CZ381099A3

CZ381099A3 - Prostředek obsahující aktivovaný protein C

Info

Publication number: CZ381099A3
Application number: CZ19993810A
Authority: CZ
Inventors: Andrew David Carlson; Theodore Arsay Sheliga
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2000-03-15
Also published as: EP0875252B1; ZA983496B; BR9809292A; ID22933A; TW585871B; US6436397B1; KR100564189B1; US6159468A; NO995134D0; US6162629A; HK1016472A1; TR199902529T2; IL132325A; CN1254284A; KR100450856B1; JP2001524111A; HUP0003401A2; WO1998048818A1; CA2287267C; EA004881B1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká oblasti lidského lékařství, konkrétně léčby cévních onemocnění aktivovaným proteinem C. Přesněji se vynález týká prostředků obsahujících aktivovaný lidský protein C.

Dosavadní stav techniky

Protein C je serin-proteasa a je přirozeným antikoagulačním činidlem, které se účastní regulace homeostasy inaktivací faktorů V* a VIII.* v koagulační kaskadě. Lidský protein C je in vivo vyráběn primárně v játrech jako jediný polypeptid o 461 aminokyselinách. Tato jednořetězcová prekursorová molekula je dále post-translačně zpracovávána 1) odštěpením 42 aminokyselinové signální sekvence; 2) proteolytickým odstraněním jřý®lnového zbytku v pozici 156 a argininového zbytku v pozici 157 z jednořetězcového zymogenu za vytvoření dvouřetězcové formy molekuly (t.j. lehkého řetězce o 155 aminokyselinách navázaného na těžký řetězec o 262 aminokyselinách obsahující serin-proteasu); 3) vitamin K - dependentní karboxylací devíti zbytků kyseliny glutamové umístěných v prvních 42 aminokyselinách lehkého řetězce, za vzniku devíti zbytků kyseliny gamma-karboxyglutamové; a 4) navázání uhlovodanu na čtyři místa (jedno v lehkém řetězci a tři v těžkém řetězci). Těžký řetězec obsahuje dobře známou trias serinových proteas Asp 257, His 211 a Ser 360. Nakonec je cirkulující 2-řetězcový zymogen aktivován in vivo trombinem na fosfolipidovém povrchu za přítomnosti iontů vápníku. Aktivace vzniká v důsledku odstranění dodekapeptidu na N-konci těžkého řetězce, což vede ke vzniku aktivovaného proteinu C (aPC), který má enzymatickou aktivitu.

0 0 0 > 0 · · • · · · • 0 0 • 0 ·

000 000

0

0 ·0

Kromě enzymových aktivit aPC v koagulační kaskadě může aPC také autodegradovat, což vede ke sníženému antikoagulačnímu účinku. Vynálezci objevili významnou degradační dráhu. Autodegradace N-konce lehkého řetězce může vést k vystřižení histidinového zbytku na druhé straně v pozici 10. Tak vede tato degradační dráha ke vzniku dvou inaktivních produktů: l) des{l-9) aktivovaného proteinu C, ve kterém je odstraněno prvních devět N-koncových zbytků lehkého řetězce; a 2) des(l-lO) aktivovaného proteinu C, ve kterém je odstraněno prvních deset N-koncových zbytků lehkého řetězce. Tato degradační dráha, která nebyla dříve známá, vede ke ztrátě antikoagulační aktivity plynoucí z odstranění zásadních GLA zbytků v pozicích 6 a 7.

Proto je minimalizace koncentrace des(l-9) a des(l-lO) produktů autodegradace proteinu C významná při získání účinných, vysoce čistých farmaceutických prostředků obsahujících aktivovaný protein C. Tyto varianty jsou dříve neznámými produkty degradace a jejich odstranění běžnými technikami přečištění je mimořádně obtížné, pokud ne nemožné. Vynálezci dále zjistili, že rozpustnost pevné formy je významně zvýšena za přítomnosti vybrané skupiny objemových činidel.

Je zřejmé, že je žádoucí minimalizace takové degradace aktivovaného proteinu C jak v roztocích, tak v lyofilizovaných formách. Proto tyto objevy umožňují přípravu účinných, vysoce čistých prostředků obsahujících aktivovaný protein C, které jsou farmaceuticky výhodné pro poskytovatele zdravotní péče.

Předkládaný vynález obsahuje vylepšené prostředky obsahující aktivovaný protein C v podstatě bez autodegradačních produktů, zejména bez des(l-9) a des(l-lO) forem lehkého řetězce aktivovaného proteinu C. Proto jsou takové prostředky vhodné pro podání pacientům, kteří potřebují takovou léčbu.

• · · w • · · • · · <

• ♦ · « • · · • · · · 9·

• ·· * • 9

9

9 9

9

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález obsahuje stabilní lyofilizované prostředky obsahující aktivovaný protein C a objemové činidlo vybrané ze skupiny skládající se z manitolu, trehalosy, raffinosy, sacharosy a jejich směsí.

Předkládaný vynález obsahuje stabilní lyofilizované prostředky obsahující přibližně 2,5 mg/ml aktivovaného proteinu C, přibližně 15 mg/ml sacharosy a přibližně 20 mg/ml NaCl. Dále předkládaný vynález obsahuje stabilní lyofilizované prostředky obsahující přibližně 5 mg/ml aktivovaného proteinu C, přibližně 30 mg/ml sacharosy a přibližně 38 mg/ml NaCl.

Předkládaný vynález také obsahuje způsob přípravy prostředku obsahujícího aktivovaný protein C a objemové činidlo vybrané ze skupiny skládající se z manitolu, trehalosy, raffinosy, sacharosy a jejich směsí.

Předkládaný vynález také obsahuje jednotkovou dávkovou formu obsahující zásobník pro jednotkovou dávku obsahující prostředek, ve kterém je poměr hmotností přibližně 1 díl aktivovaného proteinu C, 7,6 dílu soli a přibližně 6 dílů objemového činidla.

