WO2017195792A1 - 新規なｐｅｇ修飾酵素及びそれを用いた抗がん剤デリバリー - Google Patents

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peg
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cyclodextrin
anticancer agent
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有馬　英俊
敬一 本山
大志 東
辰徳 弘津
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国立大学法人熊本大学
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Definitions

  • the present invention relates to a novel PEG-modifying enzyme. More specifically, the present invention relates to a novel PEG-modified enzyme obtained by PEG-modifying an interstitial component degrading enzyme. The present invention also relates to an anticancer drug delivery and an anticancer drug using the PEG-modified enzyme.
  • Bromelain is known to degrade the extracellular matrix in cancer tissue.
  • the molecular weight of bromelain is 40 kDa or less, and it is excreted quickly after intravenous administration. Therefore, like hyaluronidase, it is difficult to transfer bromelain to cancer tissue.
  • the present invention aims to provide a novel anticancer drug delivery technology. More specifically, by effectively transferring an enzyme that decomposes components in the stroma in or around the cancer tissue to the cancer tissue, the interstitial pressure of the cancer tissue is reduced and the anticancer agent is applied to the cancer tissue. It is an object of the present invention to provide a novel anticancer drug delivery technology that can be efficiently diffused to the surface and a novel PEG-modifying enzyme that can be used therefor.
  • the present inventors have developed “Self-assembly PEGylation”, a technology that modifies PEG on peptides and proteins through the host-guest interaction of ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ -CyD) and adamantane (Ad) that they have developed.
  • ⁇ -CyD ⁇ -cyclodextrin
  • Ad adamantane
  • the present invention includes the following.
  • a complex composed of an enzyme, cyclodextrin and polyethylene glycol, The enzyme is bromelain or hyaluronidase covalently linked to at least one adamantane; And in the complex, The cyclodextrin and the polyethylene glycol are covalently bonded; A complex characterized in that the cyclodextrin and the adamantane are bound by a host-guest interaction.
  • the covalent bond between the cyclodextrin and the polyethylene glycol is 1 to 21 molecules of polyethylene glycol (preferably 1 to 14 molecules, more preferably 1 to 10 molecules, still more preferably 1 to 1 molecule of cyclodextrin.
  • the complex according to the above [1] or [2], wherein ⁇ 7 molecules) are bound.
  • the enzyme is hyaluronidase to which adamantane is covalently bound.
  • [6] The complex according to any one of [1] to [5], wherein the polyethylene glycol has a molecular weight of 2 to 40 kDa.
  • An anticancer agent comprising the complex according to any one of [1] to [8] above.
  • anticancer agent is an anticancer agent selected from the group consisting of doxorubicin, ribosomal doxorubicin (Doxyl: registered trademark), eribulin, paclitaxel (Abraxane: registered trademark), and gemcitabine.
  • An antitumor activity enhancer for an anticancer agent comprising the complex according to any one of [1] to [8] above.
  • anticancer agent is an anticancer agent selected from the group consisting of doxorubicin, ribosomal doxorubicin (Doxyl: registered trademark), eribulin, paclitaxel (Abraxane: registered trademark), and gemcitabine.
  • doxorubicin ribosomal doxorubicin
  • eribulin paclitaxel
  • gemcitabine a anticancer agent selected from the group consisting of doxorubicin, ribosomal doxorubicin (Doxyl: registered trademark), eribulin, paclitaxel (Abraxane: registered trademark), and gemcitabine.
  • the antitumor activity enhancer as described in any one of.
  • a novel enzyme that decomposes components in the stroma in or around cancer tissue modified with PEG is provided.
  • the PEG-modifying enzyme can enhance the antitumor activity of the anticancer agent by administering it to a living body together with the anticancer agent.
  • Ad-bromelain The outline of the preparation method of adamantane modified bromelain (Ad-bromelain) is shown.
  • An outline of a method for preparing PEG-modified ⁇ -CyD is shown.
  • PEG- ⁇ -CyD (2) represents ⁇ -CyD modified with PEG having a molecular weight of 2 kDa
  • PEG- ⁇ -CyD (20) represents ⁇ -CyD modified with PEG having a molecular weight of 20 kDa. It is the result of measuring the particle size of Ad-bromelain, PEG- ⁇ -CyD, and Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex (SPRA-bromelain (2) and SPRA-bromelain (20)).
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing an aggregated state of an Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex.
  • the numerical value indicates the particle diameter of each molecule or aggregate. It is the result of confirming the gelatin gel resolution of the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex. It is the result of confirming the gelatin gel permeability enhancement by the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex using FITC-dextran. It is the result of confirming the effect of Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex on tumor accumulation of FITC-dextran. It is the result which confirmed the enhancement effect of the antitumor effect of doxorubicin.
  • (A) shows changes in tumor volume
  • (B) shows survival rate of mice
  • (C) shows changes in body weight of mice. It is the result of confirming the enhancement effect of the antitumor effect of Doxil (registered trademark).
  • (A) shows changes in tumor volume
  • (B) shows survival rate of mice
  • (C) shows changes in body weight of mice. It is the result of confirming the enhancement effect of the antitumor effect of Doxil (registered trademark) of bromelain, PEGylated bromelain, and Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex. It is the result of confirming the enhancement effect of the antitumor effect of doxorubicin or doxil (registered trademark).
  • (A) shows changes in tumor volume
  • (B) shows survival rate of mice.
  • the present inventors have proposed a technique for modifying polyethylene glycol (PEG) to insulin or lysozyme through a host-guest interaction between ⁇ -CyD and adamantane (Ad), “Self-assembly PEGylation Retaining the Activity (SPRA) "Technology has been developed and reported (T. Hirotsu et al., Mol. Pharm., 14, 368-376 (2017)).
  • the prepared Ad-insulin complex / PEG- ⁇ -CyD showed no significant loss of activity and showed a sustained blood glucose lowering effect compared to insulin, whereas insulin covalently PEGylated showed very little Only showed a hypoglycemic effect.
  • Ad-lysozyme complex / PEG- ⁇ -CyD maintained the same activity as lysozyme as a result of in vitro tests, but the activity of lysozyme PEGylated by covalent bond was reduced to 23%. .
  • the complex in the present invention includes bromelain or hyaluronidase covalently bound to adamantane, cyclodextrin (preferably ⁇ -cyclodextrin), and polyethylene glycol.
  • Bromelain is a general term for proteolytic enzymes found in plant tissues called Bromeliaceae. Bromelain is a mixture of various parts derived from pineapple stems. Bromelain is known to contain a plurality of proteolytic enzymes, but also contains non-proteolytic enzymes such as acid phosphatase and peroxidase. Bromelain also has amylase and cellulase activity. In addition, various other components are also present.
  • Bromelain is also known to have anti-cancer activity and is further known to degrade the stroma (extracellular matrix) in cancer tissue.
  • Bromelain that can be used in the present invention can be used without particular limitation as long as it has an activity of degrading the stroma (extracellular matrix) of cancer tissue.
  • Bromellan can be extracted from pineapple stems and used commercially.
  • Bromelain is also sold as a medicinal product and supplement.
  • the bromelain used in the present invention is preferably a grade bromelain used for those sold as supplements or pharmaceuticals (for example, ointments), and particularly preferably a grade of bromelain used for those sold as pharmaceuticals. .
  • Hyaluronidase is a neutral activity and acid activity enzyme found in various organisms ranging from microorganisms to mammals.
  • Hyaluronan also known as hyaluronic acid
  • hyaluronic acid a substrate for hyaluronidase
  • Hyaluronan is a repetitive disaccharide of [GlcNAc ⁇ 1-4GlcUA ⁇ 1-3] n and exists in vivo as a high molecular weight linear polysaccharide.
  • the degradation of hyaluronan by hyaluronidase is either cleavage at the ⁇ -N-acetyl-hexosamine- [1-> 4] -glycoside bond or cleavage at the ⁇ -gluconolate- [1-> 3] -N-acetylglucosamine bond.
  • the hyaluronan is hydrolyzed to reduce the viscosity. Since hyaluronic acid is the main component of interstitial tissue, treatment with hyaluronidase increases tissue permeability.
  • Mammalian hyaluronidases are roughly divided into two types, neutral (pH 7.0) active and acidic (pH 4.0) active.
  • An example of neutral hyaluronidase is semen-related protein PH20.
  • Hyaluronidase has also been used in cancer treatment as a “dispersant” to increase the activity of chemotherapeutic agents and / or to facilitate access of chemotherapeutic agents to tumors.
  • the hyaluronidase that can be used in the present invention can be used without particular limitation as long as it has an activity of degrading the stroma (extracellular matrix) of cancer tissue.
  • the hyaluronidase for example, natural hyaluronidase extracted from animal-derived plasma or organs can be used, or human-derived gene-modified hyaluronidase prepared by gene recombination technology can also be used.
  • Hyaluronidase is also commercially available, and examples thereof include animal-derived hyaluronidase.
  • Hyaluronidase is used in the medical and cosmetic fields.
  • the hyaluronidase used in the present invention is preferably a grade hyaluronidase used in the medical and cosmetic fields, and particularly preferably a grade hyaluronidase used as a pharmaceutical.
  • stromal differentiation enzyme Bromelain or hyaluronidase (hereinafter collectively referred to as “stromal differentiation enzyme”) contained in the complex of the present invention is modified with adamantane.
  • Adamantane binding to the stromal degrading enzyme of the present invention can be performed by a method known in the art, and can be carried out by appropriately modifying or changing the reported method depending on the purpose. it can.
  • adamantane acetic acid is reacted with N-hydroxysuccinimide and N, N′-dichlorocarbodiimide in DMSO to introduce a succinimide group, and interstitial degradation enzyme in DMF / water.
  • adamantane can be covalently bound to the protein.
