WO2011058286A1 - Procede de purification de facteur b - Google Patents

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WO2011058286A1
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subjecting
chromatography
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Michel Poulle
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Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Definitions

  • the invention relates to a method for purifying Factor B from human blood plasma.
  • Complement plays a vital role in the defense of the body against infectious agents and in the inflammatory process. It represents an auxiliary system of immunity, in particular of the humoral response and the innate response.
  • the complement comprises a set of approximately 30 plasma and sometimes membrane proteins, synthesized essentially by the liver and macrophages and which can be activated by proteolytic cascades. It includes both plasma proteins, many different cell surface receptors, some present on inflammatory cells and others on immune system cells, as well as regulating membrane proteins that protect host cells from autoattacking. . Plasma complement proteins function either as enzymes, as binding proteins, or as regulators (inhibitors or activators).
  • Factor complement is a component of the alternative pathway of complement activation. It circulates in the blood as a protein composed of a single polypeptide chain of 93 kDa molecular weight. Upon activation of the alternate pathway, Factor B is cleaved by the resulting Complement Factor D into an inactive Ba (30 kDa) chain and the Bb (63 kDa) catalytic subunit.
  • the active subunit Bb is a serine protease that associates with C3b to form the C3 converting C3 convertase of the alternative pathway (C3bBb).
  • the Bb subunit is involved in the proliferation of pre-activated B lymphocytes, while the Ba chain inhibits their proliferation.
  • Factor B preparations would be useful for the treatment of Factor B deficiencies, but for the time being no such preparation is commercially available. Summary of the invention
  • the invention provides a method of purifying Factor B, comprising the steps of:
  • step (ii) subjecting the fraction obtained in step (i) to heparin affinity chromatography
  • step (iii) subjecting the fraction enriched in Factor B obtained in step (ii) to cation exchange chromatography;
  • the method may further comprise at least one viral inactivation treatment, preferably by the action of solvent and detergent, and / or at least one viral elimination treatment, preferably by nanofiltration.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining a Factor B preparation for therapeutic use, which comprises
  • the invention also relates to the preparation of Factor B obtainable by this method.
  • Preferably said preparation is in freeze-dried form.
  • the method of the invention has many advantages: it is industrializable, allows to purify Factor B from various production intermediates, and with a high degree of purity.
  • FIG. 1 shows a diagram showing the steps of the purification process followed in Example 1. Detailed description of the invention
  • Vector B any protein having the amino acid sequence of human native Factor B.
  • the term “Factor B” further includes naturally occurring allelic variations and / or naturally occurring Factor B isoforms, and any form or degree of glycosylation or other post-translational modification. Also included are homologues or derivatives of Factor B which exhibit the same or higher biological activity with respect to the activity of the wild-type form and / or which have a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85%. %, more preferably at least 90%.
  • Factor B activity includes the ability to activate C3 convertase.
  • Factor B activity can be measured in various ways, well known to those skilled in the art.
  • a chromatography consists of contacting the Factor B in solution
  • the starting material used is the supernatant of a cryoprecipitate of blood plasma optionally mixed with a plasma fraction not retained on anion exchange chromatography, DEAE-Sephadex type. It is also possible to use the supernatant resulting from an ethanolic precipitation. An unrestrained plasma fraction can also be used on anion exchange chromatography.
  • Heparin-type affinity chromatography uses a matrix or a support, which is most often an agarose gel, on which heparin or heparin derivatives or mimetics are grafted.
  • heparin-type ligands mention may be made especially of the following ligands: chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, or synthetic oligomers, for example cellubiosis sulfate ester (Matrex TM Cellufine Sulfate), or therapeutic analogs of heparin, for example sulfated oligosaccharides.
  • the pH is adjusted to a value of 6, for example by equilibrating the column with a 20 mM sodium phosphate buffer solution, with an osmolality of 60 ⁇ 5 mOsm / kg, and a pH of 6.0 ⁇ 0.1.
  • Example 1 An example of a particular protocol is presented in Example 1.
  • a cation exchange chromatography uses a matrix, most often of the agarose or polymeric type, on which are grafted ligands such as carboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) or methyl sulfonate (S).
  • Cation exchange supports are commercially available, for example CM-Sepharose, SP-Sepharose and S-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl CM-650, Toyopearl SP-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD carriers.
  • SP sepharose FF is used.
  • An example of a particular protocol is presented in Example 1.
  • Factor B can under certain conditions bind to anion exchange resins, and be desorbed by high ionic buffer systems.
  • Anion exchange chromatography uses a matrix, most often of the agarose or polymeric type, on which are grafted ligands such as diethylaminoethyl (DEAE), quaternary aminoethyl (QAE) or quaternary ammonium (Q).
  • DEAE diethylaminoethyl
  • Q quaternary aminoethyl
  • Q quaternary ammonium
  • Anion exchange supports are commercially available, for example DEAE-Sepharose, Q-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl Super Q-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TMAE (Merck KGaA), Macro-Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support (BioRad), DEAE HyperD, Q HyperD, DEAE Trisacryl, DEAE Sperodex (Pall garlic).
  • Q sepharose FF is used.
  • An example of a particular protocol is presented in Example 1.