Vynález dále obsahuje způsob léčby onemocnění, při kterých dochází k intravaskulární koagulaci, který obsahuje podání prostředku obsahujícího aktivovaný protein C, který je zde popsán.

V předkládaném vynálezu mají následující termíny následující definice.

Termín aPC nebo aktivovaný protein C označuje ·· *· ·· • · ♦ · » · • · · 9 · · « · 9 99 9 9 99

9 9 9 ·· 99 9 9 β · • · · · ♦ · * ♦ • · ♦ • · · · · * rekombinantní nebo plasmatický aktivovaný protein C. aPC zahrnuje a výhodně je lidský aktivovaný protein C, ačkoliv aPC může být také jiného původu nebo derivát, který má proteolytické, amidolytické, esterolytické a biologické (antikoagulační nebo profibrinolytické) aktivity aPC. Příklady derivátů aPC jsou popsány v Gerlitz et al., U.S. patent č. 5453373 a Foster et al., U.S. patent č. 5516650, jejichž obsah je zde uveden jako odkaz.

Termín APTT označuje aktivovaný parciální tromboplastinový čas.

Termín r.hPC označuje rekombinantní lidský protein C zymogen.

Termín r-aPC označuje rekombinantní aktivovaný protein C produkovaný aktivací protein C zymogenu in vitro nebo in vivo nebo přímou sekrecí aktivované formy proteinu C prokaryotickými buňkami, eukaryotickými buňkami nebo v transgenních zvířatech, včetně například sekrece 293 buňkami lidské ledviny ve formě zymogenu, který je potom přečištěn a aktivován technikami dobře v oboru známými, které jsou popsány například v Yan, U.S. patent č. 4981952 a Cottingham, WO 97/20043, jejichž obsah je zde uveden jako odkaz.

Termín kontinuální infuse označuje trvalou, v podstatě nepřerušovanou aplikaci roztoku do cév po určenou dobu.

Termín bolusová injekce označuje jednorázovou injekci léku v definovaném množství (nazývaném bolus).

Termín vhodný pro podání označuje lyofilizovaný prostředek nebo roztok, který může být podán jako terapeutické činidlo.

• · · · • · « • · · · • · • · • · · · · · ··· ·· ·

Termín zymogen nebo protein C zymogen označuje secernované, inaktivní formy, jak jednořetězcové, tak dvouřetězcové, proteinu C.

Termín farmaceuticky přijatelný pufr označuje farmaceuticky přijatelný, jak je v oboru znám. Mezi farmaceuticky přijatelné pufry patří fosforečnan sodný, citrát sodný, octan sodný nebo TRIS.

Aktivovaný protein C je antitrombotické činidlo s širším terapeutickým indexem než dostupná antikoagulancia, jako je heparin a orální antikoagulancia hydroxykumarinového typu. Jako antitrombotické činidlo má aPC výrazný účinek při léčbě široké škály získaných onemocnění, při kterých dochází k intravaskulární koagulaci, jako je trombotický infarkt, trombosa hlubokých žil, plicní embolie, trombosa periferních arterií, embolizace pocházející ze srdce nebo periferních arterií, akutní infarkt myokardu, disseminovaná intravaskulární koagulace a akutní prenebo postkapilární okluse, včetně transplantací nebo trombosy sítnice.

Předkládaný vynález se týká prostředků obsahujících aktivovaný protein C. Požadovaným prostředkem bude takový prostředek, který je stabilně lyofilizovaný přípravek vysoké čistoty skládající se z aktivovaného proteinu C a objemového činidla vybraného ze skupiny skládající se z manitolu, trehalosy, raffinosy a sacharosy. Lyofilizovaný prostředek je rekonstituován vhodným ředidlem jako je sterilní voda nebo sterilní salinický roztok. Výhodně má výsledný roztok pH přibližně 5,5 až 6,5.

Molekulové interakce v prostředku mezi aktivovaným proteinem

C, pufrem, koncentrací soli, pH, teplotou, a objemovými činidly jsou komplexní a vliv každé faktoru na stabilitu prostředku je • * « · • « • · • · · · · · • · · ·· t · · · • · · · •· ·· ·· nepředvídatelná. Lyofilizované prostředky podle předkládaného vynálezu poskytují stabilní, enzymaticky aktivní aktivovaný protein C, z důvodů redukované autodegradace. Prostředky podle předkládaného vynálezu mají zejména redukované hladiny des(l-9) aPC a des(l-lO) aPC. Obecně jsou hladiny des(l-9) aPC a des(l-lO) aPC nižší než 10% produktů autodegradace. Výhodně jsou hladiny des(l-9) aPC a des(l-lO) aPC nižší než 8% produktů autodegradace. Lépe jsou hladiny des(l-9) aPC a des(l-lO) aPC nižší než 5% a nejlépe nižší než 3% produktů autodegradace. Této stability je dosaženo pečlivou kontrolou podmínek zpracování a přidáním sacharosy, trehalosy, raffinosy nebo manitolu. Zajímavé je, že při použití jiných objemových činidel jako je hydroxyethy1škrob nebo glycin není dosaženo nezbytné stability farmaceutické výhodnosti.

Objemová činidla podle předkládaného vynálezu umožňují získání farmaceuticky elegantního prostředku, který má jednotný vzhled a který je snadno rozpustný při resuspendování ve vhodném roztoku. Po rekonstituci je prostředek stabilní po dobu 24 až 48 hodin při teplotě okolí. Taková stabilita nebyla dříve možná.