  • the number of adamantane molecules bound to one protein molecule is not particularly limited, and one or more adamantane molecules per protein molecule The effect of the present invention occurs if the molecules are bonded. Further, the number of adamantane molecules bonded to each molecule of the protein may be different. The number of adamantane molecules bound to one protein molecule can be appropriately selected according to the PEG modification via the target dextrin, and may vary depending on the type of protein, and its binding ratio Can be appropriately selected.
  • the cyclodextrin contained in the complex of the present invention may be any of ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, and ⁇ -cyclodextrin, but is preferably ⁇ -cyclodextrin.
  • ⁇ -cyclodextrin as used in the present invention is meant to include ⁇ -cyclodextrin, which is a cyclic oligosaccharide in which 6 glucoses are bonded to form a cyclic structure, and derivatives thereof.
  • ⁇ -cyclodextrin as used in the present invention is meant to include ⁇ -cyclodextrin, which is a cyclic oligosaccharide in which seven glucoses are bonded to form a cyclic structure, and derivatives thereof.
  • Derivatives include, but are not limited to, monomethyl- ⁇ -cyclodextrin, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, trimethyl- ⁇ -cyclodextrin, hydroxyalkyl- ⁇ -cyclodextrin, sulfobutyl- ⁇ -cyclodextrin, branched ⁇ -Cyclodextrin and the like.
  • ⁇ -cyclodextrin is commercially available and can be used.
  • ⁇ -cyclodextrin is also added to pharmaceutical compositions.
  • the hy ⁇ -cyclodextrin used in the present invention is not particularly limited, but is preferably purified to a high purity, particularly preferably a grade ⁇ -cyclodextrin used as an additive in a pharmaceutical composition. It is.
  • the term ⁇ -cyclodextrin as used in the present invention is meant to include ⁇ -cyclodextrin, which is a cyclic oligosaccharide in which eight glucoses are bonded to form a cyclic structure, and derivatives thereof.
  • the present invention will be described using ⁇ -cyclodextrin as an example, but the embodiment of the present invention is not limited to ⁇ -cyclodextrin.
  • the ⁇ -cyclodextrin contained in the complex of the present invention is PEG-modified by covalent bonding with PEG.
  • the PEG can be bound to ⁇ -cyclodextrin by a method known in the art, and can be performed by appropriately modifying or changing the reported method depending on the purpose.
  • the hydroxyl group of cyclodextrin can be aminated, while the end group of PEG can be carboxylated to covalently attach them.
  • the number of PEGs bonded to one molecule of ⁇ -cyclodextrin is not particularly limited, and the number of PEGs bonded to each ⁇ -cyclodextrin molecule is not limited. The number may be different.
  • the average number of PEGs bonded to one molecule of ⁇ -cyclodextrin is preferably 1 to 21, more preferably 1 to 14, still more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 7. is there.
  • the length (size) of PEG bound to ⁇ -cyclodextrin is not particularly limited, and any length of PEG can be used. Although not limited thereto, for example, PEG of 2 to 40 kDa can be mentioned.
  • the number and length (size) of PEG bound to ⁇ -cyclodextrin is the number and length (size) of PEG modified with stromal degradation enzyme in the complex of the present invention. It can be appropriately selected according to the purpose.
  • PEG-bound ⁇ -cyclodextrin molecule and adamantane-bound stromal degrading enzyme are bound via the host-guest interaction of ⁇ -cyclodextrin and adamantane, and PEG-modified. Interstitial degradation enzymes are formed. Formation of the host-guest interaction can be performed by a method known in the technical field, and can be performed by appropriately modifying or changing the reported method depending on the purpose. For example, although not limited to this, it can form by mixing both in water.
  • the complex of the present invention preferably takes the state of an aggregate in which a plurality of molecules are aggregated.
  • the aggregate is in a state where, for example, 3 to 50 molecules, preferably 5 to 30 molecules are aggregated.
  • the particle size of the aggregate of the composite of the present invention is not limited to this, but is, for example, 30 to 500 nm, preferably 30 to 300 nm, and more preferably 30 to 200 nm. By taking such a particle diameter, an effect of being easily accumulated in cancer tissue is produced by the EPR effect.
  • composition containing the complex of the present invention is not limited to this, but preferably takes the form of an injectable preparation.
  • the injectable preparation of the present invention can be administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously, into an organ, intraperitoneally, or a lesion such as a tumor.
  • the composition of the present invention can take any form of a water-soluble preparation or a lyophilized preparation, and preferably an aqueous injection or a freeze-dried injection upon use.
  • the composition of the present invention may contain sugars, preservatives, stabilizers and antistatic agents which are usually used for injections.
  • the composition of the present invention may also contain a pharmacologically acceptable pH adjuster.
  • the pH adjuster used in the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmacologically acceptable substance that can be used for pharmaceutical purposes, but preferably sodium hydroxide, carbonate buffer, phosphate buffer, Citrate buffer, acetate buffer and hydrochloric acid. These pH adjusters may be used alone or in combination of two or more.
  • the composition of the present invention can also contain an osmotic pressure adjusting agent or an isotonic agent, and can contain, for example, at least one of sodium chloride, dextrose and the like.
  • the composition of the present invention can decompose stroma (extracellular matrix) existing in or around cancer tissue and efficiently diffuse a substance (for example, an anticancer agent) into the cancer tissue. Therefore, one aspect of the present invention is characterized by being used in combination with an anticancer agent.
  • an anticancer agent When used in combination with an anticancer agent, it may be administered in combination with an anticancer agent, or may be administered separately from the anticancer agent.
  • the timing of administration may be administered at the same time as the anticancer agent, or after administering the composition of the present invention, the anticancer agent may be administered, and after administering the anticancer agent,
  • the compositions of the invention may be administered.
  • the dose of the complex of the present invention used in combination with the anticancer drug is determined according to the nature of the cancer, the degree of the disease, the treatment policy, the degree of metastasis, the size and degree of the tumor, the body weight, age, gender and the patient although it can be selected as appropriate depending on the (genetic) racial background, the pharmaceutically effective amount is generally determined based on factors such as clinically observed symptoms, the degree of progression of the disease, and the like.
  • the daily dose is, for example, 0.1 ⁇ g / kg to 10 mg / kg, preferably 1 ⁇ g / kg to 1 mg / kg when administered to humans. Administration may be performed once or divided into a plurality of times, but is preferably performed a plurality of times. Administration may be on consecutive days or intermittent administration, and can be appropriately selected depending on the state of the administration subject. Moreover, you may administer continuously over time, such as infusion.
  • the anticancer agent that can be used in combination with the composition of the present invention is not particularly limited, and any anticancer agent can be used.
  • the anticancer agent and the composition of the present invention in combination, the stroma (extracellular matrix) present in or around the cancer tissue is decomposed, and the anticancer agent is efficiently diffused into the cancer tissue.
  • the anticancer agent include, but are not limited to, doxorubicin, ribosomal doxorubicin (Doxyl: registered trademark), eribulin, paclitaxel (Abraxane: registered trademark), and gemcitabine.
  • composition of the present invention also decomposes the stroma (extracellular matrix) present in or around the cancer tissue, efficiently diffuses the anticancer drug administered in combination to the cancer tissue, The antitumor activity of the agent can be enhanced.
  • composition of the present invention can also be used as a single anticancer agent because bromelain or hyaluronidase as its component has anticancer activity.
  • the cancer to which the composition of the present invention can be used is not particularly limited, and can be used for any cancer, such as breast cancer, small cell lung cancer, colon cancer, malignant lymphoma, leukemia, testicular tumor. , Ovarian cancer, pancreatic cancer, lung cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, gingival cancer, esophageal cancer, stomach cancer, bile duct cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, prostate Can include cancer.
  • the cancer forms interstitial pressure in or around the cancer tissue, and a normal anticancer drug cannot effectively diffuse into the cancer tissue.
  • the effective dose of the complex of the present invention is the nature of cancer, the degree of illness, the treatment policy, the degree of metastasis, the amount of tumor, the body weight, the age, although it can be selected as appropriate depending on the gender and the (genetic) racial background of the patient, the pharmaceutically effective amount is generally determined based on factors such as clinically observed symptoms, disease progression, etc. .
  • the daily dose is, for example, 0.1 ⁇ g / kg to 10 mg / kg, preferably 1 ⁇ g / kg to 1 mg / kg when administered to humans. Administration may be performed once or divided into a plurality of times, or may be performed continuously over time by infusion or the like.
  • the administration may be daily or intermittent, and can be appropriately selected depending on the condition of the administration subject, but is preferably intermittent administration.
  • Example 1 Preparation of adamantane-modified bromelain Bromelain modified with adamantane using a covalent bond (Ad-bromelain) was prepared as follows. N-hydroxysuccinimide (230.18 mg) and N, N'-dichlorocarbodiimide (82.52 mg) were reacted with adamantaneacetic acid (194.27 mg) in DMSO (6 mL) to introduce a succinimide group.
  • Adamantane modified bromelain was prepared by reacting with bromelain in DMF / water (1: 6 (v / v)) (14 mL). An outline of the method for preparing the Ad-bromelain conjugate is shown in FIG.
  • PEG- ⁇ -CyD Preparation of PEG-modified ⁇ -cyclodextrin ⁇ -cyclodextrin modified with PEG using a covalent bond
  • PEG- ⁇ -CyD was prepared as follows.
  • PEG- ⁇ -CyD was prepared by reacting PEG (100 mg) having a succinimide group introduced at the end with aminated CyD (5.64 mg) in DMF / water (2: 1 (v / v)) (10 mL). did.
  • PEG- ⁇ -CyD (2) and PEG- ⁇ -CyD (20) represent PEG- ⁇ -CyD prepared using PEG having a molecular weight of 2 kDa or 20 kDa, respectively.
