FR2952639A1

FR2952639A1 - Procede de purification de facteur b

Info

Publication number: FR2952639A1
Application number: FR0958047A
Authority: FR
Inventors: Michel Poulle
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2009-11-16
Filing date: 2009-11-16
Publication date: 2011-05-20
Anticipated expiration: 2029-11-16
Also published as: AR079033A1; FR2952639B1; EP2501401A1; US8729244B2; WO2011058286A1; US20120232253A1

Abstract

L'invention concerne un procédé de purification de Facteur B, comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B ; (ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une chromatographie d'affinité de type héparine; (iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ; (iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions, (v) éluer le Facteur B.

Description

L'invention concerne un procédé de purification de Facteur B, à partir de plasma sanguin humain.

Arrière-plan technologique de l'invention : Le complément joue un rôle essentiel dans la défense de l'organisme contre des agents infectieux et dans le processus inflammatoire. Il représente un système auxiliaire de l'immunité, en particulier de la réponse humorale et de la réponse innée.

Le complément comprend un ensemble d'environ 30 protéines plasmatiques et parfois membranaires, synthétisées essentiellement par le foie et les macrophages et qui peuvent être activées par des cascades protéolytiques. Il comprend à la fois des protéines plasmatiques, de nombreux récepteurs cellulaires de surface différents, certains présents sur les cellules inflammatoires et d'autres sur les cellules du système immunitaire, ainsi que des protéines membranaires de régulation qui protègent les cellules hôte d'une auto-attaque. Les protéines plasmatiques du complément fonctionnent soit comme des enzymes, soit comme des protéines de liaison, soit comme des régulateurs (inhibiteurs ou activateurs).

Il existe 3 voies de déclenchement de la cascade du complément : la voie classique déclenchée par les anticorps, la voie alterne déclenchée par des substances bactériennes en absence d'anticorps, la voie dépendante des lectines qui reconnaissent certains polysaccharides bactériens. Ces deux dernières voies sont mises en jeu dans la réponse innée et sont extrêmement importantes dans la défense de l'hôte contre les infections bactériennes.

Le facteur B du complément est un composant de la voie alterne de l'activation du complément. Il circule dans le sang comme une protéine composée d'une seule chaîne polypeptidique de poids moléculaire 93 kDa. Lors de l'activation de la voie alterne, le Facteur B est clivé par le Facteur D du complément résultant en une chaîne Ba (30 kDa) inactive et en la sous-unité catalytique Bb (63 kDa). La sous-unité active Bb est une protéase à sérine qui s'associe avec le C3b pour former la C3 convertase de la voie alterne (C3bBb). La sous-unité Bb est impliquée dans la prolifération des lymphocytes B pré activés, tandis que la chaîne Ba inhibe leur prolifération.35 Des préparations de Facteur B trouveraient une utilité pour le traitement de déficiences en Facteur B, mais pour le moment aucune préparation de ce type n'est disponible commercialement.

Résumé de l'invention : L'invention fournit un procédé de purification de Facteur B, comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B ; (ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une chromatographie d'affinité de type héparine; (iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ; (iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions, (v) éluer le Facteur B.

Le procédé peut comprendre en outre au moins un traitement d'inactivation virale, de préférence par l'action de solvant et détergent, et/ou au moins un traitement d'élimination virale, de préférence par nanofiltration.

L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une préparation de Facteur B à usage thérapeutique, qui comprend - la purification du Facteur B selon le procédé de purification tel que défini ici, par ce en quoi on obtient un concentré de Facteur B, - suivie d'étapes de formulation, concentration, puis filtration du concentré de Facteur B.

L'invention a également pour objet la préparation de Facteur B susceptible d'être obtenue par ce procédé. De préférence ladite préparation est sous forme lyophilisée.

Le procédé de l'invention présente de nombreux avantages : il est industrialisable, permet de purifier du Facteur B à partir de divers intermédiaires de production, et avec un degré de pureté élevé.

Légende de la Figure : La Fiqure 1 montre un schéma représentant les étapes du procédé de purification suivies dans l'exemple 1.