  • Factor B is eluted by increasing the ionic strength of the equilibration buffer of anion exchange chromatography.
  • the pH of the fraction of blood plasma containing Factor B and obtained in step (i) is adjusted to be in the range of pH 5.5 to pH 6.5 and preferably to be equal to pH 6.0.
  • the pH of the fraction eluted from step (ii) and then diluted before step (iii) is adjusted to be in the range from pH 5.5 to pH 7.5.
  • the pH of the eluted fraction of step (iii) and then diluted before step (iv) is adjusted to be in the range of 5.5 to 7.5.
  • the purification of the factor B comprises the steps of:
  • step (iii) (a) subjecting the fraction obtained in step (ii) to cation exchange chromatography, for example on SP-Sepharose;
  • step (iv) subjecting the fraction enriched in Factor B obtained in step (iii) (a) or (b) to anion exchange chromatography, for example on Q-Sepharose.
  • the process In order to obtain a preparation for therapeutic use, the process generally continues with formulation, concentration and then filtration steps of the Factor B concentrate.
  • the method of manufacturing a Factor B preparation according to the invention may comprise the following steps:
  • the chromatography of step (ii) is the only heparin-type affinity chromatography, the method comprising no additional step of heparin-type affinity chromatography.
  • the method of the invention contains no chromatography other than those provided in steps (ii) to (iv) defined above.
  • process of the invention may optionally comprise additional steps, for example other anion or cation exchange chromatographies, but also optionally one or more hydrophobic interaction chromatographies.
  • Factor B can, under certain conditions, bind to hydrophobic interaction chromatography resins, and be desorbed by low ionic strength buffer systems.
  • Such a chromatography uses a matrix, most often of agarose or polymeric type, on which are grafted ligands such as phenyl, octyl, butyl, methyl, or hexylamine, phenylpropylamine, 4-mercapto-ethyl-pyridine.
  • grafted ligands such as phenyl, octyl, butyl, methyl, or hexylamine, phenylpropylamine, 4-mercapto-ethyl-pyridine.
  • Supports for this type of chromatography are commercially available, for example phenyl sepharose, octyl sepharose, butyl sepharose and Capto TM carriers.
  • the process of the invention may also comprise a chromatography of hydroxyapatite type. Indeed, Factor B can be purified using calcium phosphate, fluoroapatite and hydroxyapatite composites as the solid phase.
  • Bio-Gel Hydroxyapatite HT Bio-Rad
  • Ceramic Fluoroapatite Ceramic Fluoroapatite
  • Ceramic Hydroxyapatite Bio-Rad
  • HA Ultrogel Pall
  • the method of the invention may also comprise immunoaffinity chromatography, which uses, for example, antibodies or aptamers immobilized on a chromatography matrix.
  • the matrices are generally pre-activated resins, for example by epoxy (Sepharose 6B1 EAH Sepharose 4B, Amino Sepharose 6 FF, 6-AKS Sepharose 4FF, Toyopearl AF Epoxy, Toyopearl AF Amino, Toyopearl AF Tresyl).
  • the unbound impurities are washed using suitable buffer systems (citrate buffer, phosphate buffer, or HEPES, for example), and the Factor B is then eluted using, for example, high concentrations of chaotropic salts (thiocyanate type, lithium bromide). ), buffer systems with low pH (glycine pH 2-3) or high pH (TRIS pH 9).
  • the method of the invention may also include other treatments, such as delipidation.
  • Delipidation consists in eliminating, preferably upstream or as soon as possible in the process, lipid impurities from the protein solutions by means of, for example, precipitation or adsorption.
  • Suitable precipitating agents include, for example, polyethylene glycols (PEG) or ammonium sulfate, while silica powders ("fumed silica", Aerosil 200, Aerosil 380), dextran sulfates or fluorocarbons (Freon-13) are suitable adsorbents.
  • proteolytic impurities ie enzymes, for example proteases or glycosidases, which would be able to cleave the Factor B molecule into inactive truncated forms.
  • This elimination or inhibition is preferably carried out as soon as possible, preferably further upstream of the purification process.
  • a filter which retains a part of the proteolytic impurities (Sartoclear® filter type).
  • protease inhibitors may be, for example, benzamidine, 4-aminobenzamidine, benzamidine hydrochloride and its derivatives, lysine and its derivatives, 6-aminohexanoic acid ( ⁇ -aminocaproic acid) and its derivatives, trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid (acid tranexamic) and its derivatives, 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonylfluoride (AEBSF) and its derivatives, (4-Amidino-Phenyl) -methane-Sulfonyl Fluoride (APMSF) and its derivatives, 3,4-dichloroisocoumarin (DCI) and its derivatives, acetyl-leucyl-leucyl-arginal (Leupeptin) and its derivatives, aprotinin and its derivatives, trypsin inhibitor of soya, and its derivatives, ⁇
  • proteolytic impurities can be inhibited by adding one or more protease inhibitors of the above-mentioned group, particularly antithrombin II and C1 inhibitor, and then eliminating the enzyme / inhibitor complex at the same time. subsequent purification steps.