Výhodnými objemovými činidly v prostředku obsahujícím aktivovaný protein C jsou sacharosa, trehalosa a raffinosa. Výhodnějšími objemovými činidly jsou sacharosa a raffinosa a nejvýhodnějším činidlem je sacharosa. Poměr činidel v prostředku je 1 hmotnostní díl aPC ku 1 až 10 hmotnostním dílům objemového činidla. Dále, koncentrace objemového činidla v prostředku je významnou proměnnou v procesu sušení sublimací ze zmrzlého stavu. Optimální koncentrace objemového činidla je závislá na množství aPC a na vybraném typu objemového činidla. Výhodná koncentrace sacharosy ve roztoku pro vymrazení je 10 až 40 mg/ml. Výhodnější koncentrací sacharosy je 15 až 30 mg/ml.

Nejvýhodnější koncentrace sacharosy v roztoku pro vymrazení je • · mg/ml v prostředku obsahujícím aPC v koncentraci 2,5 mg/ml.

Nejvýhodnější koncentrace sacharosy v lyofilizačním roztoku je 30 mg/ml v prostředku obsahujícím aPC v koncentraci 5 mg/ml. Přítomnost objemového činidla podle předkládaného vynálezu v prostředku obsahujícím aktivovaný protein C umožňuje dosažení zvýšené chemické a fyzikální stability.

Před sušením sublimací ze zmrazeného stavu a po rekonstituci je výhodné udržovat pH v rozmezí od 5,5 do 6,5 pro minimalizaci autodegradace roztoku. Výhodné pH prostředku je mezi 5,6 a 6,4. Výhodnější je pH mezi 5,7 až 6,3. Ještě výhodnější je pH mezi 5,8 až 6,2. Ještě výhodnější je pH mezi 5,9 až 6,1. Nejvýhodnější je pH přibližně 6,0.

Pro udržení účinné kontroly pH by měl roztok aPC obsahovat farmaceuticky přijatelný pufr. V souladu s tím obsahuje po sušení ze zmrazeného stavu prostředek volitelně a výhodně farmaceuticky přijatelný pufr. Příklady pufrovacích systémů jsou Tris-acetat, citrát sodný a fosforečnan sodný. Výhodnými pufrovacími systémy jsou citrát sodný a fosforečnan sodný. Nejvýhodnějším pufrovacím systémem je citrát sodný. Výhodná molarita pufrovacího systému je 10 mM až 50 mM. Výhodnější molarita pufrovacího systému je 10 mM až 20 mM. Nejvýhodnější molarita je 40 mM. Odborníkům v oboru bude jasné, že je k dispozici mnoho dalších pufrovacích systémů, které mohou být také použity v prostředcích podle předkládaného vynálezu.

Podobně je při lyofilizací a po rekonstituci iontová síla zásadní proměnnou pro zajištění stability roztoku. Iontová síla je obecně určena koncentrací solí v roztoku. Mezi obvyklé farmaceuticky přijatelné sole používané pro generování iontové síly patří - bez omezení - chlorid draselný (KC1) a chlorid sodný (NaCl). Výhodnou solí v předkládaném vynálezu je chlorid sodný.

• ·· ·· ·· ♦ · · · · · · · • · · 9 9 9 · · · · 99 9 999

9 9 9 9

999 99 99 99 ► · · • · ♦ ·· » · » · ··

Během lyofilizace musí být koncentrace soli dostatečně vysoká pro krystalizací soli během vymrazovacího stupně lyofilizačního cyklu. Výhodně je koncentrace chloridu sodného vyšší než 150 mM. Lépe je koncentrace chloridu sodného v lyofilizačním roztoku mezi 150 mM a 1000 mM. Pro prostředek obsahující 2,5 mg/ml aPC je nejvýhodnější koncentrace chloridu sodného v lyofilizačním roztoku mezi 150 mM a 650 mM. Ještě lépe je koncentrace chloridu sodného v lyofilizačním roztoku mezi 250 mM a 450 mM. Ještě lépe je koncentrace chloridu sodného v lyofilizačním roztoku mezi 300 mM a 400 mM. Nejlépe je koncentrace chloridu sodného v lyofilizačním prostředku 325 mM pro prostředek obsahující 2,5 mg/ml aPC.

Podobně, pro prostředek obsahující 5,0 mg/ml aPC je nejvýhodnější koncentrace chloridu sodného v lyofilizačním roztoku mezi 150 mM a 1000 mM. Ještě lépe je koncentrace chloridu sodného v lyofilizačním roztoku mezi 250 mM a 750 mM. Ještě lépe je koncentrace chloridu sodného v lyofilizačním roztoku mezi 400 mM a 700 mM. Nejlépe je koncentrace chloridu sodného v lyofilizačním prostředku 650 mM pro prostředek obsahující 5,0 mg/ml aPC.

Poměr aPC:sůl:objemové činidlo (hmot.:hmothmot.) je významným faktorem v prostředku vhodném pro lyofilizací. Poměr závisí na koncentraci aPC, výběru a koncentraci soli a na výběru a koncentraci objemového činidla. Odborník v oboru snadno určí výhodný poměr aPC:sůl:objemové činidlo za použití technik známých v oboru a popaných například v příkladu 1. Zejména výhodný poměr hmotností je jeden díl aktivovaného proteinu C ku 7 až 8 dílům soli ku 5 až 7 dílům objemového činidla. Výhodnější poměr hmotností je jeden díl aktivovaného proteinu C ku 7,5 až 8 dílům soli ku 5,5 až 6,5 dílům objemového činidla. Nejvýhodnější poměr hmotností je 1 díl aktivovaného proteinu C ku 7,6 dílům soli ku ·· ·· • · · ♦ · · · · · · · • ··· · · · · · · · • · · ♦ · · · · ··· ···

9··· · · · · · ···· 99 «·· ·· 99 99 dílům objemového činidla.