Description détaillée de l'invention : Par « Facteur B » on entend toute protéine ayant la séquence en acides aminés du Facteur B natif humain. Le terme « Facteur B » comprend en outre les variations alléliques naturelles et/ou les isoformes du Facteur B trouvées naturellement, et toute forme ou degré de glycosylation ou autre modification post-traductionnelle. Sont aussi compris les homologues ou dérivés du Facteur B qui présentent la même ou une activité biologique supérieure par rapport à l'activité de la forme sauvage et/ou qui présentent une identité de séquence d'au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence encore d'au moins 90%.

Le terme « activité biologique » du Facteur B inclut la capacité à activer la C3 convertase. L'activité du Facteur B peut être mesurée de différentes manières, bien connues de l'homme du métier.

De manière générale, une chromatographie consiste à mettre en contact le Facteur B en solution - avec une matrice à laquelle le Facteur B se lie, éventuellement laver la matrice dans des conditions appropriées pour que le Facteur B reste lié, puis appliquer à la matrice une solution qui provoque l'élution du Facteur B de la matrice, - ou de manière alternative avec une matrice qui lie les impuretés mais pas le Facteur B

Etape (i) obtention d'une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B : De préférence on utilise comme matériau de départ le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, type DEAE-Séphadex. On peut encore utiliser le surnageant issu d'une précipitation éthanolique. On peut aussi utiliser une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions.

Etape (ii) chromatographie d'affinité de type héparine : La chromatographie d'affinité de type héparine met en oeuvre une matrice ou un support, qui est le plus souvent un gel d'agarose, sur lequel est greffé de l'héparine ou des dérivés ou mimétiques de l'héparine. Parmi les ligands de type héparine on peut citer notamment les ligands suivants : chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, ou des oligomères synthétiques, par exemple le cellubiose sulfate ester (MatrexTM Cellufine Sulfate), ou des analogues thérapeutiques de l'héparine, par exemple des oligosaccharides sulfatés. De préférence le pH est ajusté à une valeur de 6, par exemple en équilibrant la colonne avec une solution tampon de phosphate de sodium à 20 mM, avec une osmolalité de 60±5 mOsm/kg, et un pH 6,0±0.1. Un exemple de protocole particulier est présenté dans l'exemple 1. Cette étape permet de fixer le Facteur B et l'antithrombine III (AT III), et de les éluer séparément.

Etape (iii) chromatographie échangeuse de cations : Une chromatographie échangeuse de cations met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que carboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) ou methyl sulfonate (S). Des supports échangeurs de cations sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports CM-Sepharose, SP-Sepharose et S-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl CM-650, Toyopearl SP-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD SO3", Fractogel EMD COO" (Merck KGaA), Macro-Prep CM Support, Macro-Prep High S Support (BioRad), CM HyperD, S HyperD, CM Trisacryl, SP Trisacryl, SP Sperodex (ail Pall). De préférence, on utilise la SP sepharose FF. Un exemple de protocole particulier est présenté dans l'exemple 1.

Etape (iv) chromatographie échangeuse d'anions : Le Facteur B peut dans certaines conditions se lier à des résines échangeuses d'anions, et en être désorbé par des systèmes tampons à force ionique élevée.

Une chromatographie échangeuse d'anions met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que diethylaminoethyle (DEAE), aminoethyle quaternaire (QAE) ou ammonium quaternaire (Q). Des supports échangeurs d'anions sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports DEAE-Sepharose, Q- Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl Super Q-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TMAE (Merck KGaA), Macro- Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support (BioRad), DEAE HyperD, Q HyperD, DEAE Trisacryl, DEAE Sperodex (ail Pall). De préférence, on utilise la Q sepharose FF.

Un exemple de protocole particulier est présenté dans l'exemple 1.

Le Facteur B est élué par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse d'anions.

Avantageusement, le pH de la fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B et obtenue à l'étape (i) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 5,5 à pH 6,5 et de préférence pour être égal à pH 6,0. Avantageusement, le pH de la fraction éluée de l'étape (ii) puis diluée avant l'étape (iii) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 5,5 à pH 7,5. Avantageusement encore, le pH de la fraction éluée de l'étape (iii) puis diluée avant l'étape (iv) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de 5,5 à 7,5.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la purification du Facteur B comprend les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur B, par exemple (a) (b) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ; ou encore par exemple une fraction non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions (ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine, par ce en quoi on obtient une fraction enrichie en Facteur B; (iii) (a) soumettre la fraction obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP-Sépharose ; (iii) (b) suivie le cas échéant par un traitement par solvant et détergent ; (iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) (a) ou (b) à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q-Sépharose.

