PL195090B1

PL195090B1 - Stabilny liofilizowany preparat aktywowanego białka C i jego stosowanie

Info

Publication number: PL195090B1
Application number: PL98336889A
Authority: PL
Inventors: Andrew David Carlson; Theodore Arsay Sheliga
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2007-08-31
Also published as: TR199902631T2; EP0875563A2; TW585871B; ID22933A; JP4383547B2; WO1998048818A1; HUP0100284A2; CN1261280A; CZ298429B6; EA002149B1; AU7161898A; DK0875252T3; ATE285788T1; EP0875252A2; AR015598A1; CN1254284A; PL336420A1; AR012010A1; US6159468A; CA2287267C

Abstract

1. Stabilny liofilizowany preparat, znamienny tym, ze zawiera rekombinacyjne ludzkie akty- wowane bia lko C, sól, i wype lniacz wybrany z grupy, do której nale zy mannit, trehaloza, rafinoza, sa- charoza, przy czym stosunek wagowy wynosi 1 czesc rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego bia l- ka C na oko lo 7 do 8 cz esci soli i oko lo 5-7 cz esci wype lniacza. 13. Stabilny liofilizowany preparat zdefiniowany w zastrz. 1 do stosowania w leczeniu chorób zwi azanych z wykrzepianiem wewn atrznaczyniowym. 15. Stabilny liofilizowany preparat zdefiniowany w zastrz. 1 do stosowania w leczeniu udaru po- chodzenia zakrzepowego. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest stabilny liofilizowany preparat aktywowanego białka C i jego stosowanie zwłaszcza w leczeniu chorób naczyniowych.

Białko C jest proteazą serynową i występującą naturalnie substancją przeciwkrzepliwą, odgrywającą rolę w regulowaniu homeostazy poprzez unieczynnianie czynników V_a i Vlll_a kaskady krzepnięcia. Ludzkie białko C in vivo tworzy się głównie w wątrobie jako pojedynczy polipeptyd, zbudowany z 461 aminokwasów. Ta jednołańcuchowa cząsteczka prekursorowa ulega wielu modyfikacjom posttranslacyjnym; dochodzi do: 1) odcięcia 42-aminokwasowej sekwencji sygnałowej 2) proteolitycznego usunięcia z jednołańcuchowego zymogenu reszty lizynowej z pozycji 156 i reszty argininowej z pozycji 157 dla wytworzenia cząsteczki w postaci 2-łańcuchowego zymogenu (to znaczy, lekki łańcuch 155 reszt aminokwasowych łączy się mostkiem dwusiarczkowym z zawierającym proteazę serynową łańcuchem ciężkim, utworzonym z 262 reszt aminokwasowych) 3) zależnej od witaminy K karboksylacji dziewięciu reszt kwasu glutaminowego, skupionych w pierwszych 42 aminokwasach łańcucha lekkiego, w wyniku czego powstają 42 reszty kwasu gamma-karboksyglutaminowego i 4) przyłączenie węglowodanu w czterech miejscach (jednym w łańcuchu lekkim i trzech w łańcuchu ciężkim). Łańcuch ciężki zawiera znaną triadę proteazy serynowej Asp 257, His 211 i Ser 360. I wreszcie, krążący 2-łańcuchowy zymogen jest aktywowany in vivo przez trombinę na powierzchni fosfolipidu w obecności jonu wapnia. Aktywacja wynika z usunięcia dodekapeptydu na końcu N łańcucha ciężkiego, w wyniku czego powstaje aktywowane białko C (aPC), wykazujące aktywność enzymatyczną.

Oprócz enzymatycznego działania aPC w obrębie kaskady krzepnięcia krwi, aPC może również ulegać samorozpadowi, co prowadzi do zmniejszenia jego funkcjonalności jako substancji przeciwkrzepliwej. Autorzy odkryli ważny szlak rozpadu. Samorząd końca N łańcucha lekkiego może powodować powstanie klipsa na jednej stronie reszty histydynowej w pozycji 10. Tak więc na tym szlaku rozpadu powstają dwa nieczynne produkty: 1) dez(1-9) aktywane białko C, z którego usunięto pierwsze dziewięć reszt N-końcowych łańcucha lekkiego i 2) dez(1-10) aktywowane białko C, z którego usunięto pierwsze dziesięć reszt N-końcowych łańcucha lekkiego. Ten szlak rozpadu, dotąd nie opisywany, powoduje zmniejszenie aktywności przeciwkrzepliwej z powodu usunięcia krytycznych reszt GLA w pozycjach 6 i 7. Tak więc w celu wytworzenia silnego, wysoce oczyszczonego preparatu farmaceutycznego aktywowanego białka C niezbędne jest zmniejszenie do minimum poziomu dez(1-9) i dez(1-10) aktywowanych produktów samorozpadu białka C.

Odmiany te są uprzednio nie znanymi produktami rozpadu i bardzo trudne, jeżeli nie niemożliwe, jest ich usunięcie konwencjonalnymi sposobami oczyszczania. Zgłaszający odkryli również, że rozpuszczalność w stanie stałym ulega znaczącemu zwiększeniu w obecności wybranej grupy środków wypełniających. Oczywiście korzystne jest zmniejszenie do minimum takiego rozpadu aktywowanego białka C, zarówno w roztworze, jak i w stanie stałym w postaci liofilizatu. W związku z tym odkrycia te umożliwiają wytworzenie silnego, wysoce oczyszczonego preparatu farmaceutycznego aktywowanego białka C o korzystnym wyglądzie dla pracowników służby zdrowia.

W stanie techniki w opisie patentowym EP 726076 ujawniono kompozycję aktywowanego białka C zawierającą co najmniej jeden aminokwas, albuminę i/lub niejonowy środek powierzchniowo czynny. Brakuje w tym opisie jednak ujawnienia optymalnego pH stabilizacji aktywowanego białka C jak też wypełniacza w specyficznym stosunku ilościowym do aPC.

