JPH03503721A - 酵素的に活性な組換えグルコセレブロシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １６、　細胞が吐乳動物細胞である請求の範囲第１４項記載の真核細胞。

１７１．　＠乳動物細胞が支那ハムスター卵巣細胞である請求の範囲第１６項記 載の真核細胞。

］８、　核酸がヒトグルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡからなる請求の 範囲第１４項記載の真核細胞。

１９、　　ＤＮＡが、グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡのプロモータ と前記グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡのＡＴＧ開始部位との間の天 然領域の少なくとも５０％を欠如する請求の範囲第１４項記載の真核細胞。

２０、　　細胞が昆虫細胞である請求の範囲第１９項記載の真核細胞。

２１、　細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第１９項記載の真核細胞。

２２、　哺乳動物細胞が支那ハムスター卵巣細胞である請求の範囲第２１項記載 の真核細胞。

２３、　核酸がｐＶＬ９４１．ＧＣＲＤ２１により生成さしる゛請求の範囲第１ ５項記載の昆虫細胞。

２４、　核酸が、天然グルコセレブロシダーゼのアミノ酸配列に対し少なくとも ９５％のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるベクター によって生成される請求の範囲第１５項記載の昆虫細胞。

２５、　核酸がｐＡｃ３７３．ＧＣＲ２，２により生成される請求の範囲第２４ 項記載の昆虫細胞。

２６、　天然グルコセレブロシダーゼが霊長動物内で天然に生ずる請求の範囲第 ２４項記載の昆虫細胞。

２７、　天然グルコセレブロシダーゼがヒトの内部で天然に生ずる請求の範囲第 ２６項記載の昆虫細胞。

２８、　グルコセレブロシダーゼが少なくとも２個の露出マンノース残塁を含む 請求の範囲第１４項記載の真核細胞。

２９、　グルコセレブロシダーゼが３〜９個のマンノース残基を有する炭水化物 成分を含む請求の範囲第２８１項記載の真核細胞。

３０、３〜９個のマンノース残基がＭａｎ３〜Ｍａｎｇ構造内に配置されてなる 請求の範囲第２９項記載の真核細胞。

３１、　請求の範囲第１５項記載の細胞からなる昆虫。

３２゜　請求の範囲第１６項記載の細胞からなる哺乳動物。

３３、　グルコセレブロシダーゼをコードする核酸を真核細胞中に導入し、 前記細胞により前記グルコセレプロシダーゼを発現させ、かつ 前記グルコセレブロシダーゼを精製することを特徴とする酵素活性の組換グルコ セレブロシダーゼの製造方法。

３４、　真核細胞が昆虫細胞である請求の範囲第３３項記載の方法。

３５、　真核細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第３３項記載の方法。

３６、　＠乳動物細胞がＣＨＯ細胞である請求の範囲第３５項記載の方法。

３７、　細胞によりグルコセレブロシダーゼを発現させる工程が、前記細胞を培 地中でインビトロにて培養することからなる請求の範囲第３３項記載の方法。

３８、　細胞によりグルコセレブロシダーゼを発現させる工程が、前記細胞をイ ンビボにて昆虫内で成長させることからなる請求の範囲第３４項記載の方法。

３９、　細胞によりグルコセレブロシダーゼを発現させる工程が、前記細胞をイ ンビボにて哺乳動物内で成長させることからなる請求の範囲第３５項記載の方法 。

４０、　グルコセレブロシダーゼを精製する工程が、前記グルコセレブロシダー ゼを培地から精製することからなる請求の範囲第３７項記載の方法。

破壊して細胞抽出物を生成させると共に前記グルコセレブロシダーゼを前記細胞 抽出物から精製することからなる請求の範囲第３３項記載の方法。

４２、　細胞がｐＧＢ２０、ｐＧＢ３７及びｐＧＢ４２よりなる群から選択され るプラスミドにより形質転換されてなる請求の範囲第１６項記載の哺乳動物細胞 。

４３、　細胞がプラスミドｐＧＢ３４とｐＧＢ２°０、ｐＧＢ３７及びｐＧＢ４ ２よりなる群から選択されるプラスミドとにより同時形質転換されてなる請求の 範囲第１６項記載の哺乳動物細胞。

４４、　培地のｐＨが約ｐＨ６，５〜ｐＨ７，２、特許請求の範囲第３７項記載 の方法。

４５、　培地のｐＨが約ｐＨ６，６〜ｐＨ６，８である請求の範囲第４４項記載 の方法。

４６、　培地が、約５０％飽和より低くかつ細胞を維持するのに充分な量の０２ を含有する請求の範囲第３７項記載の方法。

４７、　培地が、約２０％飽和−約３０％飽和の量の０２を含有する請求の範囲 第３７項記載の方法。

明　　　細　　　書 酵素活性の組換グルコセレブロシジーゼ及団卑声月 本発明は、酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼの発現に関するものである。

ゴージニー病は、糖脂質グルコセレブロシドを加水分解するりソソーム酵素グル コセレブロシダーゼ（ｒＧＣＲＪ　）の欠損を特徴とする常染色体劣性のりソン ーム貯蔵障害である。

ゴージニー病患者において、この酵素の欠損は、白血球及び老化赤血球の膜から のグルコスフィンゴリピドの分解から主として生ずる糖脂質グルコセレブロシド を主として肝臓、牌臓及び骨髄にお（ブる食細胞のりソソームに多量に蓄積させ る。

この病気の臨床的徴候は牌腫、肝腫、骨格障害、血小板減少症及び貧血を伴う。

この病気に罹患した患者に関する現在の治療は、骨癌を緩和するための沈痛剤の 投与、血液及び血小板の輸血、並びに重度の場合には牌臓切除術を含む。骨浸蝕 を受けた患者には関節置換が必要である。プラディ−［（１９６＆＞　、ニュー ・イングランド・ジャーナル・オブ・メジソン第２７５巻、第３１２頁コは、ゴ ージニー病の治療としてＧＣＲによる酵素置換治療を提案している。しかしなが ら、フルピッシュ等［（１９７８）、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサ ーチ・コミュニケーション、第８１巻、第１０４７頁］が観察したところでは、 注入されたヒト胎盤ＧＣＲは、これが活性となる部位、すなわち細網内皮系の細 胞におけるリンツームに到達せず、寧ろ、肝細胞によって吸収される。フルピッ シュ等［（１９８１）　、バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ、第６７ ３巻、第４２５頁］は、ＧＣＲをノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び β−Ｎ−アセチルへキソースアミニダーゼにより順次に処理して食細胞に対する ヒト胎盤ＧＣＲの供給を改善すると共に、処理されたＧＣＲが未処理蛋白よりも 効率的にラットのクツベル細胞により吸収されることを示した。

ソルダ等［（１９８５）　、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイ エンス・ＵＳＡ、第８２巻、第７２８９頁］及びツジ等［（１９８６）　、ジャ ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６１巻、第５０頁］は、ヒトＧＣ Ｒをコードする遺伝子のクローン化及び配列決定を記載している。

発明のヌ直 一般に本発明は、−面において、真核細胞により産生される酵素活性の組換ＧＣ Ｒを特徴とする。［組換ＧＣＲＪ（ｒｒＧｃＲＪ　）という用語は、本明細書に おいて、たとえば昆虫細胞、酵母細胞又はたとえばＣＨＯ細胞のように哺乳動物 細胞などの細胞に挿入される遺伝子処理されたＯＣＲコード核酸から産生される 任意のＧＣＲを意味するために使用される。一般に、核酸は宿主細胞につき必要 に応じ、たとえばプラスミド若しくはウィルスのようなベクター内に存在する。

たとえば昆虫細胞にて発現させるには核酸はたとえばバキュロウィルスのような 昆虫ウィルス内に存在することができる。本明細書において使用される「昆虫細 胞」という用語は任意の生存する昆虫細胞、たとえば生存する昆虫又は組織培養 物に存在する双翅目若（）くはｆａ翅目の細胞を意味する。

本明細書にで用いる「哺乳動物細胞」という用語は任意の生存する哺乳動物細胞 、たとえば生存する咄乳動物若しくは組織培養物（存在する醤歯動物細胞若しく は霊長動物細胞を意味する。「酵素活性」という用語は本明細書において組換Ｏ ＣＲに関し用いられて、ｒＧＣＲがグルコセレブロシドを加水分解しうると共に ｒＧｃＲ１ｍａ当り少なくとも１０６単位の活性にて低分子基質４−メチル−ラ ムベリフェリルーβ−Ｄ−グリコシドを開裂すうろことを意味する。

第２の面において本発明は少なくとも１個の露出マンノース残基を有する酵素活 性の組換ＧＣＲを特徴とし・、ここで（３ＣＲはヒトマンノースリセプタ蛋白に 対し特異的に結合することができる。

