JP4383547B2 - 活性化プロテインc製剤 - Google Patents
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Description
本発明の技術分野
この発明はヒト用医薬品の分野、殊に活性化プロテインCによる脈管性疾患の処置の分野、に属する。さらに特定的には、本発明は活性化ヒトプロテインCの製剤に関する。
本発明の背景
プロテインCはセリンプロテアーゼの一種であって、血液凝固経路でVa因子およびVIIIa因子を不活性化することによって恒常性を調節する役割を担っている天然起源の抗血液凝固剤である。ヒトのプロテインCは生体内では主として肝臓でアミノ酸461個の単鎖ポリペプチドとして製造される。この単鎖前駆体分子は次のものを含む、多重の転写後修飾を受ける:すなわち、1)アミノ酸42個のシグナル配列を切断する;2)単鎖チモーゲンから2鎖のチモーゲン型分子を与えるための156位リジン残基および157位アルギニン残基における蛋白質分解的な切断を受ける(すなわち、セリンプロテアーゼを含有するアミノ酸残基262個の重鎖とジスルフィド橋を経て結合するアミノ酸残基155個の軽鎖とになる);3)ガンマカルボキシグルタミン酸残基9個を与える軽鎖の最初のアミノ酸42個に集結しているグルタミン酸残基9個がビタミンK依存性のカルボキシル化を受ける;および4)4個所(軽鎖にある1個所および重鎖にある3個所)に炭水化物が付着する。重鎖はよく確認されているAsp275、His211およびSer360からなるセリンプロテアーゼ三個組を含有する。最後に、循環している2鎖チモーゲンはカルシウムイオンの存在下にホスホリピド表面にあるトロンビンによって生体内活性化される。この活性化は重鎖のN−末端にあるドデカペプチドの除去に起因するものであって、酵素作用を有する活性化プロテインC(aPC)が産生される。
aPCの酵素活性に加えて、aPCは血液凝固経路の中で自己分解して、抗血液凝固剤としての機能が低下することがある。本発明者はこの一つの重要な分解経路を発見した。軽鎖N末端の自己分解で10位ヒスチジン残基のどちらかの側に切断を起こすことがある。そこで、この分解経路は不活性産物2種を与える:すなわち、1)デス(1〜9)活性化プロテインCであって、軽鎖N−末端の最初の残基9個が失われたもの;および2)デス(1〜10)活性化プロテインCであって、軽鎖N−末端の最初の残基10個が失われたものである。今迄に報告されたことがないこの分解経路で6位および7位にある必須なGLA残基が除去される結果として抗血液凝固作用が失われる。それ故、デス(1〜9)活性化プロテインCおよびデス(1〜10)活性化プロテインCの自己分解産物レベルを削減することは強力で高純度な活性化プロテインC医薬製剤に到達するには重要である。これらの変化体はこれまで知られていない分解産物であって、通常の精製技術で除去することは、不可能でないとしても非常に困難である。本発明者はさらに特定の増量剤が存在すると、固体状態の溶解性が顕著に改善されることを発見した。
溶液および凍結乾燥固体の両方において活性化プロテインCの分解を削減することは明らかに望ましいことである。従って、これらの発見で医薬品製造業者にとって製薬学的に見事な、強力で高純度な活性化プロテインC製剤の製造が可能になる。
本発明はこのような自己分解産物、特にデス(1〜9)型活性化プロテインC型軽鎖およびデス(1〜10)型活性化プロテインC型軽鎖を持つ活性化プロテインCを実質的に含有しない改良された活性化プロテインCの製剤を提供する。それ故、本製剤はそれを必要とする患者にとって適切である。
発明の要約
本発明は活性化プロテインCおよび増量剤であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、ショ糖、およびその混合物で構成される群から選択されたもの、を含む安定な凍結乾燥製剤を提供する。