Výhodnou solí je chlorid sodný v koncentraci 325 mM (pro prostředek obsahující 2,5 mg/ml aPC) a 650 mM (pro prostředek obsahující 5,0 mg/ml aPC) a poměr se sacharosou přibližně 1,3:1. Tato koncentrace je dostatečně vysoká pro krystalizaci soli během lyofilizace a nejpravděpodobněji vede ke vzniku amorfní směsi aPC, sacharosy a citrátu, která může být lyofilizována. Tak způsobuje iontová síla NaCl ve výhodné koncentraci 325 mM a 650 mM stabilitu prostředku v průběhu lyofilizace.

Předkládaný vynález dále obsahuje způsob pro přípravu stabilního lyofilizovaného prostředku, který obsahuje lyofilizaci roztoku obsahujícího aktivovaný protein C a objemové činidlo vybrané ze skupiny skládající se z manitolu, trehalosy, raffinosy, sacharosy a jejich směsí. Předkládaný vynález také obsahuje způsob pro přípravu stabilního lyofilizovaného prostředku, který obsahuje lyofilizaci roztoku obsahujícího aktivovaný protein C v koncentraci přibližně 2,5 mg/ml, sacharosu v koncentraci přibližně 15 mg/ml, NaCl v koncentraci přibližně 19 mg/ml a pufr (citrát sodný), který má pH vyšší než 5,5, ale nižší než 6,5. Dále předkládaný vynález obsahuje způsob pro přípravu stabilního lyofilizovaného prostředku, který obsahuje lyofilizaci roztoku obsahujícího aktivovaný protein C v koncentraci přibližně 5 mg/ml, sacharosu v koncentraci přibližně 30 mg/ml, NaCl v koncentraci přibližně 38 mg/ml a citratový pufr, který má pH vyšší než 5,5, ale nižší než 6,5.

Předkládaný vynález také obsahuje jednotkovou dávkovou formu obsahující zásobník pro jednotkovou dávku obsahující stabilní lyofilizovaný prostředek obsahující aktivovaný protein

C a objemové činidlo vybrané ze skupiny skládající se z manitolu, trehalosy, raffinosy, sacharosy a jejich směsí. Dále obsahuje • · • ·

• · · ·· · ··· předkládaný vynález způsob pro léčbu onemocnění, při kterých je přítomna intravaskulární koagulace, který obsahuje podání uvedeného prostředku.

aPC je výhodně podán parenterálně ve vhodné dávce formou kontinuální infuse trvající od l do 48 hodin pro zajištění jeho vstupu do krevního řečiště. aPC je výhodně podán v dávce od přibližně 0,01 mg/kg/h do přibližně 0,05 mg/kg/h. Alternativně je aPC podán nejprve jako bolusová injekce během 5 minut až 30 minut, kterou je podána část dávky, a potom následuje kontinuální infuse vhodné dávky trvající 23 až 47 hodin, kdy celkem je podána odpovídající dávka za 24 nebo 48 hodin.

Následující příklady popisují provedení předkládaného vynálezu a ilustrují vynález. Rozsah předkládaného vynálezu není omezen následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příprava 1: Příprava lidského proteinu C

Rekombinantní lidský protein C (r-hPC) byl produkován v 293 buňkách lidské ledviny technikami dobře známými v oboru, jak jsou uvedeny v Yan, U.S. patent č. 4981952, který je zde uveden jako odkaz. Gen kódující lidský protein C je popsán a chráněn v Bang et al., U.S. patent č. 4775624, který je zde uveden jako odkaz. Plasmid použitý pro expresi lidského proteinu C ve 293 buňkách je plasmid pLPL, který je popsán v Bang et al., U.S. patent č. 4992373, který je zde uveden jako odkaz. Konstrukce plasmidů pLPC je také popsána v Evropské patentové přihlášce č. 0445939 a v Grinell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192, která je zde také uvedena jako odkaz. Stručně, plasmid byl transfektován do 293 buněk, potom byly identifikovány stabilní transformanty, • *· ·· ·· • · · · · · · · • « · · · · · • · · · ··· ·· · • · · 9 9

999 99 ·9 99 • ·· které byly kultivovány v bezsérovém mediu. Po fermentaci bylo medium bez buněk získáno mikrofiltrací.

• · · • · · •··· ··

Lidský protein C byl separován z kultivační kapaliny modifikací techiky, kterou popsal Yan, U.S. patent č. 4981952. Bylo vyrobeno projasněné medium 4 mM v EDTA a potom bylo absorbováno na aniotovou iontoměničovou pryskyřici (Fast-Flow Q, Pharmacia). Po promytí 4 objemy kolony 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 a 2 objemy kolony 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 byl navázaný rekombinantní lidský protein C zymogen eluován 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Eluovaný protein měl vyšší než 95% čistotu po eluci, jak bylo potvrzeno

SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforesou.

Další přečištění proteinu bylo provedeno vyrobením roztoku 3M proteinu v NaCl, po kterém následovala adsorpce na hydrofobní interakční pryskyřici (Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas) uvedenou do rovnováhy ve 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Po promytí 2 objemy kolony ekvilibračního pufru bez CaCl₂ se rekombinantní lidský protein C eluoval 20 mM Tris, pH 7,4.

Eluovaný protein byl připraven pro aktivaci odstraněním zbytkového vápníku. Rekombinantní lidský protein C se vnesl do kovové afinitní kolony (Chelex-100, Bio-Rad) pro odstranění vápníku a byl znovu navázán na aniontový iontoměnič (Fast Flow Q, Pharmacia). Obě tyto kolony byly sestaveny v sérii a byly uvedeny do rovnováhy ve 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,4. Po zavedení proteinu byla Chelex-100 kolona promyta jedním objemem kolony stejného pufru před odpojením ze serie. Aniontová iontoměničová kolona byla promyta 3 objemy kolony ekvilibračního pufru před eluci proteinu za použití 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-acetatu, pH 6,5. Proteinové koncentrace roztoků rekombinantního lidského proteinu C a rekombinantního • · · ·· » · · • · • ♦ ·· aktivovaného proteinu C byly měřeny extinkcí při UV 280 nm,

E°'^1%= 1,81 nebo 1,85, v příslušném pořadí.