［少なくとも′１個の露出したマンノース残基を有するＧＣＲＪという表現は、 ＧＣＲがグリコジル化されか′つＧＣＲに結合した炭水化物基の少なくとも１個 がマンノース残基で終端した炭水化物連鎖を有することを意味する。好ましくは 、露出したマン、／−ス残基はマンノースリセプタ蛋白に対し容易に結合するこ とができ、この露出マンノースリセブタはその三次元配置においでＧ　ＣＲに対 ｔ）外側に位置する。

水防ｔｉＪｉＩＩに用語とし・で用いる「ヒトマンノースリセブタ蛋白に対し特 異的に結合しノうるＪ　ＧＣＲは、露出マンノース残基にてリセブタ蛋白により 特異的に識別されるＧＣＲである。

好適具体例において、ｒＧＣＲは霊長類ＧＣＲ１たとえばヒトＧＣＲのアミノ酸 配列に対し少なくとも９５％のホモロジーを持ったアミノ酸配列を有する。この ｒＧＣＲは少なくとも２個の露出マンノース残基を有する。ｒＧＣＲは３〜９個 のマン、！−ス残基を有する炭水化物成分を含み、好ましくはマンノース残基は Ｍａｎａ＝Ｍａｎｇ構造（Ｍａｎ３−（３１０ＮＡＣ２などと称する）に配置さ れ、リセプタ蛋白は食細胞中に天然に存在し、ざらにＧＣＲはたとえば双翅目細 胞若しくは鱗翅目細胞のような昆虫細胞、或いは酵母細胞又はたどえばＣＨＯ細 胞のように哺乳動物細胞にて産生される。

第１図は、Ｍａｎ３〜Ｍａｎ９構造に配置された３〜９個のマンノース残塁を有 する各種の炭水化物成分を例として示している。本明細書中で用いる「Ｍａｎ３ 〜ｌｖｌａｎｇ構造」という用語は、たとえば第１図に示したようなマンノース 残基及びその構造異性体の配置を意味する。

第３の面において本発明は、細胞内で発現することができ、ヒトマンノースリセ プタ蛋白と特異的に結合しうる酵素活性ｒ’　Ｇ　ＣＲをコードする遺伝子処理 された核酸を含有する真核細胞を特徴とする。

好適具体例において、核酸は天然ＯＣＲのアミノ酸配列に対し少なくとも９５％ のホモロジー、特に好ましくはたとえばヒトＧＣＲのような天然の霊長動物ＧＣ Ｒのアミノ酸配列に対し９５％のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードする ＤＮＡを持ったベクターである。

他の好適具体例において、核酸は、ＧＣＲコード配列のプロモータと遺伝子のＡ ＴＧ開始部位との間にて天然ＧＣＲ遺伝子に存在する領域の少なくとも５０％を 欠如したＤＮＡであり、より好ましくは核酸はプラスミドｐＶＬ９４１．ＧＣＲ Ｄ２１又はプラスミドｐＡｃ３７３．ＧＣＲ２−２に存在するＤＮＡであり、ざ らに細胞はこの種のプラスミドにより形質転換された昆虫細胞である。

他の好適具体例において、核酸はプラスミドｐＧＢ２０又はプラスミドｐＧＢ３ ７又はプラスミドｐＧＢ４２に存在するＤＮＡであり、ざらに細胞は哺乳動物細 胞、好ましくは支那ハムスター卵巣細胞であって、任意のこの種のプラスミドに より形質転換され或いはプラスミドｐＧＢ３４とこの種の任意のプラスミドとに より同時形質転換されたものである。

他の好適具体例において、ＯＣＲコード化核酸を含有する細胞は昆虫細胞、酵素 細胞又は哺乳動物細胞である。

関連する面において、本発明はＧＣＲコード化核酸を含有した昆虫細胞を含む生 存昆虫、或いはＧＣＲコード化核酸を含有した哺乳動物細胞を含む上記しだな生 存哺乳動物を特徴とする。

他面において本発明は、酵素活性のｒＧＣＲの製造方法を含み、この方法はｒＧ ＣＲコード化核酸を真核細胞中に導入し、この細胞によりｒＧＣＲを発現させる と共にｒＧＣＲを精製することを特徴とする。細胞により保持される発現ｒＧＣ Ｒを細胞の抽出物から精製することができ、周囲の培地中に細胞により分泌され た発現ｒＧＣＲを培地から直接に精製することができる。

好適具体例においてこの方法は、細胞をインごトロで培養し、或いは細胞をイン ビボにて生存真核生物、たとえば生存する昆虫若しくは哺乳動物にて成長させる ことを含む。

本発明は、ヒトマンノースリセプタ蛋白により特異的に識別される形態にて酵素 活性のｒＧＣＲを提供する。本発明のｒＧＣＲは、ゴーシェー病に罹患したヒト に標準的な酵素置換方式により投与するのに適する。ざらに本発明は、たとえば ヒト胎盤のような通常ＧＣＲが得られるヒト組織に一般的に存在するウィルス剤 若しくは細菌剤を含まない酵素を提供する。ざらに、本発明のｒＧＣＲは細胞か ら多量に分泌され、周囲の培地中に産生され、そこから容易に精製される。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の好適具体例の説明から一層明らかとなるで あろう。

殖産！直叢９基里 先ず最初に図面につぎ簡単に説明する。

回道 第１図は各種のｒＧＣＲのマンノース末端炭水化物成分及び典型的な複合型炭水 化物成分の略図であり、丸印はマンノース残塁を示し、黒三角印はグルコース残 基を示し、黒四角印はＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、０四角印はガラク トース残基を示し、ダイヤモンド印はＮ−アセチルノイラミン酸残基を示し、ハ ツチング三角印はフコースを示し、第２図はＯＣＲコード化領域と５′及び３′ 非コード化領域とポリヘトリン制御配列との間の各種のＧＣＲ７ＣＲ７日子クロ ーンる位置関係の略図であり、 第３図はプラスミド、すなわちプラスミドｐＧＢ９゜Ｄ２１内に挿入されたＧＣ Ｒの欠失物（５′非コード化領域が除去され、かつ３′非コード化領域の１部が 除去されている）の作成の略図であり、 第４図はプラスミドｐｖＬ９４１．ＧＣＲＤ２１の作成の略図であり、 第５図はプラスミドｐＡｃ３７３．ＧＣＲ２，２の作成の略図であり、 第６図はプラスミドｐＧＢ９．Ｄ２１Ｃ及びｐＧＢ９゜Ｄ２１Ｃ１の作成の略図 であり、 第７図はプラスミドｐＧＢ２０の作成の略図であり、第８図はプラスミドｐＧＢ ３４の作成の略図であり、第９図はプラスミドｐＧＢ３７及びｐＧＢ４２の作成 の略図である。

ルコセレブロシ　−ゼ（ＧＣＲ） 上記したように、ＯＣＲはグルコセレブロシドの加水分解を生ぜしめる酵素活性 を有する。本発明はこの種の活性を有する仝ゆる酵素を包含し、限定はしないが その例はヒト胎盤中に存在する酵素である。この酵素活性をコードする遺伝子が 上記したようにクローン化されており、そのＤＮＡ配列も公知である。本出願に おいて、本出願人はこのクローン化されたＤＮＡを用いて、ヒトにおける治療用 途に適した構造を有するｒＧＣＲを生産する例を示す。

以下、昆虫ベクター中へのヒトＧＣＲコード化ＤＮＡの挿入及び昆虫細胞による ＤＮＡの発現に関する実施例、並びに哺乳動物ベクター中へのヒトＧＣＲコード 化ＤＮＡの挿入及び哺乳動物細胞によるＤＮＡの発現に関する実施例につき説明 する。本発明はこれら実施例のみに限定されず、当業者は本発明の範囲内におい て各種の改変をなしうろことを了解す一般に、ＧＣＲ遺伝子を昆虫ウィルス内に 挿入するには、遺伝子を先ず最初に伝達ベクター、たとえば１）ＡＣ３７３に挿 入し、次いでたとえばＳＦ９細胞のような昆虫細胞に伝達ベクターを野生型ウィ ルスＤＮＡと共に同時感染させて、伝達ベクターとウィルスＤＮＡとの組換によ りＧＣＲをコードする所望の組換ウィルスを生ぜしめる。

第２図及び第５図を参照して、伝達ベクターｐＡＣ３７３（テキサス州、テキサ スＡ＆Ｍ大学、カレッジ部門におけるＭ、サンマース博士から入手）は、ポリヘ トリン制御信号の制御下で遺伝子の位置決定を可能にするＢａｍＨＩクローン化 部位を有する。たとえばバキュロウィルスのｐ１０プロモータのような他のプロ モータも本発明に適している。プラスミドｐＧＣ８−２Ｋｂは、ｐ８Ｒ３２２［ ソルダ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ。