Pour l'obtention d'une préparation à usage thérapeutique, le procédé se poursuit généralement par des étapes de formulation, concentration, puis filtration du concentré de Facteur B.

Plus précisément, le procédé de fabrication d'une préparation de Facteur B selon l'invention peut comprendre les étapes suivantes : (i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur B, par exemple le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ou par exemple une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ; (ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction non retenue à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine; laver puis éluer le Facteur B par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie d'affinité de type héparine, diluer la fraction éluée, puis (iii) (a) la soumettre à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP- Sépharose ; laver puis éluer le Facteur B par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse de cations, diluer la fraction éluée, puis (iii) (b) le cas échéant la soumettre à un traitement par solvant et détergent ; (iv) puis la soumettre à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q- Sépharose ; (v) laver et éluer le Facteur B, généralement par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse d'anions ; (vi) préparer un concentré de Facteur B.

Autres étapes possibles : De préférence, la chromatographie de l'étape (ii) est l'unique chromatographie d'affinité de type héparine, le procédé ne comprenant pas d'étape supplémentaire de chromatographie d'affinité de type héparine. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention ne contient aucune autre chromatographie que celles prévues aux étapes (ii) à (iv) définies plus haut. Toutefois, le procédé de l'invention peut éventuellement comprendre des étapes supplémentaires, par exemple d'autres chromatographies d'échanges d'anions ou de cations, mais aussi le cas échéant une ou plusieurs chromatographies par interaction hydrophobe.

Le Facteur B peut dans certaines conditions se lier à des résines de chromatographie par interaction hydrophobe, et en être désorbé par des systèmes tampons à force ionique faible. Une telle chromatographie met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que phenyl, octyl, butyl, methyl, ou encore hexylamine, phenylpropylamine, 4-mercapto-ethyl-pyridine. Des supports pour ce type de chromatographie sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports phenyl sepharose, octyl sepharose, butyl sepharose, CaptoTM MMC (ail GE Healthcare), Toyopearl Phenyl-650, Toyopearl Butyl-650, Toyopearl Hexyl-650 (ail Tosoh Biosciences), Macro-Prep Methyl HIC Support, Macro-Prep t-Butyl HIC Support (Bio-Rad), HEA HyperCel; PPA HyperCel, MEP HyperCel (ail Pall).

Le procédé de l'invention peut aussi comprendre une chromatographie de type Hydroxyapatite. En effet, le Facteur B peut être purifié en utilisant des composites de phosphate de calcium, fluoroapatite, hydroxyapatite comme phase solide. Parmi les supports disponibles commercialement, on peut citer par exemple Bio-Gel Hydroxyapatite HT (Bio- Rad), Ceramic Fluoroapatite, Ceramic Hydroxyapatite (Bio-Rad), HA Ultrogel (Pall). Le procédé de l'invention peut encore comprendre une chromatographie par immunoaffinité, qui met en oeuvre par exemple des anticorps ou des aptamères immobilisés sur une matrice de chromatographie. Les matrices sont généralement des résines pré-activées, par exemple par époxy (Sepharose 6B1 EAH Sepharose 4B, Amino Sepharose 6 FF, 6-AKS Sepharose 4FF, Toyopearl AF Epoxy, Toyopearl AF Amino, Toyopearl AF Tresyl). Les impuretés non liées sont lavées en utilisant des systèmes tampon adaptés (tampon citrate, tampon phosphate, ou HEPES par exemple), et le Facteur B est ensuite élué en utilisant par exemple de fortes concentrations en sels chaotropiques (de type thiocyanate, bromure de lithium), des systèmes tampons à faible pH (glycine pH 2-3) ou à pH élevé (TRIS pH 9).