Příprava 2: Aktivace rekombinantního lidského proteinu C

Lidský trombín byl navázán na Activated CH-Sepharose 4B (Pharmacia) za přítomnosti 50 mM HEPES, pH 7,5 při 4 °C. Vazba byla provedena na pryskyřici přítomné v koloně za použití přibližně 5000 jednotek trombinu/ml pryskyřice. Roztok trombinu se nechal cirkulovat kolonou po dobu přibližně 3 hodin před přidáním 2-aminoethanolu (MEA) v koncentraci 0,6 ml/1 cirkulujícího roztoku. Roztok obsahující MEA se nechal cirkulovat po dobu dalších 10-12 hodin pro zajištění kompletní blokády nezreagovaných aminů na pryskyřici. Po blokování byla pryskyřice s navázaným trombinem promyta 10 objemy kolony 1 M NaCI, 20 mM Tris, pH 6,5, pro odstranění všeho nespecificky navázaného proteinu a byla použita pro aktivační reakce po uvedení do rovnováhy v aktivačním pufru.

Byl připraven 5 mM roztok r-hPC v EDTA (pro chelaci jakéhokoliv zbytkového vápníku) a byl ředěn na koncentraci 2 mg/ml za použití 20 mM Tris, pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetatu, pH 6,5. Tento materiál se nechal projít kolonou obsahující trombin uvedenou do rovnováhy při 37 °C za použití 50 mM NaCI a buď 20 mM Tris, pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetatu, pH 6,5. Průtok byl upraven tak, aby bylo dosaženo přibližně 20 minutového kontaktu mezi r-hPC a trombinovou pryskyřicí. Výtokové frakce byly odebrána a byla ihned testována na amidolytickou aktivitu. Pokud neměl materiál specifickou aktivitu (amidolytickou) srovnatelnou se standardem aPC, byl recyklován přes trombinovou kolonu pro dokončení aktivace r-hPC. Potom bylo provedeno 1:1 ředění materiálu 20 mM pufrem uvedeným výše, s pH buď 7,4 nebo 6,5, pro pro uchování aPC při nižší koncentraci do použití v dalším stupni.

Odstranění vylouhovaného trombinu z aPC materiálu se provede vazbou aPC na aniontovou iontoměničovou pryskyřici (Fast Flow Q, Pharmacia) uvedenou do rovnováhy v aktivačním pufru (buď 20 mM Tris, pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetat, pH 6,5) . Trombin za těchto podmínek nereaguje s aniontovou iontoměničovou pryskyřicí, ale prochází kolonou do výtokové frakce. Po vložení aPC do kolony se proveden promytí 2-6 objemy kolony 20 mM ekvilibračního pufru před eluci navázaného aPC ve stupni eluce za použití 0,4 M NaCl buď v 5 mM Tris.acetatu, pH 6,5, nebo 20 mM Tris, pH 7,4. Vyšší objem výplachu kolony usnadňuje úplné odstranění dodekapeptidu. Materiál eluovaný z této kolony byl skladován buď jako zmrazený roztok (-20 °C), nebo jako lyofilizovaný prášek.

Antikoagulační aktivita aktivovaného proteinu C byla stanovena měřením prodloužení srážení v testu na aktivovaný parcální tromboplastinový čas (APTT). Standardní křivka byla připravena v ředícím pufru (1 mg/ml hovězího sérového albuminu radioimunotestovací čistoty (BSA), 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM

NaCl, 0,02% NaN_s) s koncentrací protenu C od 125 - 1000 ng/ml, zatímco vzorky byly připraveny v několika ředěních v uvedeném rozmezí koncentrací. Do každé kyvety bylo přidáno 50 μΐ chladné koňské plasmy a 50 μΐ rekonstituované činidlapro test na aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT Reagent, Sigma) a provedla se inkubace při 37 °C po dobu 5 minut. Po inkubaci se do každé kyvety přidalo 50 μΐ každého vzorku nebo standardu. Ředící pufr byl použit místo vzorku nebo standardu pro určení bazálního času srážení. Stopky fibrometru (CoA Screener Hemostasis

Analyzer, American Labor) byly spuštěny ihned po adici 50 μΐ 37 °

C 30 mM CaCl do každého vzorku nebo standardu. Koncentrace 2 aktivovaného proteinu C ve vzorkách byla vypočítána z lineární regresní rovnice pro standardní křivku. Zde uvedené časy srážení • 00 0 0 00 »0 0 0 0 0 0 «

0« 0 0 0 « « 0 « 0 00« «00

0 0 0 0

000 0« 00 «0 • 0 0* • 0 «

000 0 0 0 0

0 0

0000 00 jsou průměrem minimálně tří měření, včetně vzorků standardní křivky.

Příklad 1: Prostředek obsahuj ící aktivovaný protein C

Lidský aktivovaný protein C byl připraven způsobem popsaných v přípravě 1 a 2. Prostředky obsahující aktivovaný protein C byly analyzovány na zpracování v běžném lyofilizačním přístroji. Lyofilizační mikroskopie a difereciální scanning kalorimetrie (DSC) byly použity pro měření dvou parametrů, které určují to, zda může být prostředek zpracován v běžném lyofilizačním přístroji. Lyofilizační mikroskopie je užitečnou technikou pro určení kolapsových teplot zmrazených roztoků, které mají být lyofilizovány. DSC je užitečnou technikou pro určení teploty skelného přechodu (Tg') zmrazeného roztoku. Kolapsová teplota a teplota skelného přechodu jsou zejména užitečné pro určení horní hranice teploty, která může být bezpečně použita během lyofilizace. Výsledky lyofilizační mikroskopie jsou komplementární k výsledkům teploty skelného přechodu Tg', jejíž hodnota je získána DSC. Kolapsová teplota vyšší než -40 °C je optimální pro vzorek, který má být zpracován v běžném lyofilizačním přístroji.

