JP2003535574A - 可逆的に不活性な酸性化プラスミン組成物の調製法 - Google Patents

可逆的に不活性な酸性化プラスミン組成物の調製法

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Abstract

(57)【要約】 プラスミノーゲンを活性化することにより可逆的に不活性な酸性化プラスミンを調製する方法、および精製されたプラスミノーゲンの調製法の両方を開示する。調製されたプラスミンは単離され、そして低いｐＨ−緩衝能剤を用いて保存されて実質的に安定な配合物を提供する。精製されたプラスミノーゲンは典型的には画分IIおよびIIIのクロマトグラフィープロセスからの免疫グロブリンの分離で得られた画分から精製され、低ｐＨで溶出する。可逆的に不活性な酸性化プラスミンは、血栓崩壊療法の投与に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、1999年11月13日に出願された米国特許出願第09/435,331号の一部継
続出願である。
【０００２】 発明の分野 本発明は一般にはプラスミンの調製法、そしてより詳細には分解に対して安定
化する条件下でプラスミンを精製および単離する方法に関する。
【０００３】 背景 フィブリンはトロンビンの作用によりフィブリノーゲンから形成される白色の
不溶性繊維状タンパク質である。血液の凝固でフィブリンは血栓の構造的足場を
形成し、血栓はその元の場所に付着して残る血管内に形成された凝血である。正
常な条件下で、血液凝固系は平衡が維持され、そしてフィブリン沈着は繊溶酵素
系により溶解される。不幸なことには、血管傷害、血小板の活性化／刺激、およ
び凝固カスケードの活性化が平衡を乱し、これが凝血による血栓症または血管の
遮断を導く可能性がある。
【０００４】 静脈内血栓症は、すべての死ならびに他の重篤な臨床的問題の50％以上を占め
る最も多い病理学的結果の１つである。最も多い自然に発生する血管閉塞は、血
栓としても知られている静脈内の凝血の形成によるものでる。血塊の小さいフラ
グメントは血塊の本体から脱離し、そして循環系を通って移動して遠い器官にか
かり、そしてさらに血塊を形成し始めることができる。心筋梗塞、閉塞性発作、
深静脈血栓症（DVT）および末梢動脈疾患は、血栓塞栓的現象の結果としてよく
知られている。
【０００５】 プラスミノーゲンアクチベーターは現在、血栓崩壊療法で使用される好ましい
薬剤であり、そのすべてがプラスミノーゲンをプラスミンに転換し、そしてフィ
ブリンマトリックスの破壊による繊溶を促進する（M.A.Creager and V.J.Dzau,
末端の脈管疾患（Vascular Diseases of the Extremities),ppgs.1398-1406、ハ
リソンの内科学の原理（Harrison's Principles of International Medicine)、
第14版、Fauci et al.編集で、マグロウヒル社（McGraw-Hill Co.）、ニューヨ
ーク、1998；その内容は全部、引用により本明細書に編入する）。
【０００６】 最も広く使用されているプラスミノーゲンアクチベーターには、組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター（tPA）、ウロキナーゼ（UK）およびストレプトキナー
ゼ（SK）の組換え形、ならびに向上した薬物動態学およびフィブリン−結合特性
から選択された新たな世代のプラスミノーゲンアクチベーターを含む。しかしこ
のようなプラスミノーゲンアクチベーターはすべて、それらの作用機作により間
接的に作用し、そしてそれらに共通する基質であるプラスミノーゲンを溶解を行
うために血栓の部位に十分供給する必要がある。
【０００７】 UKおよびtPAは、Arg560−Val561ペプチド結合を開裂することによりプラスミ
ノーゲンをプラスミンに直接転換する。生成したプラスミンの２つのポリペプチ
ド鎖は、２つの内鎖ジスルフィド結合により一緒に保持される。25kDaの軽鎖は
触媒中心を持ち、そしてトリプシンおよび他のセリンプロテアーゼに相同的であ
る。重鎖（60kDa）は、高度に類似するアミノ酸配列を持つ５つの３重−ループ
クリングル構造から成る。このようなクリングルの中には、プラスミノーゲンお
よびプラスミンとフィブリン、アルファ２-アンチプラスミンまたは他のタンパ
ク質との相互作用の原因であるいわゆるリシン−結合部位を含むものもある。SK
およびストレプトキナーゼは、プラスミノーゲンとの複合体を形成することによ
りプラスミノーゲンを間接的に活性化し、この複合体は続いてアルギニル−バリ
ン結合を開裂することにより他のプラスミノーゲン分子を活性化するためのプラ
スミノーゲンアクチベーターとして挙動する。
【０００８】 組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、ストレプトキナーゼおよびウ
ロキナーゼのような血栓崩壊性薬剤は、血管の血栓閉塞の程度を下げるために臨
床的に成功裏に使用されてきたが、現在の血栓崩壊療法はそれらの使用に関して
、重大な限界が存在すると思われる。例えばtPAによるプラスミノーゲンの活性
化は、完全なタンパク質溶解活性を実現するためにフィブリン依存的であるので
（Harber et al.,1989）、その使用の副作用として過剰な出血が生じるかもしれ
ない。このような血栓崩壊剤の使用に関連する他の悪い結果には、心筋梗塞、閉
塞性発作、深静脈血栓症および末梢動脈疾患を含む。
【０００９】 さらに現在使用されている既知のプラスミノーゲンアクチベーターは、血栓の
排除におけるそれらの総合的な有用性に影響を及ぼす幾つかの限界がある。例え
ば現在の血栓崩壊療法の使用では、せいぜい患者のおよそ50％で管の血流が90分
以内に回復するが、急性の冠状再閉塞がほぼ10％の患者でで起こる。冠状再疎通
には平均45分以上を要し、そして脳内出血が患者の0.3％〜0.7％で起こる。残る
死亡率は、血栓崩壊処置なしでの死亡率レベルの少なくとも50％である。
【００１０】 血栓の部位に十分なプラスミンを生成するために、プラスミノーゲンアクチベ
ーターの全身投与に付随する問題を回避するための異なる取り組みは、プラスミ
ン自体を患者に直接投与することである。
【００１１】 米国特許第5,288,489号明細書でReich et al.は、患者の体内にプラスミンを
非経口的に導入することを含む繊溶処置を開示する。処置の濃度および時期は、
十分な活性プラスミンが、血栓を溶解するか、または循環するフィブリノーゲン
レベルを下げるために十分な濃度で静脈の血栓部位に達することができるように
十分となるように選択された。しかし体内への導入の直前にプラスミノーゲンか
らプラスミンを生成する必要性も開示する。
【００１２】 対照的にJensonへの米国特許第3,950,513号明細書では、プラスミン組成物が
生理学的に非毒性のアミノ酸を包含することによりpH7.0で安定化され得ること
を教示する。この方法では、低ｐＨで保存したストックプラスミン溶液を投与直
前に中和するアミノ酸で希釈する。しかし自己分解を最小にするために、できる
限り長い間、プラスミン組成物を低ｐＨに維持するという利点がある。理想的に
は、プラスミンは標的のフィブリンに会うまで低pHに維持されるだろう。