本発明はまた活性化プロテインC約2.5mg/mL、ショ糖約15mg/mLおよびNaCl約20mg/mLを含む安定な凍結乾燥製剤を提供する。さらに、本発明は活性化プロテインC約5mg/mL、ショ糖約30mg/mLおよびNaCl約38mg/mLを含有する安定な凍結乾燥製剤を提供する。
本発明はまた活性化プロテインCおよび増量剤であってマンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびショ糖およびその混合物で構成される群から選択されたものを含む製剤の製法を提供する。
本発明はまた重量比で活性化プロテインC約1部、塩約7.6部および増量剤約6部である製剤を含む単位用量レセプタクル(receptacle)を含む単位用量剤型を提供する。
本発明はさらに本明細書に記載する活性化プロテインCの製剤を投与することを包む脈管内血液凝固を伴う病状を処置する方法を提供する。
発明の詳細な説明
本明細書に開示し、特許請求する本発明の目的では、下記の用語を次の通りに定義する。
aPCまたは活性化プロテインCは活性化型のプロテインCを示すが、これは組換え体であっても血漿由来であってもよいものとする。aPCにはヒトの活性化プロテインCを包含するが、これは好ましいものである。aPCはまた、他種由来のものまたはプロテインCの分解性、アミド分解性、エステル分解性および生物学的(抗血液凝固性またはプロ−フィブリン分解性)な活性を有する誘導体であってもよいものを包含する。プロテインCの誘導体の例は、ここに全教示を参考のために引用するGerlitzほかの米国特許第5453373号およびFosterほかの米国特許第5516650号に記載されている。
APTT−活性化部分トロンボプラスチン時間。
r−hPC−組換えヒトプロテインCチモーゲン。
r−aPC−試験管内または生体内でプロテインCチモーゲンを活性化することによって、または原核生物細胞、真核生物細胞またはトランスジェニック動物からの活性型プロテインCの直接的な分泌であって、例えばヒト腎臓293細胞からチモーゲンとして分泌させ、次に当業者によく知られている技術およびここに全教示を参考のために引用するYanの米国特許第4981952号およびCottinghamのWO第97/20043号で証明されている技術によって精製および活性化されたもの含むものによって産生された組換え活性化プロテインC。
連続点滴−実質的に中断なく、血管への溶液の導入を所定の時間継続すること。
一時注射−所定量の薬剤(ボーラスと称する)を一時に注射すること。
投与に適する−治療剤として投与するのに適切な凍結乾燥剤または液剤。
チモーゲン−本明細書で使用されるプロテインCチモーゲンは単鎖型であっても二鎖型であってもよい分泌された不活性型プロテインCを示す。
医薬的に許容される緩衝剤−医薬的に許容される緩衝剤はこの技術分野で知られている。医薬的に許容される緩衝剤には燐酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはTRISが含有されている。
活性化プロテインCは、たとえばヘパリンおよび経口投与用のヒドロキシクマリン型抗凝固剤のような入手可能な抗凝固剤と比較して広い治療係数を持つ抗血栓剤である。抗血栓剤としては、aPCは血栓性発作、深部脈管血栓症、肺塞栓症、末梢動脈血栓症、心臓または末梢動脈に由来する塞栓症、急性心筋梗塞、播種性静脈内血液凝固、および移植または網膜血栓症を含む急性の前毛細血管閉塞または後毛細血管閉塞、を包含する脈管内血液凝固を伴う広範囲な後天的病状の処置に素晴らしい効果を示す。
本発明は活性化プロテインCの製剤に関する。所望の製剤は活性化プロテインCおよび増量剤(bulking agent)であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびショ糖で構成される群から選択されたものを含有する高純度で安定な凍結乾燥製品であるものの一つであろう。この凍結乾燥製品はたとえば無菌水または無菌食塩水のような適当な希釈剤を用いて再構成される。製造された液はpHが約5.5から約6.5までであるのが好ましい。