Natomiast opis patentowy JP 8301786 ujawnią jedną szczególną kompozycje aPC (różniącą się zasadniczo od kompozycji według niniejszego wynalazku) zawierającą co najmniej jeden aminokwas i albuminę lub środek powierzchniowo-czynny, o którym się mówi, że zapewnia stabilność.

W opisach patentowych JP 8301786 jak i EP 726076 nie zawarto żadnych informacji, które sugerowałyby konkretny bufor, konkretne pH czy wypełniacz, jak w niniejszym wynalazku, do wytworzenia kompozycji aPC zawierającej produkty o minimalnej autodegradacji des(1-9)aPC i des(1-10)aPC.

Celem niniejszego wynalazku było otrzymanie ulepszonych preparatów aktywowanego białka C, w zasadzie wolnych od produktów samorozpadu, zwłaszcza postaci des(1-9) i des(1-10) łańcucha lekkiego aktywowanego białka C. Tak więc preparaty te są korzystne do zastosowania u pacjenta wymagającego leczenia.

Według wynalazku stabilny liofilizowany preparat aktywowanego białka C, charakteryzuje się tym, że zawiera rekombinacyjne ludzkie aktywowane białko C, sól, i wypełniacz wybrany z grupy, do której należy mannit, trehaloza, rafinoza, sacharoza, przy czym stosunek wagowy wynosi 1 część

PL 195 090 B1 rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka C na około 7 do 8 części soli i około 5-7 części wypełniacza.

W korzystnym wykonaniu wynalazku stosunek wagowy wynosi 1 część rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka C na 7,6 części soli i 6 części wypełniacza.

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku preparat zawiera sól wybraną z chlorku potasu i chlorku sodu, korzystnie sól stanowi chlorek sodu.

Zgodnie z wynalazkiem preparat jako wypełniacz korzystnie zawiera sacharozę.

W dalszym korzystnym wykonaniu preparat według wynalazku charakteryzuje się tym, że po rekonstytucji otrzymany preparat zawiera 5 mg/ml rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka 4a C, 30 mg/ml sacharozy i 38 mg/ml chlorku sodu, korzystnie zawiera 20 mg/ml rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka C, 120 mg/ml sacharozy i 152 mg/ml chlorku sodu.

W innym korzystnym wykonaniu preparat ponadto zawiera bufor wybrany z Tris-octanu, cytrynianu sodu i fosforanu sodu lub ich mieszaniny, przy czym po rekonstytucji preparat ma pH od 5,5-6,5. Korzystny bufor stanowi cytrynian sodu, a sól wybiera się korzystnie z chlorku potasu i chlorku sodu lub korzystniej sól stanowi chlorek sodu. W tym preparacie wypełniacz korzystnie stanowi sacharoza.

Według wynalazku stabilny liofilizowany preparat aktywowanego białka C zdefiniowany wyżej stosuje się w leczeniu chorób związanych z wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym, zwłaszcza wybranym z grupy składającej się z udaru pochodzenia zakrzepowego, zakrzepicy żył głębokich, zatoru tętnicy płucnej, obwodowej zakrzepicy tętnic, zatorów pochodzących z serca lub tętnic obwodowych, ostrego zawału mięśnia sercowego, rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego i ostrej zakrzepicy przed- lub zawłośniczkowej, a zwłaszcza korzystnie w leczeniu udaru pochodzenia zakrzepowego.

Dla celów niniejszego wynalazku, określonego poniższym opisem i zastrzeżeniami, definiuje się poniżej następujące terminy. aPC, czyli aktywowane białko C, oznacza aktywowane białko C, rekombinacyjne lub pochodzące z osocza. Pojęcie aPC obejmuje, i aPC stanowi korzystnie, ludzkie aktywowane białko C, jakkolwiek aPC może również stanowić inne rodzaje aPC lub jego pochodne, wykazujące charakterystyczne dla białka C właściwości proteolityczne, amidolityczne, esterolityczne i biologiczne (przeciwkrzepliwe lub profibrynolityczne). Przykłady pochodnych białka C opisał Gerlitz i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 5453373, i Foster i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 5516650; oba te opisy włącza się w całości do niniejszego opisu przez przywołanie.

APTT - czas częściowej tromboplastyny po aktywacji r-hPC - rekombinacyjny ludzki zymogen białka C r-aPC - rekombinacyjne aktywowane białko C, wytwarzane poprzez aktywację zymogenu białka C in vitro lub in vivo lub poprzez bezpośrednie wydzielanie aktywowanej postaci białka C z komórek prokariotycznych, komórek eukariotycznych lub zwierząt transgenicznych, włączając w to na przykład wydzielanie przez komórki nerki ludzkiej 293 w postaci zymogenu, i następnie oczyszczanie i aktywowanie sposobami znanymi specjalistom i przedstawionymi przez Yana, patent Stanów Zjednoczonych 4981952 i Cottinghama, WO 97/20043, które włącza się w całości do niniejszego opisu przez przywołanie.

Ciągły wlew - w zasadzie nieprzerwane podawanie roztworu do naczynia krwionośnego przez określony czas.

Wstrzyknięcie w postaci bolusu - szybkie wstrzyknięcie określonej ilości leku (zwanej bolusem).

Korzystny do podawania - preparat liofilizowany lub roztwór, nadający się do zastosowania jako środek terapeutyczny. Zymogen - zymogen białka C, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza wydzielone nieaktywne postacie, jedno- lub dwułańcuchowe, białka C.

Bufor dopuszczalny farmaceutycznie - farmaceutycznie dopuszczalny bufor znany ze stanu techniki. Do farmaceutycznie dopuszczalnych buforów należą fosforan sodowy, cytrynian sodowy, octan sodowy i TRIS.

Aktywowane białko C jest substancją przeciwzakrzepową o szerszym wskaźniku terapeutycznym, niż dostępne środki przeciwkrzepliwe, takie jak heparyna i doustne środki przeciwkrzepliwe typu hydroksykumaryny.

