TW585871B - Improved methods for processing activated protein C - Google Patents

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585871 A7

本申Μ案^•明美國時中4案編號6_45，⑸（州7年4月 28曰提出申請）之好處。 本發明廣泛地針對降低活化C蛋白質於製備及純化中自動 降解之方法。 C蛋白質為絲胺酸蛋白酶且為天然產之抗凝血劑，其藉由 使凝血級聯中之va&vi„a因子失活而於止血作用之調節中 負有任務。人類c蛋白質主於肝中活體内製造，為單一之 461個胺基酸之多肽。此前驅體分子進行多次轉譯後修飾作 用，包括1)42個胺基酸信號序列之裂解；2)自離胺酸殘基於 156位及精胺酸殘基於157位之單鍵酶原蛋白質分解除去， 製造該分子之2-鏈形式（亦即155個胺基酸殘基之輕鏈經由二 硫橋鍵連按於含絲胺酸蛋白酶之262個胺基酸殘基之重 鏈）；3)群聚於輕鏈之前42個胺基酸之9個胺酸酸之維生素κ 依賴性羧化作用，得9個7 -羧基麩胺酸（GLA)殘基；及4)碳 水化合物黏附於4個部位（1個於輕鏈及3個於重鏈）。重鏈含 已確立之Asp 257, His 211及Ser 360之絲胺酸蛋白酶三分 體。最後，循環之2-鏈酶原於活體内於Ca++存在下由凝血酶 於磷脂表面上活化。活化得自於重鏈之N-末端除去十二 肽，產生具酵素活性之活化C蛋白質（aPC)，與其他蛋白質 一致，經活化C蛋白質作為或許是最重要之血液凝固作用之 向下調整劑造成血栓形成。 不幸地，aPC可自動降解，導致降低作為抗凝血劑之功 能。辨認、活化C蛋白質之降解途徑之技藝為該重鏈於3 0 8位 之離胺酸殘基之C蛋白質分解之夾，得11丨胺基酸斷片。此 本紙張&度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公爱）

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線 585871 A7 ----- B7 五、發明説明（2 ) 降解產物於技藝中識別爲EAK斷片。