  • immobilized dyes such as Cibacron Blue F3GA or its derivatives, other triazine dyes such as Procion Red HE-3B and its derivatives, or Procion Green H-4G and its derivatives, Reactive Red 120 and its derivatives, Reactive Green 19 and its derivatives, Reactive Yellow 86 and its derivatives, Reactive Orange 14 and its derivatives, immobilized on agarose matrices or polymeric matrix.
  • the preparation of Factor B useful in the invention has generally undergone at least one step of removing or inactivating at least one infectious agent.
  • Infectious agents include viruses and NCTAs (unconventional transmissible agents) such as prions.
  • Viral inactivation often involves treatment with chemicals, for example solvent, detergent and / or heat, for example by pasteurization.
  • Nanofiltration is also useful for removing an infectious agent.
  • the process comprises at least a solvent and detergent treatment, and a nanofiltration.
  • Pasteurization refers to methods exposing liquid Factor B compositions at a temperature of 60 ° C for at least 10h.
  • the treatment with solvent and / or detergent comprises in particular the treatment with tri-n-butyl phosphate TnBP and / or a detergent which is selected from Triton X-100, Tween (preferably Tween 80) and sodium cholate.
  • the treatment is generally continued at 25 ° C for at least 6 hours.
  • Nanofiltration generally refers to the filtration of a Factor B solution through a filter with a pore size of less than 80 nm.
  • Available filters include Planova TM 75nm, Planova TM 35nm, Planova TM 20nm or Planova TM 15nm, BioEX (Asahi corporation), Ultipor DV 50 or DV 20 (Pall Corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFR or NFP (Millipore).
  • nanofiltration is carried out after step (iv) of anion exchange chromatography.
  • the purified Factor B fraction is filtered on a filter sequence with a pore size of 20 nm and 15 nm.
  • the obtained Factor B preparation is formulated with suitable excipients and stabilizers. They may be diluents, agents, cryoprotectants, lyoprotectants, etc.
  • sugars sucrose, trehalose, glucose, lactose, etc.
  • polyols mannitol, sorbitol
  • amino acids glycine, arginine, histidine, alanine
  • Polysorbate surfactants Teween 20 or Tween 80 for example
  • polyoxamer for example poloxamer 188
  • polyethylene glycol can also be added.
  • Antioxidants eg methionine, monothioglycerol, glutathione, citric acid, ascorbic acid, sodium metabisulfite, and sodium sulfite
  • Antioxidants eg methionine, monothioglycerol, glutathione, citric acid, ascorbic acid, sodium metabisulfite, and sodium sulfite
  • Buffer substances may be further used, for example in the form of carbonate, phosphate, citrate, acetate, borate, trimethamine [(2-amino-2-hydroxymethyl-1, 3-propanediol), TRIS], glycine and lysine.
  • the liquid formulation of Factor B can desiccate if necessary, to obtain a solid form.
  • Desiccation is a method of removing water at a high stage. It is a dehydration to remove as much water as possible. This phenomenon can be natural or forced. This desiccation can be carried out using freeze-drying, atomization and cryoatomization techniques.
  • the preferred mode of obtaining the solid form of the composition for pharmaceutical use according to the invention is lyophilization.
  • Lyophilization methods are well known to those skilled in the art, see for example Wang et al, Lyophilization and Development of Solid Protein Pesticides, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60, 2000.
  • the degree of humidity is less than or equal to 3% by weight, preferably less than or equal to 2.5%, preferably less than or equal to 2%, preferably less than or equal to 1.5%.
  • the solid composition may be dissolved in water for injection (WFI) or in a reconstitution solvent to provide a therapeutic formulation.
  • WFI water for injection
  • a Factor B concentrate is prepared by following the steps shown in the attached figure.
  • Cryosorbant is prepared by thawing fresh frozen plasma at a temperature between 1 ° C and 6 ° C (cryoprecipitation). After centrifugation, the cryoprecipitate is recovered to produce the fibrinogen, von Willebrand factor and factor VIII concentrates. The supernatant is collected, part of which is subjected to a purification step on DEAE-Sephadex in order to fix the vitamin k dependent factors such as protein C, Factor VII and Factor IX. The fraction not retained on DEAE-Sephadex is mixed with the remaining cryosurnant to form Solution A. The concentration of Factor B in the fraction is about 100-150 ⁇ g mL (for a reported plasma concentration of 200 ⁇ g / mL).
  • Solution A is adjusted to a pH between 5.5 and 6.5 and preferably 6.0.
  • the adjusted fraction is then subjected to chromatography on a Heparin Sepharose FF column or other chromatographic medium on which is grafted a heparin ligand. Most plasma proteins are found not delayed in the chromatography filtrate.
  • Factor B is eluted by increasing the ionic strength of the column equilibration buffer.
  • the eluted fraction is diluted and then chromatographed on a strong cationic exchange column of SP Sepharose type FF or equivalent. After washing the gel, the weakly adsorbed proteins on the gel are eluted by increasing the ionic strength of the column equilibration buffer.
  • Factor B is eluted by further increasing the ionic strength of the column equilibration buffer.
  • the eluted fraction is then subjected to a viral inactivation step by detergent solvent treatment (Polysorbate 80 and TnBP) effective on the enveloped viruses.