製剤内で活性化プロテインC、緩衝剤、塩濃度、pH、温度および増量剤の間の分子的相互作用は複雑であって、各因子が製剤の安定化に寄与する役割は予測不能である。本発明の凍結乾燥製剤を再懸濁化すると、自己分解の低下のために安定で酵素的に活性な活性化プロテインCを提供する。本発明の製品では、殊にデス(1〜9)aPCおよびデス(1〜10)aPCのレベルが低下している。一般にデス(1〜9)aPCおよびデス(1〜10)aPCの量は自己分解産物中の10%またはそれ以下である。好ましくはデス(1〜9)aPCおよびデス(1〜10)aPCの量は自己分解産物中の8%またはそれ以下である。さらに好ましくはデス(1〜9)aPCおよびデス(1〜10)aPCの量は自己分解産物の中の5%またはそれ以下であり、最も好ましくは自己分解産物の中で3%またはそれ以下である。この安定性は注意深い製造条件の調節によって、また、ショ糖、トレハロース、ラフィノース、またはマンニトールの添加によって得られる。興味深いことに、たとえばヒドロキシエチル澱粉およびグリシンのようなその他の増量剤は必要とする安定性または医薬としての見事さを提供することはない。
本発明の増量剤は均一な外観を有し、また、適切な溶剤を用いて再懸濁すると容易に溶解する医薬的に見事な製剤を提供する。再構成すると、この製剤は室温で24時間から48時間までにわたって安定である。安定性についてのこの結果は以前には到達不能であった。
この活性化プロテインC製剤における増量剤の好適なものは、ショ糖、トレハロースおよびラフィノースである。さらに好適な増量剤はショ糖およびラフィノースであり、最も好適な増量剤はショ糖である。この製剤中の増量剤の量は重量比でaPC1部に対して増量剤1部から10部までである。さらにその上、この製剤の増量剤濃度は凍結乾燥工程での重要な製剤化用変動値である。増量剤の最適濃度はaPCの量および選択した増量剤の種類に依存する。凍結溶液中のショ糖の好適な濃度は10mg/mLから40mg/mLまでである。さらに好適なショ糖濃度は15mg/mLから30mg/mLまでである。aPC2.5mg/mLの製剤では凍結溶液中の最も好適なショ糖濃度は15mg/mLである。aPC5.0mg/mLの製剤では凍結乾燥用溶液中の最も好適なショ糖濃度は30mg/mLである。活性化プロテインCの製剤におけるここに特許請求する増量剤の存在は化学的および物理的安定性を増大する。
溶液状態における自己分解を削減するためには、凍結乾燥の前および再構成の後にpHを5.5から6.5までの範囲に維持することは好ましい。この製剤の好適なpHは約5.6と約6.4との間のpHである。さらに好適なのは約5.7と約6.3間との間のpHである。さらに一層好適なのは約5.8と約6.2との間のpHである。さらに好適なものは約5.9と約5.1との間のpHである。最も好適なpHは約6.0である。
有効なpH調節を維持するために、aPC溶液は医薬的に許容される緩衝剤を含有すべきである。従って、凍結乾燥時にこの製剤は所望ならばまた好ましくは医薬的に許容される緩衝剤を含有する。代表的な緩衝剤系にはトリス−酢酸塩、クエン酸ナトリウム、および燐酸ナトリウムを包含する。さらに好適な緩衝剤系にはクエン酸ナトリウムおよび燐酸ナトリウムを包含する。最も好適な緩衝剤はクエン酸ナトリウムである。この緩衝剤系の好適なモル濃度は10mMから50mMまでである。緩衝剤系のさらに好適なモル濃度は10mMから20mMまでである。最も好適なモル濃度は40mMである。熟練した専門家はそのほかにも多くの緩衝剤系が入手できること本発明の製剤に使用できるを認識することとなろう。