【００１３】 Yago et al.は、米国特許第5,879,923号明細書での診断試薬として有用なプラ
スミン組成物を開示する。Yago et al.の組成物は、プラスミンおよび１）少な
くとも２つのアミノ酸を含んで成るオリゴペプチド、または２）少なくとも２つ
のアミノ酸、または３）１つのアミノ酸および多価アルコールであることができ
るさらなる成分を含んで成る。しかしYago et al.の組成物は、プラスミンの酵
素的活性を維持するために中性のpHで配合されている。
【００１４】 有力な血栓崩壊剤として、プラスミンには多くの技術的難題がある。これらの
難題には、プラスミンをその不活性な前駆体であるプラスミノーゲンから転換す
るために使用されるプラスミノーゲンアクチベーターの機能的痕跡を全く含まな
い純粋なプラスミンを調製するという課題を含む。プラスミンの調製物は多くは
ほとんどプラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼまたはウロキナ
ーゼが混入し、それ故に血栓崩壊活性はプラスミン自体よりもむしろ混入するプ
ラスミノーゲンアクチベーターに左右された。混入しているプラスミノーゲンア
クチベーターは、血栓症の標的部位以外に全身性の出血を誘起する可能性もある
。ストレプトキナーゼを含むプラスミン調製物の欠点は、ストレプトキナーゼが
発熱およびアナフィラキシーショックを含む悪い免疫反応を引き起こし得る点で
ある。
【００１５】 プラスミンの臨床的使用を制限するより重要な技術的因子の１つは、広い特異
性を持つセリンプロテアーゼとしてプラスミンが高度に自己分解し、そして活性
を損失する傾向にあることである。この状況は、高品質のプラスミンの生産、こ
の活性なプロテアーゼの安定な配合物の使用前の長期間保存、および閉塞性血栓
に罹患しているヒト患者への安全かつ効果的なプラスミンの投与に対して、難し
い課題を提供する。
【００１６】 要約 本発明は、プラスミノーゲンを活性化することにより可逆的に不活性な酸性化
プラスミンを調製する方法および精製されたプラスミノーゲンの調製法の両方を
提供する。調製されたプラスミンは単離され、そして低いｐＨ−緩衝能剤(low p
H buffering capacity agent)中に保存されて、実質的に安定な配合物を提供す
る。精製されるプラスミノーゲンは典型的には、低ｐＨでの溶出によるアフィニ
ティークロマトグラフィーにより、画分II＋IIIから免疫グロブリンの分離で得
られた画分から精製される。可逆的に不活性な酸性化プラスミンは、血栓崩壊療
法の投与に使用することができる。
【００１７】 簡単に説明すると、プラスミンを精製する方法はプラスミノーゲンアクチベー
ターの存在下でプラスミノーゲンを開裂して活性プラスミンを生成し、そして活
性プラスミンからプラスミノーゲンアクチベーターを除去してプラスミン溶液を
形成することを含んで成る。次いで低いｐＨ−緩衝能剤を最終的なプラスミン溶
液に加えて、可逆的に不活性な酸性化プラスミンを形成することができる。最終
的なプラスミン溶液は、約2.5から約４の間のｐＨに緩衝化することができる。
【００１８】 プラスミノーゲンアクチベーターは、活性プラスミンを活性プラスミンに特異
的な吸着体材料に結合させて結合したプラスミンを形成することにより除去する
ことができる。１つのそのような活性プラスミンに特異的な吸着体材料は、ベン
ズアミジンを含んで成る。いったん結合すると、活性プラスミンを低ｐＨ溶液で
溶出して最終的なプラスミン溶液を形成することができる。プラスミノーゲンア
クチベーターも、さらに疎水性相互作用により除去することができる。
【００１９】 プラスミンを精製するためのさらなる方法は、プラスミノーゲンを開裂して活
性プラスミンを生成し、そして活性プラスミンを活性プラスミンに特異的な吸着
体材料に結合させて結合したプラスミンを形成することを含んで成る。結合した
プラスミンは、実質的に中性のアミノ酸で溶出して、分解したプラスミンを実質
的に含まない最終的なプラスミン溶液を形成することができる。実質的に中性の
アミノ酸はオメガ−アミノ酸を含んで成ることができ、そして典型的には最終的
なプラスミンから濾去される。最終的なプラスミンは低いｐＨ−緩衝能剤により
緩衝化されてもよい。
【００２０】 プラスミン供給源からプラスミノーゲンの精製法には、プラスミノーゲンを含
有する溶液をプラスミノーゲンに特異的な吸着体材料に加え、そして次いで約１
から約４の間のｐＨでプラスミノーゲンに特異的な吸着体材料からプラスミノー
ゲンを溶出する工程を含む。精製されたプラスミノーゲンを次いで溶出液として
集める。さらにミクロ−もしくはミニ−プラスミン（プラスミノーゲン）または
他の短縮化もしくは修飾された形のプラスミン（プラスミノーゲン）の精製法を
含むことができる。
【００２１】 すなわちここで今、既存の方法の欠点を成功裏に取り扱う方法を提供し、そし
てそのような方法よりも明確な利点を提供する。本発明のさらなる目的、特徴お
よび利点は、以下に簡単に説明する添付図面と関連させて以下の詳細な説明を再
検討することで明らかになるだろう。
【００２２】 詳細な説明 本発明は、低いｐＨ−緩衝能剤と組み合わせて可逆的に不活性な酸性化プラス
ミンを調製する方法およびプラスミン供給源からプラスミノーゲンの精製法の両
方を含んで成る。不活性な酸性化プラスミン溶液は、バッファー溶液中での不活
性化に加えて安定化剤も含んで成ることができる。プラスミノーゲンの精製法は
、病原体の不活化および除去、ならびに低ｐＨでのプラスミノーゲンの溶出の両
方を提供する。不活性な酸性化プラスミン調製物は、血栓崩壊療法の投与に使用
することができる。プラスミノーゲンの精製 本発明はプラスミノーゲンおよびプラスミンの精製法、および同時にこのよう
な過程中にウイルスおよび伝染性海綿状脳症（TSE）混入物を不活化および除去
する方法の両方を含む。出発材料のプラスミノーゲンは、コーン画分II＋IIIペ
ーストから、Deutsch & Mertz(1970)により記載されたLys-SEPHAROSEでのアフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製することができる。SEPHAROSEは、高分
子のゲル濾過による分離のための高分子量物質用のニュージャージー州のファル
マシア社（Pharmacia,Inc.)の商標名である。この方法は任意の血漿源、組換え
体源、細胞培養源またはトランスジェニック源について行うことができる。例え
ばクロマトグラフィー法からの免疫グロブリンの精製に由来する廃棄画分からの
血漿を、1999年11月24日に出願された共有する米国特許出願第09/448,771号明細
書（引用により本発明に編入する）に記載するように使用することができる。
【００２３】 プラスミノーゲンは、広いｐＨ範囲にわたりこの廃棄画分（本明細書では「カ
プリレートケーキI」（CCI）と呼ぶ）から抽出された。抽出条件は、クエン酸、
酢酸、トリス、イミダゾール、ヒスタジン、HEPESおよび／またはリン酸バッフ
ァーを含め約3.5〜約10.5の範囲にｐＨを提供することができる種々のバッファ
ーを使用して、そのｐＨで変動することができる。抽出は約４℃から37℃の温度
で行うことができ、そして有害な効果無しに１〜24時間行うことができる。さら
にイオン強度はプラスミノーゲンの抽出に対して有害な効果無しに約0.2モル濃
度の塩化ナトリウムを添加することにより変動させることができる。