された約１ｓｏｂｐの非コード化５′配列と５ｏｏｂｐの非コード化３′配列と を包含するＯＣＲの全てのコード化配列を含有する。このプラスミドはＥ、ボイ トラー博±［クリラプス・クリニーク・アンド・リサーチ・グアウンデーション 、ラジュラ、カリホルニア州］から得られ、この遺伝子を次のようにしてｐＡＣ ３７３中にクローン化した。プラスミドｐＧＣ３−２ＫｂをＥＣ０ＲＩで切断す ると共に、両末端を１゛４ポリメラーゼにより平滑末端化した。旦１ＬＩＩリン カを加え、２．２ＫｂのＧＣＲを含有する断片を精製した。

旦旦↓■末端はＢａｍＨＩ末端に対し適合性であり、ｐＡＣり同定した。得られ たプラスミドをｐＡｃ３７３．ＧＣＲ２，２と名付けた。

多核性多角体病ウィルス・オートグラフ？・カリホルニ力（Ａｕｔｏｇｒａｐｈ ａ　ｃａｔ　１ｆｏｒｎｉｃａ＞　　（Ａ　ＣＭ　Ｎ　Ｐ　Ｖ　）分離物Ｅ２（ テキサス州、テキサスＡ＆Ｍ大学・カレッジ部門Ａ、サンマース博士から入手） のゲノムに対するＯＣＲをコードする２、２Ｋｂ断片の伝達は、スポドプテラ・ フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）細胞ラインＳ Ｆ９　［スボドプテラ・フルギペルダＩＰＢＬ−３ｆ２１−ＡＥ細胞のクローン 分離物：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、受託番号ＣＲＬ１７ １１、テキサス州、テキサスＡ＆Ｍ大学・カレッジ部門、Ｍ、サンマース博士か ら入手］を野生型ウィルスＤＮＡと標準法により作成されたＤＡＣ３７３−ＧＣ Ｒ２，２とにより同時トランフエクトして行なった。要するに、ＳＦ９細胞を１ ０％胎児牛血清を含有するＴＮＭ−ＦＨ培地（ヒンク、ネーチャー、第２６６巻 、第４６６頁（１９７０）　］にて２７℃±１℃の温度で培養した。細胞は単層 又は懸濁物のいずれかで培養した。これら細胞を毎週約２〜３回でサブ培養した 。懸濁物で成長させる場合、フラスコ回転器を５０〜６０ｒｐｍにて撹拌した。

ＳＦ９細胞をウィルスＤＮＡでトランスフェクトし或いはウィルスＤＮＡと伝達 ベクターＤＮＡとの混合物で同時トランスフェクトする方法はブランド等［パイ ロロジー、第ｉｏｉ巻、第２８６頁（１９８０）　］及びカルステンス等［パイ ロロジー、第１０１巻、第３１１頁（１９８０）　］により記載されたグラハム 等、パイロロジー、第５２巻、第４５６頁（１９７３）の燐酸カルシウム技術の 変法とした。有するに、２５ｃ＋ｎ２のフラスコに２ｘ　’ｌ　Ｑ６個の細胞を 接種した。１〜２時間後、フラスコを吸引すると共に、１０％胎児牛血清を含有 する０、７５ｒＩｄｌのブレース培地を付着性細胞に添加した。次いで１ｔ！９ のウィルスＤＮＡ　（２ａの伝達ベクターＤＮＡを含む又は含まない）を含有す る０、７５１ｄの２５ｍ）ｉの１−１ｅ　ｐｅ　５（ｐＨ７，１＞　、１４０ｍ ＨのＮａＣｆｆ１．１２５０１８のＣａＣｊ！２を徐々に添加した。フラスコを ２７℃にて４時間培養した後、トランスフェクション混合物を除去し、１０％胎 児牛血清を含有する５ＩｎｌのＴＮＭ−ＦＨで交換した。ｐＧＣ８−２ｋｂから ２．２Ｋｂ　　ＧＣＲ断片をコードする組換ウィルスを生産するため、Ｉ　Ｘ　 １０６個の細胞を９ｃ＋ｎ２の皿に塗抹し、次いでこれら細胞を２μ３のｐＡｃ ３７３．ＧＣＲ２゜２と１メＯのオートグラフ？・カルホルニ力開成共有円形Ｄ ＮＡ（「ＣＣＣＤＮＡ」）とでトランスフェクトした。細胞を野生型ウィルスＤ ＮＡと伝達ベクターＤＮＡとで同時トランスフェクトした後、少割合の得られた 形質転換体は組換ウィルス生成し、ここでポリヘトリン遺伝子はもはや発現され ない。

これらは、トランスフェクトしてから４８時間後のトランスフェクトフラスコか ら収穫された上澄液を付着性細胞に感染させることにより生ぜしめた充分な個数 のウィルス性斑点を肉眼検査１ノで確認した。トランスフェクト上澄液を感染さ せてから゛１時間後、アガロース上層（増殖培地における１、５％の低融点ジ− プラク）を施した。４〜６日間の後、これらプレートを転倒させ、精密顕微鏡下 に゛（低角度照明光により観察して、野生型斑点を組換斑点から区別した。この 実施例において、同じ手順をトランスフェクションの４日後に行ない、ざらに培 地を集めて−・連の希釈（１０３〜１０５）を行なった。一連の希釈物（容積１ ｄ＞を用いてサブ融合細胞に感染させた（１００１ＩｌｌｌＩ［！ｌｌ′ｌにて ５ｘ１０６個）。感染後、これに細胞に低融点の寒天を重ねた。感染の６日後。

、これらプレートを組換斑点につき検査した。

適当な斑点を釣上げ、ざらに２回の斑点精製を行ない、これらを用いてウィルス 保存物を増加させた。斑点同定法の一層詳細な説明は、サンマース等により「バ キュロウィルスベクター及び昆虫細胞培養法のマニコーアル、テキサス・７グリ カルチヤル １５５５　（ｉ９８７）により与えられる。

ポリヘトリン発現の欠如を示唆する外観を持った８個の斑点を選択し、ざらに斑 点を精製した。３種の斑点（３−１−１、３−２−１、３−３−１と称する）か らのウィルスをさらに増殖させると共に、これら３種の分離物を感染させた細胞 をＧＣＲ発現につき分析した。

次の分析を行なって、充分な酵素活性を有する充分なｒＧＣＲが選択クローンに より産生されることを確認した。

第１に、別々に上記３種の分離物を感染させた付着性細胞の細胞溶解物を作成し 、これらをＯＣＲ−特異性ＤＮＡ配列の存在につき分析（）た。細胞を０．５Ｍ のＮａＯＨに溶解させ、溶解物をＩＯＭのＮＨ４ＡＣで中和すると共に、溶液を ドツト−プロット装＠（ビオラド社）によりトニロセルロース中に通過させた。

ニトロセルロースシートを標準ＤＮＡハイブリッド化法にしたがって処理し、ｐ Ｇｃｓ−２Ｋｂからの２、２Ｋｂ　　ＧＣＲ断片（Ｐ３２−標識）で検査した。

ウィルス分離物３−２−１及び３−３−１を感染させた細胞はＯＣＲ配列を含有 したのに対し、３−Ｌ−１を感染させた細胞及び野生型ウィルスを感染させた細 胞はＧＣＲ配列を含有しなかった。ＯＣＲコード化配列配列ードするこの種の１ クローンの構造を第２図に示し、ここでＯ　Ｃ　Ｒコード化Ｄ　Ｎ　Ａは部分欠 失（、、・たポリヘトリン遺伝子内に挿入される。

２種の分析を用いて、組換ヒトグルコセレブロシダーゼの酵素活性を測定すると 共に定量化した。感染してから３日後、これら細胞を５０＋ｎＨ燐酸ナトリウム （ｐＩ（　６．９８　）　／１％デオキシコレートで溶解させ、これら溶解物を 酵素分析に用いた。

第１の分析は低分子＠基質４ーメチルーウムベリフエリル−β−グリコシド（４ ＭＵ−Ｇｌｃ）の加水分解に基づいている。数種の他のグルコシダーゼもこの基 質を切断して蛍光性アグリコンを低ｐＨかつタウロコレート（数種の他の非特異 性グルコシダーゼの阻止剤）の存在下で遊離しうるが、この分析はｒＧＣＲの発 現レベルを決定するのに有用である。この発現を、野生型ウィルスが感染された ＳＦ９細胞における４ＭＵ−Ｇ　ｌ　ｃ活性のレベルと比較した。この分析は、 実質的にスズキによりメソッツ・エンチモロジー、第１３８巻、第１４９頁（１ ９８７）に記載されたように、０．１５％のトリトンＸ−１００及び０．１２５ ％のタウロコレートを含有する１　００ｍ）ｌ燐酸カリウム緩衝液にてＤＨ５， ９で行なった。少なくとも１０６Ｕ／ｍｇの活性を有するｒＧＣＲが本発明に有 用である。