Tabulka 1: Lyofilizace matric pro aPC prostředek

Matrice prostředku
Konc. aPC	Konc. sacharosy	Konc	. NaCl	Kolapsová teplota
2,5 mg/ml	15 mg/ml	50	mM	-59 °C
2,5 mg/ml	15 mg/ml	150	mM	-60 °C
2,5 mg/ml	15 mg/ml	325	mM	-37 °C
5,0 mg/ml	30 mg/ml	50	mM	-50 °C až -45 °C
5,0 mg/ml	30 mg/ml	150	mM	-60 °C až -55 °C
5,0 mg/ml	30 mg/ml	325	mM	-64 °C
5,0 mg/ml	30 mg/ml	650	mM	-64 °C až -28 °C

Poměr aPC k sacharose k chloridu sodnému (v 10 nebo 20 mM citratovém pufru) je významnou proměnnou prostředku ovlivňující kolapsovou teplotu a teplotu skelného přechodu. Pro zpracování v běžném lyofilizačním přístroji musí být koncentrace chloridu dostatečně vysoká (výhodně 325 mM pro 2,5 mg/ml aPA a 650 mM pro 5 mg/ml aPC) pro vykrystalizování chloridu sodného během vymrazovacího stupně lyofilizačního procesu. Prostředky obsahující aPC mohou být zpracovány v běžném lyofilizačním přístroji za zisku lyofilizovaných prostředků obsahujících podle hmotnosti 1 díl aPC, 6 dílů sacharosy a 7,6 dílů chloridu sodného.

Příklad 2: Stabilita aPC v prostředcích obsahujících různá objemová činidla

Byly připraveny prostředky obsahující aPC pro výzkum vlivu různých objemových činidel na stabilitu molekuly. Celkem šest přísad bylo přidáno k aPC ve fosforečnanovém pufru neobsahujícím • · soli. Těmito objemovými činidly byly glycin, mannitol, sacharosa, trehalosa, raffinosa a hydroxyethylškrob (HES). Stabilita aPC v prostředku obsahujícím fosforečnanový pufr a neobsahujícím sůl ani objemové činidlo (kontrola) byla srovnávána se stabilitou v prostředku s objemovým činidlem. Vzorky byly skladovány při 50 °C, 40 °C a 25 °C po různou dobu. Data z analýz těchto vzorků byla srovnávána s počátečními hodnotami (čas = 0). APTT potenciál, vylučovací vysokoúčinná kapalinová chromatografie s filtrací (SE-HPLC), SDS-PAGE a testy na obsah proteinu byly použity pro hodnocení fyzikální a chemické stability prostředků.

Prostředky obsahující aPC byly připraveny rozpuštěním aPC ve fosforečnanovém pufru na koncentraci 5 mg/ml aPC. Objemová činidla byla přidána k roztokům aPC v poměru 6:1 (objemové činidlo k aPC) nebo 30 mg/ml. Vzorky byly lyofilizovány a uskladněny v množství 5 mg aPC na ampuly.

Prostředky byly testovány na stabilitu při 50 °C.po dobu 14 a 28 dnů; 40 °C po dobu 28 dnů, 48 dnů a 6 měsíců; a při 25 °C po dobu 6 a 12 měsíců. V každou uvedenou dobu byly dvě ampule každého prostředku nezávisle analyzovány jako separátní vzorky a získaná data byla srovnávána s počátečními daty (čas = 0) .

Analýza zahrnovala účinnost aPC (APTT), SDS-PAGE, procenta aPC monomerů a obsah proteinu.

íl

• * * ·

Kontrola

	25	°C	50 °C	40	°C
	Amp	. 0 d.	6 m,	. 12 m.	. 0 d.	14 d.	28 d	. 0 d.	. 28 d.	84 d.	. 6 m.
ΑΡΤΤ	1	321	294	236	321	248	248	321	248	221	215
účinnost
(U/mg)	2	321	251	242	321	245	227	321	279	221	176
Monomer	1	99,3	98,3	96,5	99,3	97,5	97,0	99,3	96,2	95,1	95,1
Obsah (%)	2	99,2	95,8	96,4	99,2	97,3	97,1	99,2	96,1	95,4	95,4

Glycin
	25	°C	50	°C	40	°C
	Amp	. 0 d.	6 m.	12 m.	. 0 d.	14 d.	28 d.	0 d.	28 d.	. 84 d.	6 m.
APTT účinnost	1	282	233	142	282	164	97	282	191	155	158
(U/mg)	2	321	239	191	321	161	142	321	215	152	79
Monomer	1	99,1	98,4	93,3	99,1	97,4	97,2	99,1	97,8	96,4	95,8
Obsah (%)	2	99,1	98,4	96,3	99,1	97,3	97,1	99,1	97,7	96,4	95,7

«' 9

9 • ·

9 9 9

9 99 9 9 9 9

9 9

9999 99 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9

9 9 9

99 99

Manitol
		25	°C			50	°C		40	°C
	Amp	. 0 d.	6 m.	, 12 m.	. 0 d.	. 14 d.	28 d	. 0 d.	28 d.	84 d	. 6 m.
APTT účinnost	1	309	227	255	309	270	245	309	273	270	28-2
(U/mg)	2	321	321	267	321	239	242	321	300	251	191
Monomer	1	99,2	98,8	97,4	99,2	98,2	98,1	99,2	98,4	97,6	97,8
Obsah (%)	2	99,2	98,7	97,6	99,2	98,2	98,0	99,2	98,4	97,6	97,8

