CN1643140A - 生长因子和蛋白酶的组合 - Google Patents

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Abstract

一种将胞外基质降解蛋白酶和与上皮细胞功能相关的生长因子组合在一起，而所述生长因子不会被所述蛋白酶降解的组合物。优选地，所述蛋白酶为纤溶酶/纤溶酶原或相关酶，而生长因子为KGF或相关因子。该组合将上皮再形成过程或痊愈过程所必要的两个独立但协同作用的功能，即刺激上皮细胞增殖/分化和通过清除胞外基质组分而促进其迁移的两个功能结合起来。该组合可以多种方式构建，并且可用于治疗创伤或者任何其它涉及上皮起源的细胞或所述生长因子可能影响的任何其它细胞类型的病症。

Description

生长因子和蛋白酶的组合
背景
本发明涉及组合物，其包含为促进动物或人类损伤愈合的目的通过混合两种组分：(1)包含与上皮细胞功能相关的生长因子；和(2)胞外基质降解蛋白酶而形成的组合。这两种组分可以在给予待治疗受试者之前预组合，或者以相继的方式给予受试者。更具体地，本发明涉及角质形成细胞生长因子(″KGF″)与纤溶酶、纤溶酶原、纤溶酶原激活剂或其功能上的生物学等同体(equivalent)的组合，该组合用于治疗涉及上皮起源的细胞或者KGF可能影响的其它细胞类型的损伤。另外，本发明涉及试剂盒，其具有带生长因子的容器以及带胞外基质降解蛋白酶的容器。各容器的内含物可以处于载体溶液(例如水、缓冲液、盐溶液、增稠剂、乳剂或软膏)之中，或者与载体溶液一起冻干置于第三容器内，以备用户重建组分。本发明进一步的目标是利用试剂盒的组分用于创伤愈合的目的。例如，混合试剂盒的组分并置于损伤处，或者将试剂盒中单个组分以前后或相继的次序置于损伤处。备选地，可以购买或制造试剂盒的组分或生物学等同体，并随所述的方法用于促进创伤愈合的目的。
上皮细胞占人体所有细胞的三分之一。皮肤中的上皮细胞被称之为角质形成细胞。上皮细胞也见于嘴、鼻腔、胃肠道、阴道及其它器官或组织如肺和角膜的表衬。涉及上皮细胞的损伤或创伤以许多不同的形式发生，包括切伤、烧伤和溃疡。它们可能是急性或慢性的。实例包括压迫性溃疡、静脉淤积溃疡、糖尿病足疡、十二指肠溃疡、溃疡性结肠炎、口蹄溃疡、角膜溃疡。不痊愈及慢痊愈的创伤称之为慢性创伤。口或肠粘膜形式的慢性创伤在接受化疗的癌症患者中频繁发生。它们是主要的健康议题，且由于人口老化愈加如此。
内皮细胞是人体中另一个大的细胞群。它们构成所有血管的表衬。70kg成人脉管系统排布有～1,000m2内皮细胞。在老龄人群中，与心脏病、中风相关的血管损伤以及更低的末端局部缺血是最重要的医学议题之一。涉及大血管的心脏病可用某些手术操作治疗，例如血管成形术和旁路手术。然而，对于涉及小血管的疾病状况，尚无有效的治疗。最近，发展了有前景的新的这些血管病的治疗方法，即治疗性血管生成，它包括递送促进新血管形成的血管生成生长因子。由L-精氨酸和血管生成生长因子组成的治疗混合物在美国专利No.6,239,172中公布，用于治疗内皮机能障碍相关病，其全部内容特此并入作为参考。
在建立组织结构和完整性以及维持其正常功能中，胞外基质是为细胞提供支持和锚定的重要纤维基质。其组分包括胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan)、透明质酸以及弹性蛋白。在创伤的情况下，受损组织内或表面的由血纤蛋白纤维形成的血块构成了另一种基质组分。在创伤愈合或正常组织生长期间，为使细胞穿过该基质迁移，迁移细胞周围的基质降解是必需的。尽管不希望被理论束缚，已知有许多酶参与该降解过程，包括胶原酶、金属蛋白酶以及纤溶酶。存在复杂的系统调节这些酶的活性。它们中有许多是作为无活性的酶原由细胞产生的，需要例如由另一种酶激活才具有功能。这些酶中有些在细胞表面具有受体，从而限制其在细胞附近的活性。