  • An outline of a method for preparing PEG- ⁇ -CyD is shown in FIG.
  • Example 3 Preparation of Ad-bromelain / PEG- ⁇ -cyclodextrin complex
  • Ad-bromelain prepared in Example 1 and PEG-modified ⁇ -cyclodextrin prepared in Example 2 were mixed to produce Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD conjugate was prepared.
  • the particle size and stability constant of the prepared Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex were measured as follows. The particle size was measured with a Zetasizer nano after adding Ad-bromelain conjugate and PEG- ⁇ -CyD to a 5% mannitol aqueous solution in a molar ratio of 1:10.
  • Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (PEG 2 kDa) is SPRA-bromelain (2)
  • Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (PEG 20 kDa) is SPRA-bromelain (20). (The same applies to the following examples).
  • the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (2) complex has a particle size of 165 nm and a stability constant of 8.86 ⁇ 10 4 (M ⁇ 1 ), and the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (20) complex
  • the body had a particle size of 155 nm and a stability constant of 1.14 ⁇ 10 4 (M ⁇ 1 ).
  • the particle size of the prepared Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex was about 150 nm, suggesting that the particle size is likely to accumulate in the tumor due to the EPR effect.
  • the particle size of Ad-bromelain was 2.35 nm, and the particle sizes of PEG- ⁇ -CyD (2) and PEG- ⁇ -CyD (20) were 2.0 nm and 10.9 nm, respectively.
  • Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (2) complex Since the particle size of one molecule of Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (2) complex is 6.35 nm, the prepared Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (2) complex has 26 molecules. It is considered that the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (2) complex is aggregated. A schematic diagram is shown in FIG. 4A.
  • Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (20) complex is 24.15 nm
  • the produced Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (20) complex is 6
  • the molecular Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (20) complex is considered to be in an aggregated state.
  • a schematic diagram is shown in FIG. 4B.
  • Example 4 Examination of gelatin resolution Using the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex prepared in Example 3, the gelatin resolution was measured as follows. 300 ⁇ L of PBS containing 5% gelatin was added to a 24-well plate and allowed to stand overnight at 4 ° C. to solidify the gelatin. In addition, Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (2) complex and Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (20) complex dissolved in PBS (the respective concentrations are Ad-bromelain: 0.1 mM, PEG - ⁇ -CyDs: 1 mM) was added and incubated at 4 ° C. for 8 hours.
  • Example 5 Effect of FITC-Dextran on Gelatin Gel Permeability Using Transwell (manufactured by Corning), 300 ⁇ L of PBS containing 5% gelatin was added to the insert and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Solidified. In addition, Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (2) complex and Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD (20) complex dissolved in PBS (the respective concentrations are Ad-bromelain: 0.1 mM, PEG - ⁇ -CyDs: 1 mM) was added, and FITC-dextran (70 kDa, 2 MDa) was further added.
  • the insert was placed in a receiver with PBS and incubated at 4 ° C. for 8 hours. Thereafter, PBS (receiver side) was collected, and the fluorescence intensity was measured.
  • PBS receiver side
  • PEGylated bromelain concentration is 0.1 mM
  • the prepared Ad-bromelain concentration is 0.1 mM was used. The results are shown in FIG.
  • the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex (PEG 2 kDa, 20 kDa) improved the gelatin gel permeability of FITC-dextran (70 kDa, 2 MDa).
  • Example 6 Effect of FITC-dextran on tumor accumulation FITC-dextran cancer tissue accumulation by Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex using human pancreatic cancer model mice with high interstitial pressure
  • the sex was confirmed as follows. 5 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ L of human pancreatic cancer-derived cells (MIA PaCa-2, obtained from JRBC cell bank) in 10% FBS-containing RPMI together with 100 ⁇ L of Matrigel (corning, concentration: 100%) and BALB /
  • a human pancreatic cancer model mouse was prepared by injection at the base of the leg of c nu / nu mouse.
  • mice were administered Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD conjugate (PEG 20 kDa) intratumorally or intravenously to a bromelain dose of 1 mg / kg. 24 hours later, 250 ⁇ L of FTIC-dextran (2 MDa) solution (1 mg / mL) was intravenously administered to mice. After 24 hours, the tumor tissue was collected and the fluorescence intensity was measured by IVIS. As a control, the PEGylated bromelain prepared in Comparative Example 1 was administered so that the bromelain amount was 1 mg / kg. For intravenous administration, 250 ⁇ L of 5% mannitol PBS solution was administered as a control. The results are shown in FIG. In both intratumoral and intravenous administration, high tumor accumulation of FITC-dextran was observed by the combined administration of Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex.
  • Example 7 Effect of doxorubicin on antitumor effect Enhancement of antitumor activity by the combined administration of an Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex with an anticancer agent using a human pancreatic cancer model mouse investigated.
  • a human pancreatic cancer model mouse was prepared. Mice were repeated intraweekly once a week with Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD conjugate (PEG 20 kDa) at a bromelain dose of 1 mg / kg.
  • As a control 250 ⁇ L of 5% mannitol PBS solution was administered.
  • Example 8 Influence of Doxil (registered trademark) on antitumor effect
  • ribosomal doxorubicin Doxyl (registered trademark): obtained from FormuMax Scientific, administered at 4.5 mg / kg
  • the enhancement effect on the antitumor effect of doxil was confirmed by the combined use.
  • the results are shown in FIG. It was found that the antitumor effect of Doxil® was enhanced by the combined use of Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex.
  • bromelain and the PEGylated bromelain prepared in Comparative Example 1 were administered at a bromelain dose of 1 mg / kg, and they exhibited an effect of enhancing the antitumor effect of Doxil (registered trademark). I could't. The results are shown in FIG.
  • Example 9 Examination of FITC-dextran accumulation in tumor and each tissue The accumulation of FITC-dextran in each tissue by Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex was examined. Using the tumor-bearing mouse model used in Example 6, the accumulation of FITC-dextran in the cancer tissue and the accumulation in each tissue by the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex was as follows. Confirmed. The Ad-bromelain conjugate (0.1 mM) / Multi-PEG- ⁇ -CyD (0.5 mM) complex and bromelain (0.1 mM) were dissolved in 5% mannitol aqueous solution, did.
  • each sample solution was administered to tumor-bearing mice from the tail vein (1 mg / kg, 250 ⁇ L). 24 hours later, 5 mg mannitol aqueous solution (250 ⁇ L) containing 1 mg / mL FITC-dextran (2 MDa) was administered from the tail vein under ether anesthesia. As a negative control, 5% mannitol aqueous solution was administered. After 12 hours, perfusion was performed, and the heart, liver, lung, kidney, spleen and tumor were removed, and the fluorescence intensity derived from FITC in the tumor was measured under the following conditions by IVIS.
  • Exposure time 0.5 seconds, Binning: Medium, F / Stop: 2 (Fluorescent) and 8 (Photograph), excitation filter: 465 nm, fluorescence filter: GFP, lamp level: High.
  • Ad-bromelain conjugate / PEG- ⁇ -CyD conjugate was administered, accumulation of FITC-dextran in the tumor was confirmed, while accumulation in other tissues (heart, liver, lung, kidney, spleen) It was not confirmed.
  • bromelain or mannitol aqueous solution was administered, accumulation in each tissue and tumor was not confirmed.
  • Example 10 Reconfirmation of influence on antitumor effect of doxorubicin or doxil (registered trademark)
  • doxorubicin or doxil registered trademark
  • doxorubicin or doxil registered trademark
  • the enhancement effect on the antitumor effect of was confirmed.
  • the dosage is 3 mg / kg for doxorubicin, 2 mg / kg for doxil (registered trademark), and Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex (PEG 20 kDa) at a bromelain dose of 1 mg / kg. It was administered intravenously.
  • the measured tumor volume and body weight results are shown in FIG.
  • the antitumor effect was significantly enhanced by the combined use.
  • Example 11 Preparation of Ad-hyaluronidase / PEG- ⁇ -CyD complex
  • Ad-hyaluronidase was prepared using allonidase instead of bromelain.
  • the obtained Ad-hyaluronidase was mixed with the PEG-modified ⁇ -cyclodextrin prepared in Example 2 (PEG- ⁇ -CyD (20)) to prepare an Ad-hyaluronidase / PEG- ⁇ -CyD complex.
  • the ratio of PEG- ⁇ -CyD: adamantane modified hyaluronidase in the prepared conjugate was 5: 1.
  • Example 12 Measurement of enzyme activity of Ad-hyaluronidase / PEG- ⁇ -CyD complex
  • Acid decomposition activity was measured as follows. Enzyme diluent: 0.1 mg / mL bovine serum albumin, 2.4 mg / mL sodium phosphate, 4.5 mg / mL sodium chloride was dissolved in MilliQ and adjusted to PH 7.0.
  • Acidic albumin solution 1.0 mg / mL bovine serum albumin, 3.27 mg / mL sodium acetate, 4.5 ⁇ L / mL Acetic acid was dissolved in MilliQ and adjusted to pH 3.5.
  • Various hyaluronidases hyaluronidase, PEGylated hyaluronidase, Ad-hyaluronidase / PEG- ⁇ -CyD complex
  • 300 mM aqueous sodium phosphate pH 5.35
  • the enzyme dilution liquid 800 microliters was added to various hyaluronidase solutions (200 microliters), and it stirred at 37 degreeC for 10 minute (s). Thereafter, 1 mL of a hyaluronic acid-containing phosphate buffer (pH 5.35, 0.3 mg / mL) was added and stirred at 37 ° C. for 45 minutes (final concentration of hyaluronidase was 0.1 mg / mL).
  • Undegraded hyaluronic acid binds to albumin to form a poorly water-soluble complex, so that 0.5 mL of each sample solution described above is added to 2.5 mL of acidic albumin solution for 10 minutes at room temperature. After the incubation, the turbidity of the sample suspension was measured using the absorbance at 600 nm as an index, and the activity of hyaluronidase was determined from the following equation. The results are shown in FIG.