グルコセレブロシド−特異性分析につき、［Ｃ１４］−グルコセレブロシド［ブ ラディー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２４０巻、第３９ 頁（１９６５）　］を用いた。

酵素調製物をこの放射性基質と共に培養した後、混合物を５％ＴＣＡで沈澱させ た。上澄液中に残留するグルコース［Ｃ１４−放射性］の量は、グルコセレブロ シダーゼ活性の直接的測定値を与える。

分離物３−１−１を感染させた細胞から得られた溶解物は放射性基質によるバッ クグランドレベルよりも高い活性を示さなかったのに対し、３−２−１及び３− ３−１を感染させた細胞からの溶解物は相当な活性を示した。

ＳＦ９細胞により発現されるＧＣＲの量を測定すべく、免疫学的分析をも行なっ た。一般に、この分析は次の手順を含んだ。２４−穴プレートにて、細胞を５Ｘ １０５個の細胞／ウェル１個の密度で接種した。細胞を１０倍の感染倍率にて感 染させ、かつ感染してから３日後に培地を収穫し、ざらにこれら細胞を緩衝液［ ｉｏｍｓのトリス（ｐＨ７，２＞　、１５０＋ｎＨのＮａＣ４２，５ｍＨのＥＤ ＴＡ、１０％のＤＯＣ，０，１％のトリトンｘ−ｉｏｏ、０．１％のＳＤＳ及び ０．０２％のＮａＮ３］に溶解させた。ＧＣＲをポリクローナルウサギ抗体によ り免疫沈澱させ、沈澱した蛋白を５Ｏ８−ＰＡＧＥにかけた。電気泳動の後、蛋 白をニトロセルロースに移し、かつ得られたウェスタンプロットを同じ抗体で試 験した。結合した抗体の量を、ビオチニル化蛋白Ａ及びアルカリホスファターゼ 結合ストレプトアビジンにより測定した。既知量のヒト胎盤由来のＯＣＲと比較 することにより、両舌性分離物につき１０６個の細胞は約２〜４馬のｒＧＣＲを 産生したことが推定された。

Ｘ置皿−２：ｍ　虫べ’ｙ　ター、Ｉ）ＶＬ９４１．ＧＣＲＤ２１昆虫細胞にお けるＧＣＲ遺伝子の発現を最適化させるため、遺伝子における５′及び３′末端 から過剰の非コード化配列を除去した。ＧＣＲの発現に対する配列−若しくは間 隔−関連のマイナス作用を最小化させるには、ＯＣＲの開始コドンをポリヘトリ ン遺伝子制御配列にできるだけ近く配置すべきである。この過程は、ＧＣＲ遺伝 子の３′及び５′末端におけるメツセージ不安定化配列を最小化させ或いは除去 する。

この目的で第２図、第３図及び第４図を参照して、ＢｇＩｎ部位により規定され た欠失誘導体ＧＣＲ，Ｄ２１を支持するプラスミドｐＧＢ９．Ｄ２１　（第３図 ）を作成した。ＯＣＲ遺伝子を有するこのＢｇｌ　■カセットは５′末端に５個 の塩基を有すると共に、クローン化（旦旦ユ■）末端とＧＣＲコード化配列配列 間の３′末端に２９０個の塩基を有し、これはである。ｐＧＢ９．Ｄ２１の段階 的作成を第３図に要約する。

要するに、ＧＣＲＣＤＮＡクローン、すなわちｐＧＣ３−２ＫｂをＳａＣ工によ りＧＣＲコード化配列配列′末端から約２９０個の塩基対にて切断し、ざらにこ れら端部をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。ＥＣ０ＲＩによる ＧＣＲの５′末端から得られた約１６０ｂｐの第２の切断物は、ＧＣＲコード化 配列配列する２、Ｏｋｂの断片を与えた。

この断片を精製し、かつＨｉ　ｎｃＩＩ及びＥＣ０ＲＩ切断ｐＧＢ３に結合させ てｐＧＢ９を作成した。ＳａＣ工及びロット　ＳＫ＋　（ストラタジーン、う・ ジヨウ、カリホルニア州）からイー・コリプラスミドｐＧＢ３を作成した。得ら れたプラスミドｐＧＢ３は、その複数クローン化部位の各末ＥＣ０ＲＩ及び次い でエキソヌクレアーゼ■及びインゲン豆ヌクレアーゼで切断して、Ｂｇｌ　Ｉ［ 部位とＧＣＲコード化配列配列′末端との間にて過剰の５′非コ一ド化配列を除 去した。この処理の後、これら末端を再結合させる共に、これらプラスミドを用 いてイー・コリＸＬ−１ブルーを形質転換させた。これら形質転換体を制限分析 によりスクリーニングし、次いでＤＮＡ配列決定を用いて欠失の長さを決定した 。この方法を用いて、Ｂｇｌ　ＩＩ部位とＧＣＲの開始コドンとの間に５ｂｐの みを有するｐＧＢ９．Ｄ２１を同定した。

次いで、縮小したＧＣＲ−コード化断片ＯＣＲ，Ｄ２１を、第４図に示すように 伝達ベクターｐｖＬ９４１中にクローン化させた。伝達ベクターＩＬ９４１　［ テキサスＡ＆Ｍ大学、カレッジ部門、テキサス州、Ｍ、サンマース博士から入手 ］は、ポリヘトリン制御信号の制御下で遺伝子を位置決定するための３ａｍＨＩ クローン化部位を有するので、ｐＡＣ３７３と極めて類似している。これら２種 のベクター間の主たる相違点は、ｐＡＣ３７３のポリヘトリン制御配列がポリヘ トリン翻訳開始コドンに対し位置−８までしか延在しないのに対し、ｐＶＬ９４ １においてはポリヘトリン遺伝子の全５′非コ一ド化制御配列が存在することに ある。この相違点は、制御配列の制御下に置かれた遺伝子の発現増加をもたらし うる。

ＡＣＭＮＰＶゲノムへの一６〜＋１８５０領域（第２図参照）にわたるＧＣＲｃ ＤＮＡ断片の移動は、ＳＦ９細胞を野生型ウィルスＤＮＡとＤＶＬ９４１．ＧＣ ＲＤ２１とにより同時トランスフェクトして行なった。組換体、すなわち非ポリ へドリンコード化ウィルスから生じたウィルス斑点の同時トランスフェクション 及びその後の分離につき行なった手順は、ｐＡｃ３７３．ＧＣＲ２，２につき上 記した通りある。この組換ウィルスを感染させると、細胞はポリクローナル抗〜 ＯＣＲ抗体と交差反応する物質をもたらし、この物質は４−ＭｔＪ−グルコシド 及びＩＣ”］グルコシルセレブロシド分析により測定して酵素活性を有した。

生細胞におけるｒＧＣＲの産生 有用とするのに充分な量でｒＧＣＲを産生させるため、非感染昆虫細胞を増殖さ せ、次いで標準的手順により上記組換ウィルスの１種を感染させると共に、得ら れた蛋白を次のように精製する。ＳＦ９細胞を付着的に或いは懸濁培養にて遠心 分離フラスコ中で成長させ、たとえばベルコ５００ｄフラスコを５５０−６Ｏｒ ｐで操作する。培地はたとえばＴＮＭ−ＦＨ［ヒンク、ネーチャー、第２６６巻 、第４６６頁（１９７０）　］とし、これに１０％胎児牛血清を補充した。５Ｆ ９Ｉｉ！胞は、トランバー等［アニュアル・ＮＹ・アカデミ−・サイエンス、第 ４６９巻、第２７９頁（１９８６）　］により記載されたように、胎児牛血清濃 度を低下させるのに適する。或いは、これら細胞をたとえばロジー（よりナチュ ールビッセンシャッフエン、第６９巻、第９２頁（ｔ９８２）＆：、、記載され たように血清フリーの培地中で増殖させることができ、或いはマイクロカプセル 内に包封した昆虫細胞を高細胞密度まで増殖させると共に、大規模の昆虫細胞培 養をたとえばキング等によりバイオテクノロジー・レタース、第１０巻、第６８ ３頁（１９８８）に記載されたように容易化させることができる。

昆虫細胞に−Ｘ−産生されたｒＧＣＲの■ｉＦ″Ｇ　ＣＲを、組換ウィルスが感 染されたＳＦ９細胞の培地から次のように精製した。感染してから３日後、培地 （ｒＧＣＲを含有する）を、細胞懸濁物の遠心分離（ツルバールＲＣ３にて１５ 分間の２０００ｒｐｍ　）により細胞から分離した。