Sacharosa

		25	°C			50	°C		40	°C
	Amp.	0 d.	6 m.	12 m.	0 d.	14 d.	28 d,	. 0 d.	28 d	. 84 d.	6 m.
APTT účinnost	1	327	300	288	327	300	288	327	267	306	285
(U/mg)	2	297	300	306	297	291	291	297	321	242	294
Monomer	1	99,2	99,0	98,5	99,2	98,7	98,9	99,2	98,8	98,5	98,9
Obsah (%)	2	99,2	99,0	98,5	99,2	98,7	98,9	99,2	98,8	98,5	98,9

• It It 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 « » * 999 999

9 9 9. 9

9 9 9 9 · 9 9

Trehalosa
	25	°C	50 °C	40	°C
	Amp,	. 0 d.	6 m.	. 12 m.	. 0 d.	. 14 d.	28 d.	0 d.	. 28 d.	. 84 d.	, 6 m.
APTT účinnost	1	312	291	282	312	258	282	312	273	276	27-6
(U/mg)	2	309	315	282	309	270	215	309	303	245	255
Monomer	1	99,2	99,0	98,4	99,2	98,6	98,8	99,2	98,8	98,4	98,7
Obsah (%)	2	99,2	98,8	98,4	99,2	98,6	98,8	99,2	98,7	98,4	98,7

Raffinosa
	25 °C	50 °C	40	°C
	Amp	. 0 d.	6 m.	12 m.	0 d.	14 d.	28 d.	0 d.	28 d	. 84 d.	6 m.
APTT účinnost	1	321	270	255	321	261	258	321	276	273	279
(U/mg)	2	288	285	306	288	255	264	288	270	239	255
Monomer	1	99,1	99,0	97,0	99,1	98,6	98,7	99,1	98,7	98,4	98,6
Obsah (%)	2	99,1	99,0	98,2	99,1	98,6	98,7	99,1	98,7	98,4	98,6

» · * • · • · · · ·· ·· • · ·

9 · ·· · ··· • · »·

HES

		25	°C			50	°C		40	°C
	Amp,	. 0 d.	6 m.	. 12 m.	0 d.	. 14 d.	28 d.	0 d.	. 28 d	. 84 d	. 6 m.
APTT účinnost	1	282	188	176	282	182	164	282	194	185	145
(U/rag)	2	285	245	215	285	188	161	285	176	152	103
Monomer	1	97,8	95,6	92,2	97,8	93,0	91,8	97,8	93,7	90,6	88,7
Obsah (%)	2	97,8	95,3	91,8	97,8	92,9	91,0	97,8	92,9	90,5	88,5

Nebyly zaznamenány žádné významné změny pH, barvy, charakteristik prostředku a fyzikálního vzhledu vzorků během 1 roku testu na stabilitu. Při analýze v APTT testu a SE-HPLC měly prostředky obsahující HES a glycin menší fyzikální stabilitu (z důvodů agregace) a chemickou stabilitu (účinnost) při srovnání s kontrolou. Prostředky obsahující manitol vykazovaly o něco vyšší fyzikální a chemickou stabilitu než kontroly a všechny ostatní prostředky obsahující sacharosu, trehalosu a rafinosu vykazovaly výrazně lepší fyzikální a cehmickou stabilitu než kontrola. Proto umožňují manitol, sacharosa, trehalosa a rafinosa, které jsou použity jako objemová činidla v prostředcích obsahujících aPC, dosažení lepší fyzikální a chemické stability ve srovnání s prostředky obsahujícími aPC bez objemového činidla nebo obsahující jako objemové činidlo HES nebo glycin.

Příklad 3: Stabilita rekombinantního lidského aktivovaného proteinu C

Dvě šarže lyofilizovaného prostředku obsahujícího rekombinantní lidský aktivovaný protein C (aPC) byly uskladněny • · · · · · • «* po dobu 1 měsíce při 40 °C/75% n^lativní vlhkosti a potom byly analyzovány na možnou degradaci. Stabilita aPC byla také sledována po rekonstituci sterilní vodou a uskladnění na dobu až 72 hodin při teplotě okolí. Lyofilizovaný $PC prostředek obsahoval 10 mgv_vá'PŮ,' 6 0 'mg sacharosy/ 76 mg chloridu sodného a 15,1 mgy^ittaťu na ampuly. aPC v tomto prostředku je stabilní v suchém' stavu po dobu alespoň jednoho měsíce při uskladnění při 40 °C/75% relativní vlhkosti a roztoku je stabilní po dobu 24 hodin při teplotě okolí.

Obě šarže byly připraveny za použití stejného množství 10 mg aPC, 60 mg sacharosy, 76 mg chloridu sodného a 15,1 mg citrátu na ampuly. Obě lyofilizované šarže byly uskladněny po dobu 1 měsíce při 40 °C/75% relativní vlhkosti a potom byla sledována stabilita aPC za požití testu účinnosti na APTT, vylučovací HPLC pro kvantifikaci aPC peptidů a hmotnostní spektrometrie pro kvantifikaci variantních forem proteinu. Jedna šarže byla rekonstituována sterilní vodou na koncentraci aPC 1 mg/ml a nechala se při teplotě okolí. Stabilita aPC v roztoku byla stanovena v 0, 1, 4, 8, 24, 48 a 72 hodin pomocí APTT testu a hmotnostní spektrometrie.

Nebyla pozorována ztráta aktivity aPC a byl pozorován nesignifikantní rozsah strukturální degradace molekuly po skladování v suchém stavu po dobu 1 měsíce při 40 °C/75% relativní vlhkosti. aPC v tomto prostředku je stabilní po rekonstituci po dobu více než 24 hodin v prostředku obsahujícím 1 mg/ml aPC.