【００２４】 プラスミノーゲンの抽出後、脂質およびタンパク質不純物およびTSEは、約１
〜約10重量／容量％の範囲のポリエチレノグリコール（PEG）の添加、あるいは
約80〜約120g／リットルの硫酸アンモニウムの添加による沈殿で減少した。PEG
および硫酸アンモニウム沈殿はディプス（depth）フィルトレーションにより除
去され、そして生成した溶液をリシンアフィニティー樹脂のカラムに入れた。
【００２５】 所望によりプラスミノーゲンの可溶性を、オメガ−アミノ酸（リシン、アルギ
ニン、トラネキサム酸またはイプシロンアミノカプロン酸、またはそれらの組み
合わせもしくは同族体）の添加により、カプリレートケーキIの抽出後に強化し
てもよい。可溶性の強化は約0.02Ｍ〜約１Ｍのオメガ−アミノ酸を用いて達成す
ることができ、好ましくは約0.1Ｍのリシンで十分であるように思われる。加え
たならば、リシンは好ましくはPEGまたは硫酸アンモニウム沈殿およびディプス
フィルトレーション後に透析濾過（diafiltration）により除去され、そして生
成した溶液をリシンアフィニティー樹脂カラムに入れる。「リシンアフィニティ
ー樹脂」という句は、リシンまたはその誘導体またはイプシロンカプロン酸をリ
ガンドとして含むアフィニティー樹脂に一般的に使用される。カラムは約１〜４
の低ｐＨ溶液で溶出することができる。
【００２６】 アフィニティーカラムから溶出した後に得たタンパク質は、一般的に少なくと
も80％のプラスミノーゲンである。次いで精製したプラスミノーゲンは、グリシ
ンのような単純なバッファーおよびリシンまたはオメガ−アミノ酸の存在下で低
ｐＨで保存する。低ｐＨでの保存は、スパイキング法（spiking method）により
測定されるようなウイルスの不活化および除去ならびにTSE除去の機会も与える
。我々の研究では、非包膜化ウイルスに関しては１つの４log除去工程を含む６l
ogクリアランス、および包膜化ウイルスに関しては２つの独立した４log排除工
程を含む10logクリアランスについて、プラスミンが最も緊縮な要件に合うこと
を示唆している。十分なウイルスのクリアランスに加えて、プラスミンは加える
安定性について、６logよりも大きいTSE感染性の除去を有する。
【００２７】 溶液中のプラスミノーゲンは、プラスミノーゲンアクチベーターの添加により
プラスミンに活性化され、これは限定するわけではないがストレプトキナーゼ、
ウロキナーゼまたは樹脂に固定化されたウロキナーゼの使用および樹脂に固定化
されたストレプトキナーゼの使用を含む多数の方法で達成することができる。好
適なプラスミノーゲンアクチベーターは、可溶性ストレプトキナーゼである。グ
リセロール、およびリシン、ポリリシン、アルギニン、イプシロンアミノカプロ
ン酸およびトラネキサム酸のようなオメガ−アミノ酸のような安定化剤の添加は
、プラスミンの収量を強化することが示された。プラスミンの精製 プラスミンは非活性化プラスミノーゲンから、アフィニティークロマトグラフ
ィーによりベンズアミジンをリガンドとして持つ樹脂および中性のオメガ−アミ
ノ酸溶液または低ｐＨ溶液での溶出を用いて精製した。この工程では本質的にす
べての分解したプラスミンならびにストレプトキナーゼのほとんどを除去するこ
とができる。
【００２８】 残りのストレプトキナーゼを除去するための仕上げ工程として、低ｐＨでの疎
水性的互作用クロマトグラフィーが好適である。HIC工程の後、プラスミンは限
外濾過および透析濾過および0.22μmの濾過により滅菌タンパク質溶液として配
合される。
【００２９】 本方法はさらにプラスミノーゲンアクチベーターを使用してプラスミノーゲン
をプラスミンに活性化し、そして次に形成された活性プラスミンを活性プラスミ
ンに特異的な吸着体材料上で捕捉する工程を含む。結合したプラスミンは次いで
低ｐＨバッファーにより溶出される。溶出したプラスミンは、酸のような低いｐ
Ｈ−緩衝能剤を用いて緩衝化される。典型的には溶出したプラスミンは約2.5か
ら約４の間のｐＨに緩衝化される。
【００３０】 酸性バッファーの低い緩衝能は、可逆的に不活性化された酸性化プラスミンを
迅速に生理学的ｐＨとし、そして次いで血栓崩壊剤として投与された時に活性化
させることができるようにする。典型的にはこのバッファーは、酸性化されたプ
ラスミンに対して約５倍以下の血清容量を加えることにより、酸性化されたプラ
スミンのｐＨを中性ｐＨに上げる濃度で加えられる。活性プラスミンを生成するためのプラスミノーゲンの開裂 プラスミノーゲンは、固定化または可溶性プラスミノーゲンアクチベーターの
触媒的濃度を使用することによりプラスミンに開裂することができる。哺乳動物
で主要な繊溶酵素であるプラスミンは、血漿中を循環している不活性な酵素前駆
体であるプラスミノーゲンに由来するトリプシン様の特異性を持つセリンプロテ
アーゼである。プラスミノーゲン自体は、N-末端グルタミン酸残基を有する790
アミノ酸のポリペプチドである。可溶性ストレプトキナーゼ、組織プラスミノー
ゲンアクチベーター（tPA）またはウロキナーゼのようなプラスミノーゲンアク
チベーターは、単鎖プラスミノーゲン分子を開裂してArg560-Val561ペプチド結
合で活性なプラスミンを生成する。生成したプラスミンの２つのポリペプチド鎖
は２つの内鎖ジスルフィド結合により一緒に保持される。25kDaの軽鎖は触媒中
心を持ち、そしてトリプシンおよび他のセリンプロテアーゼに相同的である。重
鎖（60kDa）は、高度に類似するアミノ酸配列を持つ５つの３重−ループクリン
グル構造から成る。このようなクリングルの中には、プラスミノーゲンおよびプ
ラスミンとフィブリン、アルファ２-アンチプラスミンまたは他のタンパク質と
相互作用する原因となるいわゆるリシン−結合部位を含むものもある。
【００３１】 プラスミノーゲンの活性化は約４℃〜約37℃で起こり、そして典型的には約２
から24時間の間を要する。プラスミノーゲンはオメガ−アミノ酸およびグリセロ
ールのような安定化剤の存在下で開裂することができる。オメガ−アミノ酸には
、リシン、イプシロンアミノカプロン酸、トラネキサム酸、ポリリシン、アルギ
ニン、それらの組み合わせおよび同族体を含むことができる。活性化が完了する
と、プラスミン溶液を濾過し、そしてオメガ−アミノ酸および塩化ナトリウムの
添加により中性ｐＨで数日はさらに安定化され、そしてベンズアミジン-SEPHARO
SEに添加することができる。プラスミノーゲンアクチベーターおよび不純物の除去 プラスミノーゲンの開裂から形成された活性プラスミンは、次いで活性プラス
ミンに特異的な吸着体に結合させてプラスミノーゲンアクチベーターを実質的に
除去することができる。目的タンパク質はトリプシン様の特異性を持つ活性なセ
リンプロテアーゼなので、ベンズアミジンは活性プラスミンの捕捉を可能とする
活性プラスミンに特異的な吸着体として使用することができる。ベンズアミジン
と同様の特性を有する活性プラスミンに特異的な他の吸着体を使用してもよい。
ベンズアミジンは固体支持媒体に固定化することができる。固体支持媒体は、樹
脂またはSEPHAROSEであることができる。さらに疎水性相互作用を使用してプラ
スミノーゲンアクチベーターをさらに除去することもできる。
【００３２】 より具体的には、開裂したプラスミノーゲンは典型的にはアミノ酸、塩化ナト
リウムおよびグリセロールの溶液中に含まれ、これは約0.05Ｍ Tris、pH8.5、0.