  • Example 13 Blood test after administration of Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD The effect of administration of the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex on the living body Confirmed by inspection.
  • the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex was administered once intravenously at a bromelain dose of 1 mg / kg. After 24 hours, serum was collected and various biochemical items (creatinine ( CRE), blood urea nitrogen (BUN), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and lactate dehydrogenase (LDH)).
  • bromelain and the PEGylated bromelain prepared in Comparative Example 1 were administered at a bromelain dose of 1 mg / kg, and as a control, 250 ⁇ L of 5% mannitol PBS solution was administered.
  • the results are shown in Table 1 below.
  • the covalent PEGylated bromelain almost completely lost its enzyme activity, whereas the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex of the present invention retained almost 100% of the activity. It was. From the above results, it was shown that the Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex has high interstitial resolution and an antitumor activity enhancing action of an anticancer agent in vitro and in vivo. In addition, since Ad-bromelain / PEG- ⁇ -CyD complex has enhanced the antitumor activity of anticancer agents when administered intravenously in vivo, this technology is an anticancer agent superior to existing technologies. It is considered useful as a DDS.
  • the complex of the present invention is useful as a DDS of an anticancer agent.

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Abstract

本発明は、新規な抗がん剤デリバリー技術を提供することを目的とする。より具体的には、癌組織内またはその周辺における間質中の成分を分解する酵素を癌組織に有効に移行させることにより、癌組織の間質圧を低下させて抗がん剤を癌組織に効率良く拡散させることができる新規な抗がん剤デリバリー技術およびそれに用いることができる新規なＰＥＧ化酵素を提供することを目的とする。本発明により、酵素、シクロデキストリンおよびポリエチレングリコールからなる複合体であって、該酵素が、少なくとも一つのアダマンタンが共有結合したブロメラインまたはヒアルロニダーゼであり、そして、該複合体においては、該シクロデキストリンと該ポリエチレングリコールが共有結合しており、該シクロデキストリンと該アダマンタンが、ホスト・ゲスト相互作用により結合していることを特徴とする複合体、が提供される。

Description

新規なＰＥＧ修飾酵素及びそれを用いた抗がん剤デリバリー
　本発明は、新規なＰＥＧ修飾酵素に関する。より具体的には、間質成分の分解酵素をＰＥＧ修飾した新規なＰＥＧ修飾酵素に関する。本発明はまた、該ＰＥＧ修飾酵素を用いた抗がん剤デリバリーおよび抗がん剤に関する。
　膵臓癌などの難治がんにおいて、癌組織周辺には密に間質が存在する。このため、癌組織内では間質圧が高くなり、ナノサイズの抗がん剤ですら癌組織の隅々まで拡散せず、治療効果が減弱するという問題がある。そこで、間質圧の亢進したがんに対して、癌組織の間質に存在するヒアルロナンを分解して間質圧を低下させることができるヒアルロニダーゼを用いた治療戦略が試みられている。
　しかし、ヒアルロニダーゼの血中消失半減期は静脈内投与において３分以下であり、ヒアルロニダーゼが癌組織へ移行することは困難であった。そこで、ヒアルロニダーゼを共有結合によりＰＥＧ化（Ｍ．Ｗ． ３０ ｋＤａ）することが試みられた。ＰＥＧ化ヒアルノニダーゼの血中半減期は１０時間以上に延長したことが報告されている。
　また、前立腺がんモデルマウスにＰＥＧ化ヒアルロニダーゼを静脈内投与すると、癌組織の間質を分解し、間質圧を低下させた結果として、ドセタキセルやドキソルビシン封入リポソームの抗がん活性を上昇させたことが報告されている（非特許文献１）。同様に、ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼを膵管腺がんモデルマウスに静脈内投与すると、分子量 ２ ＭＤａのＦＩＴＣ－デキストランの腫瘍への移行が増大すること、また、ゲムシタビンの抗がん活性が増強することが報告されている（非特許文献１）。
　このように、ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼを用いたがん組織深部へのＤＤＳは非常に有望な治療戦略であり、現在、ヒアルロン酸高発現進行性膵臓癌を対象として、アルブミン／パクリタキセル結合体（アブラキサン（登録商標））もしくはゲムシタビンとの併用投与の臨床試験第ＩＩ相が実施されている。
　しかしながら、共有結合によりヒアルロニダーゼをＰＥＧ化すると、本来の活性が７５％も低下してしまうことから、非ＰＥＧ化体と比較して、投与量の増大を余儀なくされる。このことは、副作用の観点のみならず、近年の医療費の驚異的な高騰に対しても懸念すべき問題点である。
　ブロメラインは、癌組織内の細胞外マトリックスを分解することが知られている。しかし、ブロメラインの分子量は ４０ ｋＤａ以下であり、静脈内投与後速やかに排泄されてしまう。従って、ヒアルロニダーゼ同様、ブロメラインを癌組織へ移行することは困難である。
Jacobetz M.A, et al., Gut, 62, 112-120 (2013)
　本発明は、新規な抗がん剤デリバリー技術を提供することを目的とする。より具体的には、癌組織内またはその周辺における間質中の成分を分解する酵素を癌組織に有効に移行させることにより、癌組織の間質圧を低下させて抗がん剤を癌組織に効率良く拡散させることができる新規な抗がん剤デリバリー技術およびそれに用いることができる新規なＰＥＧ修飾酵素を提供することを目的とする。
　本発明者らは、自身が開発したβ－シクロデキストリン（β－ＣｙＤ）とアダマンタン（Ａｄ）のホスト－ゲスト相互作用を介してペプチドやタンパク質にＰＥＧを修飾する技術である、“Self-assembly PEGylation Retaining the Activity（ＳＰＲＡ）”技術を用いて、癌組織内またはその周辺における間質中の成分を分解する酵素をＰＥＧで修飾することにより、それらの酵素の活性を損なわず、また、ＰＥＧ修飾酵素を抗がん剤とともに生体に投与することにより、抗がん剤の抗腫瘍活性を増強することができることを見いだし、本発明を完成させた。
　本発明は以下のものを含む。
［１］酵素、シクロデキストリンおよびポリエチレングリコールからなる複合体であって、
該酵素が、少なくとも一つのアダマンタンが共有結合したブロメラインまたはヒアルロニダーゼであり、
そして、該複合体においては、
該シクロデキストリンと該ポリエチレングリコールが共有結合しており、
該シクロデキストリンと該アダマンタンが、ホスト・ゲスト相互作用により結合していることを特徴とする複合体。
［２］前記シクロデキストリンが、β－シクロデキストリンである上記［１］に記載の複合体。
［３］前記シクロデキストリンと前記ポリエチレングリコールの共有結合が、シクロデキストリン１分子に対してポリエチレングリコールが１～２１分子（好ましくは、１～１４分子、より好ましくは１～１０分子、さらに好ましくは１～７分子）が結合している、上記［１］または［２］に記載の複合体。
［４］前記酵素が、アダマンタンが共有結合したブロメラインである、上記［１］～［３］のいずれか一つに記載の複合体。
［５］前記酵素が、アダマンタンが共有結合したヒアルロニダーゼである、上記［１］～［３］のいずれか一つに記載の複合体。
［６］前記ポリエチレングリコールが、分子量２～４０ｋＤａである上記［１］～［５］の何れか一つに記載の複合体。
［７］上記［１］～［６］のいずれか一つに記載の複合体であって、該複合体は５～３０分子が凝集して凝集体を形成している複合体。
［８］前記凝集体の粒子径が５０～５００ｎｍ（好ましくは１００～３００ｎｍ、より好ましくは、１００～２００ｎｍ）である上記［７］に記載の複合体。
［９］上記［１］～［８］のいずれか一つに記載の複合体を含む抗がん剤。
［１０］抗がん剤との併用で用いられることを特徴とする上記［１］～［８］のいずれか一つに記載の複合体。
［１１］前記抗がん剤が、ドキソルビシン、リボソーマルドキソルビシン（ドキシル：登録商標）、エリブリン、パクリタキセル（アブラキサン：登録商標）、およびゲムシタビンからなる群から選ばれる抗がん剤である上記［１０］に記載の複合体。
［１２］上記［１］～［８］のいずれか一つに記載の複合体からなる、抗がん剤の抗腫瘍活性増強剤。
［１３］前記抗がん剤が、ドキソルビシン、リボソーマルドキソルビシン（ドキシル：登録商標）、エリブリン、パクリタキセル（アブラキサン：登録商標）、およびゲムシタビンからなる群から選ばれる抗がん剤である上記［１２］に記載の抗腫瘍活性増強剤。
　本発明により、新規な、ＰＥＧにより修飾された癌組織内またはその周辺における間質中の成分を分解する酵素が提供される。該ＰＥＧ修飾酵素は、抗がん剤とともに生体に投与することにより、抗がん剤の抗腫瘍活性を増強することができる。