同様にして、凍結乾燥の間および再構築後のイオン強度は溶液状態での安定性を保証するために重要な変数である。このイオン強度は一般にその溶液の塩濃度によって決定される。イオン強度を作製するために典型的に使用される医薬的に許容される塩は、これらに限定するものではないが、塩化カリウム(KCl)および塩化ナトリウム(NaCl)を包含する。本発明における好適な塩は塩化ナトリウムである。この塩の濃度は凍結乾燥の間の凍結乾燥周期の凍結段階でこの塩が結晶化を起こすに十分な高濃度としなければならない。塩化ナトリウム濃度は150mMよりも濃いのが好ましい。凍結させる溶液中の塩化ナトリウム濃度は150mMと1000mMとの間がさらに好ましい。aPC2.5mg/mLを含有する製剤については、凍結する溶液中のさらに好ましい塩化ナトリウム濃度は150mMと650mMとの間である。凍結する溶液中のさらに好ましい塩化ナトリウム濃度は250mMと450mMとの間である。凍結する溶液中の塩化ナトリウム濃度は300mMと400mMとの間がなおさらに好ましい。凍結する溶液中の最も好ましい塩化ナトリウム濃度は、aPC2.5mg/mLを含有する製剤については325mMである。
同様にして、aPC5.0mg/mLを含有する製剤については凍結する溶液中のさらに好ましい塩化ナトリウム濃度は150mMと1000mMとの間である。凍結する溶液中のさらに好ましい塩化ナトリウム濃度は250mMと750mMとの間である。凍結する溶液中のそれ以上に好ましい塩化ナトリウム濃度は400mMと700mMとの間である。凍結する溶液中の最も好ましい塩化ナトリウム濃度はaPC5.0mg/mLを含有する製剤については650mMである。
aPC:塩:増量剤の比率(w:w:w)は凍結乾燥工程のために適切な製剤における重要な因子である。この比率はaPC濃度、塩の選択およびその濃度、および増量剤の選択およびその濃度に依存して変動する。当技術分野の熟練者は当技術分野で認められている技術、例えば実施例1に記載されている技術などによってaPC:塩:増量剤の好適な比率を容易に確認できよう。殊に重量比で活性化プロテインC1部に対する約7部と約8部との間の塩、約5部と約7部との間の増量剤が好適である。より好適なものでは活性化プロテインC1部に対する重量比で約7.5部と約8部との間の塩、および約5.5部と約6.5部との間の増量剤である。最も好適なものは活性化プロテインC約1部に対する約7.6部の塩、および約6部の増量剤、の比率である。
好適な塩は325mM濃度(aPC2.5mg/mLを含有する製剤で)および325mM濃度(aPC5.0mg/mLを含有する製剤で)の塩化ナトリウムおよび約1.3:1の比率のショ糖(w:w)である。この濃度は、凍結工程の間に塩が結晶化を起こして、凍結乾燥することができるaPC、ショ糖およびクエン酸塩の無晶形混合物を与えることが予期されるためには十分に高濃度である。このようにして、好適な濃度である325mMおよび650mMのNaClのイオン強度はこの製剤に凍結乾燥工程の間の安定性を与える。
本発明はさらに活性化プロテインCおよび増量剤であってマンニトール、トレハロース、ラフィノースおよびショ糖およびその混合物で構成される群から選択されたものを含む溶液を凍結乾燥することを含む安定な凍結乾燥製剤の製造法を提供する。本発明はまた活性化プロテインC約2.5mg/mL、ショ糖約15mg/mL、NaCl約19mg/mLおよびクエン酸ナトリウム緩衝剤を含有し、pH5.5またはそれ以上であるがpH6.5またはそれ以下である溶液を凍結乾燥することを含む安定な凍結乾燥製剤の製法を提供する。さらにその上、本発明は活性化プロテインC約5mg/mL、ショ糖約30mg/mL、NaCl約38mg/mLおよびクエン酸ナトリウム緩衝剤を含有し、pH5.5またはそれ以上であるがpH6.5またはそれ以下である溶液を凍結乾燥することを含む安定な凍結乾燥製剤を製造する方法を提供する。
本発明は、活性化プロテインCおよび増量剤であってマンニトール、トレハロース、ラフィノース、ショ糖およびその混合物で構成される群から選択されたものを含む安定な凍結乾燥製剤を含有する単位用量レセプタクル(receptacle)を含む単位用量剤型を提供する。さらに本発明は前記の製剤を投与することを含む脈管内血液凝固を伴う病状の処置法を提供する。