Jako środek przeciwzakrzepowy aPC ma duże znaczenie w leczeniu wielu rozmaitych chorób nabytych, związanych z wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym, takich jak udar pochodzenia zakrzepowego, zakrzepica żył głębokich, zator tętnicy płucnej i jej odgałęzień, obwodowa zakrzepica tętnic, zatory pochodzące z serca lub tętnic obwodowych, ostry zawał mięśnia serca, rozsiane wykrzepianie

PL 195 090 B1 wewnątrznaczyniowe i ostra zakrzepica przed- lub zawłośniczkowa, na przykład po przeszczepach lub w zakrzepicy siatkówki.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są preparaty aktywowanego białka C. Korzystny byłby preparat, stanowiący stabilny, liofilizowany produkt o wysokiej czystości, zawierający aktywowane białko C i wypełniacz dobrany z grupy, do której należy mannit, trehaloza, rafinoza i sacharoza. Produkt liofilizowany rozpuszcza się w odpowiednim rozcieńczalniku, na przykład w jałowej wodzie lub jałowej soli fizjologicznej. Korzystnie, pH powstałego roztworu wynosi od około 5,5 do około 6,5.

Interakcje cząsteczkowe w preparacie, między aktywowanym białkiem C, buforem, stężeniem soli, pH, temperaturą i wypełniaczem, są złożone, a znaczenie każdego z czynników dla stabilności preparatu jest nie do przewidzenia. Preparaty liofilizowane według niniejszego wynalazku po wytworzeniu zawiesiny dostarczają stabilnego, enzymatycznie czynnego, aktywowanego białka C, z powodu zmniejszenia samorozpadu.

Produkty według niniejszego wynalazku wykazują zwłaszcza obniżony poziom dez(1-9) aPC i dez(1-10) aPC. Ogólnie, poziom dez(1-9) aPC i dez(1-10) aPC wynosi poniżej 10% produktów samorozpadu. Korzystnie, poziom dez(1-9) aPC i dez(1-10) aPC wynosi poniżej 8% produktów samorozpadu. Jeszcze korzystniej, poziom dez(1-9) aPC i dez(1-10) aPC wynosi poniżej 5% produktów samorozpadu, i najkorzystniej, poziom dez(1-9)aPC i dez(1-10) aPC wynosi poniżej 3% produktów samorozpadu. Stabilność tę osiąga się poprzez dodanie sacharozy, trehalozy, rafinozy lub mannitu.

Co ciekawe, inne wypełniacze, takie jak skrobia hydroksyetylowa i glicyna, nie zapewniają niezbędnej stabilności ani korzystnego wyglądu preparatu farmaceutycznego. Wypełniacz według niniejszego wynalazku pozwala wytworzyć preparat o korzystnym, jednolitym wyglądzie, łatwo rozpuszczający się przy zastosowaniu odpowiedniej substancji rozpuszczonej. Po rozpuszczeniu preparat jest stabilny przez czas do 24-48 godzin w temperaturze pokojowej. Pozwala to uzyskać preparat o dotąd niemożliwej do uzyskania stabilności.

Korzystne wypełniacze w preparacie aktywowanego białka C stanowią sacharoza, trehaloza i rafinoza. Korzystniejsze wypełniacze stanowią sacharoza i rafinoza, a najkorzystniejszy wypełniacz stanowi sacharoza. Ilość wypełniacza w preparacie wynosi 1 część aPC na 1-10 części wypełniacza (wagowo).

Ponadto, stężenie wypełniacza w preparacie jest zmienną preparatu ważną dla procesu liofilizacji. Optymalne stężenie wypełniacza zależy od ilości aPC i rodzaju dobranego wypełniacza. Korzystne stężenie sacharozy w roztworze liofilizowanym wynosi 10-40 mg/ml. Korzystniejsze stężenie sacharozy wynosi 15-30 mg/ml. Najkorzystniejsze stężenie sacharozy w roztworze liofilizowanym wynosi 15 mg/ml w preparacie aPC w ilości 2,5 mg/ml. Najkorzystniejsze stężenie sacharozy w roztworze liofilizowanym wynosi 30 mg/ml w preparacie aPC w ilości 5 mg/ml. Obecność zastrzeżonego wypełniacza w preparacie aktywowanego białka C zapewnia zwiększoną stabilność chemiczną i fizyczną.

Przed liofilizacją i w czasie rozpuszczania korzystne jest utrzymywanie pH w zakresie 5,5-6,5 w celu zmniejszenia do minimum samorozpadu roztworu. Korzystne pH preparatu stanowi pH w zakresie od około 5,6 do około 6,4. Korzystniejsze pH preparatu stanowi pH w zakresie od około 5,7 do około 6,3. Jeszcze korzystniejsze pH preparatu stanowi pH w zakresie od około 5,8 do około 6,2. Jeszcze korzystniejsze pH preparatu stanowi pH w zakresie od około 5,9 do około 6,1. Najkorzystniejsze pH preparatu stanowi pH około 6,0.

W celu utrzymania skutecznej kontroli pH roztwór aPC powinien zawierać farmaceutycznie dopuszczalny bufor. W związku z tym w czasie liofilizacji preparat ewentualnie i korzystnie zawiera farmaceutycznie dopuszczalny bufor.

Przykłady układów buforowych stanowią Tris-octan, cytrynian sodowy i fosforan sodowy. Korzystniejsze układy buforowe stanowią cytrynian sodowy i fosforan sodowy. Najkorzystniejszy bufor stanowi cytrynian sodowy. Korzystna molarność układu buforowego wynosi 10 mM - 50 mM. Korzystniejsza molarność układu buforowego wynosi 10 mM - 20 mM. Najkorzystniejsza molarność układu buforowego wynosi 40 mM. Specjalista zauważy, że dostępnych jest jeszcze wiele innych układów buforowych, które można także stosować w preparatach według niniejszego wynalazku.