5Ｍ NaClで平衡化したベンズアミジン-SEPHAROSEカラムに添加する前に、溶液を
中性ｐＨで数日間安定化させる。カラムは典型的には４℃で実験する。非結合ピ
ークの前部には、高分子量の不純物を含み、残りの非結合ピークは残存する非活
性化プラスミノーゲンおよびプラスミンの不活性な自己分解産物を表す。
【００３３】 次いで結合したプラスミンは、酸性バッファーまたは実質的に中性のオメガ−
アミノ酸で溶出することができる。ベンズアミジン-SEPHAROSEに結合したプラス
ミンは、グリシンバッファーのような酸性バッファーで溶出することができる。
実質的に中性pHのオメガ−アミノ酸を結合したプラスミンの溶出に使用する時、
最終的に溶出したプラスミン溶液は分解したプラスミンを実質的に含まない。典
型的には実質的に中性pHのアミノ酸は約6.5から約8.5の間の値のpHを有する。中
性オメガ−アミノ酸の例には、リシン、イプシロンアミノカプロン酸、トラネキ
サム酸、ポリリシン、アルギニン、それらの同族体および組み合わせを含む。低いｐＨ−緩衝能剤を用いたプラスミン溶液の緩衝化 溶出したプラスミンは低いpH−緩衝能剤を用いて緩衝化することができる。低
いｐＨ−緩衝能剤は、典型的にはアミノ酸、少なくとも１つのアミノ酸の誘導体
、少なくとも１つのアミノ酸を含むオリゴペプチドまたは上記の組み合わせのい
ずれかのバッファーを含んで成る。さらに低いpH−緩衝能剤は、酢酸、クエン酸
、塩酸、カルボン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、安息香酸、セリン、トレオニン
、メチオニン、グルタミン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラ
ニン、アスパラギン酸、それらの誘導体または組み合わせから選択されるバッフ
ァーを含んで成ることができる。バッファーは可逆的に不活性な酸性化プラスミ
ン中に、組成物に対して約４〜５倍以下の容量の血清を加えることにより酸性化
プラスミンのpHを中性pHに上げる濃度で存在することができる。
【００３４】 バッファー溶液中のプラスミン濃度は、全溶液の約0.01mg/ml〜約50mg/mlの範
囲であることができる。バッファーの濃度は、約１nM〜約50mMの範囲であること
ができる。もちろんこれらの範囲は選択するバッファーに依存して、または添加
剤もしくは安定化剤のような他の成分に依存して広く、または狭くしてもよい。
加えるバッファーの量は、可逆的に不活性な酸性化プラスミン溶液が約2.5から
約４の間のｐＨを有するようにする量である。不活性な酸性化プラスミン溶液のさらなる安定化 可逆的に不活性な酸性化プラスミン溶液は、多価アルコール、医薬的に許容さ
れる炭水化物、塩、グルコサミン、チアミン、ナイアシンアミドまたはそれらの
組み合わせのような安定化剤の添加によりさらに安定化することができる。安定
化塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムお
よびそれらの組み合わせから成る群から選択することができる。グルコース、マ
ルトース、マンニトール、ソルビトール、シュクロース、ラクトース、トレハロ
ースおよびそれらの組み合わせのような糖または糖アルコールも加えることがで
きる。
【００３５】 可逆的に不活性な酸性化プラスミン溶液を安定化するために加える炭水化物の
濃度は、約0.2重量／容量％〜約20重量／容量％の範囲を含む。塩、グルコサミ
ン、チアミン、ナイアシンアミドおよびそれらの組み合わせの範囲は、約0.01Ｍ
〜約１Ｍの範囲であることができる。
【００３６】 緩衝化された酸性水に配合されるプラスミンは、大変安定であることが分かっ
た。活性の損失またはタンパク質溶解的または酸性の性質による分解産物の外観
無しに、この状態で数カ月維持することができる。４℃で、プラスミンは少なく
とも９カ月間安定である。室温でも、プラスミンは少なくとも２カ月間安定であ
る。これにより配合物は血栓崩壊投与の長期投薬計画に適合するので、室温での
長期間の安定性は重要である。例えば組織プラスミノーゲンアクチベーターまた
はウロキナーゼのような血栓崩壊剤の36時間投与が末梢動脈閉塞の処置では通例
である。
【００３７】 緩衝化された酸性化プラスミンが生理学的pHに移されて完全に活性になる能力
は、カゼイン溶解（caseinolytic）アッセイおよびまた125Ｉ-フィブリンで標識
した血塊溶解アッセイでのその活性により証明される。これらのアッセイは両方
ともpH7.4で行われ、そしてpHの変化および等-pI点（pH５〜5.5）を通す間にプ
ラスミン活性が完全に回収された。これはプラスミンが非−緩衝化溶媒中に配合
され、そして緩衝化溶液に加えられた時（血漿のPBS）、即座に中性pHに調整さ
れ、そして通常はゆっくりとした等−ｐＩ点の通過に伴う沈殿が起こらないから
である。
【００３８】 本発明で使用する活性プラスミンの特徴は、酸性バッファー中でのプラスミン
の維持および酸性水中でのその配合であり、純粋かつ安定な活性プラスミンを提
供する。その効力は、限定するわけではないが本発明の範囲内にあるプラスミン
またはプラスミンを含有する組成物のような実質的に精製された、または部分精
製された酵素を統一化する（unified）インビトロアッセイで、およびインビボ
のウサギ頸静脈血栓症モデルで証明された。
【００３９】 特許請求する発明の観点を採用する血栓崩壊および関連する軽い病気の処置法
の記載は、「可逆的に不活性化された酸性化プラスミンの局所送達による血栓崩
壊法（Method of Thrombolysis by Local Delivery of Reversibly Inactivated
Acidified Plasmin）」（代理人処理番号B185 1020）という題名の出願に開示
され、そして本出願と共通して譲渡され、そして同時に出願され、そしてこれは
全部、引用により本明細書に編入する。さらに特許請求する発明に従い作成され
る組成物は、「可逆的に不活性化された酸性化プラスミン（Reversibly Inactiv
ated Acidified Plasmin）」（代理人処理番号B185 1030）という題名の出願に
開示され、そして本出願と共通して譲渡され、そして同時に出願され、そしてこ
れは全部、引用により本明細書に編入する。
【００４０】 以下の実施例は、本発明を具体的に説明するためのみに与え、そして本発明を
限定するものではない。当業者は与える実施例は特許請求する発明を具体的に説
明するものであり、本方法が前記特許請求の範囲によってのみ範囲を限定される
と認識するだろう。
【００４１】
【実施例】
実施例１カプリレート ケーキI（CCI）抽出ならびにPEG沈殿および濾過による脂質減少 カプリレート ケーキI（CCI）はIGIV-C-法おける再懸濁画分II＋IIIのpH５カ
プリレート沈殿から生じた画分である。プラスミノーゲン（Pmg）を約1:10のケ
ーキ:バッファー比で２〜３時間、４℃で混合しながら可溶化することによりCCI
から抽出する。幾つかの抽出溶液を調査する一方、本方法を100mM Tris pH 10.5
で行いpHを中性以上に維持した；CCIからのPmg可溶化に好ましい条件。表１は調
査した抽出溶液をそれらの最終的な抽出pHおよびPmg効力と一緒に表す。
【００４２】 表１ 抽出溶液 最終抽出pH Pmg(IU/mL) 0.1M Tris pH10.5 9.2−9.5 1.77 0.2M Tris pH7.5 7.5 2.06 0.05M クエン酸塩、0.2M ε-ACA， 6.0 1.49 0.4M NaCl pH6.5 0.15M クエン酸塩 pH8.3 6.7 1.21 0.4％ 酢酸 pH3.5 3.5 0.05 CCI抽出溶液およびそれらがもたらす最終的な抽出pHおよびPmg活性。
【００４３】 抽出から２〜３時間後、抽出物の温度を20℃に、そしてpHを7.5に調整する。