アダマンタン修飾ブロメライン（Ad-bromelain）の調製方法の概略を示す。 ＰＥＧ修飾β－ＣｙＤの調製方法の概略を示す。ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２）は、分子量２ ｋＤａのＰＥＧで修飾したβ－ＣｙＤを示し、ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２０）は、分子量２０ ｋＤａのＰＥＧで修飾したβ－ＣｙＤを示す。 Ａｄ－ブロメライン、ＰＥＧ－β－ＣｙＤ、およびＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体（SPRA-bromelain(2)及びSPRA-bromelain(20)）の粒子径を測定した結果である。 Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の凝集した状態を模式的に示した図である。数値は、それぞれの分子または凝集体の粒子径を示す。 Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体のゼラチンゲル分解能を確認した結果である。 ＦＩＴＣ－デキストランを用いた、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体によるゼラチンゲル透過性促進を確認した結果である。 ＦＩＴＣ－デキストランの腫瘍集積性に対する、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の効果を確認した結果である。 ドキソルビシンの抗腫瘍効果の増強効果を確認した結果である。（Ａ）は腫瘍の容積の変化を、（Ｂ）はマウスの生存率を、（Ｃ）はマウスの体重の変化を示している。 ドキシル（登録商標）の抗腫瘍効果の増強効果を確認した結果である。（Ａ）は腫瘍の容積の変化を、（Ｂ）はマウスの生存率を、（Ｃ）はマウスの体重の変化を示している。 ブロメライン、ＰＥＧ化ブロメライン、およびＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体のそれぞれのドキシル（登録商標）の抗腫瘍効果の増強効果を確認した結果である。 ドキソルビシン又はドキシル（登録商標）の抗腫瘍効果の増強効果を確認した結果である。（Ａ）は腫瘍の容積の変化を、（Ｂ）はマウスの生存率を示している。各値は ３匹のマウスの平均値±標準誤差で表している。*p < 0.05 versus 5 % mannitol、+p < 0.05 versus Doxorubicin、++p < 0.05 versus Doxil（登録商標）。 Ａｄ－ヒアルロニダーゼ／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体のインビトロでの酵素活性を確認した結果である。各値は ｎ＝３の平均値±標準誤差で表している。*p < 0.05 versus ヒアルロニダーゼ。
　以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
　本発明者らは、β－ＣｙＤとアダマンタン（Ａｄ）のホスト－ゲスト相互作用を介してインスリンやリゾチームにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を修飾する技術である、“Self-assembly PEGylation Retaining the Activity（ＳＰＲＡ）”技術を開発し、報告している（T. Hirotsuら、Mol. Pharm., 14, 368-376 (2017)）。作成したＡｄ－インスリン複合体／ＰＥＧ－β－ＣｙＤは、活性の損失もなく、インスリンに比べて顕著に持続した血糖低下作用を示したが、一方、共有結合によりＰＥＧ化したインスリンは、ごく僅かな血糖低下作用しか示さなかった。また、Ａｄ－リゾチーム複合体／ＰＥＧ－β－ＣｙＤは、インビトロの試験の結果、リゾチームと同様の活性を維持していたが、共有結合によりＰＥＧ化したリゾチームの活性は２３％に低下していた。
　本発明における複合体は、アダマンタンが共有結合したブロメラインまたはヒアルロニダーゼ、シクロデキストリン（好ましくは、β－シクロデキストリン）、およびポリエチレングルコールを含む。
　ブロメラインは、ブロメリアセア(Bromeliaceae)という植物の組織中で発見されたタンパク質分解酵素の総称である。ブロメラインは、パイナップルの茎由来の様々な部分の混合物である。また、ブロメラインは、複数のタンパク質分解酵素を含んでいることが知られているが、酸性ホスファターセやペルオキシダーゼ等の非タンパク質分解酵素をも含んでいる。ブロメラインはまた、アミラーゼ及びセルラーゼ活性をも有する。さらに、様々な他の成分も存在する。
　ブロメラインはまた抗癌活性を持つことが知られており、さらには、癌組織中の間質（細胞外マトリックス）を分解することが知られている。
　本発明において用いることができブロメラインは、癌組織の間質（細胞外マトリックス）を分解する活性を有するものであれば、特に制限なく用いることができる。ブロメランは、パイナップルの茎から抽出して用いることもでき、また市販のものを用いることもできる。ブロメラインは、医薬品やサプリメントとしても販売されている。本発明において用いるブロメラインは、好ましくは、サプリメントまたは医薬品（例えば、軟膏）として販売されるものに用いられるグレードのブロメラインであり、特に好ましくは、医薬品として販売されるものに用いられるグレードのブロメラインである。
　ヒアルロニダーゼは、微生物からホ乳類におよぶ多様な生物において見出される、中性活性および酸活性の酵素である。ヒアルロニダーゼの基質であるヒアルロナン（ヒアルロン酸としても知られている）は、[GlcNAcβ1-4GlcUAβ1-3]nの繰り返し二糖類で、生体内では高分子直鎖多糖類として存在する。ヒアルロニダーゼによるヒアルロナンの分解は、β-N-アセチル-ヘキソサミン-[１->４]-グリコシド結合での切断またはβ-グルコノレート-[１->３]-N-アセチルグルコサミン結合での切断のいずれかによって達成され、ヒアルロナンは加水分解されて粘度が低下する。ヒアルロン酸は、間質組織の主成分であるため、ヒアルロニダーゼで処理をすると組織の浸透性が増加する。
　哺乳類のヒアルロニダーゼは、中性域（ｐＨ７．０）活性型および酸性域（ｐＨ４．０）活性型の大きく２つの種類に分けられる。中性ヒアルロニダーゼは、例えば、精液関連タンパク質ＰＨ２０をあげることができる。酸活性ヒアルロニダーゼ、例えば、様々な臓器やヒト血漿からの抽出物で報告されている。
　ヒアルロニダーゼはまた、化学療法剤の活性を高めるために、および／または化学療法剤の腫瘍へのアクセスを容易にするために“分散剤”として癌治療において用いられている。
　本発明で用いることができるヒアルロニダーゼは、癌組織の間質（細胞外マトリックス）を分解する活性を有するものであれば、特に制限なく用いることができる。ヒアルロニダーゼは、例えば、動物由来の血漿や臓器から抽出された天然型のヒアルロニダーゼを用いることもでき、また、遺伝子組換え技術により作製したヒト由来の遺伝子組換えヒアルロニダーゼを用いることもできる。ヒアルロニダーゼは市販もされており、例えば、動物由来のヒアルロニダーゼをあげることができる。ヒアルロニダーゼは、医療および美容整形分野で用いられている。本発明において用いるヒアルロニダーゼは、好ましくは、医療および美容整形分野で用いられているグレードのヒアルロニダーゼであり、特に好ましくは、医薬品として用いられているグレードのヒアルロニダーゼである。
　本発明の複合体に含まれるブロメラインまたはヒアルロニダーゼ（以下、合わせて、「間質分化酵素」という）は、アダマンタンで修飾されている。本発明の間質分解酵素へのアダマンタンの結合は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、目的に応じて、報告されている方法に、適宜、修正・変更を加えて行うことができる。例えば、これに限定されないが、アダマンタン酢酸をＤＭＳＯ中で、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドおよびＮ，Ｎ’－ジクロロヘキシルカルボジイミドを反応させて、スクシンイミド基を導入し、ＤＭＦ／水中で間質分解酵素と反応させることにより、アダマンタンをタンパク質に共有結合させることができる。
　本発明の複合体に含まれるアダマンタン修飾された間質分解酵素において、タンパク質１分子に対して結合しているアダマンタン分子の数は、特に限定されず、タンパク質１分子に対して１つ以上のアダマンタン分子が結合していれば本発明の効果が生じる。また、タンパク質のそれぞれの分子毎に結合しているアダマンタン分子の数は異なってもよい。タンパク質１分子に対して結合するアダマンタン分子の数は、目的とするデキストリンを介してのＰＥＧ修飾に応じて適宜選択することができ、また、タンパク質の種類に応じて異なってもよく、その結合比は適宜選択することができる。
　本発明の複合体に含まれるシクロデキストリンは、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリンの何れでもよいが、好ましくはβ－シクロデキストリンである。
　本発明でいうα－シクロデキストリンは、６個のグルコースが結合し環状構造をとった環状オリゴ糖であるα－シクロデキストリンおよびその誘導体を含む意味である。
　本発明でいうβ－シクロデキストリンは、７個のグルコースが結合し環状構造をとった環状オリゴ糖であるβ－シクロデキストリンおよびその誘導体を含む意味である。誘導体としては、これに限定されないが、例えば、モノメチル－β－シクロデキストリン、ジメチル－β－シクロデキストリン、トリメチル－β－シクロデキストリン、ヒドロキシアルキル－β－シクロデキストリン、スルフォブチル－β－シクロデキストリン、分岐β－シクロデキストリン等をあげることができる。β－シクロデキストリンは市販されており、それを用いることができる。
　β－シクロデキストリンは医薬組成物にも添加されている。本発明において用いるヒβ－シクロデキストリンは、特に限定されないが、好ましくは、高純度に精製されたものであり、特に好ましくは、医薬組成物において添加剤として用いられているグレードのβ－シクロデキストリンである。
　本発明でいうγ－シクロデキストリンは、８個のグルコースが結合し環状構造をとった環状オリゴ糖であるγ－シクロデキストリンおよびその誘導体を含む意味である。
　以下、β－シクロデキストリンを例として本発明を説明するが、本発明の態様は、β－シクロデキストリンに限定されるものではない。
　本発明の複合体に含まれるβ－シクロデキストリンは、ＰＥＧと共有結合することによりＰＥＧ修飾されている。β－シクロデキストリンへのＰＥＧの結合は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、目的に応じて、報告されている方法に、適宜、修正・変更を加えて行うことができる。例えば、これに限定されないが、シクロデキストリンの水酸基をアミノ化し、一方、ＰＥＧの末端基をカルボキシル化して、それらを共有結合させることができる。
　ＰＥＧで修飾されたβ－シクロデキストリンにおいて、β－シクロデキストリン１分子に対して結合しているＰＥＧの数は、特に限定されず、また、β－シクロデキストリン分子それぞれ毎に結合しているＰＥＧの数は異なってもよい。β－シクロデキストリン１分子に対して結合しているＰＥＧの数は、平均値として、好ましくは１～２１、より好ましくは１～１４、さらに好ましくは１～１０、よりさらに好ましくは１～７である。
　β－シクロデキストリンに結合するＰＥＧの長さ（大きさ）は特に制限がなく、任意の長さのＰＥＧを用いることができる。これに限定されないが、例えば、２～４０ｋＤａのＰＥＧをあげることができる。
　分子量が大きいＰＥＧを結合する場合は、β－シクロデキストリン１分子当たりのＰＥＧ分子の数は少なくすることができる。
　β－シクロデキストリンに結合するＰＥＧの数および長さ（大きさ）は、本発明の複合体において、間質分解酵素を、どの程度の数や長さ（大きさ）のＰＥＧで修飾するかという目的に応じて適宜選択することができる。
　本発明の複合体においては、ＰＥＧが結合したβ－シクロデキストリン分子と、アダマンタンが結合した間質分解酵素が、β－シクロデキストリンとアダマンタンのホスト－ゲスト相互作用を介して結合し、ＰＥＧ修飾された間質分解酵素が形成される。ホスト－ゲスト相互作用の形成は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、目的に応じて、報告されている方法に、適宜、修正・変更を加えて行うことができる。例えば、これに限定されないが、水中で両者を混合することにより形成できる。