Le procédé de l'invention peut également inclure d'autres traitements, tels qu'une délipidation. La délipidation consiste à éliminer, de préférence en amont ou le plus tôt possible dans le procédé, des impuretés lipidiques des solutions de protéines au moyen par exemple d'une précipitation ou d'une adsorption. Des agents précipitants adaptés incluent par exemple des polyéthylèneglycols (PEG) ou du sulfate d'ammonium, tandis que des poudres de silice ("silice fumée"; Aerosil 200, Aerosil 380), dextran sulfates ou fluorocarbones (Freon-113) sont des adsorbants adaptés. Il peut aussi être avantageux d'éliminer ou inhiber les impuretés protéolytiques, à savoir les enzymes, par exemple les protéases ou glycosydases, qui seraient capables de cliver la molécule de Facteur B en des formes tronquées inactives. Cette élimination ou inhibition est de préférence réalisée le plus tôt possible, de préférence encore en amont du procédé de purification. Pour cela on peut utiliser une méthode chromatographique dans laquelle des inhibiteurs de protéases sont immobilisés sur des matrices de type agarose ou matrice polymérique. On peut aussi utiliser un filtre qui retient une partie des impuretés protéolytiques (type filtre Sartoclear®).

De tels inhibiteurs de protease peuvent être par exemple benzamidine, 4-aminobenzamidine, benzamidine chlorhydrate et ses dérivés, lysine et ses dérivés, acide 6-aminohexanoïque (acide E-aminocaproïque) et ses dérivés, acide trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylique (acide tranexamique) et ses dérivés, 4-(2- Aminoéthyl)benzènesulfonylfluorure (AEBSF) et ses dérivés, (4-Amidino-Phenyl)-Methane-Sulfonyl Fluorure (APMSF) et ses dérivés, 3,4-dichloroisocoumarine (DCI) et ses dérivés, Acétyl- leucyl-leucyl-arginal (Leupeptine) et ses dérivés, aprotinine et ses dérivés, inhibiteur trypsique du soja, et ses dérivés, a2-antiplasmine et ses dérivés, inhibiteurs de la thrombine (notamment antithrombine III) et ses dérivés. Des supports de chromatographie disponibles commercialement sont par exemple ECH Lysine Sepharose 4 B, Benzamidine Sepharose 6B (GE Healthcare), p-Aminobenzamidine Agarose 6XL (Prometic). Plutôt que de les éliminer, les impuretés protéolytiques peuvent être inhibées en ajoutant un ou plusieurs inhibiteurs de protéases du groupe mentionné ci-dessus, en particulier de l'antithrombine III et du Cl-inhibiteur, puis en éliminant le complexe enzyme/inhibiteur au moyen des étapes subséquentes de purification. Une autre approche pour éliminer les impuretés protéolytiques est d'utiliser des colorants immobilisés tels que Cibacron Blue F3GA ou ses derivés, d'autres colorants triazines tels que Procion Red HE-3B et ses dérivés, ou Procion Green H-4G et ses dérivés, Reactive Red 120 et ses dérivés, Reactive Green 19 et ses dérivés, Reactive Yellow 86 et ses dérivés, Reactive Orange 14 et ses dérivés, immobilisés sur des matrices de type agarose ou matrice polymérique.

Inactivation des virus La préparation de Facteur B utile dans l'invention a généralement subi au moins une étape d'élimination ou d'inactivation d'au moins un agent infectieux. Parmi les agents infectieux, on peut citer les virus et les ATNC (agents transmissibles non conventionnels) comme le prion. Une inactivation virale comprend souvent un traitement avec des produits chimiques, par exemple par solvant, détergent et/ou par la chaleur, par exemple par pasteurisation. Une nanofiltration est aussi utile pour éliminer un agent infectieux. De préférence le procédé comprend au moins un traitement par solvant et détergent, et une nanofiltration. La pasteurisation se réfère à des méthodes exposant les compositions liquides de Facteur B à une température de 60°C pendant au moins 10h.

Le traitement par solvant et/ou détergent (appelé généralement traitement solvant/détergent) comprend notamment le traitement par tri-n-butylphosphate TnBP et/ou un détergent qui est choisi parmi le Triton X-100, Tween (de préférence Tween 80) et cholate sodium. Le traitement est généralement poursuivi à 25°C pendant au moins 6h.

La nanofiltration se réfère généralement à la filtration d'une solution de Facteur B à travers un filtre avec une taille de pores inférieure à 80 nm. Des filtres disponibles sont par exemple Planova TM 75 nm, Planova TM 35 nm, Planova TM 20 nm ou Planova TM 15 nm, BioEX (Asahi corporation), Ultipor DV 50 or DV 20 (Pall corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFR ou NFP (Millipore). De préférence une nanofiltration est réalisée après l'étape (iv) de chromatographie échangeuse d'anions. Dans un mode de réalisation particulier, la fraction de Facteur B purifiée est filtrée sur une séquence de filtres avec une taille de pores de 20nm et 15nm.