表２は比懸法に基づき、清澄化血漿プールから画分II＋IIIおよびCCI抽出を通し
たPmg収率を表す。
【００４４】 表２ コーン画分 mg Pmg/g(SD),n ％Pmg工程収率 ％Pmg方法の 収率 清澄化血漿プール 0.124(0.013),33 画分II＋III 0.143(0.024),30 65.6 CCI抽出 0.145(0.01),7 101 66.3(L-リシン後) 清澄化血漿プール からCCI抽出までのPmgに関する工程および方法の収率。
【００４５】 血漿中わずか約66％のPmgが画分II＋IIIに持ち込まれるが、ほとんどすべての
Pmgが懸濁した画分II＋III沈殿中に見いだされ、そしてCCIから抽出される。Tri
s pH10.5中でのCCIの抽出、9.2〜9.5のpHの最終CCI抽出物はCCI中に見いだされ
るすべてのPmgを可溶化している。
【００４６】 リンシ誘導体（100mM L-リシン、50mM イプシロンアミノカプロン酸(EACA)）
の添加により、CCI抽出物中のPmgの溶解性が上がり、図１に具体的に説明するよ
うに後のPEG沈殿および濾過工程中の回収の上昇をもたらす。
【００４７】 脂質の減少も、PEG3350を３％〜４重量／重量％で添加することによる沈殿を
通して達成された。すでに述べたように、PEG添加に先立ち100mMまでのL-リシン
の添加が、PEG濾液中の高いPmg回収（すなわち約90％より多い）を維持するため
に必要である。リシンを添加しないと、わずか約25％のPmgがPEG濾液中で回収さ
れるだけである（図１）。PEG沈殿は20℃で１〜２時間、混合しながら進める。
フィルターを４重量／重量％まで加え、そして混合した後にCUNO30SPを通すディ
プスフィルトレーション、続いてさらに0.5ミクロンおよび0.22ミクロンのフィ
ルターで清澄化する。
【００４８】 図１はコレステロールおよびトリグリセリド濃度により測定された脂質含量が
、PEG沈殿および濾過後に60〜70％まで減少することを示す（CCI濾液I）。CCI濾
液Iは、リン酸緩衝化生理食塩水 pH7.5で1:1に希釈し、そして20℃で１〜２時間
、沈殿として維持し、しばしば後に濾過が続く。CCI濾液Iを0.5μmおよび0.22μ
mのフィルターに通して濾過して、さらなる沈殿物を除去する：CCI濾液II。CCI
抽出物およびCCI濾液IおよびIIに関する比濁法によるデータを図２で具体的に説
明する。フィブリノーゲンおよびアポリポプロテイン Ａ−１濃度は、PEG沈殿後
に低下することに注目されたい。
【００４９】 CCI濾液IIは、リン酸緩衝化生理食塩水pH7.5に対するクロス フロー フィルト
レーション（tangential flow filtration:TFF）により透析濾過して、リシンア
フィニティー樹脂に対するPmg結合について競合的インヒビターとして作用しな
いようにL-リシン濃度を下げる。実験はリシン除去の必要性を具体的に説明する
ために行った。CCI濾液IIは、可溶性リシン濃度を減少させずに直接リシンアフ
ィニティー樹脂にのせ、約４％のPmg活性の捕捉および放出をもたらす。CCI濾液
IIをTBS（10mM Tris、150mM NaCl pH7.5）で1:1に希釈すると、わずか５％のPmg
活性の捕捉および放出が得られただけであった。リシン濃度を下げるために約５
倍容量の透析濾過後、約22％のPmg活性が捕捉され、そしてリシンアフィニティ
ー樹脂から放出された（振り返ると、カラムには約50％が過剰に付加された）。
【００５０】 一定容量の透析濾過は、30KDaの分子量カットオフ膜を使用して、５容量のリ
ン酸緩衝化生理食塩水pH7.5に対するクロス フロー フィルトレーション（TTF）
により行った。透析濾過後、タンパク質溶液を限外濾過により４〜５ A280/mL
まで濃縮した。比濁法によるUF/DF保持物（retentate）中のPmgの回収率は、平
均84％（±１、ｎ＝３）であった。図３はこれまでに検討した各工程の中間産物
に関する還元型SDS PAGEを表す。図２および３のデータでは、CCI抽出物および
その後の濾液の複雑性および不均一性を具体的に説明する。 実施例２ リシンアフィニティークロマトグラフィーによるPmgの精製 リシンアフィニティークロマトグラフィーの目的はPmgを精製することであり
、Pmgは透析濾過したCCI濾液II中の総タンパク質の約３〜５％を表す。DF CCI濾
液IIを、3.4〜4.0A280/mL樹脂で0.01M NaH2PO4、0.15M NaCl pH7.5で平衡化した
リシン-SEPHAROSE 4B（アマーシャム ファルマシア#17-0690-01）カラムに添加
した。非結合タンパク質は、カラムを平衡バッファーで洗浄し、そして次に樹脂
を0.01M NaH2PO4、0.5M NaCl pH7.5で洗浄して、非特異的に結合したタンパク質
を除去した：タンパク質は取り出されなかった。結合したタンパク質であるPmg
を、0.1Ｍグリシン、0.03Ｍ リシン pH3.0で溶出し、そして混合しながら集めて
低pHを維持した。図４および５は、それぞれPmgのSDS PAGE分析およびリシンア
フィニティー精製のクロマトグラムを表す。樹脂は連続して0.1Ｎ NaOH、そして
2.0Ｍ NaCl、0.1％ Triton X-100で清浄化し、そして20％エタノールに保存した
。表３はPmgの比濁法によるPmgの工程収率および還元型SDS PAGEによる純度を表
す。
【００５１】 表３ 方法の中間産物 工程収率％ Pmg純度％ リシン-SEPHAROSE 4B 75.7 85.9 溶出液 リシンアフィニティークロマトグラフィーのPmg工程収率および純度 実施例３ウイルスの不活化および除去ならびにTSE除去 ナノフィルトレーション プラスミン法中のナノフィルトレーションの最適な配置は、Pmgリシンアフィ
ニティー溶出液（Pmg）から病原体の至適除去条件を決定することと一緒に、特
定のナノフィルトレーションのスキームについて試験した。PmgはPPVまたはBVDV
でスパイクし、そしてPALL DV20フィルター膜を通して濾過した。すべての実験
は50mlの出発材料（0.3mg/ml Pmg）を用い、30psiの定圧、pH3.4および室温で行
った。攻撃溶液は、ナノフィルトレーションに先立ち0.22μmを通して前濾過し
た。ナノフィルトレーションによる様々な病原体の除去のための至適条件につい
ての決定因子は、主に既知の病原体の最少４logの感染性除去、生成物回収のパ
ーセント、残る効力のパーセント、生成物濃度および生成物pHの維持を達成する
こと を扱った。我々はPPVおよびBVDBのクリアランスが＞４log10TCID50であっ
たことを検出した。ナノフィルトレーション工程も４logTSEより大きな除去能力
を有する。実験で得られたすべての生成物を回収は＞95％であり、Pmg活性に実
質的な変化は無かった。カプリレートのウイルス不活化 カプリレートの不活化は大変pHに依存的であり、そして酸性pH条件下でより効
力的であるので、低pHリシンアフィニティークロマトグラフィー溶出工程でカプ
リレートによるウイルス不活化を実験することは合理的であった。我々はモデル
１の包膜化ウイルスとしてBVDVを使用してカプリレートのリシンアフィニティー
溶出液中の殺ウイルス活性を実験した。＞4.4 log10減少をもたらした完全なBVD
V不活化が、pH3.4の３mMのカプリレートを用いたリシンアフィニティーカラム溶
出液で、1.5mg/ml Pmgの存在下にて30分間の室温でのインキューベーション中に
検出された。生成物の不存在下でも、完全なBVDV不活化（＞4.7log10の減少）が
３mMカプリレートでpH3.4にて30分後に達成された。目で見える沈殿はカプリレ
ート処理中に観察されず、生成物およびウイルスのスパイクが可溶性のままであ
り、そしてカプリレートにより沈殿しないことを示唆している。リシンアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィー後の生成物の回収および効力に及ぼす加えたカ