　本発明の複合体は、好ましくは、複数の分子が凝集した凝集体の状態をとる。これに限定されないが、凝集体は、例えば、３～５０分子、好ましくは５～３０分子が凝集した状態をとる。本発明の複合体の凝集体の粒子径は、これに限定されないが、例えば、３０～５００ｎｍ、好ましくは、３０～３００ｎｍ、より好ましくは、３０～２００ｎｍである。このような粒子径を取ることにより、ＥＰＲ効果により、がん組織に集積し易いという効果を生じる。
　本発明の複合体を含む組成物（以下、単に、本発明の組成物という）は、これに限定されないが、好ましくは、注射用製剤の形態をとる。本発明の注射用製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、臓器内、腹腔内、あるいは腫瘍等の病巣に投与することができる。また本発明の組成物は、水溶性製剤または凍結乾燥製剤のいずれの形態をとることができ、好ましくは、水性注射剤、または凍結乾燥した用時溶解型注射剤をあげることができる。
　本発明の組成物は、通常注射剤に用いられる糖類、防腐剤、安定化剤、静電防止剤を含んでもよい。本発明の組成物はまた、薬理学的に許容できるｐＨ調整剤を含有することができる。本発明に用いられるｐＨ調整剤は、医薬用途に使用でき、薬理学的に許容できる物質であれば特に限定されるものではないが、好ましくは水酸化ナトリウム、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び塩酸である。これらのｐＨ調整剤は１種単独でも、２種以上を混合して用いてもよい。本発明の組成物はまた、浸透圧調整剤または等張化剤を含むことができ、例えば、塩化ナトリウムやデキストロース等の少なくとも１種を含むことができる。
　本発明の組成物は、癌組織内またはその周辺に存在する間質（細胞外マトリックス）を分解し、物質（例えば、抗がん剤）を癌組織に効率良く拡散させることができる。よって、本発明の一つの態様は、抗がん剤との併用で用いられることを特徴とする。抗がん剤と併用して用いられる場合は、抗がん剤と混合して投与してもよく、また、抗がん剤と別々に投与してもよい。投与のタイミングも、抗がん剤と同時に投与してもよく、また、本発明の組成物を投与した後、抗がん剤を投与してもよく、抗がん剤を投与した後、本発明の組成物を投与してもよい。
　抗がん剤との併用で用いられる本発明の複合体の投与量は、癌の性質、病気の程度、治療方針、転移の程度、腫瘍の大きさ及び程度、体重、年齢、性別及び患者の（遺伝的）人種的背景に依存して適宜選択できるが、薬学的有効量は、一般に、臨床上観察される症状、病気の進行の度合い等の要因に基づいて決定される。１日あたりの投与量は、例えば、ヒトに投与する場合は、０．１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇである。投与は、１回で投与しても複数回に分けて投与してもよいが、好ましくは複数回の投与である。投与は、連日であっても間歇投与であってもよく、投与対象の状態に応じて適宜選択できる。また、点滴等により時間をかけて連続的に投与してもよい。
　本発明の組成物と併用して用いることができる抗がん剤は特に限定されず、何れの抗がん剤も用いることができる。抗がん剤と本発明の組成物を併用して用いることにより、癌組織内またはその周辺に存在する間質（細胞外マトリックス）が分解され、抗がん剤が癌組織に効率良く拡散されて抗がん効果を有効に発揮できる。すなわち、抗がん剤のドラッグデリバリー剤として用いることができる。
　抗がん剤として、これに限定されないが、例えば、ドキソルビシン、リボソーマルドキソルビシン（ドキシル：登録商標）、エリブリン、パクリタキセル（アブラキサン：登録商標）、ゲムシタビンをあげることができる。
　本発明の組成物はまた、癌組織内またはその周辺に存在する間質（細胞外マトリックス）を分解し、併用して投与された抗がん剤を癌組織に効率良く拡散させ、抗がん剤の抗腫瘍活性を増強することができる。
　本発明の組成物は、さらに、その成分であるブロメラインまたはヒアルロニダーゼが抗がん活性を有することより、単独の抗がん剤としても用いることができる。
　本発明の組成物を用いることができるがんは特に限定されず、いずれのがんに対しても用いることができ、例えば、乳がん、小細胞肺がん、大腸がん、悪性リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、咽頭がん、喉頭がん、舌がん、歯肉がん、食道がん、胃がん、胆管がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、前立腺がんなどを挙げることができる。好ましくは、癌組織内またはその周辺に間質圧を形成し、通常の抗がん剤が癌組織内に有効に拡散できない癌である。
　本発明の組成物を単独で抗がん剤として用いる場合、本発明の複合体の有効投与量は、癌の性質、病気の程度、治療方針、転移の程度、腫瘍の量、体重、年齢、性別及び患者の（遺伝的）人種的背景に依存して適宜選択できるが、薬学的有効量は、一般に、臨床上観察される症状、病気の進行の度合い等の要因に基づいて決定される。１日あたりの投与量は、例えば、ヒトに投与する場合は、０．１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇである。投与は、１回で投与しても複数回に分けて投与してもよく、また、点滴等により時間をかけて連続的に投与してもよい。また、投与は、連日であっても間歇投与であってもよく、投与対象の状態に応じて適宜選択できるが、好ましくは、間歇投与である。
　以下、本発明を、以下に記載の実施例をもとに説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）アダマンタン修飾ブロメラインの調製
　共有結合を用いてアダマンタンで修飾したブロメライン（Ａｄ－ブロメライン）を以下のようにして調製した。
　アダマンタン酢酸（１９４．２７ｍｇ）をＤＭＳＯ中（６ｍＬ）で、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（２３０．１８ｍｇ）およびＮ，Ｎ’－ジクロロヘキシルカルボジイミド（８２．５２ｍｇ）を反応させて、スクシンイミド基を導入し、ＤＭＦ／水中（１：６（ｖ／ｖ））（１４ｍＬ）でブロメラインと反応させることにより、アダマンタン修飾ブロメラインを調製した。
　Ａｄ－ブロメライン結合体の調製方法の概略を図１に示す。
（実施例２）ＰＥＧ修飾β－シクロデキストリンの調製
　共有結合を用いてＰＥＧで修飾したβ－シクロデキストリン（ＰＥＧ－β－ＣｙＤ）を以下のようにして調製した。
　末端にスクシンイミド基が導入されたＰＥＧ（１００ｍｇ）とアミノ化ＣｙＤ（５．６４ｍｇ）をＤＭＦ／水中（２：１（ｖ／ｖ））（１０ｍＬ）で反応させることでＰＥＧ－β－ＣｙＤを調製した。ＰＥＧ－β―ＣｙＤ（２）及びＰＥＧ－β―ＣｙＤ（２０）はそれぞれ、分子量２ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧを用いて調製したＰＥＧ－β－ＣｙＤを表す。
　ＰＥＧ－β－ＣｙＤの調製方法の概略を図２に示す。
（実施例３）Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－シクロデキストリン複合体の調製
　実施例１で調製したＡｄ－ブロメラインと実施例２で調製したＰＥＧ修飾β－シクロデキストリンを混合して、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体を調製した。
　作製したＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の粒子径および安定度定数を以下のようにして測定した。
　粒子径は５％マンニトール水溶液にＡｄ－ブロメライン結合体およびＰＥＧ－β－ＣｙＤをモル比１：１０となるように加え、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　ｎａｎｏにより測定した。
　安定度定数は、Ａｄ－ブロメライン（１ｍＭ）およびＰＥＧ－β－ＣｙＤ（０．０２ｍＭ）をＰＢＳに溶解し、等温滴定型熱量計により測定した。
　結果を図３に示す。なお、図中、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（ＰＥＧ ２ｋＤａ）は、ＳＰＲＡ－ｂｒｏｍｅｌａｉｎ（２）と、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（ＰＥＧ ２０ ｋＤａ）は、ＳＰＲＡ－ｂｒｏｍｅｌａｉｎ（２０）と表記してある（以下の実施例も同様）。Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２）複合体は、粒子径が１６５ｎｍ、安定度定数は８．８６ｘ１０4（Ｍ-1）であり、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２０）複合体は、粒子径が１５５ｎｍ、安定度定数は１．１４ｘ１０4（Ｍ-1）であった。作製されたＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の粒子径は、１５０ ｎｍ程度であり、ＥＰＲ効果により腫瘍に集積しやすいサイズであることが示唆された。一方、Ａｄ－ブロメラインの粒子径は２．３５ｎｍ、ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２）およびＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２０）の粒子径はそれぞれ２．０ｎｍおよび１０．９ｎｍであった。
　１分子のＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２）複合体の粒子径は６．３５ｎｍであるので、作製されたＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２）複合体は、２６分子のＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２）複合体が凝集した状態と考えられる。模式図を図４Ａに示す。一方、１分子のＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２０）複合体の粒子径は２４．１５ｎｍであるので、作製されたＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２０）複合体は、６分子のＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２０）複合体が凝集した状態と考えられる。模式図を図４Ｂに示す。
（比較例１）ＰＥＧ化ブロメラインの調製
　共有結合を用いてＰＥＧで修飾したブロメラインを以下のようにして調製した。
　末端にスクシンイミド基が導入された分子量２ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧ（２０ｍｇ）とブロメライン（４１ｍｇ）をＤＭＦ／水中（１：５０（ｖ／ｖ））（１５．３ｍＬ）で反応させることでＰＥＧ化ブロメライン（PEG-bromelain(2)、及び、PEG-bromelain(20)）を調製した。
（実施例４）ゼラチン分解能の検討
　実施例３において作製したＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体を用いて、以下のようにしてゼラチン分解能を測定した。