KGF是成纤维细胞生长因子(″FGF″)家族的成员，并且也已知称之为成纤维细胞生长因子-7(″FGF-7″)(Werner，Cytokine & GrowthFactor Reviews 9：153-165，1998)。该家族的成员已其结合肝素(heparin)的能力为特征，在介导生长因子及其受体之间的相互作用中起着关键作用(Schlessiger等，Cell 83：357-360，1995)。FGF家族原型aFGF(FGF-1)和bFGF(FGF-2)已被广泛研究。KGF于1989年首次分离(Rubin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：802-806(1989))。随后，克隆了KGF基因并且在细菌中表达了KGF。Finch等，Science 245，752-755(1989)；Ron等，J.Biol.Chem.268：2984-2988(1993)；Rubin等，美国专利No.5,741,642。独特之处在于它是由间质起源的细胞产生的，但主要地作用于上皮起源的细胞。KGF刺激上皮细胞的增殖和分化(Aaronson等，Annals of the New York Academy of Sciences 638，62-77，1991)。
成熟KGF是163个氨基酸的多肽。结构和诱变研究已证明肝素和受体结合结构域位于接近分子中央的部分。包括残基23-144的KGF片段(Δ23 KGF-R144Q)保留了原始的生物学活性连同提高的热稳定性(Osslund等，Protein Science 7：1681-1690(1998))。美国专利No.5,677,278(“′278专利”)公开了截短的角质形成细胞生长因子片段(Δ23KGF或缺失N-端头23个氨基酸的KGF)，其与成熟全长角质形成细胞生长因子相比，促有丝分裂活性表现出至少2-倍的提高。′278专利还涉及截短的KGF与毒素分子的缀合物，用于治疗上皮过度增生病。而且，′278专利涉及含截短的KGF和药学上可接受的载体的治疗组合物，以及其用于创伤愈合目的的用途。′278的全部内容特此并入作为参考。
存在四类FGF受体(″FGFR″)，FGFR1-FGFR4。已经鉴定了多种FGFR同工型。虽然aFGF与所有四类FGFR都结合，但已知KGF仅与FGFR2 IIIb同工型结合。KGF在皮肤创伤中高度表达。已在损伤后的膀胱和肾脏中以及在炎性肠病观察到增加的KGF表达。与其它生长因子不同，KGF在愈合期间持续高水平表达(Werner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6896-6900，1992)。动物研究证明向创伤局部施用KGF加速愈合(Staiano-Coico等，J.Exp.Med.178：865-878(1993)；Pierce等，J.Exp.Med.179：831-840(1994)；Wu等，Arch.Surg.131：660-666(1996))。在实验诱导的大肠炎中已证明系统给药KGF减轻损伤。在置于辐射和/或化疗的动物中，KGF也保护上皮细胞。此外，糖皮质激素治疗已知延迟创伤愈合，可抑制KGF表达。用于控释递送肽及生长因子的组合物和装置的用途已在美国专利No.6,187,330(“′330专利”)中公开。′330专利专利的发明可用于局部递送血管生成碱性成纤维细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子，并且其全部内容特此并入作为参考。
在美国专利No.5,965,530(′530专利”)中，证明KGF作用于其它类型的细胞，并且其全部内容特此并入作为参考。根据动物中深入的体内研究，现已发现KGF刺激除角质形成细胞之外的多种类型细胞增殖、生长和分化。对KGF体内生物学效应的这种较好的理解能够更广地利用该多肽作为治疗剂，适当地配制为药物组合物，用于特异性地治疗折磨或影响组织和器官例如真皮附件、肝、肺及胃肠道的疾病状态和医学病情。除了上皮起源的细胞，最近证明KGF作用于微血管内皮细胞，但并非来自大血管如大动脉的那些细胞。它刺激微血管内皮细胞的趋化性和增殖，并在大鼠角膜中诱发血管生成。Gillis等，Journal of Cell Science 112：2049-2057(1999)。
最近鉴定了与KGF相似的生长因子，命名为FGF-10或KGF-2(Yamasaki等，Journal of Biological Chemistry 271：15918-19521(1996)；Beer等，Oncogene.15：2211-2218(1997)；Igarashi等，Journal ofBiological Chemistry.273：13230-13235(1998)；Jimenez和Rampy，Journal of Surgical Research.81：238-242(1999))。它处于同一个FGF家族，并与KGF享有54％的氨基酸同一性。它也主要作用于上皮细胞。不过，与KGF不同，FGF-10也与FGFR1结合，并且更牢固地与肝素结合。FGF-10似乎不如KGF那样高度在皮肤创伤中表达，尽管发现局部施用FGF-10促进愈合过程。