aPCは好ましくは有効な型で血流に送達されることを確実にするために適切な用量を約1時間から約48時間にわたって連続的な点滴剤として注射することによって非経口的に投与する。投与するaPCの量は約0.01mg/kg/時から約0.05mg/kg/時までである。これとは別にaPCは約5分間から約30分間にわたってボーラス注射として時間当り用量の適切な一部を注射し、それに続いて約23時間から約47時間にわたって適切な用量を連続的に点滴することによって投与して24時間から48時間にわたる適切な用量の投与とするものでもよい。
以下の実施例に本発明を実施する方法を記載し、本発明を例示することとしたい。本発明の範囲を以下の実施例のみから構成されると理解すべきではない。
製造例1 ヒトプロテインCの製造
組換えヒトプロテインC(r−hPC)は、たとえばここに全教示を参考のために引用するYanの米国特許第4981952号に記載されているような熟練した専門家によく知られた技術によってヒトの腎293細胞中で産生させた。ヒトのプロテインCをコードする遺伝子はここに全教示を参考のために引用するBangほかの米国特許第4775624号に開示され、特許されている。ヒトのプロテインCを293細胞中で発現するプラスミドはプラスミドpLPCで、ここに全教示を参考のために引用するBangほかの米国特許第4992373号に開示されている。プラスミドpLPCの構築はここに全教示を参考のために引用する欧州特許公開番号0445939号およびGrinnellほか著、1987年、Bio/Technology、5巻:1189〜1192頁にも記載されている。略述すれば、このプラスミドを293細胞に遺伝子移入し、次に安定な形質転換体を確認し、副次培養して血清不含培地中で増殖させた。発酵後、マイクロ濾過によって細胞不含培地を得た。
ヒトのプロテインCをYanの米国特許第4981952号に記載の技術を適用することによって培養液から分離した。清澄化した培地を4mM−EDTAとした後、アニオン交換樹脂に吸着(Fast−Flow・Q、Pharmacia社製)させた。4カラム容の20mM−トリス、200mM−NaCl、pH7.4および2カラム容の20mM−トリス、150mM−NaCl、pH7.4を用いて洗浄した後、結合した組換えヒトのプロテインCチモーゲンを20mM−トリス、150mM−NaCl、10mM−CaCl2、pH7.4を用いて溶離した。溶離した蛋白質はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって判断すると純度95%またはそれ以上であった。
この蛋白質のその後の精製は、この蛋白質をNaClで3Mとし、続いて20mM−トリス、3M−NaCl、10mM−CaCl2、pH7.4と平衡させた疎水性相互作用樹脂(Toyopearl・Phenyl、650M、TosoHaas社製)に吸着させることによって達成した。2カラム容のCaCl2不含の平衡緩衝剤で洗浄した後、組換えヒトプロテインCを20mM−トリス、pH7.4で溶離した。
溶離した蛋白質から残留カルシウムを除去して活性化する準備をした。組換えヒトプロテインCを金属親和性カラム(Chelex−100、Bio−Rad社製)上を通過させてカルシウムを除去し、再度アニオン交換剤(Fast・Flow・Q、Pharmacia社製)に結合させた。両カラムを直列に並べ、20mM−トリス、150mM−NaCl、5mM−EDTA、pH7.4と平衡させた。蛋白質を負荷した後、Chelex−100カラムを1カラム容の同じ緩衝液で洗浄後、連結した装置から外した。アニオン交換カラムを3容の平衡緩衝液で洗浄後、0.4M−NaCl、20mM−トリス−アセテート、pH6.5を用いて蛋白質を溶離した。組換えヒトプロテインC溶液および組換え活性化プロテインC溶液の蛋白質濃度はUV280nmの吸光度によって測定して、各々E0.1%=1.81または1.85の値を得た。
製造例2 組換えヒトプロテインCの活性化