　２４ウェルプレートに５％ゼラチンを含有するＰＢＳを３００μＬ添加し、４℃で一晩放置し、ゼラチンを固化した。それに、ＰＢＳに溶解したＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２）複合体およびＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２０）複合体（それぞれの濃度は、Ａｄ－ブロメライン：０．１ｍＭ，ＰＥＧ－β－ＣｙＤｓ：１ｍＭ）を３００μＬ添加し、４℃で８時間、インキュベートした。その後、上清中のタンパク質をＢＣＡTMＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを用いて定量することにより、溶解したゼラチンを測定した。ポジティブコントロールとして、ＰＢＳに溶解したブロメライン（濃度は、２０μｇ／３００μＬ）を用い、対照として、ＰＢＳに溶解した、比較例１で作製したＰＥＧ化ブロメライン（濃度は、０．１ｍＭ）、実施例１で作製したＡｄ－ブロメライン（濃度は、０．１ｍＭ）を用いた。
　結果を図５に示す。共有結合により直接ＰＥＧ鎖で修飾したＰＥＧ化ブロメラインのゼラチン分解能はほぼ完全に消失したのに対し、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（ＰＥＧ　２ｋＤａ，２０　ｋＤａ）のゼラチン分解能は、ブロメライン単独と比較して同等以上であった。
（実施例５）ＦＩＴＣ－デキストランのゼラチンゲル透過性に対する影響
　トランスウェル（ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて、インサートに５％ゼラチンを含有するＰＢＳを３００μＬ添加し、４℃で一晩放置し、ゼラチンを固化した。それに、ＰＢＳに溶解したＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２）複合体およびＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２０）複合体（それぞれの濃度は、Ａｄ－ブロメライン：０．１ｍＭ，ＰＥＧ－β－ＣｙＤｓ：１ｍＭ）を１００μＬ添加し、さらに、ＦＩＴＣ－デキストラン（７０ ｋＤａ，２ ＭＤａ）を加えた。インサートを、ＰＢＳを入れたレシーバーに入れ、４℃で８時間、インキュベートした。その後、ＰＢＳ（レシーバー側）を回収し、蛍光強度を測定した。ポジティブコントロールとして、ＰＢＳに溶解したブロメライン（濃度は、０．１ｍＭ）を用い、対照として、ＰＢＳに溶解した、比較例１で作製したＰＥＧ化ブロメライン（濃度は、０．１ｍＭ）、実施例１で作製したＡｄ－ブロメライン（濃度は、０．１ｍＭ）を用いた。
　結果を図６に示す。Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体（ＰＥＧ ２ｋＤａ，２０ ｋＤａ）は、ＦＩＴＣ－デキストラン（７０ ｋＤａ，２ ＭＤa）のゼラチンゲル透過性を向上させた。
（実施例６）ＦＩＴＣ－デキストランの腫瘍集積性に対する影響
　間質圧の高いヒト膵臓がんモデルマウスを用いて、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体による、ＦＩＴＣ－デキストランのがん組織集積性を、以下のようにして確認した。
　１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ中の、ヒト膵臓がん由来細胞（ＭＩＡ ＰａＣａ－２、ＪＲＢＣ細胞バンクより入手）の５ｘ１０6細胞／１００μＬを、マトリゲル（ｃｏｒｎｉｎｇ社製、濃度：１００％）１００μＬと共に、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの脚の付け根に注射し、ヒト膵臓がんモデルマウスを作製した。マウスに、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体（ＰＥＧ ２０ ｋＤａ）をブロメライン用量で１ｍｇ／ｋｇとなるように、腫瘍内または静脈内に投与した。２４時間後に、ＦＴＩＣ－デキストラン（２ ＭＤａ）溶液（１ｍｇ／ｍＬ）２５０ μＬをマウスに静脈内投与した。２４時間後に、腫瘍組織を採取し、蛍光強度をＩＶＩＳで測定した。対照として、比較例１で作製したＰＥＧ化ブロメラインを、ブロメライン量で１ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。静脈内投与については、コントロールとして、５％マンニトールＰＢＳ溶液を２５０μＬ投与した。
　結果を図７に示す。腫瘍内投与および静脈内投与いずれにおいても、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の併用投与により、ＦＩＴＣ－デキストランの高い腫瘍集積性が認められた。
（実施例７）ドキソルビシンの抗腫瘍効果に対する影響
　ヒト膵臓がんモデルマウスを用いて、抗がん剤とのＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の併用投与による、抗腫瘍活性の増強を検討した。
　実施例６と同様にして、ヒト膵臓がんモデルマウスを作製した。マウスに、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体（ＰＥＧ ２０ ｋＤａ）をブロメライン用量で１ｍｇ／ｋｇとなるようにして、腫瘍内に投与を週１回繰り返した。コントロールとして、５％マンニトールＰＢＳ溶液を２５０μＬ投与した。Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の最初の投与の２４時間後から、ドキソルビシン（ＷＡＫＯから購入）を、５ｍｇ／ｋｇの用量にて、週１回、静脈内投与を繰り返した。
　マウスの生存率、体重、および腫瘍の大きさを経時的に測定した。結果を図８に示す。ドキソルビシンの抗腫瘍効果が、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の併用により増強されていることが認められた。
（実施例８）ドキシル（登録商標）の抗腫瘍効果に対する影響
　実施例７と同様にして、リボソーマルドキソルビシン（ドキシル（登録商標）：FormuMax Scientificから入手、４．５ｍｇ／ｋｇで投与）との併用による、ドキシルの抗腫瘍効果に対する増強効果を確認した。結果を図９に示す。ドキシル（登録商標）の抗腫瘍効果が、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の併用により増強されていることが認められた。また、対照として、ブロメラインおよび比較例１で作製したＰＥＧ化ブロメラインを、ブロメライン用量で１ｍｇ／ｋｇとなるように投与したところ、それらには、ドキシル（登録商標）の抗腫瘍効果の増強効果は認められなかった。結果を図１０に示す。
（実施例９）ＦＩＴＣ－デキストランの腫瘍及び各組織への集積性の検討
　Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体による、ＦＩＴＣ－デキストランの各組織への集積性を検討した。
　　実施例６で用いた担がんマウスモデルを用いて、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体による、ＦＩＴＣ－デキストランのがん組織集積性、及び各組織への集積性を以下のようにして確認した。
　Ａｄ－ブロメライン結合体（０．１ ｍＭ）／Ｍｕｌｔｉ－ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（０．５ ｍＭ）複合体、及びブロメライン（０．１ ｍＭ）を５％ マンニトール水溶液にそれぞれ溶解し、各試料溶液とした。エーテル麻酔下、担がんマウスに各試料溶液を尾静脈より投与した（１ ｍｇ／ｋｇ、２５０ μＬ）。２４時間後、エーテル麻酔下にて１ ｍｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ－デキストラン（２ ＭＤａ）含有５％ マンニトール水溶液（２５０ μＬ）を尾静脈より投与した。ネガティブコントロールとして、５％ マンニトール水溶液を投与した。１２時間後、灌流を行い、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓および腫瘍を摘出してＩＶＩＳにより腫瘍内のＦＩＴＣ　由来の蛍光強度を以下の条件で測定した。露光時間：０．５秒、Binning:Medium、F/Stop:２（Fluorescent）および８（Photograph）、励起フィルター：４６５　ｎｍ、蛍光フィルター：ＧＦＰ、ランプレベル：Ｈｉｇｈ。
　Ａｄ－ブロメライン結合体／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体を投与した場合、ＦＩＴＣ－デキストランの腫瘍への集積が確認された一方、他の組織（心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓）への集積は確認されなかった。ブロメライン又はマンニトール水溶液のみを投与した場合は、各組織及び腫瘍への集積は確認されなかった。
（実施例１０）ドキソルビシン又はドキシル（登録商標）の抗腫瘍効果に対する影響の再確認
　実施例７及び８と同様にして、ドキソルビシン又はドキシル（登録商標）との併用による、ドキソルビシン又はドキシル（登録商標）の抗腫瘍効果に対する増強効果を確認した。但し、投与量は、ドキソルビシンは３ｍｇ／ｋｇ、ドキシル（登録商標）は２ｍｇ／ｋｇとし、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体（ＰＥＧ ２０ ｋＤａ）をブロメライン用量で１ｍｇ／ｋｇとなるように静脈内に投与した。測定した腫瘍体積及び体重の結果を図１１に示す。ドキソルビシン又はドキシル（登録商標）のいずれにおいても、併用により抗腫瘍効果を有意に増強した。
（実施例１１）Ａｄ－ヒアルロニダーゼ／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の調製
　実施例１と同様にして、ブロメラインの代わりにアルロニダーゼを用いてＡｄ－ヒアルロニダーゼを調製した。
　得られたＡｄ－ヒアルロニダーゼと実施例２で調製したＰＥＧ修飾β－シクロデキストリン（ＰＥＧ－β－ＣｙＤ（２０））を混合して、Ａｄ－ヒアルロニダーゼ／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体を調製した。調製した複合体中のＰＥＧ－β－ＣｙＤ：アダマンタン修飾ヒアルロニダーゼ比は、５：１であった。
（比較例２）ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼの調製
　共有結合を用いてＰＥＧで修飾したヒアルロニダーゼを以下のようにして調製した。
　末端にスクシンイミド基が導入されたＰＥＧ（分子量２０ｋＤａ）とヒアルロニダーゼをＤＭＦ／水中（１：２５（ｖ／ｖ））で反応させることでＰＥＧ化ヒアルロニダーゼを調製した。ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼのＰＥＧ置換数は、０．７８であった。
（実施例１２）Ａｄ－ヒアルロニダーゼ／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の酵素活性の測定
　実施例９で調製したＡｄ－ヒアルロニダーゼ／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体及び比較例２で調製したＰＥＧ化ヒアルロニダーゼのヒアルロン酸分解活性を以下のようにして測定した。
　酵素希釈液：０．１ ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、２．４ ｍｇ／ｍＬ リン酸ナトリウム、４．５ ｍｇ／ｍＬ 塩化ナトリウムをミリＱに溶解し、ＰＨ ７．０に調整。
　酸性アルブミン溶液：１．０ ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、３．２７ ｍｇ／ｍＬ 酢酸ナトリウム、４．５ μＬ／ｍＬ 酢酸をミリＱに溶解し、ｐＨ ３．５ に調整。