以則對降低自動降解之嘗試集中於減少eak斷片之形成。 最値得注意的，Pr〇uty等，EP 0 662 513,（1995, 7, 12)敎示 減少aPC之自動降解作用，藉由控制pH至約6.3至7.〇 ;於3M 脲中培養aPC;或暴露aPC於最高之鹽條件下，其定義爲高 於0·4Μ或低於〇.〇5M。 申請者等已發現第二重要之降解途徑·輕鏈之沁末端之自 動降解造成於10位之組織胺酸殘基兩端之夾。以降解途徑 得2個無活性之產物輕鏈之前9個殘基之^末端夾，得脱 9)活化C蛋白質，及輕鏈之前1〇個殘基之义末端夾，得脱 (1-10)活化C蛋白質。此降解途徑，其以前未報告，造成失 去抗凝血劑活性，由於除去於6與7位之重要的GLA殘基。 因此’減少脱（1-9)及脱（1-1〇)活化c蛋白質自動降解產物之 含量’於達到有效之高純度活化C蛋白質醫藥製劑上爲重 要的。此等變化產物爲以前未知之降解產物，且若非不可 能亦極難以藉習用之純化技術除去。減少彼等之形成之條 件’以如並不知道。 經满部中央標準局—工消費合作社印f (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由申明者等鑑疋之此對活化C蛋白質之重要之自動降解 途徑’使能發現促進活化c蛋白質之純度及效力之製備及 調配條件。申請者等已證明於低之PH(例如少於（6 3"自動 降解途控比308-309自動降解途徑有利於脱（1-9)aPC或脱G· 10>?(：優先的，然而，於少於63之1)11下，使用提高之]^(^ 濃度（高於150mM)，實質上降低脱及/或脱（l_i〇)apc 自動降解反應之程度。 一5一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585871 A7 _______B7 五、發明説明（3 ) 於是’本發明提供於離子強度高於15〇ηιΜ及pH於約5.5至 少於6.3之下製造活化C蛋白質。於此等條件下，脫（1-9)apc 及脫（M 0)aPC之形成，顯著地降低。本發明因此提供製備 活化C蛋白質水性溶液而無不要之降解作用之改良方法。 圖式簡單說明 圖1提供活化之人類C蛋白質之主要結構，有助於說明本 文所述之自動降解途徑。 本文所採之命名係基於人類活化c蛋白質之主要序列之編 號。精於此道者會了解活化C蛋白質之其他物種可於主要序 列中稍變化，因此造成本文所定義之命名之變換。 本發明提供活化C蛋白質水性溶液，及製備此等溶液之改 良方法，其包括於高於150mM之離子強度及約5.5至少於6.3 之pH下進行此製備。 本發明另提供純化活化C蛋白質之方法，藉由層析法分 離，包括於該層析法分離中，使用具離子強度高於15〇mM 及約5.5至少於6·3之pH之溶離水性溶將該活化c蛋白質溶 離。 本發明另提供藉由過濾濃縮活化C蛋白質溶液之方法，其 包括將該活化C蛋白質作為具離子強度高於1 50mM及pH約 5.5至少於6.3之水溶液，進料至濾膜。 本發明亦提供藉由本文所述之方法製備之活化C蛋白質。 本發明最後提供具少於10%重量比之脫（1_9)aPC及/或脫 (MO)aPC之活化蛋白質C醫藥製劑。 用於本揭示内容中之所有胺基酸縮寫為那些由美國專利 及商標局述於37 C.F.R· § 1.822 (B)(2)中所接受的。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 585871 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 爲了本發明之目的，當本文揭示及提出專利申請，下列 用詞如下所定義。 aPC或活化蛋白質C-係指不論重組體或自血漿衍生之c蛋 白質aPC包括且較好是人類c蛋白質，雖然aPC亦可包含其 他具C蛋白質蛋白分解、酰胺分解、酯分解及生物學（抗凝 血劑或血纖維蛋白溶解）活性之物種或衍生物。C蛋白質衍 生物之實例由Gerlitz等，美國專利第5,453,373號及Foster等 ’美國專利第5,516,650號所述，其全部之敎示併入本文供 參考。 APTT-經活化之部分組織促凝血酶原激酶時間。 