ウシのトロンビンを活性化したCH−セファロース4B(Pharmacia社製)に4℃でpH7.5の50mM−HEPESの存在下に結合させた。この結合反応はトロンビン約5000単位/樹脂mLを用いてカラムに予め充填しておいた樹脂上で行った。カラムにトロンビン溶液を約3時間循環させた後、2−アミノエタノール(MEA)を0.6mL/循環溶液Lの濃度で添加した。このMEA含有溶液をさらに10〜12時間循環させて樹脂上にある未反応アミンの完全な遮断を確保した。遮断に続いてトロンビン結合樹脂を10カラム容の1M−NaCl、20mM−トリス、pH6.5を用いて洗浄し、非特異的に結合した蛋白質を全て除去し、これを活性化緩衝液と平衡させた後に活性化反応に使用した。
精製したr−hPCをEDTA(残留カルシウムがあればキレート化するために)で5mMとし、20mM−トリス、pH7.4または20mM−トリス−アセテート、pH6.5を用いて2mg/mL濃度まで希釈した。この物質を37℃で50mM−NaClおよび20mM−トリス、pH7.4か20mM−トリス−アセテート、pH6.5かのどちらかと平衡させたトロンビンカラム上を通過させた。流速はr−hPCとトロンビン樹脂との間の接触時間が約20分間になるように調節した。溶出液を集めて直ちにアミド分解活性について検定した。この物質が樹立されたaPC標準と比較して特異的(アミド分解的)活性を持たなければ、それをトロンビンカラムに再循環させてr−hPCを完全に活性化させた。それに続いてこの物質を前記と同じpH7.4または6.5の20mM−緩衝液を用いて1:1希釈してaPCを低濃度に保持して次のプロセッシング工程まで待機させた。
このaPC物質から浸出したトロンビンの除去はaPCを150mM−NaClを用いて活性化緩衝液(20mM−トリス、pH7.4または20mM−トリス−アセテート、pH6.5)と平衡させたアニオン交換樹脂(Fast・Flow・Q、Pharmacia社製)に結合させることによって達成した。トロンビンはこれらの条件下にはアニオン交換樹脂とは相互作用せずにカラムを通過して試料用溶出液に入る。カラムにaPCを負荷した後、2〜6カラム容の20mM−平衡緩衝液による洗浄を行った後、5mM−トリス−アセテート、pH6.5または20mM−トリス、pH7.4中の0.4M−NaClを用いる段階的溶離によって結合したaPCを溶離した。カラムの大容積洗浄はドデカペプチドの完全性の高い除去を促進した。このカラムから溶離した物質を凍結溶液中で(−20℃)、または凍結乾燥粉末として保存した。
活性化プロテインCの抗血液凝固作用は、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)血液凝固検定法での血液凝固時間の延長を測定することによって決定した。標準曲線は希釈緩衝液(1mg/mL放射免疫検定級ウシ血清アルブミン[BSA]、20mM−トリス、pH7.4、150mM−NaCl、0.02%NaN3)中、プロテインC濃度125〜1000ng/mLの範囲で作製し、一方、試料はこの濃度範囲内で数段階希釈して調製した。各試料キュベットに冷ウマ血漿50μLおよび再構成した活性化部分トロンボプラスチン時間試薬(APTT試薬、Sigma社製)50μLを添加し、37℃で5分間インキュベーションした。インキュベーション後、適当な試料または標準50μLを各キュベットに添加した。試料または標準品の代わりに希釈緩衝液を用いて基礎血液凝固時間を決定した。各試料または標準品に37℃で30mM−CaCl250μLを添加した直後にフィブロメーター(CoA・Screener・Hemostasis・Analyzer、American・Labor社製)のタイマーを起動させた。試料の活性化プロテインC濃度は標準曲線の線形回帰式から算出した。標準曲線試料の分を含めて、本明細書で報告する血液凝固時間は最低3回反復の平均値である。
実施例1 活性化プロテインCの製剤