Formulation De manière à obtenir des préparations de Facteur B à usage thérapeutique, qui soient stables, la préparation de Facteur B obtenue est formulée avec des excipients et agents stabilisants appropriés. Il peut s'agir de diluants, d'agents, cryoprotecteurs, lyoprotecteurs, etc. Parmi les lyoprotecteurs classiques, on peut citer les sucres (saccharose, tréhalose, glucose, lactose etc.), les polyols (mannitol, sorbitol) et les acides aminés (glycine, arginine, histidine, alanine) qui peuvent être utilisés à une concentration entre 0 et 10%. Des tensio-actifs de type polysorbate (Tween 20 ou Tween 80 par exemple), polyoxamer (par exemple poloxamer 188), polyéthylèneglycol peuvent être ajoutés également.

On peut encore ajouter des antioxydants (par exemple methionine, monothioglycérol, glutathione, acide citrique, acide ascorbique, sodium metabisulfite, et sodium sulfite).

Des substances tampon peuvent être encore utilisées, par exemple sous forme de carbonate, phosphate, citrate, acetate, borate, trimethamine [(2-amino-2-hydroxymethyl-1,-3- propanediol),TRIS], glycine et lysine.

Dessication La formulation liquide de Facteur B peut subir une dessiccation si nécessaire, pour l'obtention d'une forme solide. La dessiccation est un procédé d'élimination de l'eau à un stade poussé. Il s'agit d'une déshydratation visant à éliminer autant d'eau que possible. Ce phénomène peut être naturel ou forcé. Cette dessiccation peut être réalisée à l'aide des techniques de lyophilisation, d'atomisation et de cryoatomisation. Le mode préféré d'obtention de la forme solide de la composition à usage pharmaceutique selon l'invention est la lyophilisation. Les méthodes de lyophilisation sont bien connues de l'homme du métier, voir par exemple Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60, 2000. D'autres procédés appropriés pour réduire le degré d'humidité ou la teneur en eau de la composition sont envisageables. De préférence le degré d'humidité est inférieur ou égal à 3% en poids, de préférence inférieur ou égal à 2,5%, de préférence inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1,5%.

La composition solide peut être dissoute dans de l'eau pour préparations injectables (ou « water for injection ou WFI ») ou dans un solvant de reconstitution, pour obtenir une formulation à usage thérapeutique.

La figure et les exemples illustrent l'invention sans en limiter la portée.

Exemples :

Exemple 1 : Purification du Facteur B Un concentré de Facteur B est préparé en suivant les étapes représentées à la Figure jointe. Du cryosurnageant est préparé par décongélation du plasma frais congelé à une température située entre 1°C et 6°C (cryoprécipitation). Après centrifugation, le cryoprécipité est récupéré pour produire les concentrés de fibrinogène, de facteur von Willebrand et de facteur Vlll. Le surnageant est collecté dont une partie est soumise à une étape de purification sur DEAE-Sephadex afin de fixer les facteurs vitamine k dépendants tels que la protéine C, le Facteur VII et le Facteur IX. La fraction non retenue sur DEAESephadex est mélangée avec le cryosurnageant restant pour constituer la Solution A. La concentration du Facteur B dans la fraction est d'environ 100-150 pg/mL (pour une concentration plasmatique reportée de 200 pg/mL).

La solution A est ajustée à un pH entre 5,5 et 6,5 et de préférence à 6,0. La fraction ajustée est alors soumise à une chromatographie sur une colonne Heparine Sepharose FF ou autre support chromatographique sur lequel est greffé un ligand Heparine. La plupart des protéines plasmatiques sont retrouvées non retardées dans le filtrat de chromatographie. Après lavage du gel jusqu'au retour à la ligne de base, le Facteur B est élué par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de la colonne. La fraction éluée est diluée, puis chromatographiée sur colonne échangeur cationique fort de type SP Sepharose FF ou équivalent. Après lavage du gel, les protéines faiblement adsorbées sur le gel sont éluées par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de la colonne. Le Facteur B est élué par augmentation encore plus élevée de la force ionique du tampon d'équilibrage de la colonne. La fraction éluée est alors soumise à une étape d'inactivation virale par traitement solvant détergent (Polysorbate 80 et TnBP) efficace sur les virus enveloppés. La fraction est ensuite diluée, ajustée à un pH de 6,0 (essai 1) ou de 6,5 (essai 2) puis soumise à une chromatographie sur une colonne échangeur anionique fort de type Q Sepharose FF ou équivalent équilibrée à pH 6,0 ou 6,5. Après lavage du gel jusqu'au retour à la ligne de base, le Facteur B est élué par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de la colonne. La fractionde Facteur B obtenue à ce stade est de pureté très élevée et peut être soumise à une étape d'élimination virale par nanofiltration, puis concentrée et formulée par ultrafiltration.