Podobnie, w czasie liofilizacji i rozpuszczania siła jonowa jest zmienną krytyczną dla zapewnienia stabilności stanu rozpuszczonego. Siła jonowa jest zwykle określona przez stężenie soli w roztworze. Do farmaceutycznie dopuszczalnych soli, typowo stosowanych dla wytworzenia siły jonowej, należą, jednak bez ograniczenia, chlorek potasu (KCl) i chlorek sodu (NaCl).

PL 195 090 B1

Korzystną sól w niniejszym wynalazku stanowi chlorek sodu. W czasie liofilizacji stężenie soli musi być dostatecznie wysokie dla spowodowania krystalizacji soli w czasie etapu zamrażania cyklu liofilizacji. Korzystne, stężenie chlorku sodu wynosi powyżej 150 mM.

Korzystniej, stężenie chlorku sodu w roztworze zamrażającym wynosi od 150 mM do 1000 mM. Dla preparatu zawierającego 2,5 mg/ml aPC, korzystniejsze stężenie chlorku sodu w roztworze zamrażającym wynosi od 150 mM do 650 mM. Jeszcze korzystniej, stężenie chlorku sodu w roztworze zamrażającym wynosi od 250 mM do 400 mM. Jeszcze korzystniej, stężenie chlorku sodu w roztworze zamrażającym wynosi od 300 mM do 400 mM. Najkorzystniej, stężenie chlorku sodu w roztworze zamrażającym wynosi 325 mM dla preparatu zawierającego 2,5 mg/ml aPC.

Podobnie, dla preparatu zawierającego 5,0 mg/ml aPC, korzystniejsze stężenie chlorku sodu w roztworze zamrażającym wynosi od 150 mM do 1000 mM. Jeszcze korzystniej, stężenie chlorku sodu w roztworze zamrażającym wynosi od 250 mM do 750 mM. Jeszcze korzystniej, stężenie chlorku sodu w roztworze zamrażającym wynosi od 400 mM do 700 mM. Najkorzystniej, stężenie chlorku sodu w roztworze zamrażającym wynosi 650 mM dla preparatu zawierającego 5,0 mg/ml aPC.

Stosunek aPC:sól:wypełniacz (wagowo) jest istotnym czynnikiem w preparacie nadającym się do liofilizacji. Stosunek ten waha się w zależności od stężenia aPC, doboru i stężenia soli oraz doboru i stężenia wypełniacza. Specjalista może łatwo wyznaczyć korzystny stosunek aPC:sól:wypełniacz sposobami znanymi ze stanu techniki, opisanymi na przykład w przykładzie 1. Bardziej szczegółowo, korzystny jest stosunek wagowy jednej części aktywowanego białka C na 7-8 części soli i 5-7 części wypełniacza. Korzystniejszy jest stosunek wagowy jednej części aktywowanego białka C na 7,5-8 części soli i 5,5-6,5 części wypełniacza. Najkorzystniejszy jest stosunek wagowy jednej części aktywowanego białka C na około 7,6 części soli i około 6 części wypełniacza.

Korzystną solą jest chlorek sodu w stężeniu 325 mM (dla preparatu zawierającego 2,5 mg/ml aPC) i 650 (dla preparatu zawierającego 5,0 mg/ml aPC) i w stosunku około 1,3:1 do sacharozy (wagowo). To stężenie jest dostatecznie wysokie dla spowodowania krystalizacji soli w czasie zamrażania, i najprawdopodobniej powstaje wówczas amorficzna mieszanina aPC, sacharozy i cytrynianu, którą można poddać liofilizacji. Tak więc siła jonowa NaCl w korzystnym stężeniu 325 mM i 650 mM nadaje stabilność preparatowi w czasie procesu liofilizacji.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również sposób wytwarzania stabilnego preparatu liofilizowanego, obejmujący liofilizację roztworu, zawierającego aktywowane białko C i wypełniacz dobrany z grupy, do której należy mannit, trehaloza, rafinoza, sacharoza i ich mieszaniny. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również sposób wytwarzania stabilnego preparatu liofilizowanego, obejmujący liofilizację roztworu, zawierającego około 2,5 mg/ml aktywowanego białka C, około 15 mg/ml sacharozy, około 19 mg/ml NaCl i bufor cytrynian sodowy o pH powyżej 5,5, lecz poniżej 6,5. Ponadto, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania stabilnego preparatu liofilizowanego, obejmujący liofilizację roztworu, zawierającego około 5 mg/ml aktywowanego białka C, około 30 mg/ml sacharozy, około 38 mg/ml NaCl i bufor cytrynian sodowy o pH powyżej 5,5, lecz poniżej 6,5.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również postać dawek jednostkowych, zawierająca pojemnik z dawką jednostkową, zawierający stabilny, liofilizowany preparat, zawierający aktywowane białko C i wypełniacz dobrany z grupy, do której należy mannit, trehaloza, rafinoza, sacharoza i ich mieszaniny. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również sposób leczenia chorób związanych z wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym, obejmujący podawanie opisanego wyżej preparatu.

aPC korzystnie podaje się pozajelitowo dla zapewnienia jego przedostania się do krwiobiegu w postaci skutecznej poprzez wstrzyknięcie odpowiedniej dawki w postaci ciągłego wlewu w czasie od około jednej do około czterdziestu ośmiu godzin. aPC podaje się w ilości od około 0,01 mg/kh/h do około 0,05 mg/kh/h. Zamiast tego aPC można podawać poprzez wstrzyknięcie części odpowiedniej dawki godzinowej w postaci bolusu w czasie od około 5 minut do około 30 minut, i następnie ciągły wlew odpowiedniej dawki w czasie od około dwudziestu trzech do około 47 godzin, w wyniku czego odpowiednia dawka podana jest w czasie 24-48 godzin.

Poniższe przykłady ułatwiają opisanie zastosowania wynalazku i są jego ilustracją. Zakres niniejszego wynalazku nie jest ograniczony do poniższych przykładów.