  • the fraction is then diluted, adjusted to a pH of 6.0 (test 1) or 6.5 (test 2) and then subjected to chromatography on a strong anionic exchange column type Q Sepharose FF or equivalent equilibrated at pH 6, 0 or 6.5.
  • Factor B is eluted by increasing the ionic strength of the column equilibration buffer.
  • the fraction of Factor B obtained at this stage is of very high purity and can be subjected to a viral elimination step by nanofiltration, then concentrated and formulated by ultrafiltration.
  • Factor B assay is carried out conventionally by immunoenzymatic method (ELISA) with commercial reagents (Diagnostica Stago). Briefly, the Factor B to be assayed is captured by a human anti-Factor B antibody immobilized on a solid phase. The fixed Factor B is then recognized by a peroxidase immunoconjugate. The level of bound peroxidase is measured by its activity on the ortho-phenylenediamine substrate in the presence of hydrogen peroxide. The intensity of the staining, after stopping the reaction with a strong acid, is a function of the amount of Factor B initially present in the sample. Factor B thus assayed is called "Antigen Factor B" or "Ag".

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Abstract

L'invention concerne un procédé de purification de Facteur B, comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B; (ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une chromatographie d'affinité de type 1 héparine; (iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations; (iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions, 20 (v) éluer le Facteur B.

Description

Procédé de purification de Facteur B
L'invention concerne un procédé de purification de Facteur B, à partir de plasma sanguin humain.
Arrière-plan technologique de l'invention :
Le complément joue un rôle essentiel dans la défense de l'organisme contre des agents infectieux et dans le processus inflammatoire. Il représente un système auxiliaire de l'immunité, en particulier de la réponse humorale et de la réponse innée.
Le complément comprend un ensemble d'environ 30 protéines plasmatiques et parfois membranaires, synthétisées essentiellement par le foie et les macrophages et qui peuvent être activées par des cascades protéolytiques. Il comprend à la fois des protéines plasmatiques, de nombreux récepteurs cellulaires de surface différents, certains présents sur les cellules inflammatoires et d'autres sur les cellules du système immunitaire, ainsi que des protéines membranaires de régulation qui protègent les cellules hôte d'une autoattaque. Les protéines plasmatiques du complément fonctionnent soit comme des enzymes, soit comme des protéines de liaison, soit comme des régulateurs (inhibiteurs ou activateurs).
Il existe 3 voies de déclenchement de la cascade du complément : la voie classique déclenchée par les anticorps, la voie alterne déclenchée par des substances bactériennes en absence d'anticorps, la voie dépendante des lectines qui reconnaissent certains polysaccharides bactériens. Ces deux dernières voies sont mises en jeu dans la réponse innée et sont extrêmement importantes dans la défense de l'hôte contre les infections bactériennes.
Le facteur B du complément est un composant de la voie alterne de l'activation du complément. Il circule dans le sang comme une protéine composée d'une seule chaîne polypeptidique de poids moléculaire 93 kDa. Lors de l'activation de la voie alterne, le Facteur B est clivé par le Facteur D du complément résultant en une chaîne Ba (30 kDa) inactive et en la sous-unité catalytique Bb (63 kDa). La sous-unité active Bb est une protéase à sérine qui s'associe avec le C3b pour former la C3 convertase de la voie alterne (C3bBb). La sous-unité Bb est impliquée dans la prolifération des lymphocytes B pré activés, tandis que la chaîne Ba inhibe leur prolifération. Des préparations de Facteur B trouveraient une utilité pour le traitement de déficiences en Facteur B, mais pour le moment aucune préparation de ce type n'est disponible commercialement. Résumé de l'invention :
L'invention fournit un procédé de purification de Facteur B, comprenant les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B ;
(ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une chromatographie d'affinité de type héparine;
(iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions,
(v) éluer le Facteur B.
Le procédé peut comprendre en outre au moins un traitement d'inactivation virale, de préférence par l'action de solvant et détergent, et/ou au moins un traitement d'élimination virale, de préférence par nanofiltration.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une préparation de Facteur B à usage thérapeutique, qui comprend
- la purification du Facteur B selon le procédé de purification tel que défini ici, par ce en quoi on obtient un concentré de Facteur B,
- suivie d'étapes de formulation, concentration, puis filtration du concentré de Facteur B.
L'invention a également pour objet la préparation de Facteur B susceptible d'être obtenue par ce procédé. De préférence ladite préparation est sous forme lyophilisée. Le procédé de l'invention présente de nombreux avantages : il est industrialisable, permet de purifier du Facteur B à partir de divers intermédiaires de production, et avec un degré de pureté élevé.
Légende de la Figure :
La Figure 1 montre un schéma représentant les étapes du procédé de purification suivies dans l'exemple 1. Description détaillée de l'invention :
Par « Facteur B » on entend toute protéine ayant la séquence en acides aminés du Facteur B natif humain. Le terme « Facteur B » comprend en outre les variations alléliques naturelles et/ou les isoformes du Facteur B trouvées naturellement, et toute forme ou degré de glycosylation ou autre modification post-traductionnelle. Sont aussi compris les homologues ou dérivés du Facteur B qui présentent la même ou une activité biologique supérieure par rapport à l'activité de la forme sauvage et/ou qui présentent une identité de séquence d'au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence encore d'au moins 90%.