遠心分離復、培地をブチル置換マトリックス、たとえばＴＳＫ−ゲル、トヨバー ルブチル６５０Ｃ［ネストグループ、サウスボロー、マサチューセッツ州コにお ける疎水性クロマトグラフィーにかけた。２５ＩＩｄｌのカラム（１，６ｘ　１ ２ｃ＋ｎ）が、少なくとも５００ｄの培地につき充分である。このカラムを２０ ％エチレングリコールを含有する５０ｍＨクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５，０）で洗 浄し、各フラクションを２０〜８０％のエチレングリコール濃度勾配で溶出させ た。これらフラクションを集め、上記の４ＭＵ−グルコシド分析によりＧＣＲ活 性につき分析した。典型的な実験において、８５％の回収率が得られた。次いで 、部分精製されたＧＣＲをフェニル置換マトリックス、たとえばＴＳＫ−ゲル、 トヨバールフェニル６５０Ｓ　［ネストグループ、サウスボロー、マサチューセ ッツ州］にて第２の疎水性クロマトグラフィ一工程にかけた。ＧＣＲ溶液を５０ ｍ）！クエン酸塩（ｐＨ５゜Ｏ）、２０％エチレングリコールとなし、これを同 じ緩衝剤で平衡化させたカラムに充填した。これら条件下で、ＧＣＲはフェニル 置換マトリックスに吸着された。

次いで、カラムを５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５，０）で洗浄して、エチレングリ コールを除去した。次いで、ＯＣＲを０〜５０％のエタノール濃度勾配（５０ｍ ＭクエンＭ塩中）で溶出させ、上記のように回収した。この手順は、実質的に他 の蛋白を含まないＧＣＲｍ製物を与えた。次いで、得られたＧＣＲを下記するよ う（オリゴ糖構造分析にかけた。

■里に盃見仝漫ぶＲの発現 全昆虫にてｒＧＣＲの発現を得るため、モエダ等の手順（（１９８５）　、ネー チャー・、第３１５巻、第５９２頁］を用いることができる。要するに、ｒＧＣ Ｒをコードする組換３０　ｍｌ）　Ｖ　Ｘ　　ｉｎ　Ｏｒ　！−核多角体病ウイ ルス＜ＢｒｎＮＰＶ）を生ぜしめた。培養細胞から細胞外ウィルスとして得られ たこの組換ウィルスを用いて、蚕の体腔中へ注射することにより蚕幼虫に感染さ せた。ｒＧ　ＣＲ蛋白を血り〕／パから回収した。或いは、ＢｍＮＰＶは寿命、 複製方式、ポリヘトリン産生及びＤＮＡボモロジーに関しオートグラフ？・カリ ホル：力多核性多角体病ウィルスと同様なバキュロウィルスであるため、ＧＣＲ ｉ伝子を有する組換ＡＣＭＮＰＶを用いて同様な手順を使用することができる。

感染した培養ＳＦ９細胞から回収された組換ウィルスを用いて、このウィルスを 昆虫中へ注射することにより、たとえばスボドプテラ・フルギベルダ（Ｓｐｏｄ ｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）又はトリコブルシア・ニー（Ｔｒｉｃ ｈｏｐｌｔ＋ｓｉａ　ｒｉｉ　）の幼虫のような許容しうる昆虫に感染させた。

組換ウィルスを感染昆虫で複製させ、この昆虫は次いでポリヘトリンの代りにｒ ＧＣＲを産生する。適当な期間の後、組換蛋白を昆虫から回収する。

他の方法に８いては、ｒＧＣＲをコードするウィルスを経口投与して昆虫（感染 させることができる。ＡＣＭＮＰＶの感染性はその標的細胞並びにウィルス種類 に依存する。多角性多角体病ウィルスは、細胞外ウィルス及び吸蔵ウィルスとし て知られた２つの形態で生ずる。後者は感染の後期に産生され、多面体内に封入 された複数のウィルス粒子で構成される。多面体は大型の蛋白質構造を有し、主 たる構造のウィルスコードされた蛋白ポリヘトリンの付着により感染細胞の核内 に形成され、したがって多数のウィルス粒子を埋蔵する。

細胞若しくは昆虫が死滅した後、これら多面体は経口投与する際に感染性を維持 する。埋蔵多面体の加水分解による経口感染した昆虫の牛腸で放出されるウィル ス粒子は、牛腸細胞（感染することができる。次いで、昆虫における他の器官の 二次的感染が生ずる。多面体埋蔵された吸蔵ウィルス粒子は食餌摂取物に混合す ると多数の昆虫に感染させる有効な方法となる。組換吸蔵ウィルスを生ぜり、め る手順は、エメリー等（１９８７）　、プロティン・エンジニアリング、第１巻 、第３５９頁に記載されている。要するに、ポリへトランプロモータとこのプロ モータの下流に６けるＧＣＲ遺伝子とをコードする断片を、ポリヘトリン及びそ のプロモータをコードするＡｃＭＮＰＶ　　ＤＮＡ制限断片を有するプラスミド にクローン化させると共に、遺伝子における充分な配列５′及び３′を同時トラ ンスフェクションの俊に組換させる。このプラスミドにおけるクローン化部位は 、そのプラスミドに存在する天然ポリへドリンプＯモータの上流に位置する（た だし反対方向である）。したがって、得られた伝達ベクターは正常なポリヘトリ ン遺伝子とＧＣＲ遺伝子との両者を有し、これらはそれぞれポリヘトリン転写メ カニズムに関するそれ自身のコピーを有する。このベクターと感染性のポリヘト リン陰性ＡＣＭＮＰＶ　　ＤＮＡによるスポドプテラ・フルギペルダ細胞の同時 トランスフェクションは、ポリヘトリンとＧＣＲとの両者をコードする組換ウィ ルスをもたらす。かくして、２種類のこの組換ウィルスを得ることができる。昆 虫の幼虫に経口感染させるには、上記したように吸蔵型が有用である。

哺乳動物細胞におけるＧＣＲ発 組換ＧＣＲ遺伝子カセットの最適化 哺乳動物細胞におけるＯＣＲの発現を最適化させるため、ざらにＯＣＲ遺伝子を 有するＧＣＲ，Ｄ２１　　ＢｇｌＩＩカセットを改変させた。一般に第６図を参 照して、改変はオリゴヌクレオチド指向の突然変異［一般にクンケル（１９８６ ）　、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第８ ２巻、第４８８〜４９２頁；ワンプ等、バイオロジ−クス、第７巻、第１０００ 〜１ｏｉｏ頁（１９８９）に記載］を用いて行ない、ＧＣＲ翻訳開始部位に近い ヌクレオチド配列を変化させて、哺乳動物細胞にあける最適翻訳のための共通配 列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）に一致させ［コザック（１９８６）　、セル、第４４ 巻、第２８３〜２９２頁に記載］、ざらにＧＣＲＤ２１Ｃ停止コドンの過剰の配 列３′を欠失させた。過剰の３′配列の欠失は潜在的なメツセージ不安定化配列 を除去すると共に、ビシストロニツタ（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ　）ベクターか らのＧＣＲに対するＤＨＦＲ発現の調節を可能にする。

ベクター作成 ＣＩ−（０細胞に関するビシス１〜ロニツクｇｃｒ−ｄｈｆｒ発現ベクターをベ クターｐＳＶ２−ｄｈｆｒから第７図に示したように作成した［スブラマニ等（ １９８１）　、モレキュラ・アンド・セルラー・バイオロジー、第９巻、第８５ ４〜８６４頁に記載］。このベクターｐＧＢ２０は、ＳＶ４０早期プロモータの 制御下にてｇｃｒ、Ｄ２１Ｃとそれに続＜　ｄ　ｈ　ｆ　ｒとを含有した。ＤＨ ＦＲ発現は、ｇｃｒを翻訳した後にｄｈｆｒを翻訳するリポソームに依存し、こ れはｄｈｆｒメツセージの５′末端に隣接位置する。このビシストロニツタ配置 は、ＧＣＲに関するＤＨＦＲの発現レベルを低下させた。得られるＤＨＦＲに関 するＧＣＲ発現の増加は、安定な形質転換体をメソトレキセートを用いて選択し た後に実現することができる。

次の特性を有する第２の一連のビシストロニックｇｃｒ発現ベクターを作成した ：　（１＞ＳＶ４０エンハンサ−アデノ・ウィルス主俊期プロモータ（Ａｄ　　 ＭＬＰ＞組合せ物により促進されるｇｃｒの転写；　（２）ｄｈｆｒによるビシ ストロニツタ配置における（ＪＣｒの転写：　（］ＳＶ４０からの停止及びポリ アデニル化信号：及び（４）原核オリジンとアンピシリン耐性遺伝子とを有する が哺乳動物細胞にて悪影響がおる「毒」配列を欠如したＤＮＡの最小２ｋｂ断片 ［ラスキー及びボッチャン（１９８１）　、ネーチャー、第２９３巻、第７９〜 ８１頁］。