* · ·· · · « ·· ·· • · · ···· ··«· • ··· · · · · · » ·

Claims

♦ · · * · · · · ······

PeLt-entoAz-es nároky

1. Stabilní lyofilizovaný prostředek vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C a objemové činidlo vybrané ze skupiny skládající se z manitolu, trehalosy, raffinosy a sacharosy a jejich směsí.
2. Prostředek podle nároku lvyznačující se tím, že objemovým činidlem je sacharosa, trehalosa nebo raffinosa.
3. Prostředek podle nároku 2vyznačující se tím, že objemovým činidlem je sacharosa nebo raffinosa.
4. Prostředek podle nároku 3vyznačující se tím, že objemovým činidlem je sacharosa.
5. Prostředek podle nároku lvyznačuj ící že dále obsahuje farmaceuticky přijatelnou sůl.
6. Prostředek podle nároku Svyznačuj ící že poměr hmotností je přibližně 1 díl aktivovaného přibližně 7 až 8 dílů soli a přibližně 5 až 7 dílů činidla.

se tím, se tím, proteinu C, obj emového
7. Prostředek podle nároku 6vyznačuj ícísetím, že poměr hmotností je přibližně 1 díl aktivovaného proteinu C, přibližně 7,2 až 7,8 dílů soli a přibližně 5,5 až 6,5 dílů objemového činidla.
8. Prostředek podle nároku 7vyznačuj ícísetím, že pbměr hmotností je přibližně 1 díl aktivovaného proteinu C, přibližně 7,6 dílů soli a přibližně 6 dílů objemového činidla.

• · ·· · ·· ·· 4 4 • · · · · · « · · · · • · · · 9 9 4 · « « 4 ♦ · · · · · 99 444444 • · · 4 · 9 0 4 ······ 4·4 ·· |·
9. Prostředek podle nároku Svyznačující se tím, že solí je NaCl.
10. Prostředek podle nároku 9vyznačující se tím, že objemovým činidlem je sacharosa.
11. Prostředek podle nároku lvyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelný pufr.
12. Prostředek podle nároku 11 vyznačující se tím, že uvedený pufr je vybrán ze skupiny skládající se z Tris-acetatu, citrátu sodného a fosforečnanu sodného.
13. Farmaceuticky přijatelný pufr podle nároku 12, kterým je citrát sodný.
14. Stabilní lyofilizovaný prostředek vyznačující se tím, že obsahuje přibližně 2,5 mg/ml aktivovaného proteinu C, přibližně 15 mg/ml sacharosy a přibližně 20 mg/ml NaCl.
15. Stabilní lyofilizovaný prostředek vyznačující se tím, že obsahuje přibližně 5 mg/ml aktivovaného proteinu C, přibližně 30 mg/ml sacharosy a přibližně 38 mg/ml NaCl.
16. Způsob přípravy prostředku podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje lyofilizaci roztoku obsahujícího aktivovaný protein C a objemové činidlo vybrané ze skupiny skládající se z manitolu, trehalosy, raffinosy a sacharosy a jejich směsí.
17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že objemovým činidlem je sacharosa, trehalosa nebo raffinosa.

·· · ···
18. Způsob podle nároku 17 vyznačuj ící se tím, že objemovým činidlem je sacharosa nebo raffinosa.
19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že objemovým činidlem je sacharosa.
20. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že prostředek dále obsahuje farmaceuticky přijatelnou sůl.
21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že poměr hmotností je přibližně 1 díl aktivovaného proteinu C, přibližně 7 až 8 dílů soli a přibližně 5 až 7 dílů objemového činidla.
22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že poměr hmotností je přibližně 1 díl aktivovaného proteinu C, přibližně 7,2 až 7,8 dílů soli a přibližně 5,5 až 6,5 dílů objemového činidla.
23. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že poměr hmotností je přibližně 1 díl aktivovaného proteinu C, přibližně 7,6 dílů soli a přibližně 6 dílů objemového činidla.
24. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že pH roztoku je mezi 5,5 a 6,5.
25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že pH je přibližně 5,8 až 6,2.
26. Způsob podle nároku 25 v y pH je přibližně 6,0.

značuj íc se t i m, že
27. Způsob přípravy stabilního lyofilizovaného prostředku • · ·· · ··· • · · • · • · ···· ·· vyznačující se tím, že zahrnuje lyofilizací roztoku obsahujícího přibližně 2,5 mg/ml aktivovaného proteinu C, přibližně 15 mg/ml sacharosy, přibližně 20 mg/ml NaCl a citratový pufr, kde uvedený roztok má pH vyšší než 5,8, ale nižší než 6,2.
28. Způsob přípravy stabilního lyofilizovaného prostředku vyznačující se tím, že zahrnuje lyofilizací roztoku obsahujícího přibližně 5 mg/ml aktivovaného proteinu C, přibližně 30 mg/ml sacharosy, přibližně 38 mg/ml NaCl a citratový pufr, kde uvedený roztok má pH vyšší než 5,8, ale nižší než 6,2.
29. Jednotková dávková forma vyznačující se tím, že sestává ze zásobníku pro dávkovou jednotku obsahujícího prostředek podle nároku 1.
30. Jednotková dávková forma vyznačující se tím, že sestává ze zásobníku pro dávkovou jednotku obsahujícího prostředek podle nároku 8.
31. Způsob léčby získaných onemocnění, při kterých dochází k intravaskulární koagulaci vyznačující se tím, že zahrnuje podání protředku podle nároku 1 pacientovi, který potřebuje takovou léčbu.
32. Způsob léčby získaných onemocnění, při kterých dochází k intravaskulární koagulaci vyznačující se tím, že zahrnuje podání protředku podle nároku 14 pacientovi, který potřebuje takovou léčbu.
33. Způsob léčby získaných onemocnění, při kterých dochází k intravaskulární koagulaci vyznačující se tím, že zahrnuje podání protředku podle nároku 15 pacientovi, který potřebuje takovou léčbu.
34. Stabilní lyofilizovaný prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 12 k použití jako lék při léčbě onemocnění, při kterých dochází k intravaskulární koagulaci.
35. Stabilní lyofilizovaný prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 12 k použití jako lék při léčbě ischemického iktu.