プリレートの影響は、最小であった。PEG沈殿 我々はPEGがTSE除去に及ぼす効果を調査した。カプリレート ケーキ I抽出物
のディプスフィルトレーションおよび３％ PEG沈殿により達成された清澄化およ
び脂質の除去は、２log10より大きいTSE除去をもたらした。
【００５２】 表４ 工程 BVDV PPV TSE ナノフィルトレーション ＞４log ４log ４log 3mM カプリレート ＞４log ＜１log ＜１log リシンアフィニティー 3.3log 2.5log 未決定 PEG沈殿 ＜１ ＜１ ２〜３log 全クリアランス ＞12 ＞６ ＞６ プラスミン法に於ける全ウイルス／TSEクリアランス 実施例４PmgのPm(Pm)へのストレプトキナーゼ(SK)活性化 SKの精製したPmg溶液への添加は、PmgをPmに転換する。リシンアフィニティー
カラムの溶出液pH3.4を、30kD分子量のカットオフ膜を通してTFFにより２mg/mL
に濃縮する。Pmg溶液温度を４℃に下げ、そしてPmg安定化剤、EACAを最終濃度20
mMで加えて、3.4から7.5へのpH調整中の損傷に対してPmgを保護する。EACAを加
えないと、67kDa種がpHの振れ後に現れる。pH調整中にEACAの存在は、EACA無し
で のpH調整と比べてPmg分解の低下をもたらす（図６）。いったんpHが7.5に調
整されれば、Pmg溶液を20％グリセロール、４℃で１：１に希釈して１mg Pmg/mL
、0.05M グリシン、0.015M L-リシン、0.01M EACA、10％グリセロール pH7.5の
最終条件にする。このような条件は、Pm自己分解を最小にするために至適化され
た。SKをこの溶液に100:1のPmg:SKモル比で加える。SK反応混合物を４℃で16時
間混合して、PmgをPmに活性化させる。14種類のSK活性化反応からそれぞれ４群
のタンパク質種（Pmg、Pm HC、Pm LCおよび不純物／切断された（clipped）Pm）
の還元型SDS PAGEにより測定した平均相対的純度のパーセントを表５に掲げる。
【００５３】 表５ タンパク質 平均純度％ SD Pmg 20.3 5.3 Pm 68.5 4.4 Pm 重鎖 49.0 2.9 Pm 軽鎖 19.4 1.5 不純物／切断されたPm 11.3 1.8 SK活性化後の還元型SDS PAGEによるPmg、Pm（HC、LC）および混入物／切断さ
れたPmの相対的な平均％ データは、SK活性化に再現性があり、そして約11％の切断されたPm／不純物の
みをもたらす一方、PmgのPmへの活性化は約80％である。活性化およびPmの自己
分解反応を止めるために、NaClおよびEACAをそれぞれ0.5Mおよび0.25Mの最終濃
度で加える。この溶液はPmの完全性に関しては少なくとも４℃で４日間安定であ
る。図７は、この過程でPmの純度またはPm自己分解（他の）に変化がないことを
具体的に説明している。 実施例５ベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーによるPmの精製 ベンズアミジンアフィニティー精製の目的は、活性Pmから非活性化Pmgおよび
不純物（Pm分解産物を含む）の分離である。0.05M グリシン、0.015M L-リシン
、0.25M EACA、0.5M NaCl、10％グリセロール中でpHを8.5に合わせた安定なSK活
性化溶液を、50mM Tris、500mM NaCl pH8.5で平衡化したベンズアミジン-SEPHAR
OSE 6B（アマーシャム ファルマシア #17-0568-01）カラムに添加する。切断さ
れた、および完全な両方のPmをアフィニティー樹脂により捕捉すると同時に、前
述の不純物をカラムから流し出す。カラムは280nmでの吸収がベースラインに達
するまで平衡化バッファーで洗浄する。次いで結合したPmを２つのうちのいずれ
か１つの方法で溶出する：１）樹脂を取り出し、そしてバッチ形式で0.1M グリ
シン、0.03M リシン pH3.4で溶出する；２）カラム形式で１M EACA pH7.5で溶出
する。EACA pH7.5での溶出は完全なPmのみを取り出すが、損傷したPmは樹脂に結
合したままである。すべての残りのタンパク質を剥がすための工程。図８は、典
型的なカラム形式、EACA溶出プロフィールを示す。Pm溶出のためにカラムから樹
脂を取り出すので、バッチ溶出プロフィールは非結合タンパク質ピークのみから
成る。捕捉され、そしてアフィニティー樹脂から溶出されるPmは、図９で具体的
に説明するように87〜91％完全であり（自己分解されていない）、そして＞ 99
％全Pmである。EACAを用いたベンズアミジン樹脂からのPmの溶出は、EACAのよう
なリシン誘導体がPmの重鎖と相互作用し、一方ベンズアミジンは軽鎖と相互作用
するので予想されなかった。 実施例６PmgアクチベーターSKの除去 これらの工程の目的は、残りのフィブリン凝固溶解活性がPmの活性のみとなる
ように、PmgアクチベーターSKを除去することである。ベンズアミジンアフィニ
ティー工程は、表６に具体的に説明するように、PmからSKを＞99％除去する。
【００５４】 表６ プラスミン法の工程 ストレプトキナーゼ(ng/mL) SK活性化 1930.1 ベンズアミジン-SEPHAROSE 非結合 1549.5 ベンズアミジン-SEPHAROSE 溶出Pm 1.9 HIC 非結合Pm 0.7 HIC NaOH 分離(SK) 1.3 Pmの最終配合物 ＜0.5 ベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロ
マトグラフィーによる、ELISAにより測定されたSK除去。
【００５５】 オクチルSEPHAROSE 4FF（アマーシャム ファルマシア#17-0946-02）を使用し
た疎水性相互作用工程は、本質的に残るSKを除去するための仕上げ工程として作
用する。最終的な滅菌Pm生成物は、ELISAにより検出可能なSKは無い。ベンズア
ミジンアフィニティーカラムからの１Ｍ ELISA溶出物 pH7.5を、pH3.4に調整し
、そして(NH4)SO4を0.1Mの最終濃度で加える。これはオクチルSEPHAROSE 4FFカ
ラムへのタンパク質添加物となる。カラムは0.1M (NH4)SO4、0.1M グリシン、30
mM リシン pH3.4で平衡化する。Pmはカラムを通過し、一方SKはカラムに結合し
、そしてPmから分離する。捕捉されたSKは樹脂から0.1〜1.0N NaOHと一緒に取り
出される。図９は主要な実験の試験からのオクチルSEPHAROSE ４FFクロマトグラ
ムである。PmgおよびSKを2:1のPmg:SKのモル比で混合し、そしてオクチルSEPHAR
OSE ４FFクロマトグラフィーにかけた。高レベルのSKを使用したので、抗-SKウ
エスタンブロットを使用して、クロマトグラフィーサイクル全体でSKを追跡でき
た。図１０はSDS PAGEおよび抗-SKウエスタンブロットにより、PmからSKの除去
を具体的に説明する。SK標準（パネルＡおよびＢ：レーン１）は47kDaのその分
子量に真に移動する。いったんPmgと混合すると、SKは修飾され、そしてより早
く移動し、そしい幾つかの種も移動する。Pmのバルクを含む非結合タンパク質画
分には、抗-SKウエスタンブロットにより検出できるSKは無い(パネルＢ：レーン
３）。
【００５６】 上記のベンズアミジンアフィニティーおよびHICクロマトグラフィーにより精
製された最終的なPmの滅菌調製物に関する結果を、表７に掲げる。
【００５７】 表７ タンパク質 平均純度％ Pmg 0.0 Pm 95.5 Pm 重鎖 66.5 Pm 軽鎖 29.0 不純物／切断されたPm 4.5 HIC後の還元型SDS PAGEによるPm（HC、LC）の相対的な平均純度％;ｎ＝２。
【００５８】 上記に具体的に説明し、そして記載したように特別な態様を説明してきたが、