Proces 1

Preparat ludzkiego białka C

W komórkach nerki ludzkiej 293 wytworzono rekombinacyjne ludzkie białko C (r-hPC) sposobami znanymi specjalistom, takimi jak opisane przez Yana w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4981952, który włącza się w całości do niniejszego opisu przez przywołanie. Gen kodujący ludzkie

PL 195 090 B1 białko C został opisany i zastrzeżony przez Banga i wsp., w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4775624, który włącza się w całości do niniejszego opisu przez przywołanie. Plazmid stosowany do ekspresji ludzkiego białka C w komórkach 293 stanowił plazmid pLPC, opisany przez Banga i wsp., w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4992373, który włącza się w całości do niniejszego opisu przez przywołanie. Wytwarzanie plazmidu pLPC opisano także w Europejskiej Publikacji Patentowej nr 0445939 i opisał je Grinnel i wsp., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192; publikację tę również włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Pokrótce, plazmid transfekowano do komórek 293, następnie zidentyfikowano stabilne transformanty i hodowano je w pożywce bez surowicy. Pożywkę bez surowicy wytworzono po fermentacji, przez mikrofiltrację.

Ludzkie białko C oddzielono od płynu hodowli adaptacją sposobu Yana z patentu Stanów Zjednoczonych nr 4981952. Sklarowaną pożywkę doprowadzono do objętości 4 mM w EDTA, po czym absorbowano na żywicę anionowymienną (Fast-Flow Q, Pharmacia). Po przemyciu 4 objętościami kolumny 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 i 2 objętościami kolumny 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4, związany rekombinacyjny zymogen ludzkiego białka C eluowano 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Eluowane białko było po elucji w ponad 95% oczyszczone, co oceniono poprzez elektroforezę na żelu SDS-poliakrylamidowym.

Dalszego oczyszczenia białka dokonano poprzez wytworzenie 3M zawiesiny białka w NaCl i następnie adsorpcję na hydrofobową żywicę interaktywną (Toyopearl Phenyl 650 mM, TosoHaas), zrównoważoną w 20 mM Tris, 3M NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Po przemyciu 2 objętościami kolumny bufora równoważącego bez CaCl₂, ludzkie rekombinacyjne białko C eluowano 20 mM Tris, pH 7,4.

Eluowane białko przygotowano do aktywacji poprzez usunięcie pozostałego wapnia. Rekombinacyjne ludzkie białko C przepuszczono przez metalową kolumnę powinowactwa (Chelex-100, BioRad) w celu usunięcia wapnia i ponownie związano z anionowymieniaczem (Fast Flow Q, Pharmacia). Obie kolumny ustawiono w serię i zrównoważono w 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,4. Po nałożenia białka kolumnę Chelex-100 przemyto jedną objętością kolumny tego samego buforu, przed odłączeniem jej z serii. Kolumnę anionowymienną przemyto 3 objętościami kolumny bufora równoważącego przed eluowaniem białka 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-octanu, pH 6,5. Stężenie białka w roztworach rekombinacyjnego ludzkiego białka C i rekombinacyjnego aktywowanego białka C mierzono^, o^dpowⁱe^dnⁱo^{, p}rz^y eksjnkj UV ²⁸⁰ nm E⁰¹¹%=1,⁸1 ^lu^b 1,⁸5.

Proces 2

Aktywowanie rekombinacyjnego ludzkiego białka C

W obecności 50 mM HEPES, pH 7,5, w temperaturze 4°C, sprzężono trombinę bydlęcą z aktywowaną CH-Sepharose 4B (Pharmacia). Reakcję sprzężenia przeprowadzono na żywicy już nałożonej na kolumnę, stosując około 5000 jednostek trombiny/ml żywicy. Roztwór trombiny poddano krążeniu przez kolumnę przez około 3 godziny, po czym dodano 2-aminoetanol (MEA) w stężeniu 0,6 ml/l krążącego roztworu. Roztwór zawierający MEA poddano krążeniu przez dodatkowe 10-12 godzin w celu zapewnienia całkowitego zablokowania nieprzereagowanych amin na żywicy. Po zablokowaniu żywicę sprzężoną z trombiną przemyto 10 objętościami kolumny 1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 6,5, w celu usunięcia całości białka związanego nieswoiście, i zastosowano do reakcji aktywacji, po zrównoważeniu w buforze aktywującym.

Wytworzono 5 mM zawiesinę r-hPC w EDTA (w celu chelatacji ewentualnie pozostałego wapnia) i rozcieńczono do stężenia 2 mg/ml 20 mM Tris, pH 7,4, lub 20 mM Tris-octanu, pH 6,5. Materiał ten przepuszczono przez kolumnę trombinową, zrównoważoną w temperaturze 37°C 50 mM NaCl i albo 20 mM Tris, pH 7,4, albo 20 mM Tris-octanu, pH 6,5. Prędkość przepływu ustawiono tak, aby zapewnić około 20-minutowy czas kontaktu między r-hPC a żywicą trombinową. Wyciek zebrano i natychmiast zbadano w nim aktywność amidolityczną. Jeżeli substancja nie wykazywała aktywności swoistej (amidolitycznej) porównywalnej z ustaloną normą aPC, poddawano ją ponownemu cyklowi na kolumnie trombinowej w celu aktywowania r-hPC, aż do ukończenia. Następnie substancję rozcieńczono 1:1 20 mM bufora jak wyżej, przy pH 7,4 lub 6,5 dla utrzymania mniejszego stężenia aPC przed następnym etapem obróbki.