水性-包括潛溶劑系統及只使用水爲溶媒。較佳地，水性 只以水爲溶媒。 層析法分離-包括技藝中所認可及重視之層析法技術， 包括大小排斥法、陰離子性、陽離子性、疏水性、逆相之 類。 叉流過濾·係指藉切線流過濾膜之分配，其中產物由膜保 留（如於濃縮或透析濾過法）或通過濾膜（如於病毒清除過濾）。 PC·蛋白質c酶原。 製備-係指用於製造活化c蛋白質之單元操作，如管柱層 析法、過遽（切線、叉流、終端式）、冷;東乾燥、系抽或貯 存。 、二-aPC-重組體活化c蛋白質，其製造藉由活體外活化 或藉由原核細胞、眞核細胞或轉殖基因動物之直接分泌C 蛋白質之經活化形式，包括例如自人類腎臟如細胞分泌爲 -Ί- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇'〆297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 B7 585871 五、發明説明（5 ) 酶原’再藉熟知於精於此道者且於Yan，美國專利第 =81，952及 Cottingham，w〇 97/2〇〇43 中證明之技術純 活化。 本發明係有關製備活化C蛋白質之改良方法。本發明特 別地有關經由蛋白質濃化或濃縮及蛋白質純化操作，同時 ♦,自動降解製備活化c蛋白質。本發明以具此製備且尤 、k飾作用、濃化及純化操作，使用蛋白質水性溶液 於本文所述條件下進行爲特徵。 文所聲月之條件之組合減少脱及脱 之〉成脱（l_9)aPC及脱（i-i〇)apC極難以藉已知之純化技 術學除去，所以希望於製造aPC之醫療製劑中減少其形成 於所聲明之條件下製備之活化c蛋白質，實質上無脱 9)aPC及脱（1-10)aPC變化物。一般，於此等條件下製備之 aPC之醫療製劑，實質上無脱（1_9)apc及脱…，一般 具少於10%，較好少於8%，更佳少於5%，最佳少於3%重量 百分比之此等變化物，個別地或混合地，使用如本文所述 及聲明製備之aPC製備之冷凍乾燥醫療調配物，證明於溶 液狀態（冷凍乾燥以前）有改進之穩定性及經重新組成後有 24至48小時穩定性。於2至8°C下高達5天，於i5°C下高達50 天及於25 C下高達40小時，觀察到效力之流失不多於5%。 於本發明之前，此穩定性以前無法達到。 小心地控制pH離子強度及較好地溫度，則活化蛋白質c 於製備中之水性溶液中及於調配物中之自動降解可降低至 以前無法可得之程度-特別是於無脲或其他變性劑；組織胺 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經漓部中央標牟局員工消費合作社印繁 585871 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（6 ) 酸、離胺酸鹽酸鹽或白蛋白存在下。 ^本發明之廣大實務，其涵蓋製備C蛋白質方法包括各 種單元操作，物理分離及純化操作，包括層析法處理及叉 、:過濾如供純化蛋白質組合物，濃縮蛋白質溶液或供溶媒 叉換及可能地化學及酵素處理。由本發明涵蓋之蛋白質製 備万法尤其包括藉由標準層析方法如離子交換層析法、疏 水性層析法之類及藉超遽與類似方法之蛋白質濃縮而純化 蛋=質製備法亦包括於辟存槽中蛋白質溶液之保留及類似 此等純化及濃縮步驟之製備。爲降低不穩定性，活化c蛋 白質溶液之所有製備法，包括各種蛋白質純化及蛋白質濃 縮步驟，於本文所述之條件下進行。此製備步驟係針對蛋 白質 < 最後分離，通常爲供醫藥製劑中調配用之冷凍乾燥 粉末。 水性製備溶液之PH爲約5.5至少於6.3。更佳地，5·7至少 於6.3，更佳地，pH於約5 6至約6 2之間。更佳者爲約$ 8至 約6·2之間，仍更佳者爲pH於約5.9至約6.1之間。最佳者爲 約PH6.0。維持有效之pH控制之代表性緩衝系純包括丁以^乙 酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸鹽_甘胺酸及磷酸鈉。 更佳之緩衝系統包括檸檬酸納及嶙酸納。最佳之緩衝劑爲 棒權酸鋼。緩衝系統之較佳莫耳濃度爲10mM至50mM。最 佳之莫耳濃度爲2〇至4〇mM。