除了KGF和FGF-10，存在能够刺激上皮细胞的其它生长因子。这些生长因子包括表皮生长因子(″EGF″)、肝细胞生长因子(″HGF″)、转化生长因子-α(″TGF-α″)、胰岛素样生长因子I(″IGF-I″)以及酸性成纤维细胞生长因子(″aFGF″)。不过，这些生长因子也作用于其它类型的细胞例如成纤维细胞、肝细胞和肌细胞。
上皮细胞的迁移，同许多其它细胞一样，被认为与尿激酶纤溶酶原激活剂(″uPA″)及其受体(″uPAR″)的表达密切相关(Morioka等，J.Invest.Dermatol.88：418-423，1987；Romer等，J.Invest.Dermatol.102：519-522，1994)。uPAR的作用是使uPA介导的血纤蛋白溶解或蛋白水解集中于细胞表面。uPAR与单链的失活uPA或scuPA结合，然后它转变为活性两链uPA。已证明KGF提高上皮细胞中uPA的表达(Tsuboi等，J.Invest.Dermatol.101：49-53，1993；Zheng等，EuropeanJournal of Cell Biology 69：128-134，1996)。uPA将纤溶酶原转变为纤溶酶。纤溶酶原是90 kDa的糖蛋白，并且包括5个kringle结构域和一个蛋白酶结构域。激活通过在单肽键(Arg 561-Val 562)处切割纤溶酶原发生。两条链在激活后仍以二硫键交联在一起。纤溶酶原通过纤溶酶原结合位点结合于细胞表面，然后它很容易被uPAR-结合的uPA激活。组织纤溶酶原激活剂(tPA)也激活纤溶酶原，但不具有细胞表面受体，并且需要结合到血纤蛋白上取得最佳的酶活。缺失头4个或所有5个kringle结构域的纤溶酶原被称之为小-纤溶酶原或微-纤溶酶原。它们作为纤溶酶原可被类似地激活。Komorowicz等，Biochemistry37：9112-9118(1998)。
纤溶酶/纤溶酶原是血纤蛋白溶解的关键酶(Collen，Thrombosisand Haemostasis 82：259-270，1999)。它负责降解血纤蛋白凝块及其它胞外基质组分，但它也参与金属蛋白酶和生长因子例如TGF-β的激活。除了uPA和tPA，纤溶酶原也可被其它酶激活，包括链激酶、葡萄球菌激酶以及普通吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂。最近的研究证明纤溶酶对创伤愈合至关重要。纤溶酶原基因敲除小鼠作为血纤蛋白过度沉积的结果表现出延迟的皮肤创伤愈合，这依次防止角质形成细胞迁移(Romer等，Nature Medicine 2：287-292，1996)。如果这些小鼠中纤维蛋白原基因也缺失，则创伤愈合能力得以拯救(Bugge等，Cell 87：709-19，1996)。在动脉和角膜损伤的愈合中也观察到纤溶酶的重要性(Carmeliet等，Circulation 96：3180-91(1997)；Kao等，InvestigativeOphthalmology & Visual Science 39：502-508(1998))。在慢性静脉胫溃疡中，已观察到纤溶酶缺陷(Hoffman等，J.Invest.Dermatol.111：1140-4，1998)。此外，uPA和/或tPA基因缺失作为血纤蛋白过度沉积的结果也导致延迟的创伤愈合(Bugge等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：5899-5904(1996)；Heymans等，Nature Medicine.5：1135-1142(1999))。纤溶酶已被用作治疗创伤的局部制剂，并且也平价为可注射治疗血栓症。
血管生成的起始步骤包括内皮细胞的迁移，并且也涉及胞外基质的蛋白水解降解。uPA和uPAR的表达在迁移的内皮细胞中上调(Carmeliet和Collen，Trends in Cardiovascular Medicine 7：271-281，1997)。尽管不希望被理论束缚，纤溶酶原激活剂和纤溶酶原引发在血管生成中起重要作用的蛋白酶级联反应。利用基因敲除小鼠的研究证明uPA-缺陷型小鼠表现出受损的血管再形成，即使是在用已知的血管生成生长因子血管内皮生长因子(VEGF)治疗后(Heymans等，NatureMedicine.5：1135-1142，1999)。