基礎ベクターｐＧＢ３４を第８図に示したようにｐｓＶ２ｄｈｆｒから作成した 。第１工程において、最終ベクターにおける発現に悪影響を及ぼしつるｐｖｕ［ 部位とＭａｅＩＩ部位との間の「毒」配列を除去した。得られたプラスミドは、 Ｆ　ｏ　ｋ、　Ｉ部位とＥＣＯＲ１部位との間にて最小断片（２ｋｂ）内に５ｖ ４０エンハンサ−（７２ｂｐ反復）　とｐＢＲ３２２複製オリジンとアンピシリ ン耐性コード遺伝子（ｂ　ｌ　ａ）とを有する。第２工程において、２ｋｂ　　 ＦｏｋＩ−ＥｃｏＲＩ断片ｔＡｄ−ＭＬＦ及びｄｈｆｒ遺伝子とＳＶ４０ポリア デニル化信号とを有するｐＤＨＦＲＩＩＩからの断片［ベルフナ−及びシャープ （１９８５）　、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、第１３巻、第８４１〜８ ５７頁に記載］からの断片と組合せた。ポリアデニル化部位とｐＢＲ３２２配列 との間の過剰の配列を除去すると共に、ＰＳｔＩクローン化部位を３ａｍ−ＨＩ クリンカを用いる標準的手順によりＢａｍＨＩまで変化させた。得られた作成物 ｐＧＢ３４は、哺乳動物細胞における組換蛋白の効率的産生に必要とされる配置 を越えた極めて小ざい配列を有する。第９図に示すように、ＣＨＯ細胞にてＧＣ Ｒを発現させるべく、ｇｃｒ、Ｄ２１Ｃ若しくはｇｃｒ。

Ｄ２１Ｃ１（第６図に示す）のいずれかを用いて、このベクターの改変体を作成 した。作成物は種々異なるレベルにてＤＨＦＲを発現し、したがってＤ　ＨＦ　 Ｒの選択及びＧＣＲ発現の相対的増幅を調節する。これらの作成物自身をビシス トロニツタ増幅性ｇｃｒ発現ベクターとして使用することができる。或いは、ｐ Ｇ８３４を用いる同時トランスフェクションの一層広範に使用される方式を用い ることもできる。

哺乳動物細胞のトランスフェクション 哺乳動物細胞中にベクターＤＮＡを導入するには、数種の方法を用いることがで き、燐酸カルシウムトランスフェクション及びエレクトロポレーション［一般に Ｆ、Ｍ、アウスベル等編（１９８９）　、カレント・プロトコールス・イン・モ レキュラ・バイオロジー、第９．１．１−９．ｉ、４頁及び９．３．１−９、３ ．２頁、ウィリー＆サンズ社、ニューヨークに記載］、リポフエクチン（登録商 標）トランスフェクション［製造業者、ベセスダ・リサーチ・ラボラドリース社 、ガイセルスブルク、ミズーリー州により記載］、原形質融合［たとえばサンド リーゴルジン等（１９８１）　、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１巻、 第７４３〜７５２頁に記載］、又はポリブレントランスフェクションを包含する 。組換コロニーの選択は、リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとを欠 如するが透析された胎児牛血清を含有する培地にて細胞を培養することにより行 なわれる。

増幅 ｒＧＣＲの発現を増大させるため、これら細胞をＦ、Ｍ。

アウスベル等編（１９８９）　、カレント・プロトコールレス・イン・モレキュ ラ・バイオロジー、第９．９．１−９．９．６頁、ウィリー＆サンズ社、ニュー ヨークに記載されたと同様な増幅法にかけることができ、この方法はＲ，Ｊ、カ ウフマン等（１９８２）ジャーナル・セルラ・モレキュラ・バイオロジー、第１ ５９巻、第６０１〜６２１頁に記載された方法と同様である。一般に、より高レ ベルの発現がより高レベルのメソトレキセート耐性から生ずる。ｄｈｆｒ遺伝子 の代りに他の増幅しうる遺伝子を用いて、他の増幅法を利用することもできる。

その例はオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子 など、並びにその組合せであって、当業者に知られている。これらの例について はＲ，Ｊ。カウフマン、Ｊ、セットロウ！　（１９８９）　、ジエネチック・エ ンジニアリング、第９巻、第１５５〜１９８頁、ブレナム・プレス社、ニコーヨ ークを参照することができる。他の遺伝子を用いて増幅を得るには、上ａａベク ターにおけるｄｈｆｒ遺伝子の代りに選択された遺伝子、たとえばオルニヂンデ 力ルポキシラーゼ遺伝子又はアＹノシンデアミナー・ゼ遺伝子を用い、この種の ベクターで１−ランスフエフｌ−１ノだ後に適当な選択培地を用いて増幅を得る ことができる。

９逝 支那ハムスター卵巣細胞で発現さ１１、た組換ＧＣＲの酵素活性を、４−メヂル ーウムベリフＩリルーβ−Ｄ−グリフシトを基質どしで用いるごと〔二より測定 り、た。この基質の酵素加水分解４Ｊ蛍光性の生成物を発生し２、これを分光蛍 光測定計により定量化しＡ、　（３＜、二の方法の詳細はメソッズ・オグ・エン チし［１ジー、第り巻、第４７８〜４７９頁（’１９７８）に記載され゛ている 。この分析は、伯の非−ＧＣＲグルＴＪシダージー性か部分的に、すなわら燐酸 塩緩衝液（ｐＨ５，９＞、０．１２５％タウ１−コニコレート・、０．１５％１ −リｌ−ンＸ−１００を用いで阻止される条イ１−下で行なわれる。

組換Ｇ　ＣＲの存在を確認する他の方法は、ヒト・胎盤から精製されたグルニコ セ１．ノブ［１ジグ−・ゼの作成１こ対し・ウリーギで生成；ｙれた・トリク０ −ナル抗体を用いることで６５る。ＧＣＲ生産細胞からの培地又は細胞溶解物を ５Ｏ８−ボ１−）ｌｉ７り１−ノルアミドゲル電気泳動にかけることができ、次 いで蛋白をゲルからニトロセルロースに移す。ニトロセルロース上のｒＧＣＲの 存在は抗体で試験して確認され、これはごオチニル化蛋白Ａ−アルカリホスファ ターゼ結合ストレプトアビジン技術を用いて或いはビオチニル化ヤギ−抗−ウサ ギ■ｇＧ抗体−アルカリホスフ７ターゼ結合ストレプトアじジン、或いはニドク ロセルロース上の抗体を検出するための他の任意の標準法を用いで検出される。

この種の方法の詳細は、たとえばＥ、バーロー及びＤ２レイン編、アンチボディ ース・ラボラトリ−・マ′ニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ ［ヘリー社、−１−ヨーク（１９８８）に記載されている。

ＣＨＯ細明によりｒ’　Ｇ　ＣＲの産生を決定する他のｔｉ法は、インどボ（ご て成長細胞を［Ｓ３Ｊメチオニンで標革し、次いで培地を回収づると共に細胞を ／ことえば５０ｍＨのクエン酸塩（ｒｉＨ６，５）と１％のコリン酸す１・１ノ ウムとを含有する緩衝液中１こ標識後の所定［持間間隔で溶解させることである 。次いで、溶解物と培地とを、標準法Ｖ、よりポリクローナル抗体を用いて免疫 沈澱させる。このポリクロ−ナル抗体はたとえば抗血清の形態な７ビδ種の形態 で使用することができ、或いは蛋白△−アガＩ］−・ス呑しくは蛍白Ｇ−アガロ ースで精製することができ、或いはグルコセ１ノブＵシダーゼが固定化されてい るマ゛トリック、ストニで親和性精製することもできる。高純度の抗体は−・般 に低いバックグランド信号をもたらす。或いは、ＧＣＲじ対リ−るモノ′クロー ナル抗体を用いろごと香、）できる９゜こ行ら検出法の例（６表、たとえばＥ、 バー・口・−及びり。レーｔン編、７ンチーボテ７゛イース・ラボラド・ツー・ マニュアル、下−７−ルド・スプリング・ハーバルー−ラボラトリ・−社、ニコ ーヨーク（１９８８）　（、、’：記載されている。

こわ、らの検出法は、ＣＨＯ細胞におε°ｊるｒＧＣＲの発現を示した。典型的 な試験において、上記ベクターの１種でトランスフェクトさせた細胞はビシス１ −口Ｓ、ツタ法又は同時トランスフェクト、３ン法のいずれかを用いてｒＣ３Ｃ ；Ｒを１〜１０ｍｇ７／２の範囲のレベルＣ発現し、これは細胞密度、培養条件 及び細胞支持７１−リツクスと共に変化する。ｒ　Ｇ　ＣＲは細胞内と培地中と の両者に見られる。細胞内ｒ　Ｇ　ＣＲ，はエンドグルコサミニダーゼＨとエン ドグルフサミニダーゼＦとの両者に感受性であり、蛋白上の炭水化物連鎖がいわ ゆる高マンノース型でおると思われることを示し、Ｌノたがって細胞内ｒ　Ｇ　 ＣＲは下記するようにゴージニー病の処置に特に有用でおる。培地から回収され たｒＧＣＲはより分子量が大であり、エンドグルコサミニダーゼＨに対し耐性で ある。