精於此道者會了解的是，許多 其他緩衝系統爲可得的，其亦可用來維持pH於所聲明之範 圍内。 製備溶液之離子強度爲本發明之第二重要要素。離子強 -9- €氏張尺度適用) Μ規格（·χ297公董） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ----------IT---- 585871 A7 ___________ B7 五、發明説明（7) 度一般得自添加醫藥上可接受之鹽_較好爲NaCl或KC1。離 子強度較好高於或等於150mM，得自於緩衝溶液中高於 150mM之鹽濃度。較好地，鹽濃度不多於1〇〇〇111]^以促進下 游製備。最佳地，鹽濃度由約2〇〇mM至i〇〇〇mjv[高於50mM 及低於400 mM之濃度，以前咸信爲不可接受的。 確保最小之自動降解之另外條件爲溫度。較佳地，於溶 液製備中之製備溫度於〇°C與i〇°C之間，更佳地於此等溫度 外2°C至8°C活化之蛋白質c發生顯著地發生自動降解。然 而超過10°C歷_短期間可耐受而無包含活化c蛋白質之完整 性〇 活化C蛋白質之濃度對本發明並不重要。顯著地，以高 濃度製備C蛋白質之能力，於本文所述之條件下顯著地增 進。較佳之C蛋白質濃度由約1毫克/毫升至約5〇毫克/毫升 ，更佳地1至30毫克/毫升，更佳地1至2〇毫克/毫升，最佳地 1至10毫克/毫升，雖然較高或較低之濃度被認爲可實行的。 經濟部中央標率局員工消費合作社印^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如本文所述製備之活化C蛋白質，有用於廣大之各種涉 及血管内凝血之所須疾病狀態包括血栓性休克，濃度靜脈 血栓形成、肺插塞、周圍動脈血栓形成、源自心臟或周圍 動脈之插塞、急性心肌梗塞、散佈性血管内凝血及急性或 微血管前或後之閉塞，包括移植或視網膜血栓形成之治療。 活化C蛋白質，理想地以冷凍乾燥狀態以填充劑調配。 填充劑理想地加以選擇致使改進分子之固態穩定性，此賦 形劑之實例爲蔗糖、海藻糖、棉子糖。精於此道者會了解 許多其他填充劑爲可得的，其亦可用於活化C蛋白質。調 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585871 A7 B7 經满部中央標隼局員工消費合作社印髮 五、發明説明（8 ) 配物之填充劑爲冷束乾燥製程之重要之調配變數。較佳之 填充劑爲廉糖，以待冷束乾燥之溶液中爲15至3〇毫克/毫升 之濃度。Α2·5毫克/毫升之aPC之調配物中，於待冷康乾燥 之溶液中之蔗糖之最佳濃度爲15毫克/毫升。於5 〇毫克/毫 升之aPC之調配物中，待冷康乾燥之溶液中之嚴糖之最佳 濃度爲30毫克/毫升。 下列實例提供來例示及説明本發明。本發明之範園不應 被解釋爲受限於此等實例。除非另外指示所有有關部分比 及百分比係基於重量比及所有溫度以攝氏度數表示。 製備1 人類C蛋白質之製備 於人類腎臟293細胞中藉熟知於精於此道者之技術，如述 於Yan ’美國專利第4,981，952號中者製造重組體人類c蛋白 質（酶原），該專利中之敎示全部併入本文供參考。於Bang 等’美國專利第4,775,624號中，揭示及提出專利申請基因 編碼之人類蛋白質C，其全部敎示併入本文供參考。用來 於293細胞中表現人類蛋白質C之質體爲質體pLPC，其揭示 於Bang等，美國專利第4,992,373號，其全部敎示併入本文 供參考。質體pLPC之構組亦述於歐洲專利公告第0 445 939 號，及於 Grinnell等，1987, Bio/Technology.5:1189-1192,其 敎示亦併入本文供參考。簡言之，將質體轉染於293細胞中 ，再鑑別穩定之轉化體，於無血清之培養基中繼代培養並 使生長。發酵後，藉由微量過濾得無細胞之培養基。 自培養液藉採用Yan，美國專利第4,981，952號之技術（其 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 ox 297公釐） ；—------、玎-----Φ0Ι (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585871 經濟部中央標率局員工消費合作社印繁 A7 __B7___五、發明説明（9 ) 全部敎示併入本文供參考）分離人類C蛋白質酶原。