Dokonano usunięcia wyługowanej trombiny z substancji aPC poprzez związanie aPC z żywicą anionowymienną (Fast Flow Q, Pharmacia), zrównoważoną w buforze aktywacyjnym (20 mM Tris, pH 7,4, lub 20 mM Tris-octanu, pH 6,5) z 150 mM NaCl. Trombina w tych warunkach nie reaguje z żywicą anionowymienną, lecz przechodzi przez kolumnę, wyciekając do miejsca pobierania próbek. Po nałożeniu aPC na kolumnę, dokonuje się płukania 2-6 objętościami kolumny 20 mM buforu równoważącego przed eluowaniem związanego aPC w etapie elucji z zastosowaniem 0,4 M NaCl w 5 mM

PL 195 090 B1

Tris-octanu, pH 6,5, lub 20 mM Tris, pH 7,4. Większa objętość płukania kolumny ułatwia bardziej całkowite usunięcie dodekapeptydu. Substancję eluowaną z tej kolumny przechowywano w postaci zamrożonego roztworu (-20°C) lub liofilizowanego proszku.

Aktywność przeciwzakrzepową aktywowanego białka C oznaczano poprzez pomiar wydłużenia czasu krzepnięcia w teście czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT). Wytworzono standardowa krzywą w buforze rozcieńczającym (1 mg/ml bydlęcej albuminy surowicy [BSA] o czystości do badań radioimmunologicznych, 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% NaNs) w zakresie stężenia białka C od 125 do 1000 ng/ml i wytworzono próbki w kilku rozcieńczeniach w tym zakresie stężeń.

Do każdej kuwety z próbką dodano 50 μΙ zimnego osocza końskiego i 50 μΙ rozpuszczonego aktywowanego odczynnika do testu czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (odczynnik APTT, Sigma) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 minut. Po inkubacji do każdej kuwety dodano 50 μΙ odpowiedniej próbki lub wzorca.

W celu określenia podstawowego czasu krzepnięcia zamiast próbki lub wzorca zastosowano bufor rozcieńczający. Stoper fibrometru (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) włączono bezpośrednio po dodaniu do każdej próbki lub wzorca 50 μl 30 mM CaCh w temperaturze 37°C. Stężenie aktywowanego białka c w próbkach obliczano z równania regresji liniowej krzywej standardowej. Podane wartości czasu krzepnięcia stanowią średnią z co najmniej trzech oznaczeń, w tym próbki krzywej standardowej.

P r z y k ł a d 1

Preparat aktywowanego białka C

Według opisów z procesu 1 i 2 wytworzono ludzkie aktywowane białko C. Preparaty aktywowanego białka C analizowano pod kątem obróbki w konwencjonalnym urządzeniu do liofilizacji. W celu oznaczenia dwóch parametrów decydujących o tym, czy preparat można poddawać obróbce w konwencjonalnym urządzeniu do liofilizacji, zastosowano mikroskopię liofilizacji i różnicową kalorymetrie skaningową (DSC).

Mikroskopia liofilizacji jest użyteczną techniką oznaczania temperatury zapadania się zamrożonych roztworów, przeznaczonych do liofilizacji. DCS jest użyteczną techniką oznaczania temperatury zeszklania (Tg') zamrożonego roztworu. Temperatura zapadania się i temperatura zeszklania są szczególnie użyteczne w przewidywaniu górnej granicy temperatury, którą można bezpiecznie zastosować w czasie liofilizacji. Wyniki mikroskopii liofilizacji są uzupełniające w stosunku do temperatury zeszklania Tg' wartości uzyskanych w DSC.

W celu obróbki próbki w konwencjonalnym urządzeniu do liofilizacji optymalna jest temperatura zapadania powyżej -40°C.

T a b e l a 1

Liofilizacja matryc preparatów aPC

Matryca preparatu
Stężenie aPC	Stężenie sacharozy	Stężenie NaCl	Temperatura zapadania
2,5 mg/ml	15 mg /ml	50 mM	-59°C
2,5 mg /ml	15 mg /ml	150 mM	-60°C
2,5 mg/ml	15 mg /ml	325 mM	-37°C
5,0 mg /ml	30 mg /ml	50 mM	od -50 do -45°C
5,0 mg/ml	30 mg /ml	150 mM	od -60 do -55°C
5,0 mg/ml	30 mg /ml	325 mM	-64°C
5,0 mg /ml	30 mg /ml	650 mM	od -32 do -28°C

Stosunek aPC do sacharozy i chlorku sodu (w 10 lub 20 mM buforze cytrynianowym) jest istotną zmienną preparatu, wpływającą na temperaturę zapadania i temperaturę zeszklenia.

W celu obróbki w konwencjonalnym urządzeniu do liofilizacji stężenie chlorku sodu musi być dostatecznie wysokie (korzystnie 325 mM dla preparatu zawierającego 2,5 mg/ml aPC i 650 mM dla preparatu zawierającego 5 mg/ml aPC) dla spowodowania wykrystalizowania chlorku sodu w etapie zamrażania procesu liofilizacji. Preparaty aPC można obrabiać w konwencjonalnym urządzeniu do

PL 195 090 B1 liofilizacji w celu wytworzenia liofilizowanych produktów zawierających 1 część aPC, 6 części sacharozy i 7,6 części chlorku sodu (wagowo).

P r z y k ł a d 2

Stabilność aPC w preparacie produktu zawierającym różne wypełniacze

Wytworzono preparaty aPC w celu zbadania wpływu różnych wypełniaczy na stabilność cząsteczki. Do aPC w buforze fosforanowym, nie zawierającym soli, dodano w sumie sześć zaróbek. Wypełniaczami tymi były: glicyna, mannit, sacharoza, trehaloza, rafinoza i skrobia hydroksyetylowa (HES). Porównywano stabilność aPC w preparacie zawierającym fosforan i nie zawierającym soli ani wypełniacza (kontrola) z preparatami zawierającymi wypełniacze. Próbki przechowywano w temperaturze 50°C, 40°C i 25°C przez różnie długi czas. Dane z analizy tych próbek porównano z wartościami wyjściowymi (czas -0).

W celu oceny fizycznej i chemicznej stabilności preparatów stosowano test APTT, chromatografię cieczową wysokosprawną z wyłączeniem zależnym od rozmiaru cząstki (SE-HPLC), SDS-PAGE i testy na zawartość białka.