Le terme « activité biologique » du Facteur B inclut la capacité à activer la C3 convertase. L'activité du Facteur B peut être mesurée de différentes manières, bien connues de l'homme du métier.
De manière générale, une chromatographie consiste à mettre en contact le Facteur B en solution
avec une matrice à laquelle le Facteur B se lie, éventuellement laver la matrice dans des conditions appropriées pour que le Facteur B reste lié, puis appliquer à la matrice une solution qui provoque l'élution du Facteur B de la matrice, ou de manière alternative avec une matrice qui lie les impuretés mais pas le Facteur B
Etape (i) obtention d'une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B :
De préférence on utilise comme matériau de départ le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, type DEAE-Séphadex. On peut encore utiliser le surnageant issu d'une précipitation éthanolique. On peut aussi utiliser une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions.
Etape (ii) chromatographie d'affinité de type héparine :
La chromatographie d'affinité de type héparine met en œuvre une matrice ou un support, qui est le plus souvent un gel d'agarose, sur lequel est greffé de l'héparine ou des dérivés ou mimétiques de l'héparine. Parmi les ligands de type héparine on peut citer notamment les ligands suivants : chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, ou des oligomères synthétiques, par exemple le cellubiose sulfate ester (Matrex™ Cellufine Sulfate), ou des analogues thérapeutiques de l'héparine, par exemple des oligosaccharides sulfatés.
De préférence le pH est ajusté à une valeur de 6, par exemple en équilibrant la colonne avec une solution tampon de phosphate de sodium à 20 mM, avec une osmolalité de 60±5 mOsm/kg, et un pH 6,0±0.1 .
Un exemple de protocole particulier est présenté dans l'exemple 1.
Cette étape permet de fixer le Facteur B et l'antithrombine III (AT III), et de les éluer séparément. Etape (iii) chromatographie échangeuse de cations :
Une chromatographie échangeuse de cations met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que carboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) ou methyl sulfonate (S). Des supports échangeurs de cations sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports CM-Sepharose, SP-Sepharose et S-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl CM-650, Toyopearl SP-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD S03", Fractogel EMD COO" (Merck KGaA), Macro-Prep CM Support, Macro-Prep High S Support (BioRad), CM HyperD, S HyperD, CM Trisacryl, SP Trisacryl, SP Sperodex (ail Pall).
De préférence, on utilise la SP sepharose FF. Un exemple de protocole particulier est présenté dans l'exemple 1 .
Etape (iv) chromatographie échangeuse d'anions :
Le Facteur B peut dans certaines conditions se lier à des résines échangeuses d'anions, et en être désorbé par des systèmes tampons à force ionique élevée.
Une chromatographie échangeuse d'anions met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que diethylaminoethyle (DEAE), aminoethyle quaternaire (QAE) ou ammonium quaternaire (Q). Des supports échangeurs d'anions sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports DEAE-Sepharose, Q- Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl Super Q-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TMAE (Merck KGaA), Macro- Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support (BioRad), DEAE HyperD, Q HyperD, DEAE Trisacryl, DEAE Sperodex (ail Pall). De préférence, on utilise la Q sepharose FF. Un exemple de protocole particulier est présenté dans l'exemple 1. Le Facteur B est élué par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse d'anions.
Avantageusement, le pH de la fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B et obtenue à l'étape (i) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 5,5 à pH 6,5 et de préférence pour être égal à pH 6,0. Avantageusement, le pH de la fraction éluée de l'étape (ii) puis diluée avant l'étape (iii) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 5,5 à pH 7,5. Avantageusement encore, le pH de la fraction éluée de l'étape (iii) puis diluée avant l'étape (iv) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de 5,5 à 7,5.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la purification du Facteur B comprend les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur B, par exemple (a) (b) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ; ou encore par exemple une fraction non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions
(ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine, par ce en quoi on obtient une fraction enrichie en Facteur B;
(iii) (a) soumettre la fraction obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP-Sépharose ;
(iii) (b) suivie le cas échéant par un traitement par solvant et détergent ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) (a) ou (b) à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q-Sépharose.
Pour l'obtention d'une préparation à usage thérapeutique, le procédé se poursuit généralement par des étapes de formulation, concentration, puis filtration du concentré de Facteur B.
Plus précisément, le procédé de fabrication d'une préparation de Facteur B selon l'invention peut comprendre les étapes suivantes :
(i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur B, par exemple le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ou par exemple une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ;
(ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction non retenue à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine;
laver puis éluer le Facteur B par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie d'affinité de type héparine, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (a) la soumettre à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP- Sépharose ;
laver puis éluer le Facteur B par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse de cations, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (b) le cas échéant la soumettre à un traitement par solvant et détergent ;
(iv) puis la soumettre à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q- Sépharose ;
(v) laver et éluer le Facteur B, généralement par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse d'anions ;
(vi) préparer un concentré de Facteur B. Autres étapes possibles :
De préférence, la chromatographie de l'étape (ii) est l'unique chromatographie d'affinité de type héparine, le procédé ne comprenant pas d'étape supplémentaire de chromatographie d'affinité de type héparine.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention ne contient aucune autre chromatographie que celles prévues aux étapes (ii) à (iv) définies plus haut.