ヒトの活性化プロテインCは製造例1および製造例2に記載したようにして製造した。活性化プロテインC製剤は通常の凍結乾燥機による処理法について分析した。凍結乾燥顕微鏡術および示差走査型熱量測定術(DSC)を用いてパラメータ2種を測定して製剤が通常の凍結乾燥機で処理できるかどうかを検討した。凍結乾燥顕微鏡術は凍結乾燥をするために凍結した溶液の崩壊(collapse)温度を決定するためには有用な技術である。DSCは凍結した溶液のガラス転移温度(Tg’)を決定するために有用な技術である。崩壊温度およびガラス転移温度は凍結乾燥工程の間に安全に使用できる温度の上限を予測するために特に有用である。凍結乾燥顕微鏡術の結果はDSCによって得られるTg’値のガラス転移温度と符合する。−40℃またはそれより上の崩壊温度は、通常の凍結乾燥機で処理すべき試料について最適である。
aPC対ショ糖対塩化ナトリウムの比率(10mMまたは20mM−クエン酸塩緩衝液中)は崩壊温度およびガラス転移温度に影響を与える重要な製剤用変数である。通常の凍結乾燥機で処理するためには、塩化ナトリウム濃度は凍乾剤製法の凍結工程の間に塩化ナトリウムが晶出を起こすために十分に高い濃度(好ましくは2.5mg/mLのaPC製剤については325mMおよび5mg/mLのaPC製剤については650mM)でなければならない。aPCの製剤は通常の凍結乾燥機で処理すれば重量比で1部のaPC、6部のショ糖および7.6部の塩化ナトリウムから構成される凍結乾燥製品を製造できる。
実施例2 種々の増量剤を含有する製剤製品におけるaPCの安定性
分子安定性に対する様々な増量剤の効果を検討するため、aPCの製剤を調製した。塩を含有しない燐酸緩衝液中のaPCに合計6種の添加剤を加えた。これらの増量剤はグリシン、マンニトール、ショ糖、トレハロース、ラフィノース、およびヒドロキシエチル澱粉(HES)である。燐酸塩中、無塩、無増量剤製剤(「対照」)でのaPCの安定性を増量剤添加製剤での安定性と比較した。試料は50℃、40℃、および25℃で様々な長さの時間貯蔵した。これらの試料の分析データを初期値(時間=0)と比較した。APTT力価、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)、SDS−PAGEおよび蛋白質含量検定法を使用して製剤の物理学的および化学的安定性を評価した。
aPCの製剤はaPCを燐酸緩衝液にaPC5mg/mLまで溶解することによって調製した。増量剤は6:1の比率(増量剤対aPC)または30mg/mLでaPC溶液の一部に添加した。これらの試料を凍結乾燥してaPC5mg/バイアルとした。
これらの製剤は50℃で14日間および28日間;40℃で28日間、48日間および6ケ月間;および25℃で6ケ月間および12ケ月間;にわたる安定性試験を行った。各時点において、各製剤のバイアル2個を別個の試料として独立に分析し、これらの試料から得たデータを初期値(時間=0)と比較した。分析には、aPC力価(APTT)、SDS−PAGE、aPCモノマーの百分率、および蛋白質含量を含めた。
pH、色、包装特性および物理的外観にはどの試料にも1年の安定性試験期間内に顕著な変化は認められなかった。ATPPおよびSE−HPLC操作で分析すると、HES製剤およびグリシン製剤は対照と比較して物理学的安定性(凝集による)および化学的安定性(力価)が低かった。マンニトール製剤は対照と比較すると僅かに良好な物理学的および化学的安定性を示したが、その他の製剤、すなわちショ糖、トレハロースおよびラフィノースの製剤は全て対照と比較してはるかに優れた物理学的および化学的な安定性を示した。それ故、aPC製剤における増量剤としてのマンニトール、ショ糖、トレハロースおよびラフィノースは増量剤不含またはグリシンまたはHESを有するaPC製剤と比較して化学的および物理学的に優れた安定性を示す。
実施例3 組換えヒト活性化プロテインCの安定性