在將經 淨化之培養基吸收於陰離子交換樹脂（Fast-Flow Q， Pharmacia)之前，使其於EDTA中，爲4 mM。以4個管柱體 積之20 mM Tris，200 mM NaCl，pH 7.4及2個管柱體積之20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4洗滌後，以 20 mM Tris，150 mM NaCl，10 mM CaCl2，pH 7.4將結合之重組體人類C蛋白 質酶原溶離。溶離後，藉由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電源判斷 ，溶離之蛋白質純度高於95%。 蛋白質之進一步純化，藉由使蛋白質於NaCl中成3M，接 著吸附於 20 mM Tris，3M NaCl, 10 mM CaCl2，pH 7.4 中平衡 之疏水性相互作用之樹脂（Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas) 。以2個管柱體積之平衡緩衝液（無CaCl2)洗後，重組體人類 C蛋白質酶原以20 mM Tris，pH 7.4溶離。藉由除去殘餘之 鈣，製備溶離之蛋白質供活化。將酶原通過金屬親和性管 柱（Chelex-100, Bio-Rad)除去躬，並再結合於陰離子交換樹 月旨（Fast Flow Q，Pharmacia)。此兩管柱串聯排列並以20 mM Tris，150 mM NaCl，5 mM EDTA，pH 7.4 平衡。在負載蛋白 質後，Chelex-100管柱以一管柱體積之同一緩衝液洗，再 將其自串聯移除。陰離子交換管柱以3體積之平衡緩衝液 洗，再以0.4M NaCl，20 mM Tris·乙酸鹽，pH 6.5將蛋白質 溶離，重組體人類C蛋白質之蛋白質濃度藉由UV 280 nm測 定消光EG1%=1.81。 製備2 重組體人類蛋白質C之活化 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585871 A7 B7 五、發明説明（i〇) 將牛凝血酶於50 mM HEPES，ρΗ7·5存在下，於4°C下偶 聯於活化之CH瓊脂糖4B(Pharmacia)。於已充填於管柱内（使 用約5000單位凝血酶/毫升樹脂）之樹脂上做偶聯反應。將 凝血酶溶液通過管柱循環約3小時，再加2-胺基乙醇（MEA) 至濃度爲0.6毫升/升之循環溶液。將含MEA之溶液循環另Ου小時 ，以 確保樹脂上未反應之胺之完 全封阻 。封 阻後， 以10個管柱體積之1Μ NaCl，20 mM Tris，ρΗ6.5洗，除去所 有非特異性結合之蛋白質，且於活化緩衝液中平衡後，用 於活化反應中。 使rHPC於EJ>TA中（以螫合任何殘之鈣）5 mM，再以20 mM Tris，pH 7.4或20 mM Tris-乙酸鹽，pH 6·5稀釋至濃度爲2毫 克/毫升。將此物質通過於37°C下以50 mM NaCl及20 mM Tris，pH 7.4或20 mM Tris-乙酸鹽ρΗ6·5平衡之凝血酶管柱。 調流速使容許rHPC與凝血酶樹脂之間之接觸時間約20分。 收集溶出液，並立刻測定酰胺分解活性。若此物質不具有 與確立之aPC之標準品可比較之特異性活性（酰胺分解），將 其於凝血酶管柱上再循環以活化該rHPC至完全。此接著以 如上之20 mM緩衝液將該物質以1:1稀釋。 經滴部中央標準局貝工消費合作社印繁 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 活化C蛋白質之抗凝血劑活性，藉由測量於活化之部分 組織促凝血酶原激酶時間（APTT)凝血測定中之凝血時間之 延長而決定。於稀釋緩衝液（1毫克/毫升放射性免疫測定級 BSA，20 mM Tris，pH 7.4, 150 mM NaCl，0.02% NaN3)c蛋白