ｒＧＣＲの炭水化物構造 上記したように産生されたｒＧＣＲがゴージニー病の治療に有用となるよう正確 にグリ］シル化されたかどうかを決定するため、次の手順を行なって炭水化物構 造、特にｒＧＣＲの炭化化物構造におけるマンノース配置を決定した。一般に、 炭水化物は少なくとも１個の露出したマンノースを有し、好ま］ツクはＭａｎ３ 〜Ｍａｎ９ＨＡ造、′ｇなわら１ｖｉａｒＬ３〜Ｍａｎｇ＠、’告を有する炭水 化物と同じ機能的特徴を有する構造を有する筈である（たとえば他の糖残基を１ 種若しくはそれ以上の図示した糖残基の代り（二相いることができる）。一般に 、じト胎盤ＯＣＲには４個のオリゴ糖成分が存在する。

Ｍａｎ３〜Ｍａｎｇ構造に存在するこれら成分を持った組換Ｇ　ＣＲは、ヒトに あけるマンノースリセプタにつき非グリコジル化ＯＣＲよりも大きい親和性を有 する。オリゴ糖成分１個当りマンノース残基が多くなりかつこの種の成分が多く なる程、この親和性も大となる。本発明による組換Ｇ　ＣＲは少なくとも１個の 露出マンノースを有するこの種の少なくとも１種のオリゴ糖を有するが、好まし くは２個、３個若しくは４個のそれぞれＭａｎ３〜Ｍａｎｇ構造を持ったこの種 のオリゴ糖を有する。

ｒＧＣＲから得られたオリゴ糖の分析は、一般にじラニ等［アナリチカル・バイ オケミストリー、第１６２巻、第４８５頁（１９８７）　］により記載された方 法にしたがう。ＡＳｎ−結合したオリゴ糖を５ＤＳ−変性ｒＧＣＲ（１００ＩＩ ！ｊ＞　カら遊離させ、その際Ｎ−グリカ太−ゼ酵素（８０単位）と共に３７℃ にて１８時間培養した。反応の完結は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動により判定した。遊離したオリゴ糖を、エタノール（７５％Ｖ／Ｖ　）により 蛋白を沈澱させた後に上澄液中で回収し、ナトリウムボロトリタイドでの処理に より還元末端にて放射能標識り、た。標識されたオリゴ糖を高性能液体クロマト グラフィー（ｈｐｌｃ）とエキソグリコシダーゼ切断との組合せにより分析した 。

シアリル化の程度は、２５ｍＨのＫｌ−（２ＰＯ４で予備平衡化されたマイクロ バックＡ　Ｘ−１０カラムでのｈｐｌｃ［よりトリチウム標識されたオリゴ糖を 分析して決定し、燐酸によりｐＨ４，０まで滴定した。高いシアリル酸含有量を 有するＧＣＲは本発明に有用でないと思われるが、低いシアリル酸含有量を有す るＯＣＲ（すなわち未添加のＧＣＲ）は露出されたマンノース成分を有すると思 われる。カラムを同じ緩衝液により１５分間溶出させ、次いで２５ｍＨのＫＨ２ ＰＯａ　　（ｐＨ４，０）から５００ｍＨのに８２　ＰＯａ　　（ｐＨ４，０＞ （１）ｍＷに至る１１Ｊ状ｍ度勾配を用いて３０分間溶出させた。この溶出過程 において、特徴的位置におけるカラムからオリゴ糖が付着シアリル酸残基の個数 に応じ溶出された。組換ＧＣＲから得られたＡ　ｓ　ｎ−結合オリゴ糖は主とし て（９５％）の中性物質で構成された。

この種の中性物質は本発明に極めて有用である。

それぞれ中性及び（又は）脱シアリル化オリゴ糖の寸法を、マイクロバックＡＸ −５カラムを用いるｈｐｌｃにより分析した。カラムをアセトニトリル：水（６ ５：３５）で予備平衡化させ、次いで溶剤の水含有量が０．５％／ｍｉｎの速度 で増加する６０分間の濃度勾配を用いて溶出を行なった。この手順は、寸法に応 じてオリゴ糖を分別した。カラムは、下記する構造を持ったオリゴ糖標準により 検定した。感染ＳＦ９細胞から得られたｒＧＣＲからのオリゴ糖の分析は、これ らがＭａｎ３　Ｇ　Ｉ　０ＮＡＣ（ＦＬＪＣ）Ｇ　ｌ　ｃＮＡｃｏ−Ｔ−と同様 な保持時間を有する単一物質よりなることを示した：露出したマンノース基の存 在はこれらオリゴ糖をマンノシダーゼで処理して容易に決定され、このマンノシ ダーゼはマンノース基を特異的に除去する。この処理及び結果の分析は常法によ り行なわれる。

ｒＧＣＲの有用性を決定する他の方法においては、ｒＧＣＲが大食細胞に結合し てこれにより吸収される能力を測定する。大食細胞に対するｒＧＣＨのこの標的 はＭａｎ／Ｇｌ　ｃＮＡｃリセプタにより媒介され、シュタール等、ジャーナル ・セルラー・バイオロジー、第９３巻、第４９頁（１９８２）　］により記載さ れたようにマウスから得られたチオグリコレート−誘導の腹腔的大食細胞を用い て決定することができる。

要するに、マウス（体重２５〜３０Ｑ　、　Ｃ５７種）に１〜１．５威のチオグ リコレート７０ス［ディフコ社、デトロイト、ミシガン州１を腹腔的注射する。

３〜４日後、マウスをＣＯ２で窒息させて殺し、腹腔内を燐酸塩緩衝塩水で洗浄 する。細胞を遠心分離（ｓｏｏｇ、１０分間）によりペレッ１〜化させ、１０％ 胎児牛血清を含有するＤＭＥ　［ギブコ社、グランド・アイランド、ニューヨー ク州］に再懸濁させると共に、９６穴の組織培養プレートに塗抹する。、９０分 間後、非付着性細胞を洗浄除去し、かつ付着性大食細胞を０〜１８０分間の範囲 の特定時間にわたり２００成中０〜２０１！９の範囲の特定量のｒＧＣＲを含有 する培地にて３７℃の温度で酵母マンナン（２〜１０ｍｇ／ｍｌ　）の不存在下 及び存在下で培養する。培養後、過剰のｒＧＣＲを含有する培地を取出し、細胞 を数回洗浄し、次いで溶解させ、ざらに細胞により吸収されたｒＧｃＲの量を細 胞溶解物で決定する。酵母マンナンの存在下に吸収される量は非特異的吸収であ る。２種の数値間の差は、Ｍａｎ／Ｇｌ　ｃＮＡｃリセブタを介し特異的に吸収 される量である。実験を４℃で行なった場合には吸収が起こらず、ｒ　Ｇ　ＣＲ は細胞表面に結合する。このようにして、ＧＣＲのＭａｎ／ＧＩ　ＣＮＡＣリセ プター特異性結合を決定することができる。

使用 本発明のｒＧＣＲは、治療量のｒＧＣＲを与えることによリゴーシエー病の治療 に有用である。治療量という用語は、ゴージニー病の臨床的徴候を顕著に緩和さ せるｒＧＣＲの量を意味する。この種のｒＧＣＲは上記したように後に翻訳改変 させて、ヒトマンノースリセプタを標的とする炭水化物構造を与えねばならない 。一般に、この種のｒＧＣＲはそれぞれＭａｎ３〜Ｍａｎ９構造を有する少なく とも２個の炭水化物成分を有し、この種のｒＧＣＲは治療組成物で与えられるｒ ＧＣＲの少なくとも５０％を示す。たとえば、体重７０に！Ｊの患者につき毎月 １０〜５００ｍｇを投与して、この患者に１年間にわたり０．２５〜３ｇのｒＧ ＣＲを投与する。ｒＧＣＲは任意の標準的な医薬上許容しうるキャリヤ（たとえ ば生理食塩水）における医薬組成物として投与され、たとえば静脈内注射により 常法で投与される。

奇逓 プラスミドｐＶＬ９４１．ＧＣＲＤ２１を有するイー・コリ菌株（ＤＨ５α）は アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに対し１９８８年１２月２２日 付けで寄託され、ＡＴＣＣ受託番号６７、８６６が付与された。プラスミドｐＧ Ｂ４２を有するイー・コリ菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ンに対し１９８９年１２月２１日付けで寄託され、ＡＴＣＣ受託番号が付与され た。