組換えヒト活性化プロテインC(aPC)の凍結乾燥製剤2ロットを40℃/相対湿度75%で1ケ月貯蔵後、分解の可能性について分析した。aPCの安定性は無菌水で再構成し、常温で72時間まで貯蔵したものについても観察した。バイアル中の凍結乾燥aPC製品はaPC10mg、ショ糖60mg、塩化ナトリウム76mg、およびクエン酸塩15.1mgを含有していた。この製剤中のaPCは乾燥状態では40℃/相対湿度75%で短くとも1ケ月間は安定であって、溶液中では常温で貯蔵した時には24時間安定である。
両ロットはバイアル当りaPC10mg、ショ糖60mg、塩化ナトリウム76mgおよびクエン酸塩15.1mgを含有する同一の単位処方を使用して製造した。aPCの両凍結乾燥ロットは40℃/相対湿度75%で1ケ月間貯蔵後にAPTT検定、aPCペプチドを定量するためのイオン対形成HPLC、および蛋白質変化体を定量するための質量分析を使用してaPCの安定性を観察した。ロットの一つは無菌水を使用してaPC1mg/mLに再構成し、常温に保持した。溶液中におけるaPCの安定性は0時間、1時間、4時間、8時間、24時間、48時間および72時間の時点でAPTTおよび質量スペクトル術を使用して観察した。
乾燥状態では40℃/相対湿度75%で1ケ月間の貯蔵後にaPC活性の低下は認められず、また分子構造の分解量は有意でなかった。この製剤中のaPCは1mg/mLに再構成後、24時間まで安定である。
Claims (16)
- 活性化プロテインC;増量剤であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノースおよびショ糖、およびそれらの混合物で構成される群から選択されたもの;および再構成した際に得られる製剤が5.5〜6.3との間のpHを有するような緩衝剤系、を含む安定な凍結乾燥製剤。
- 緩衝剤系がクエン酸ナトリウムを含有する、請求項1に記載の製剤。
- 活性化プロテインCと、増量剤であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノースおよびショ糖で構成される群から選択されたものを含有する凍結乾燥製剤であって、該活性化プロテインCと該増量剤との重量比が1:5〜1:7である、凍結乾燥製剤。
- 増量剤がショ糖、トレハロース、またはラフィノースである請求項1〜3のいずれか1項に記載の製剤。
- 増量剤がショ糖である請求項4の製剤。
- さらに医薬的に許容される塩を含む請求項1〜5のいずれか1項に記載の製剤。
- 重量比が活性化プロテインC1部、塩7部と8部との間、および増量剤5部と7部との間、である請求項6の製剤。
- 重量比が活性化プロテインC1部、塩7.6部、および増量剤6部、である請求項6の製剤。
- 塩がNaClであり、増量剤がショ糖である請求項8の製剤。
- 活性化プロテインC5mg、ショ糖30mgおよびNaCl38mgを含む安定な凍結乾燥製剤。
- 活性化プロテインC20mg、ショ糖120mgおよびNaCl152mgを含む安定な凍結乾燥製剤。
- 活性化プロテインCと、増量剤であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、ショ糖およびその混合物で構成される群から選択されたものを含有する溶液を凍結乾燥することを含む請求項1〜11のいずれか1項に記載の製剤を製造する方法。
- 溶液のpHが5.5〜6.3の間である、請求項12に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の製剤を含む単位用量レセプタクルを含む単位用量剤型。
- 脈管内血液凝固を伴う病状の処置における薬剤として使用するための請求項1〜11のいずれか1項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
- 血栓症発作の処置における薬剤として使用するための請求項1〜11のいずれか1項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
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