質之濃度範圍125·1000毫微克/毫升製備標準曲線’而樣品 之製備以此濃度範圍之數倍稀釋。於各樣品測定地，加SQ -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585871 7 Β 經漪部中央標率局員工消費合作衽印繁 五、發明説明（η) 微升冷的馬血漿及50微升重新構成之活化 < 部分組織促凝 血酶原激酶時間試劑（APTT試劑，’於37 C培養5分 培養後，加50微升之適當樣品或檫率品至各測足小池。用 稀釋緩衝液代替樣品或標準品以決處基本凝血時間。加50 微升37°C 30 mM CaCl至各樣品或標率品後互刻開始纖維计 (fibr〇meter)(C〇A Screener 止血分析儀 ’ American Lab〇r)之 計時器。自標準曲線之線性迴歸式针算樣品中之活化0蛋 白質濃度，凝血時間爲3次重複測量之最小値t平均’包括 標準曲線樣品，重組體活化C蛋白寶（蛋白質濃度藉UV 280 nm 消光 EG1%=1.8SW 定。 實例1 aPC之層析法分離

將具導電度約I4 mMho及pH 5.7之aPC;容液施加於與Q

Sepharose Fast Flow陰離子交換樹脂之25公分X 14公分（hx d) 管柱縱列連接之S-Sepharose Fast Fl〇W陽離子交換樹脂之9·5 公分X 9公分（h X d)管柱。兩管柱已於檸樣酸鋼， pH6.0, 150 mM NaCl中預先平衡。管柱充填每升陰離子交 換樹脂10克之aPC。管柱以72管柱體積之平衡緩衝液洗，並 以20 mM擰檬酸鋼ρΗό.Ο, 400 mM NaCl階式溶離。所有操作 於2-8°C及60公分/Φ時之線性流速下進行。 雖然aPC具高活性（以APTT測定539單位/毫克），且於層析 法中（於波峰720克/升）及於聚集主流中（1〇克/升）很濃，但產 物維持穩定。此等觀察由還原及非還原之胰酶消化輕鏈質 譜法證實，其指示無可檢測（<2%)之含308-309蛋白質内分 —14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 585871 A7 B7 五、發明説明（I2) 解夾之異形式，亦以脱（l_9)aPC及脱（1-10)存在（<5%)。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例2 病毒過滤 於 20 mM Tris，150 mM NaCl，及 20 mM EDTA缓衝液中之 活化C蛋白質（4毫克/毫升），用切線流動過濾（Millipore VirusolveTM180膜）過濾。aPC之通過濾膜藉使用透析過濾緩 衝液促進。透析過濾缓衝液爲20 mM檸檬酸鈉及150 mM NaCU。將於 20 mM Tris，150 mM NaCl及 20 mM EDTA緩衝液 中之4毫克/毫升aPC溶液（10升）。用擰檬酸鈉及NaCl緩衝液 爲透析過濾緩衝液得aPC溶液之最後體積爲21.5升。 實例3 冷凍乾燥 於小瓶中藉加適當量之蔗糖、NaCl及檸檬酸鈉至預定體 積之r-aPC製備溶液，得2.5毫克/毫升aPC，15毫克/毫升蔗 糖，325 mM NaCl及20 mM檸檬酸鈉，ρΗ6·0。溶液用習用 之冷凍乾燥機冷凍乾燥，得適宜重新組成之冷凍乾燥之 aPC小瓶，再投予患者。冷凍乾燥調配物具少於1〇%脱（1_ 9)aPC及脱（l_10)aPC。 經漭部中央標率局負工消費合作社印紫 實例4 冷象乾燥 於小瓶中藉加適當量之蔗糖，NaCl及擰檬酸鈉至預定體 積之r-aPC中製備溶液，得5毫克/毫升aPC，30毫克/毫升蔗 糖，650 mM NaCl及40 mM擰檬酸鈉，ρΗ6·0。溶液用習用 之冷凍乾燥機冷凍乾燥，得適宜重新組成之冷凍乾燥之 -15- 尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐) 585871 A7 -----— ____B7 五、發明説明（13 ) aPC小瓶。冷凍乾燥調配物具少於脱（i_9)apc及脱（卜 10)aPC。 本發明之原理，較佳實施例及操作方式已述於前面説明 曰中，然而本又欲保護之本發明，並不限於所揭示之特別 形式，因爲彼等被視爲例示説明而非限制性。精於此道者 可做變化而無偏離本發明之主旨。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 聲

、1T 經满部中央標攀局員工消費合作社印製 -適 度 尺 張 紙 I本 準 I標 I家 國 國 I釐 公 7 9 2

Claims (1)

1. 585871

   之pH下進行該冷凍乾燥。 2· —種製備重組人類經活化c蛋白質調配物之方法，其係 在不含變性劑、組胺酸、離胺酸鹽酸鹽或白蛋白之情況 下將重組人類經活化C蛋白質之溶液予以冷凍乾燥而製 传*，違/谷液具有1 50 mM至400 mM間之離子強度及5.5至 6.3之 pH 〇 3 ·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該pH係由5·9至 6.1 〇 4·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該pH係以檸檬 酸鈉緩衝。 5· —種製備重組人類經活化c蛋白質調配物之方法，其包 括將包括重組人類經活化C蛋白質及填充劑之溶液予以 冷凍乾燥，該填充劑係選自海藻糖、棉子糖及蔗糖及其 混合物。 6·根據申請專利範圍第5項之方法，其中該調配物具少於 10%重量比之脫（1-9)重組人類經活化c蛋白質及脫（M0) 重組人類經活化C蛋白質。 7·根據申請專利範圍第6項之方法，其中該調配物具少於 5%重量比之脫（1-9)重組人類經活化C蛋白質及脫（1-10) 重組人類經活化C蛋白質。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 585871 A 8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 8. 根據申請專利範圍第1，2，5，6及7項中任一項之方法， 其中該溶液進一步含氯化鈉。 9. 根據申請專利範圍第5、6及7項中任一項之方法，其中 該製備方法為冷凍乾燥。 -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）