量変化を追加的に試験するために、前記２次精製法を遂行して得られた原液を４℃で２９週間保管し、各時点でヒアルロニダーゼの含量を確認し、その結果を下記表１２に示した。
上記表１１および表１２に示されているように、１次精製した後の原液以外にも２次精製法で一段階精製した原液でも４℃で２９週間安定しているのを確認した。
＜実施例７＞安定化剤条件実験
安定化剤条件試験に使用した原液はＨｄａｓｅ原料に対して実施例５の５次精製後の産物である９５％以上の純度を有するヒアルロニダーゼを１，５００ＩＵ／ｍＬ（＝１００％）の濃度に合わせてそれぞれの表に記載された条件によって溶液を製造した。
７−１：安定化成分確認
９５％以上の純度を有するヒアルロニダーゼを１，５００ＩＵ／ｍＬ（＝１００％）の濃度に合わせて下記表１３に記載された条件によって溶液を製造し、これを４℃で保管して各時点のヒアルロニダーゼ含量を確認し、下記表１３のように含量減少を示した。
同一なヒアルロニダーゼを１，５００ＩＵ／ｍＬ（＝１００％）に合わせて下記表１４の条件により溶液を調製し、これを４℃に保管して各時点でヒアルロニダーゼ含量を確認し、表１５の結果を得た。
上記結果から、ヒアルロニダーゼの安定化成分としてはＥＤＴＡまたはＭｇＣｌ２＋Ｔｗｅｅｎ８０＋ｐＨ４．５乃至６．０の組み合わせられた条件であるのを確認した。
７−２：安定化剤濃度条件試験
安定性試験に使用されたヒアルロニダーゼは９５％以上精製されたものであり、実験濃度は１，５００ＩＵ／ｍＬ（＝１００％）になるようにし、下記表１６条件で調製して安定性試験を行った。ＥＤＴＡ、ＭｇＣｌ２、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度を２倍および１０倍希釈して４℃、２５℃の保管条件で安定性試験を行った。
実験結果を下記表１７に示した。
上記表で示したように、条件１および条件３で約２６週間ヒアルロニダーゼの安定性を確認し、その他の条件では減少する傾向を示した。
＜実施例８＞
８−１：安定化剤のＨｄａｓｅ試料に対する試験
実施例１に記載された、１次精製も行われていない未精製Ｈｄａｓｅ試料に対して、ＥＤＴＡまたはＭｇＣｌ２＋Ｔｗｅｅｎ８０＋ｐＨ５．０に対する安定性を実験した。既存のヒアルロニダーゼ製品に使用される原料（ヒアルロニダーゼ、含量約８００〜１１００ＩＵ／ｍｇ）を下記表１８のそれぞれの緩衝液または注射用水（Ｗａｔｅｒ Ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＷＦＩ）に１，５００ＩＵ／ｍＬ（＝１００％）になるように溶かした後、４℃、２５℃、３７℃の保管条件で安定性試験を行った。
実験結果は下記の表１９に示した。
上記表１９に示されているように、ＷＦＩに溶解された原料が他の緩衝液（ＥＤＴＡまたはＭｇＣｌ２＋Ｔｗｅｅｎ８０＋ｐＨ５．０）に溶解された原料より含量が急激に減少することを確認し、これはＥＤＴＡまたはＭｇＣｌ２＋Ｔｗｅｅｎ８０＋ｐＨ５．０の組成がヒアルロニダーゼ安定性に寄与するのを確認することができた（４℃）。
８−２：安定化剤の実施例２乃至５による精製原液に対する試験
実施例２乃至５により順次に行った各段階で得られた各原液をそれぞれの精製段階の平衡化緩衝液を用いて１，５００ＩＵ／ｍＬ（＝１００％）に希釈して４℃、３７℃の保管条件で安定性試験を行い、その結果を下記表２０に示した。
表２０に示されているように、観察期間の間にヒアルロニダーゼの含量は減少しなかった。
８−３：実施例２乃至５により精製後に得られた原液を透析してＥＤＴＡ／ＭｇＣｌ
２
を除去した後に得られた試料に対する安定化試験
精製段階でＥＤＴＡまたはＭｇＣｌ２が使用された場合、これを再び除去した後に、前記成分の安定化効果有無を確認するために、実施例２乃至５により精製後にそれぞれ得られた原液を１，５００ＩＵ／ｍＬ（＝１００％）に希釈し、下記表２１のＥＤＴＡ／ＭｇＣｌ２が除去されたバッファーを用いて透析後、４℃、３７℃の保管条件で安定性試験を行い、その結果を下記表２２に示し、４℃および３７℃で全て含量が減少することを確認した。
高度精製ヒアルロニダーゼに対してラットに対するアナフィラキシーショック反応および受動皮膚アナフィラキシー反応試験で問題点が発生しないので、安定性が確保された。したがって、高度精製ヒアルロニダーゼは現在市販されている注射剤より純度が高く安全性に優れている注射剤として価値がある。
Claims (25)
- 純度９５％以上であり、比活性度が７０，０００ＩＵ／ｍｇ以上であるヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を含む、液状製剤。
- 前記液状製剤は、注射剤である請求項１に記載の液状製剤。
- 前記液状製剤は、２乃至８℃温度条件でヒアルロニダーゼの活性が最初酵素活性１００基準対比９０％以上維持する安定性を有する請求項１に記載の液状製剤。