本出願人であるゲンチーム・コーポレーション社は特許期間の終了前に死滅した 場合にはこれら培養物をその最後の要求があってから５年間又は３０年間のいず れか長い方の期間にわたり交換する義務を有し、ざらにこの寄託物を第三者に一 方的に提供しうる時点につきこの特許出願の発行に関する寄託を通知する義務を 負う。この時点まで、寄託物は米国特許法３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，Ｎ（１１〜１４及び 米国特許法３５Ｕ、Ｓ、Ｃ。

Ｎｏ１１２の規定に基づき特許庁に入手することができる。

他の実ｉ態様 請求の範囲には他の実施態様も含まれる。たとえば、適する炭水化物構造を有す るｒＧＣＲは、ＧＣＲコード用ＤＮＡを任意のを推動物または無を推動物の真核 細胞に導入しかつこの細胞をその成長期間中に炭水化物処理の阻止剤、たとえば デオキシ−マンノジリマイシン、スエインソニン、カスタノスペルミン、デオキ シ−ノジリマイシン、Ｎ−メチルーデオギジーノジリマイシン又はその均等阻止 剤で処理することにより産生させることができる。これら阻止剤はＧ　Ｉ　ｃ３ 　Ｍａｎ９　Ｇ　Ｉ　ＣＮＡＣ２から小型物質への図示し、た変換（二際し特定 工程を阻止するよう作用し、かくして多数の露出マンノース残基を与える。

ＦＩＧ、４ ｇｃｒＤ２１ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ。８ Ｆ　Ｉ　Ｇ、９−２ Ｖ４０ Ｖ４０ ざ９Ａ 手続宇甫正書（方式） 平成３年５月２９日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 事件の表示　　ＰＣＴ／ＵＳ８９１０５８０１発明の名称　　酵素活性の組換グ ルコセレブロシダーゼ補正をする者 事件との関係　　　　　　　　　特許出願人名　称　　ジェンザイム　コーボレ イション住　所　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．真核細胞により産生される酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼ。
2. ２．昆虫細胞により産生される請求の範囲第１項記載のグルコセレブロシダーゼ 。
3. ３．哺乳動物細胞により産生される請求の範囲第１項記載のグルコセレブロシダ ーゼ。
4. ４．支那ハムスター卵巣細胞により産生される請求の範囲第３項記載のグルコセ レブロシダーゼ。
5. ５．少なくとも１個の露出マンノース残基を含み、ヒトマンノースリセブタ蛋白 と結合しうる酵素活性のグルコセレブロシダーゼ。
6. ６．グルコセレブロシダーゼが霊長動物グルコセレブロシダーゼのアミノの酸配 列に対し少なくとも９５％のホモロジーを持ったアミノ酸配列を有する請求の範 囲第項１又は第５項記載の酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼ。
7. ７．霊長動物グルコセレブロシダーゼがヒトグルコセレブロシダーゼである請求 の範囲第６項記載の酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼ。
8. ８．少なくとも２個の露出マンノース残基を含む請求の範囲第５項記載の酵素活 性の組換グルコセレブロシダーゼ。
9. ９．３〜９個の露出マンノース残塁を有する炭水化物部分を含む請求の範囲第８ 項記載の酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼ。
10. １０．３〜９個のマンノース残基がＭａｎ３〜Ｍａｎ９構造内に配置されてなる 請求の範囲第９項記載の酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼ。
11. １１．リセブタ蛋白が、食細胞中に天然に存在するヒトマンノースリセブタ蛋白 である請求の範囲第５項記載の酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼ。
12. １２．グルコセレブロシダーゼが昆虫細胞内で産生される請求の範囲第５項記載 の酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼ。
13. １３．グルコセレブロシダーゼが哺乳動物細胞内で産生される請求の範囲第５項 記載の酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼ。
14. １４．グルコセレブロシダーゼがヒトマンノースリセブタ蛋白と特異的に結合し うることを特徴とする酵素活性の組換グルコセレブロシダーゼをコードする核酸 を含む真核細胞。
15. １５．細胞が昆虫細胞である請求の範囲第１４項記載の真核細胞。
16. １６．細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第１４項記載の真核細胞。
17. １７．哺乳動物細胞が支那ハムスター卵巣細胞である請求の範囲第１６項記載の 真核細胞。
18. １８．核酸がヒトグルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡからなる請求の範 囲第１４項記載の真核細胞。
19. １９．ＤＮＡが、グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡのブロモ−タと前 記グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡのＡＴＧ開始部位との間の天然領 域の少なくとも５０％を欠如する請求の範囲第１４項記載の真核細胞。
20. ２０．細胞が昆虫細胞である請求の範囲第１９項記載の真核細胞。
21. ２１．細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第１９項記載の真核細胞。
22. ２２．哺乳動物細胞が支那ハムスター卵巣細胞である請求の範囲第２１項記載の 真核細胞。
23. ２３．核酸がＰＶＬ９４１．ＧＣＲＤ２１により生成される請求の範囲第１５項 記載の昆虫細胞。
24. ２４．核酸が、天然グルコセレブロシダーゼのアミノ酸配列に対し少なくとも９ ５％のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるベクターに よって生成される請求の範囲第１５項記載の昆虫細胞。
25. ２５．核酸がＰＡＣ３７３．ＧＣＲ２．２により生成される請求の範囲第２４項 記載の昆虫細胞。
26. ２６．天然グルコセレブロシダーゼが霊長動物内で天然に生ずる請求の範囲第２ ４項記載の昆虫細胞。
27. ２７．天然グルコセレブロシダーゼがヒトの内部で天然に生ずる請求の範囲第２ ６項記載の昆虫細胞。
28. ２８．グルコセレブロシダーゼが少なくとも２個の露出マンノース残基を含む請 求の範囲第１４項記載の真核細胞。
29. ２９．グルコセレブロシダーゼが３〜９個のマンノース残基を有する炭水化物成 分を含む請求の範囲第２８項記載の真核細胞。
30. ３０．３〜９個のマンノース残基がＭａｎ３〜Ｍａｎ９構造内に配置されてなる 請求の範囲第２９項記載の真核細胞。
31. ３１．請求の範囲第１５項記載の細胞からなる昆虫。
32. ３２．請求の範囲第１６項記載の細胞からなる哺乳動物。
33. ３３．グルコセレブロシダーゼをコードする核酸を真核細胞中に導入し、 前記細胞により前記グルコセレブロシダーゼを発現させ、かつ 前記グルコセレブロシダーゼを精製することを特徴とする酵素活性の組換グルコ セレブロシダーゼの製造方法。
34. ３４．真核細胞が昆虫細胞である請求の範囲第３３項記載の方法。
35. ３５．真核細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第３３項記載の方法。
36. ３６．哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である請求の範囲第３５項記載の方法。
37. ３７．細胞によりグルコセレブロシダーゼを発現させる工程が、前記細胞を培地 中でインビトロにて培養することからなる請求の範囲第３３項記載の方法。
38. ３８．細胞によりグルコセレブロシダーゼを発現させる工程が、前記細胞をイン ビボにて昆虫内で成長させることからなる請求の範囲第３４項記載の方法。
39. ３９．細胞によりグルコセレブロシダーゼを発現させる工程が、前記細胞をイン ビボにて哺乳動物内で成長させることからなる請求の範囲第３５項記載の方法。
40. ４０．グルコセレブロシダーゼを精製する工程が、前記グルコセレブロシダーゼ を培地から精製することからなる請求の範囲第３７項記載の方法。
41. ４１．グルコセレブロシダーゼを精製する工程が、細胞を破壊して細胞抽出物を 生成させると共に前記グルコセレブロシダーゼを前記細胞抽出物から精製するこ とからなる請求の範囲第３３項記載の方法。
42. ４２．細胞がｐＧＢ２０、ＰＧＢ３７及びＰＧＢ４２よりなる群から選択される プラスミドにより形質転換されてなる請求の範囲第１６項記載の哺乳動物細胞。
43. ４３．細胞がプラスミドｐＧＢ３４とｐＧＢ２０、ＰＧＢ３７及びｐＧＢ４２よ りなる群から選択されるプラスミドとにより同時形質転換されてなる請求の範囲 第１６項記載の哺乳動物細胞。
44. ４４．培地のｐＨが約ｐＨ６．５〜ｐＨ７．２である請求の範囲第３７項記載の 方法。
45. ４５．培地のｐＨが約ｐＨ６．６〜ｐＨ６．８である請求の範囲第４４項記載の 方法。
46. ４６．培地が、約５０％飽和より低くかつ細胞を維持するのに充分な量のＯ２を 含有する請求の範囲第３７項記載の方法。
47. ４７．培地が、約２０％飽和〜約３０％飽和の量のＯ２を含有する請求の範囲第 ３７項記載の方法。