Preparaty aPC wytwarzano poprzez rozpuszczanie aPC w buforze fosforanowym do stężenia 5 mg/ml aPC. Do części roztworu aPC dodawano wypełniacze w stosunku 6:1 (wypełniacze do aPC), lub 30 mg/ml. Próbki liofilizowano (5 mg aPC/fiolkę).

Stabilność preparatów badano w temperaturze 50°C przez 14 i 28 dni; w temperaturze 40°C przez 28 dni, 48 dni i 6 miesięcy; i w temperaturze 25°C przez 6 i 12 miesięcy. Dla każdego punktu czasowego analizowano niezależnie dwie fiolki każdego preparatu jako oddzielne próbki, a dane z tych próbek porównywano z wartościami wyjściowymi (czas=0). Analizy obejmowały siłę aPC (APTT), SDS-PAGE, odsetek monomeru aPC i zawartość białka.

						Kontrola
			25°C			50°C			40°C
	Fiolka	Wartość wy^j- ściowa	6 miesięcy	12 miesięcy	Wartość wy^j- ściowa	14 dni	28 dni	Wartość wy^j- ściowa	28 dni	84 dni	6 miesięcy
Siła APTT	1	321	294	236	321	248	248	321	248	221	215
(U/mg)	2	321	251	242	321	245	227	321	279	233	176
Mono- mer	1	99,3	98,3	96,5	99,3	97,5	97,0	99,3	97,7	96,2	95,1
Zawartość (%)	2	99,2	95,8	96,4	99,2	97,3	97,1	99,2	97,7	96,1	95,4

						Glicyna
			25°C			50°C			40°C
	Fiolka	Wartość wy^j- ściowa	6 miesięcy	12 miesięcy	Wartość wy^j- ściowa	14 dni	28 dni	Wartość wy^j- ściowa	28 dni	84 dni	6 miesięcy
Siła APTT	1	282	233	142	282	164	97	282	191	155	158
(U/mg)	2	321	239	191	321	161	142	321	215	152	79
Mono- mer	1	99, 1	98,4	93,3	99,1	97,4	97,2	99,1	97,8	96,4	95,8
Zawartość (%)	2	99, 1	98,4	96,3	99,1	97,3	97,1	99,1	97,7	96, 4	95,7

PL 195 090 B1

						Mannit
			25°C			50°C			40°C
	Fiolka	Wartość ^wyj^- ściowa	6 miesięcy	12 miesięcy	Wartość ^wy^j- ściowa	14 dni	28 dni	Wartość ^wy^j- ściowa	28 dni	84 dni	6 miesięcy
Siła APTT	1	309	227	255	309	270	245	309	273	270	282
(U/mg)	2	321	321	267	321	239	242	321	300	251	191
Monomer	1	99,2	98,8	97,4	99,2	98,2	98,1	99,2	98,4	97,6	97,8
Zawartość (%)	2	99,2	98,7	97,6	99,2	98,2	98,0	99,2	98,4	97,6	97,8

						Sacharoza
			25°C			50°C			40°C
	Fiolka	Wartość ^wy^j- ściowa	6 miesięcy	12 miesięcy	Wartość ^wy^j- ściowa	14 dni	28 dni	Wartość ^wy^j- ściowa	28 dni	84 dni	6 miesięcy
Siła APTT	1	327	300	288	327	300	288	327	267	306	285
(U/mg)	2	297	300	306	297	291	291	297	321	242	294
Mono- mer	1	99,2	99,0	98,5	99,2	98,7	98,9	99,2	98,8	98,5	98,9
Zawartość (%)	2	99,2	99,0	98,5	99,2	98,7	98,9	99,2	98,8	98,5	98,9

						Trehaloza
			25°C			50°C			40°C
	Fiolka	Wartość ^wyj^- ściowa	6 miesięcy	12 miesięcy	Wartość ^wyj^- ściowa	14 dni	28 dni	Wartość ^wyj^- ściowa	28 dni	84 dni	6 miesięcy
Siła APTT	1	312	291	282	312	258	282	312	273	276	276
(U/mg)	2	309	315	282	309	270	215	309	303	245	255
Monomer	1	99,2	99,0	98,4	99,2	98,6	98,8	99,2	98,8	98,4	98,7
Zawartość (%)	2	99,2	98,8	98,4	99,2	98,6	98,8	99,2	98,7	98,4	98,7

PL 195 090 B1

						Rafinoza
			25°C			50°C			40°C
	Fiolka	Wartość ^wy^j- ściowa	6 miesięcy	12 miesięcy	Wartość ^wy^j- ściowa	14 dni	28 dni	Wartość ^wy^j- ściowa	28 dni	84 dni	6 miesięcy
Siła APTT	1	321	270	255	321	261	258	321	276	273	279
(U/mg)	2	288	285	306	288	255	264	288	270	239	255
Monomer	1	99,1	99,0	97,0	99,1	98,6	98,7	99,1	98,7	98,4	98,6
Zawartość (%)	2	99,1	99,0	98,2	99,1	98,6	98,7	99,1	98,7	98,4	98,6

						HES
			25°C			50°C			40°C
	Fiolka	Wartość wy^j- ściowa	6 miesięcy	12 miesięcy	Wartość wy^j- ściowa	14 dni	28 dni	Wartość wy^j- ściowa	28 dni	84 dni	6 miesięcy
Siła APTT	1	282	188	176	282	182	164	282	194	185	145
(U/mg)	2	285	245	215	285	188	161	285	176	152	103
Mono- mer	1	97,8	95,6	92,2	97,8	93,0	91,8	97,8	93,7	90,6	88,7
Zawartość (%)	2	97,8	95,3	91,8	97,8	92,9	91,0	97,8	92,9	90,5	88,5

Nie stwierdzano istotnych zmian pH, zabarwienia, cech opakowania ani wyglądu fizycznego żadnej z próbek przez ponad roczny okres stabilności. W analizie APTT i SE-HPLC, preparaty HES i glicyny wykazywały gorszą stabilność fizyczną (wskutek agregacji) i chemiczną (siła) w porównaniu z kontrolą.