Toutefois, le procédé de l'invention peut éventuellement comprendre des étapes supplémentaires, par exemple d'autres chromatographies d'échanges d'anions ou de cations, mais aussi le cas échéant une ou plusieurs chromatographies par interaction hydrophobe.
Le Facteur B peut dans certaines conditions se lier à des résines de chromatographie par interaction hydrophobe, et en être désorbé par des systèmes tampons à force ionique faible.
Une telle chromatographie met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que phenyl, octyl, butyl, methyl, ou encore hexylamine, phenylpropylamine, 4-mercapto-ethyl-pyridine. Des supports pour ce type de chromatographie sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports phenyl sepharose, octyl sepharose, butyl sepharose, Capto™ MMC (ail GE Healthcare), Toyopearl Phenyl-650, Toyopearl Butyl-650, Toyopearl Hexyl- 650 (ail Tosoh Biosciences), Macro-Prep Methyl HIC Support, Macro-Prep t-Butyl HIC Support (Bio-Rad), HEA HyperCel; PPA HyperCel, MEP HyperCel (all Pall). Le procédé de l'invention peut aussi comprendre une chromatographie de type Hydroxyapatite. En effet, le Facteur B peut être purifié en utilisant des composites de phosphate de calcium, fluoroapatite, hydroxyapatite comme phase solide. Parmi les supports disponibles commercialement, on peut citer par exemple Bio-Gel Hydroxyapatite HT (Bio- Rad), Ceramic Fluoroapatite, Ceramic Hydroxyapatite (Bio-Rad), HA Ultrogel (Pall).
Le procédé de l'invention peut encore comprendre une chromatographie par immunoaffinité, qui met en oeuvre par exemple des anticorps ou des aptamères immobilisés sur une matrice de chromatographie. Les matrices sont généralement des résines pré-activées, par exemple par époxy (Sepharose 6B1 EAH Sepharose 4B, Amino Sepharose 6 FF, 6-AKS Sepharose 4FF, Toyopearl AF Epoxy, Toyopearl AF Amino, Toyopearl AF Tresyl). Les impuretés non liées sont lavées en utilisant des systèmes tampon adaptés (tampon citrate, tampon phosphate, ou HEPES par exemple), et le Facteur B est ensuite élué en utilisant par exemple de fortes concentrations en sels chaotropiques (de type thiocyanate, bromure de lithium), des systèmes tampons à faible pH (glycine pH 2-3) ou à pH élevé (TRIS pH 9).
Le procédé de l'invention peut également inclure d'autres traitements, tels qu'une délipidation. La délipidation consiste à éliminer, de préférence en amont ou le plus tôt possible dans le procédé, des impuretés lipidiques des solutions de protéines au moyen par exemple d'une précipitation ou d'une adsorption. Des agents précipitants adaptés incluent par exemple des polyéthylèneglycols (PEG) ou du sulfate d'ammonium, tandis que des poudres de silice ("silice fumée"; Aerosil 200, Aerosil 380), dextran sulfates ou fluorocarbones (Freon-1 13) sont des adsorbants adaptés.
Il peut aussi être avantageux d'éliminer ou inhiber les impuretés protéolytiques, à savoir les enzymes, par exemple les protéases ou glycosydases, qui seraient capables de cliver la molécule de Facteur B en des formes tronquées inactives. Cette élimination ou inhibition est de préférence réalisée le plus tôt possible, de préférence encore en amont du procédé de purification. Pour cela on peut utiliser une méthode chromatographique dans laquelle des inhibiteurs de protéases sont immobilisés sur des matrices de type agarose ou matrice polymérique. On peut aussi utiliser un filtre qui retient une partie des impuretés protéolytiques (type filtre Sartoclear®). De tels inhibiteurs de protease peuvent être par exemple benzamidine, 4- aminobenzamidine, benzamidine chlorhydrate et ses dérivés, lysine et ses dérivés, acide 6-aminohexanoïque (acide ε-aminocaproïque) et ses dérivés, acide trans-4-aminomethyl- cyclohexanecarboxylique (acide tranexamique) et ses dérivés, 4-(2- Aminoéthyl)benzènesulfonylfluorure (AEBSF) et ses dérivés, (4-Amidino-Phenyl)- Methane-Sulfonyl Fluorure (APMSF) et ses dérivés, 3,4-dichloroisocoumarine (DCI) et ses dérivés, Acétyl- leucyl-leucyl-arginal (Leupeptine) et ses dérivés, aprotinine et ses dérivés, inhibiteur trypsique du soja, et ses dérivés, a2-antiplasmine et ses dérivés, inhibiteurs de la thrombine (notamment antithrombine II I) et ses dérivés. Des supports de chromatographie disponibles commercialement sont par exemple ECH Lysine Sepharose 4 B, Benzamidine Sepharose 6B (GE Healthcare), p-Aminobenzamidine Agarose 6XL (Prometic).