　各種ヒアルロニダーゼ（ヒアルロニダーゼ、ＰＥＧ化ヒアルロニダーゼ、Ａｄ－ヒアルロニダーゼ／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体）を３００ ｍＭ リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ ５．３５）に溶解した（ヒアルロニダーゼとして １ ｍｇ／ｍＬ）。次いで、各種ヒアルロニダーゼ溶液（２００ μＬ）に酵素希釈液（８００ μＬ）を添加し、３７℃で １０ 分間撹拌した。その後、ヒアルロン酸含有リン酸緩衝液（ｐＨ ５．３５、０．３ ｍｇ／ｍＬ）１ ｍＬを添加し、３７℃で４５分間撹拌した（ヒアルロニダーゼの終濃度は、０．１ ｍｇ／ｍＬ）。
　未分解のヒアルロン酸は、アルブミンと結合して難水溶性の複合体を形成することより、上記の各試料溶液０．５ ｍＬを、酸性アルブミン溶液２．５ ｍＬに添加し、室温で１０分間保温した後、試料懸濁液の濁度を６００ｎｍの吸光度を指標に測定し、以下の式よりヒアルロニダーゼの活性を求めた。　結果を図１２に示す。
式１

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
（実施例１３）Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ投与後の血液検査
　Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体を投与することにより、生体にどのような影響を及ぼすかを、血液生化学検査により確認した。
　Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体を、ブロメライン用量で１ｍｇ／ｋｇとなるようにして、静脈内に単回投与し、２４時間後に、血清を採取し、各種生化学的項目（クレアチニン（ＣＲＥ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ））について測定した。対照として、ブロメラインおよび比較例１で作製したＰＥＧ化ブロメラインを、ブロメライン用量で１ｍｇ／ｋｇとなるように投与し、コントロールとして、５％マンニトールＰＢＳ溶液を２５０μＬ投与した。結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　上記の結果より、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体の投与によって、血液生化学検査値は変化しなかったことから、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体は安全性に優れると考えられる。
　上記したように、共有結合型のＰＥＧ化ブロメラインは酵素活性がほぼ完全に失われたのに対して、本発明のＡｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体は活性をほぼ１００％保持していた。
　以上の結果より、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体は、インビトロおよびインビボにおいて高い間質分解能や抗がん剤の抗腫瘍活性増強作用を有することが示された。また、Ａｄ－ブロメライン／ＰＥＧ－β－ＣｙＤ複合体は、インビボ静脈内投与において、抗がん剤の抗腫瘍活性を増強させたことから、本技術は既存技術よりも優れた抗がん剤のＤＤＳとして有用であると考えられる。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　本発明の複合体は、抗がん剤のＤＤＳとして有用である。

Claims (13)

  1. 　酵素、シクロデキストリンおよびポリエチレングリコールからなる複合体であって、
    該酵素が、少なくとも一つのアダマンタンが共有結合したブロメラインまたはヒアルロニダーゼであり、
    そして、該複合体においては、
    該シクロデキストリンと該ポリエチレングリコールが共有結合しており、
    該シクロデキストリンと該アダマンタンが、ホスト・ゲスト相互作用により結合していることを特徴とする複合体。
  2. 　前記シクロデキストリンが、β－シクロデキストリンである上記［１］に記載の複合体。
  3. 　前記シクロデキストリンと前記ポリエチレングリコールの共有結合が、シクロデキストリン１分子に対してポリエチレングリコールが１～２１分子が結合している、請求項１または２に記載の複合体。
  4. 　前記酵素が、アダマンタンが共有結合したブロメラインである、請求項１～３のいずれか一つに記載の複合体。
  5. 　前記酵素が、アダマンタンが共有結合したヒアルロニダーゼである、請求項１～３のいずれか一つに記載の複合体。
  6. 　前記ポリエチレングリコールが分子量２～４０ ｋＤである請求項１～５の何れか一つに記載の複合体。
  7. 　前記請求項１～６のいずれか一つに記載の複合体であって、該複合体は５～３０分子が凝集して凝集体を形成している複合体。
  8. 　前記凝集体の粒子径が１００～３００ｎｍである請求項７に記載の複合体。
  9. 　請求項１～８のいずれか一つに記載の複合体を含む抗がん剤。
  10. 　抗がん剤との併用で用いられることを特徴とする請求項１～８のいずれか一つに記載の複合体。
  11. 　前記抗がん剤が、ドキソルビシン、リボソーマルドキソルビシン、エリブリン、パクリタキセル、およびゲムシタビンからなる群から選ばれる抗がん剤である請求項１０に記載の複合体。
  12. 請求項１～８のいずれか一つに記載の複合体からなる抗がん剤の抗腫瘍活性増強剤。
  13. 前記抗がん剤が、ドキソルビシン、リボソーマルドキソルビシン（ドキシル：登録商標）、エリブリン、パクリタキセル、およびゲムシタビンからなる群から選ばれる抗がん剤である請求項１２に記載の抗腫瘍活性増強剤。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011519361A (ja) * 2008-04-14 2011-07-07 ハロザイム インコーポレイテッド 修飾されたヒアルロニダーゼおよびヒアルロナン関連疾患および状態の治療における使用
WO2013089803A2 (en) * 2011-12-16 2013-06-20 Liao Benedict Schue Bromelainase ( extract of bromelain proteinases ) as chemotherapeutic agents in treating and /or preventing various types of cancer.
JP2015514109A (ja) * 2012-04-04 2015-05-18 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤と腫瘍標的タキサンの組み合わせ治療
JP2016502981A (ja) * 2012-12-17 2016-02-01 ピットニー ファーマシューティカルズ ピーティーワイ リミテッド ムチンが関与する疾患の処置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011519361A (ja) * 2008-04-14 2011-07-07 ハロザイム インコーポレイテッド 修飾されたヒアルロニダーゼおよびヒアルロナン関連疾患および状態の治療における使用
WO2013089803A2 (en) * 2011-12-16 2013-06-20 Liao Benedict Schue Bromelainase ( extract of bromelain proteinases ) as chemotherapeutic agents in treating and /or preventing various types of cancer.
JP2015514109A (ja) * 2012-04-04 2015-05-18 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤と腫瘍標的タキサンの組み合わせ治療
JP2016502981A (ja) * 2012-12-17 2016-02-01 ピットニー ファーマシューティカルズ ピーティーワイ リミテッド ムチンが関与する疾患の処置

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHATNAGAR PRIYANKA ET AL.: "Bromelain nanoparticles protect against 7,12- dimethylbenz[a] anthracene induced skin carcinogenesis in mouse model", EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICS AND BIOPHARMACEUTICS, vol. 91, 2015, pages 35 - 46, XP029147084 *
NANA SATO ET AL.: "Kanshitsuatsu no Takai Shuyo eno Koganzai Delivery o Mezashita Jiko Kaigogata Chobunshi PEG-ka Bromelain no Kochiku", PROCEEDINGS OF THE 136TH ANNUAL MEETING OF THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, vol. 136, March 2016 (2016-03-01) *
NANA SATO ET AL.: "Shuyo Shinbu eno Koganzai Delivery System no Kochiku o Mezashita Chobunshi PEG-ka Bromelain no Chosei", DAI 32 KAI THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, vol. 32, 2015, pages 101 *
SHIBATA K. ET AL.: "ACTIVITY ON CANCER CELLS AND DISTRIBUTION IN TISSUE OF ANTI-CANCER DRUGS", PROGR. ANTIMICROB. ANTICANCER CHEMOTHER., PROC. INT. CONGR. CHEMOTHER., vol. 2, 1970, pages 334 - 339 *
TAISHI HIGASHI: "PEGylation of Protein Drugs utilizing the Complexation with Cyclodextrin", GRANTS-IN-AID FOR SCIENTIFIC RESEARCH (KAGAKU KENKYUHI HOJOKIN) KENKYU SEIKA HOKOKUSHO, 30 May 2013 (2013-05-30), pages 1 *
TATSUNORI HIROTSU ET AL.: "Cyclodextrin no Chobunshi Tokusei o Riyo shita Kassei Hojigata PEG-ka Gijutsu no Kochiku", DAI 37 KAI THE ANNUAL MEETING OF THE JAPANESE SOCIETY FOR BIOMATERIALS YOKOSHU, vol. 37, 2015, pages 269 *

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