Preparat z mannitem wykazywał nieco lepszą stabilność fizyczną i chemiczną niż kontrola, a pozostałe preparaty - z sacharozą, z trehalozą i z rafinozą - wykazywały jeszcze lepsza stabilność fizyczną i chemiczną w porównaniu z kontrolą. Tak więc zastosowanie jako wypełniacza w preparacie aPC mannitu, sacharozy, trehalozy i rafinozy pozwala uzyskać lepszą stabilność fizyczną i chemiczną w porównaniu z preparatami aPC bez wypełniacza lub z glicyną lub HES.

P r z y k ł a d 3

Stabilność rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka C

Dwie partie liofilizowanego preparatu rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka C (aPC) przechowywano przez 1 miesiąc w temperaturze 40°C i wilgotności względnej 75%, po czym analizowano pod kątem ewentualnego rozpadu. Stabilność aPC badano również po rozpuszczeniu w jałowej wodzie i przechowywaniu przez czas do 72 godzin w temperaturze otoczenia. Liofilizowany produkt aPC zawierał 10 mg aPC, 60 mg sacharozy, 76 mg chlorku sodu i 15,1 mg cytrynianu na fiolkę aPC w tym preparacie jest stabilne w stanie suchym przez co najmniej miesiąc przy przechowywaniu w temperaturze 40°C i wilgotności względnej 75% a w roztworze przez 24 godziny w temperaturze otoczenia. Obydwie partie wytworzono stosując tę samą jednostkową recepturę obejmującą 10 mg aPC, 60 mg sacharozy, 76 mg chlorku sodu i 15,1 mg cytrynianu na fiolkę. Obydwie liofilizowane partie aPC przechowywano przez miesiąc w temperaturze 40°C i wilgotności względnej 75%; stabilność aPC kontrolowano testem APTT, HPLC ze sprzęganiem jonów w celu ilościowego oznaczenia peptydów aPC i spektrometrią masową w celu ilościowego oznaczenia odmian białka. Jedną z partii rozpuszczono również w jałowej wodzie, do uzyskania stężenia 1 mg/ml aPC, i utrzymywano w temperaturze otoPL 195 090 B1 czenia. Stabilność aPC w roztworze kontrolowano w punktach czasowych 0, 1, 4, 8, 24, 48 i 72 godzin, stosując APTT i spektrometrie masową. Nie stwierdzono utraty aktywności aPC, a rozpad strukturalny cząsteczki po przechowywaniu w stanie suchym przez miesiąc temperaturze 40°C i wilgotności względnej 75% był nieznaczący aPC w tym preparacie zachowuję stabilność przez czas do 24 godzin w stężeniu 1 mg/ml po rozpuszczeniu.

Claims

1. Staailny I iofilizzwany preeprat, zznmieenn tym, Zż zzwiera rekombinaacjne I uddkie aktywowane białko C, sól, i wypełniacz wybrany z grupy, do której należy mannit, trehaloza, rafinoza, sacharoza, przy czym stosunek wagowy wynosi 1 część rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka C na około 7 do 8 części soli i około 5-7 części wypełniacza.

2. Prekarar waełudzzktrz.1, z znmieenntym. żż stosuuykwaagwawanysi1 cczśćrekon·lbinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka C na 7,6 części soli i 6 części wypełniacza.

3. Preepret we^e^^u zzata. 1 albo 2, zznmieenn tym, żż sól wayiera się z chlofeo ppfaku i chlorku sodu.

4. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że sól stanowi chlorek sodu.

5. Preparat według zastrz. 1 albo 2, albo 4, znamienny tym, że wypełniacz stanowi sacharoza.

6. Ρ^^θΙ waełud zzat/Zz 5, zznaiieeny yyy^, żż pp rekonaty-udji ofrzzmbny p^emaa zza wiera 5 mg/ml rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka C, 30 mg/ml sacharozy i 38 mg/ml chlorku sodu.

7. Preeprat waełud zzas^ 55 zznameenn tym, żż pp rekonaty-udji ofrzzmbny poemat zzt wiera 20 mg/ml rekombinacyjnego ludzkiego aktywowanego białka C, 120 mg/ml sacharozy i 152 mg/ml chlorku sodu.

8. Preeρrat waełud zzktrz. L zznmieeny tym, żż zpnyatozzwiera Zif wayιany z Tris-ootann, cytrynianu sodu i fosforanu sodu lub ich mieszaniny, przy czym po rekonstytucji preparat ma pH od 5,5-6,5.

9. Preparat według zastrz. 8, znamienny tym, że bufor stanowi cytrynian sodu.

10. Preparat według zastrz. 8, albo 9, znamienny tym, że sól wybiera się z chlorku potasu i chlorku sodu.

11. Preparat według zastrz. 10, znamienny tym, że sól stanowi chlorek sodu.

12. Preparat według zastrz. 8 albo 9, albo 11, znamienny tym, że wypełniacz stanowi sacharoza.

13. Stabilny liofilizowany preparat zdefiniowany w zastrz. 1 do stosowania w leczeniu chorób związanych z wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym.

14. Stabilny liofilizowany preparat według zastrz.13, znamienny tym, że stosuje się go w leczeniu chorób związanych z wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym wybranych z grupy składającej się z udaru pochodzenia zakrzepowego, zakrzepicy żył głębokich, zatoru tętnicy płucnej, obwodowej zakrzepicy tętnic, zatorów pochodzących z serca lub tętnic obwodowych, ostrego zawału mięśnia sercowego, rozsianego wykrkepiania wewnątrznaczyniowego i ostrej zakrzepicy przed- lub zawłośniczkowej.

15. Stakilnyli ofilizzwanypreepratzZdkniowanyw zzas^l d d stosówaniaw ieeczkiu u ddruppf chodzenia zakrzepowego.