Plutôt que de les éliminer, les impuretés protéolytiques peuvent être inhibées en ajoutant un ou plusieurs inhibiteurs de protéases du groupe mentionné ci-dessus, en particulier de l'antithrombine II I et du Ci -inhibiteur, puis en éliminant le complexe enzyme/inhibiteur au moyen des étapes subséquentes de purification.
Une autre approche pour éliminer les impuretés protéolytiques est d'utiliser des colorants immobilisés tels que Cibacron Blue F3GA ou ses dérivés, d'autres colorants triazines tels que Procion Red HE-3B et ses dérivés, ou Procion Green H-4G et ses dérivés, Reactive Red 120 et ses dérivés, Reactive Green 19 et ses dérivés, Reactive Yellow 86 et ses dérivés, Reactive Orange 14 et ses dérivés, immobilisés sur des matrices de type agarose ou matrice polymérique.
Inactivation des virus
La préparation de Facteur B utile dans l'invention a généralement subi au moins une étape d'élimination ou d'inactivation d'au moins un agent infectieux. Parmi les agents infectieux, on peut citer les virus et les ATNC (agents transmissibles non conventionnels) comme le prion. Une inactivation virale comprend souvent un traitement avec des produits chimiques, par exemple par solvant, détergent et/ou par la chaleur, par exemple par pasteurisation. Une nanofiltration est aussi utile pour éliminer un agent infectieux. De préférence le procédé comprend au moins un traitement par solvant et détergent, et une nanofiltration.
La pasteurisation se réfère à des méthodes exposant les compositions liquides de Facteur B à une température de 60°C pendant au moins 10h.
Le traitement par solvant et/ou détergent (appelé généralement traitement solvant/détergent) comprend notamment le traitement par tri-n-butyl phosphate TnBP et/ou un détergent qui est choisi parmi le Triton X-100, Tween (de préférence Tween 80) et cholate sodium. Le traitement est généralement poursuivi à 25°C pendant au moins 6h.
La nanofiltration se réfère généralement à la filtration d'une solution de Facteur B à travers un filtre avec une taille de pores inférieure à 80 nm. Des filtres disponibles sont par exemple Planova™ 75 nm, Planova™ 35 nm, Planova™ 20 nm ou Planova™ 15 nm, BioEX (Asahi corporation), Ultipor DV 50 or DV 20 (Pall corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFR ou NFP (Millipore). De préférence une nanofiltration est réalisée après l'étape (iv) de chromatographie échangeuse d'anions. Dans un mode de réalisation particulier, la fraction de Facteur B purifiée est filtrée sur une séquence de filtres avec une taille de pores de 20nm et 15nm.
Formulation
De manière à obtenir des préparations de Facteur B à usage thérapeutique, qui soient stables, la préparation de Facteur B obtenue est formulée avec des excipients et agents stabilisants appropriés. Il peut s'agir de diluants, d'agents, cryoprotecteurs, lyoprotecteurs, etc.
Parmi les lyoprotecteurs classiques, on peut citer les sucres (saccharose, tréhalose, glucose, lactose etc.), les polyols (mannitol, sorbitol) et les acides aminés (glycine, arginine, histidine, alanine) qui peuvent être utilisés à une concentration entre 0 et 10%. Des tensio-actifs de type polysorbate (Tween 20 ou Tween 80 par exemple), polyoxamer (par exemple poloxamer 188), polyéthylèneglycol peuvent être ajoutés également.
On peut encore ajouter des antioxydants (par exemple methionine, monothioglycérol, glutathione, acide citrique, acide ascorbique, sodium metabisulfite, et sodium sulfite).
Des substances tampon peuvent être encore utilisées, par exemple sous forme de carbonate, phosphate, citrate, acétate, borate, trimethamine [(2-amino-2-hydroxymethyl- 1 ,-3- propanediol),TRIS], glycine et lysine.
Dessication
La formulation liquide de Facteur B peut subir une dessiccation si nécessaire, pour l'obtention d'une forme solide.
La dessiccation est un procédé d'élimination de l'eau à un stade poussé. Il s'agit d'une déshydratation visant à éliminer autant d'eau que possible. Ce phénomène peut être naturel ou forcé. Cette dessiccation peut être réalisée à l'aide des techniques de lyophilisation, d'atomisation et de cryoatomisation. Le mode préféré d'obtention de la forme solide de la composition à usage pharmaceutique selon l'invention est la lyophilisation.
Les méthodes de lyophilisation sont bien connues de l'homme du métier, voir par exemple Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60, 2000.
D'autres procédés appropriés pour réduire le degré d'humidité ou la teneur en eau de la composition sont envisageables. De préférence le degré d'humidité est inférieur ou égal à 3% en poids, de préférence inférieur ou égal à 2,5%, de préférence inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1 ,5%.
La composition solide peut être dissoute dans de l'eau pour préparations injectables (ou « water for injection ou WFI ») ou dans un solvant de reconstitution, pour obtenir une formulation à usage thérapeutique.
La figure et les exemples illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Exemples :
Exemple 1 : Purification du Facteur B
Un concentré de Facteur B est préparé en suivant les étapes représentées à la Figure jointe.