- 前記液状製剤は、ｐＨ４．０乃至６．０を提供する緩衝剤；０．００１乃至０．５v/v％の非イオン性界面活性剤；および０．１乃至５ｍＭのキレート剤またはＭｇＣｌ２を含有する安定化剤を追加的に含む請求項１に記載の液状製剤。
- 前記キレート剤は、ＥＤＴＡである請求項４に記載の液状製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ソルビタン脂肪酸エステルである請求項４に記載の液状製剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００などからなる群より選択されたものである請求項６に記載の液状製剤。
- 前記緩衝剤は、サクシネート緩衝液、アセテート緩衝液、ホスフェート緩衝液、シトレート緩衝液、マロン酸塩緩衝液、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液およびグリシン緩衝液である請求項４に記載の液状製剤。
- 前記ヒアルロニダーゼは、羊、牛、豚またはヒト由来である請求項１に記載の液状製剤。
- 前記ヒアルロニダーゼは、哺乳類ヒアルロニダーゼ遺伝子を微生物または動物細胞または植物細胞に導入して生産される組み換えヒアルロニダーゼである請求項１に記載の液状製剤。
- 前記ヒアルロニダーゼは、ヒアルロニダーゼ−含有原料を、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過法からなる群より選択された１種以上の方法で精製されたものである請求項１に記載の液状製剤。
- 前記アフィニティークロマトグラフィーは、ブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、またはヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーである請求項１１に記載の液状製剤。
- 前記ヒアルロニダーゼは、順次にブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製されたものである請求項１２に記載の液状製剤。
- 前記ヒアルロニダーゼは、順次にブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過法で精製されたものである請求項１３に記載の液状製剤。
- ｐＨ４．０乃至６．０を提供する緩衝剤；０．００１乃至０．５v/v％の非イオン性界面活性剤；および０．１乃至５ｍＭのキレート剤またはＭｇＣｌ２を含む、ヒアルロニダーゼの安定化剤。
- 前記キレート剤はＥＤＴＡである請求項１５に記載の安定化剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ソルビタン脂肪酸エステルである請求項１５に記載の安定化剤。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００などからなる群より選択されたものである、請求項１７に記載の安定化剤。
- 前記緩衝剤は、サクシネート緩衝液、アセテート緩衝液、ホスフェート緩衝液、シトレート緩衝液、マロン酸塩緩衝液、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液およびグリシン緩衝液である請求項１５に記載の安定化剤。
- 前記ヒアルロニダーゼは、未精製酵素または精製された酵素である請求項１５に記載の安定化剤。
- 前記精製された酵素は、ヒアルロニダーゼ−含有原料を、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過法からなる群より選択された１種以上の方法で精製されたものである請求項２０に記載の安定化剤。
- 前記アフィニティークロマトグラフィーは、ブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、またはヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーである請求項２１に記載の安定化剤。
- 前記ヒアルロニダーゼは、順次にブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過法で精製されたものである請求項２２に記載の安定化剤。
- 前記ヒアルロニダーゼは、羊、牛、豚またはヒト由来のものである請求項１５に記載の安定化剤。
- 前記ヒアルロニダーゼは、哺乳類ヒアルロニダーゼ遺伝子を微生物または動物細胞または植物細胞に導入して生産される組み換えヒアルロニダーゼである請求項１５に記載の安定化剤。
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