Exemple 2 : Tests de pureté Des échantillons des fractions de Facteur B en cours de purification ont été prélevés à la fin de chacune des étapes indiquées à l'exemple 1.

Tests de purification Le dosage du Facteur B est réalisé classiquement par méthode immunoenzymatique (ELISA) avec des réactifs commerciaux (Diagnostica Stago). Brièvement, le Facteur B à doser est capté par un anticorps anti-Facteur B humain immobilisé sur une phase solide. Le Facteur B fixé est ensuite reconnu par un immuno-conjugué à la peroxydase. Le taux de peroxydase liée est mesuré par son activité sur le substrat ortho-phénylènediamine en présence d'eau oxygénée. L'intensité de la coloration, après arrêt de la réaction par un acide fort, est fonction de la quantité de Facteur B présente initialement dans l'échantillon. Le Facteur B ainsi dosé est appelé « Facteur B antigène » ou « Ag ».

Les résultats de purification sont indiqués dans le tableau ci-dessous.

Tableau 1 : Purification du Facteur B à partir de la Solution A. Etape Rendement Pureté (%) (Ag/Prot) Départ Solution A 100 0,002 1ere étape de purification sur 22 0,038 Heparin-Sepharose FF 2eme étape de purification sur 81 0,068 SP-Sepharose FF 3eme étape de purification sur Essai 1 Essai 2 Essai 1 Essai 2 Q-Sepharose FF 60 100 0,85 0,84

Claims

Revendications1. Procédé de purification de Facteur B, comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur B ; (ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une chromatographie d'affinité de type héparine; (iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ; (iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions, (v) éluer le Facteur B.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la chromatographie de l'étape (ii) est l'unique chromatographie d'affinité de type héparine, le procédé ne comprenant pas d'étape supplémentaire de chromatographie d'affinité de type héparine.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite fraction soumise à la chromatographie de type héparine est ajustée à un pH de 6.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un traitement d'inactivation virale, de préférence par l'action de solvant et détergent.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un traitement d'élimination virale, de préférence par nanofiltration.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant les étapes consistant à : 30 (i) obtenir (a) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, ou (b) une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions; (ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction plasmatique non retenue sur une 35 chromatographie échangeuse d'anions à une chromatographie d'affinité sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine, par ce en quoi on obtient une fraction enrichie en facteur B ;25(iii) (a) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations sur SP-Sépharose ; (iii) (b) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) (a) à un traitement par solvant et détergent ; (iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur B obtenue à l'étape (iii) (b) à une chromatographie échangeuse d'anions sur Q-Sépharose ; (v) éluer le Facteur B.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur B, par exemple (a) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ou par exemple (b) une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions; (ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine; laver puis éluer le facteur B par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie d'affinité de type héparine, diluer la fraction éluée, puis (iii) (a) la soumettre à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SPSépharose ; laver puis éluer le facteur B par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie échangeuse de cations, diluer la fraction éluée, puis (iii) (b) le cas échéant la soumettre à un traitement par solvant et détergent ; (iv) puis la soumettre à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur QSépharose ; (v) laver et éluer le Facteur B, généralement par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse d'anions.
8. Procédé d'obtention d'une préparation de Facteur B à usage thérapeutique, comprend - la purification du Facteur B selon le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 7, par ce en quoi on obtient un concentré de Facteur B, - suivie d'étapes de formulation, concentration, puis filtration du concentré de Facteur B.
9. Préparation de Facteur B susceptible d'être obtenue par le procédé de la revendication 8.
10. Préparation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite préparation est sous forme lyophilisée.