Du cryosurnageant est préparé par décongélation du plasma frais congelé à une température située entre 1 °C et 6°C (cryoprécipitation). Après centrifugation, le cryoprécipité est récupéré pour produire les concentrés de fibrinogène, de facteur von Willebrand et de facteur VIII. Le surnageant est collecté dont une partie est soumise à une étape de purification sur DEAE-Sephadex afin de fixer les facteurs vitamine k dépendants tels que la protéine C, le Facteur VII et le Facteur IX. La fraction non retenue sur DEAE- Sephadex est mélangée avec le cryosurnageant restant pour constituer la Solution A. La concentration du Facteur B dans la fraction est d'environ 100-150 μg mL (pour une concentration plasmatique reportée de 200 μg/mL).
La solution A est ajustée à un pH entre 5,5 et 6,5 et de préférence à 6,0. La fraction ajustée est alors soumise à une chromatographie sur une colonne Héparine Sepharose FF ou autre support chromatographique sur lequel est greffé un ligand Héparine. La plupart des protéines plasmatiques sont retrouvées non retardées dans le filtrat de chromatographie. Après lavage du gel jusqu'au retour à la ligne de base, le Facteur B est élué par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de la colonne. La fraction éluée est diluée, puis chromatographiée sur colonne échangeur cationique fort de type SP Sepharose FF ou équivalent. Après lavage du gel, les protéines faiblement adsorbées sur le gel sont éluées par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de la colonne. Le Facteur B est élué par augmentation encore plus élevée de la force ionique du tampon d'équilibrage de la colonne. La fraction éluée est alors soumise à une étape d'inactivation virale par traitement solvant détergent (Polysorbate 80 et TnBP) efficace sur les virus enveloppés. La fraction est ensuite diluée, ajustée à un pH de 6,0 (essai 1 ) ou de 6,5 (essai 2) puis soumise à une chromatographie sur une colonne échangeur anionique fort de type Q Sepharose FF ou équivalent équilibrée à pH 6,0 ou 6,5. Après lavage du gel jusqu'au retour à la ligne de base, le Facteur B est élué par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de la colonne. La fractionde Facteur B obtenue à ce stade est de pureté très élevée et peut être soumise à une étape d'élimination virale par nanofiltration, puis concentrée et formulée par ultrafiltration.
Exemple 2 : Tests de pureté
Des échantillons des fractions de Facteur B en cours de purification ont été prélevés à la fin de chacune des étapes indiquées à l'exemple 1.
Tests de purification
Le dosage du Facteur B est réalisé classiquement par méthode immunoenzymatique (ELISA) avec des réactifs commerciaux (Diagnostica Stago). Brièvement, le Facteur B à doser est capté par un anticorps anti-Facteur B humain immobilisé sur une phase solide. Le Facteur B fixé est ensuite reconnu par un immuno-conjugué à la peroxydase. Le taux de peroxydase liée est mesuré par son activité sur le substrat ortho-phénylènediamine en présence d'eau oxygénée. L'intensité de la coloration, après arrêt de la réaction par un acide fort, est fonction de la quantité de Facteur B présente initialement dans l'échantillon. Le Facteur B ainsi dosé est appelé « Facteur B antigène » ou « Ag ».
Les résultats de purification sont indiqués dans le tableau ci-dessous. Tableau 1 : Purification du Facteur B à partir de la Solution A.
Figure imgf000012_0001

Claims

Revendications
1. Procédé de purification de Facteur B, comprenant les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B ;
(ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une chromatographie d'affinité de type héparine;
(iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions,
(v) éluer le Facteur B.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la chromatographie de l'étape (ii) est l'unique chromatographie d'affinité de type héparine, le procédé ne comprenant pas d'étape supplémentaire de chromatographie d'affinité de type héparine.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite fraction soumise à la chromatographie de type héparine est ajustée à un pH de 6.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un traitement d'inactivation virale, de préférence par l'action de solvant et détergent.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un traitement d'élimination virale, de préférence par nanofiltration.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir (a) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, ou (b) une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions;
(ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions à une chromatographie d'affinité sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine, par ce en quoi on obtient une fraction enrichie en facteur B ; (iii) (a) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations sur SP-Sépharose ;
(iii) (b) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) (a) à un traitement par solvant et détergent ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) (b) à une chromatographie échangeuse d'anions sur Q-Sépharose ;
(v) éluer le Facteur B.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur B, par exemple (a) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ou par exemple (b) une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions;
(ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine;
laver puis éluer le facteur B par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie d'affinité de type héparine, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (a) la soumettre à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP- Sépharose ;
laver puis éluer le facteur B par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie échangeuse de cations, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (b) le cas échéant la soumettre à un traitement par solvant et détergent ;
(iv) puis la soumettre à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q- Sépharose ;
(v) laver et éluer le Facteur B, généralement par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse d'anions.
8. Procédé d'obtention d'une préparation de Facteur B à usage thérapeutique, comprend
- la purification du Facteur B selon le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 7, par ce en quoi on obtient un concentré de Facteur B,
- suivie d'étapes de formulation, concentration, puis filtration du concentré de Facteur B.
9. Préparation de Facteur B susceptible d'être obtenue par le procédé de la revendication 8.
10. Préparation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite préparation est sous forme lyophilisée.
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