開示した態様に関して様々な変更を行うことができると認識される。したがって
、本発明は多彩な形式のみを開示したが、当業者には多くの付加、削除および修
飾を本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができ、そして前記
特許請求の範囲の説明を除き、不当な限定を強要すべきではないことは明らかで
ある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミノーゲン回収およびPEG沈殿／ディプスフィルトレーションを通すCCI
濾液からの脂質の除去の効果をグラフで表す。
【図２】 CCI抽出物およびその後の濾液IおよびIIに関する比濁法のデータをグラフで表
す。
【図３】 CCI抽出物、濾液およびUF/DF保持物のクーマーシー染色した還元型SDS-PAGE（
10〜20％ Tris-グリシン）のゲルを表す。
【図４】 PmgのリシンSEPHAROSE 4Bアフィニティー精製のクーマーシー染色した還元型S
DS-PAGE（10〜20％ Tris-グリシン）を表す。
【図５】 Pmgのアフィニティー精製に関するリシンSEPHAROSE 4Bのクロマトグラムをグ
ラフで表す。
【図６】 イプシロンアミノカプロン酸の存在または不存在下で、リシンSEPHAROSE 4Bの
溶出物（Pmg）をpH調整した、クマーシー染色した還元型SDS-PAGE（10〜20％ Tr
is-グリシン）を表す。
【図７】 0.5M NaCl、0.25M ε-ACA 停止後のストレプトキナーゼ活性化溶液の安定性を
グラフで表す。
【図８】 SKで活性化したPmgのアフィニティー精製に関するベンズアミジンSEPHAROSE 6
Bのクロマトグラムをグラフで表す。
【図９】 ベンズアミジンSEPHAROSE 6Bで精製したPmのクーマーシー染色した還元型SDS-
PAGE（10〜20％ Tris-グリシン）を表す。
【図１０】 ストレプトキナーゼの除去に関する疎水性相互作用クロマトグラフィー（オク
チルSEPHAROSE 4FF）のクロマトグラムをグラフで表す。
【図１１】 非還元型SDS-PAGEおよび抗-SKウエスタンブロットを表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ケント，ジヨナサン・デイ アメリカ合衆国ノースカロライナ州27540 ホリースプリングス・ダツチヒルロード 101 (72)発明者 コーニーエバ，マリナ・エヌ アメリカ合衆国ノースカロライナ州27606 ローリー・ダツチマンドライブ5308 (72)発明者 ボームバツハ，ジヨージ・エイ アメリカ合衆国ノースカロライナ州27543 ナイトデイル・ベデイングフイールドドラ イブ902 (72)発明者 クツク，スコツト・エイ アメリカ合衆国ノースカロライナ州27529 ガーナー・ウイトホーンドライブ221 (72)発明者 ブラドリー，リタ・テイ アメリカ合衆国ノースカロライナ州27513 キヤリー・ニユービンガムコート105 (72)発明者 ノボカトニ，バレリー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27612 ローリー・ウイーバーントレイル4617 (72)発明者 ビリンズ，タネツト・ビー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27604 ローリー・キヤツスルパインズドライブ 2168 Ｆターム(参考） 4B050 CC06 DD11 FF03C FF03E FF14C FF14E GG06 KK02 KK05 KK08 KK09 KK11 KK12 LL01 4C084 AA06 BA01 BA08 BA22 BA26 CA36 CA53 CA56 DC06 ZA01 ZA03 ZA362

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プラスノミーゲンアクチベーターの存在下でプラスミノーゲ
    ンを開裂して活性プラスミンを生成し； 活性プラスミンからプラスミノーゲンアクチベーターを実質的に除去してプラ
    スミン溶液を形成し；そして 低いｐＨ-緩衝能剤を用いてプラスミン溶液を緩衝化して可逆的に不活性な酸
    性化プラスミンを形成する、 ことを含んで成る、プラスミンの精製法。
  2. 【請求項２】 プラスミノーゲンアクチベーターを実質的に除去する工程が
    、 活性プラスミンを活性プラスミンに特異的な吸着体材料に結合させて結合した
    プラスミンを形成し；そして 結合したプラスミンを低ｐＨ溶液で溶出してプラスミン溶液を形成する、 工程を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 活性プラスミンに特異的な吸着体材料がベンズアミジンを含
    んで成る、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 プラスミノーゲンアクチベーターがさらに疎水性相互作用に
    より除去される、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 プラスミノーゲンを、オメガ−アミノ酸およびグリセロール
    を含んで成る安定化剤の存在下で開裂することを更に含む、請求項１に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 プラスミノーゲンが、固定化された、可溶性の、およびそれ
    らの組み合わせのプラスミノーゲンアクチベーターから成る群から選択される触
    媒濃度のプラスミノーゲンアクチベーターを使用して開裂される、請求項１に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 プラスミノーゲンアクチベーターが、ストレプトキナーゼ、
    ウロキナーゼ、tPAおよびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求
    項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 プラスミノーゲンアクチベーターが可溶性ストレプトキナー
    ゼである、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 プラスミノーゲンアクチベーターがSEPHAROSEを含んで成る
    固体支持媒体上に固定化されている、請求項６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 低いｐＨ−緩衝能剤が、アミノ酸、少なくとも１つのアミ
    ノ酸の誘導体、少なくとも１つのアミノ酸を含むオリゴペプチドまたはそれらの
    組み合わせを含んで成るバッファーを含んで成る、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 低いｐＨ−緩衝能剤が、酢酸、クエン酸、塩酸、カルボン
    酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、安息香酸、セリン、トレオニン、メチオニン、グ
    ルタミン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギ
    ン酸、それらの誘導体またはそれらの組み合わせから選択されるバッファーを含
    んで成る、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 バッファーが、酸性化プラスミンに約５倍以下の容量の血
    清を加えることにより酸性化プラスミンのｐＨを中性ｐＨに上げる濃度で可逆的
    に不活性な酸性化プラスミン中に存在する、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 可逆的に不活性な酸性化プラスミン溶液が、約2.5から約
    ４の間のｐＨを有する請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 多価アルコール、医薬的に許容される炭水化物、塩、グル
    コサミン、チアミン、ナイアシンアミドまたはそれらの組み合わせから選択され
    る安定化剤を添加することにより可逆的に不活性な酸性化プラスミンを安定化す
    ることを更に含む、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム
    、塩化カルシウムおよびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項
    １４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 グルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、
    シュクロース、ラクトース、トレハロースまたはそれらの組み合わせから選択さ
    れる糖または糖アルコールを添加することにより、可逆的に不活性な酸性化プラ
    スミンを安定化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 プラスミノーゲンを開裂して活性プラスミンを生成し； 活性プラスミンを活性プラスミンに特異的な吸着体材料に結合して結合したプ
    ラスミンを形成し；そして 結合したプラスミンを実質的に中性なアミノ酸を用いて溶出して、分解したプ
    ラスミンを実質的に含まない最終的なプラスミン溶液を形成する、 ことを含んで成る、プラスミンの精製法。
  18. 【請求項１８】 プラスミノーゲンが、触媒的濃度のプラスミノーゲンアク
    チベーターを使用して開裂される、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 活性化されたプラスミン溶液がオメガ−アミノ酸および塩
    化ナトリウムの添加により安定化される、請求項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 実質的に中性なアミノ酸が、オメガ−アミノ酸を含んで成
    る、請求項１７に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 オメガ−アミノ酸が、リシン、イプシロンアミノカプロン
    酸、トラネキサム酸、ポリリシン、アルギニン、それらの同族体およびそれらの
    組み合わせから成る群から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 実質的に中性なアミノ酸を最終的なプラスミン溶液から濾
    去する、請求項１７に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 低いｐＨ−緩衝能剤を最終的なプラスミン溶液に加えて、
    可逆的に不活性な酸性化プラスミンを形成することを更に含む、請求項１７に記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】 可逆的に不活性な酸性化プラスミンのｐＨを約2.4から約
    ４の間のｐＨに調整することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 安定化剤を最終的なプラスミン溶液に加えることを更に含
    む、請求項１７に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 安定化剤がアミノ酸、塩またはそれらの組み合わせから成
    る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 プラスミノーゲンを含有する溶液を、プラスミノーゲンに
    特異的な吸着体材料に加え； 約１から約４の間のｐＨでプラスミノーゲンに特異的な吸着体材料からプラス
    ミノーゲンを溶出し；そして プラスミノーゲンを含有する溶出液を集める、 ことを含んで成る、血漿供給源からプラスミノーゲンを精製する方法。
  28. 【請求項２８】 血漿供給源がコーン（Cohn）の血漿分画法の画分II＋III
    に由来する、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 プラスミノーゲンを血漿ペースト画分から約3.5から10.5の範囲のｐＨでバッ
    ファー溶液を用いて抽出し、そしてプラスミノーゲンを含有する溶液を集め； ポリエチレングリコールまたは硫酸アンモニウムをプラスミノーゲンを含有す
    るバッファー溶液に加えて不純物を沈殿させ； プラスミノーゲンを含有する流出液から沈殿した不純物を分離し；そして プラスミノーゲンを含有する流出液をリシンアフィニティー樹脂に加える、 工程を更に含んで成る、請求項２７に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 プラスミノーゲン抽出溶液が約7.0から約10.5の範囲のｐ
    Ｈである、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 約１〜約10重量／重量％のポリエチレングリコールまたは
    80〜120g／リットルの硫酸アンモニウムを加える、請求項２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 プラスミノーゲン溶解強化物を更に加えることを含む、請
    求項２９に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 プラスミノーゲン溶解強化物が、リシン、イプシロンアミ
    ノカプロン酸、トラネキサム酸、ポリリシン、アルギニン、それらの組み合わせ
    およびそれらの同族体から成るオメガ−アミノ酸の群から選択される、請求項３
    ２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 プラスミノーゲン溶解強化物を除去することを更に含む、
    請求項３２に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 溶出したプラスミノーゲンを約３から約４の間のｐＨで処
    理する、請求項２７に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ｐＨ調整前にオメガ−アミノ酸を加えることにより、約
    ３から中性へのｐＨ調整中にプラスミノーゲンを安定化する方法。
  37. 【請求項３７】 病原体を除去することを更に含む、請求項２７に記載の方
    法。
  38. 【請求項３８】 病原体の除去が、ウイルス病原体を不活化すること、およ
    びＴＳＥ病原体を除去することを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 ウイルスが、熱処理、カプリレートの添加、溶媒界面活性
    剤の添加、ナノフィルトレーションおよびそれらの組み合わせから成る群から選
    択される工程により不活化または除去される、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 ＴＳＥが、ＰＥＧ沈殿、ディプスフィルトレーションおよ
    びナノフィルトレーションから成る群から選択される工程により除去される、請
    求項３８に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 プラスミノーゲンに特異的な吸着体材料が、リシンアフィ
    ニティー樹脂を含んで成る、請求項２７に記載の方法。
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