除了纤溶酶/纤溶酶原，存在其它可能参与血纤蛋白降解的酶。一种此类酶是金属蛋白酶(MMP)，其具有20个成员。MMP-12和-14已知降解血纤蛋白。纤溶酶原缺陷小鼠中的创伤愈合严重延迟，但创伤最终痊愈。相反，如果对这些小鼠施用广谱MMP抑制剂(如galardin)，则创伤愈合被完全终止(Lund等，EMBO J.，18，4645-4656，1999)。MMP-14对血纤蛋白的降解也参与内皮细胞的迁移(Hiraoka等，Cell，95，365-377，1998)。
凝血酶抑制剂和重组纤溶酶原激活剂的用途已被用于调节创伤愈合过程的产品。例如，美国专利No.6,174,855公开了使用凝血酶抑制剂生产用于调节体内创伤愈合过程的产品，尤其是抑制或预防血纤蛋白相关的粘附和/或疤痕组织形成，以及用于调节体内创伤愈合过程的产品，包括多糖(如壳聚糖)和基于肽的低分子量凝血酶抑制剂，并且其全部内容特此并入作为参考。另外，美国专利No.6,033,664(“′664专利”)公开了利用非细菌纤溶酶原激活剂生产局部医药制品，用以治疗缓慢或不痊愈的创伤。另外，′664专利涉及包括生理学上可接受的载体和有效量的非细菌纤溶酶原激活剂的组合物，其中排除tPA，并将其全部内容特此并入作为参考。
尽管存在所有的这些进展，仍急需能够有效治疗涉及上皮起源的细胞的损伤的制剂。如早先所陈述的，现有技术教导损伤可用多种蛋白来源的生长因子或蛋白生长因子的混合物治疗。另外，现有技术教导缓慢痊愈的损伤可用蛋白水解酶治疗。组合使用蛋白生长因子和蛋白水解酶辅助创伤愈合是违反直觉的，即使蛋白生长因子和酶的功能似乎是令人称赞的。这种推理最明显的理由是蛋白水解酶行使水解(消化)蛋白的能力。因而，对本领域普通技术人员而言，蛋白生长因子(如KGF)和消化蛋白的酶(如纤溶酶原)的组合作为创伤愈合的疗法最初似乎是起反作用的。然而，本发明提供了这样的结果，它表明了通过生长因子和蛋白水解酶组合的协同效应。尤其期望此类组合制剂得以生产并基于其在体内条件下复杂的相互作用加以利用。
概述
本发明的一个实施方案涉及包含通过混合两组分形成的组合物：(1)与上皮细胞功能相关的生长因子；和(2)胞外基质降解蛋白酶，用以在受试者例如包括人类的动物的损伤中促进创伤愈合的目的。两组分可在给予受试者前“预混”，或者两组分可相继给予受试者。更具体地，本发明涉及使用酸性成纤维细胞生长因子(成纤维细胞生长因子-1)、角质形成细胞生长因子(成纤维细胞生长因子-7)、角质形成细胞生长因子-2(成纤维细胞生长因子-10)、表皮生长因子、转移生长因子-α、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子或这些生长因子中任一功能上的生物学等同体联合纤溶酶/纤溶酶原、小纤溶酶/小纤溶酶原、微纤溶酶/微纤溶酶原、尿激酶纤溶酶原激活剂、组织纤溶酶原激活剂、链激酶或这些激活剂功能上的生物学等同体和/或用于促进动物或人类损伤愈合的目的的蛋白酶。
本发明的另一个实施方案涉及装有生长因子容器和胞外基质降解蛋白酶容器的试剂盒。各容器的内含物可以处于载体溶液中(例如水、缓冲液、生理盐水、增稠剂、乳剂或膏剂)，或者与载体溶液在第三容器中冻干，以备用户重建组分。混合试剂盒的组分并置于动物或人类的损伤处，用于促进创伤愈合的目的。备选地，试剂盒的个别组分可以前后或相继的次序置于损伤处。
本发明另一实施方案涉及通过使用与上皮细胞功能相关的生长因子与胞外基质降解蛋白酶组合治疗动物或人类损伤的方法。该方法涉及使用本文所述的试剂盒或其单独组分。例如，混合试剂盒的组分，并置于损伤处，或者可将试剂盒的单独组分以前后或相继的次序置于损伤处。备选地，可以购买或制造试剂盒的组分或生物学等同体，并以所述的方法用于促进创伤愈合的目的。
附图的简短说明
图1.用多种蛋白酶处理KGF。KGF(1.74μM)用多种蛋白酶以所示的浓度于37℃处理1小时，然后置于凝胶电泳。蛋白用考马斯亮蓝染色。凝胶图像利用NIH image 1.62分析。显示了凝胶泳道的扫描特征。KGF及其切割片段(～16kDa)分别以闭合和开口的箭头表示。所示分子量范围内的蛋白酶条带用星号表示。标准的分子量(kDa)显示在顶部。电泳方向以实心箭表示。
图2.胰蛋白酶、纤溶酶和胰凝乳蛋白酶在KGF上的切割位点。通过～16kDa切割片段(见表1)的N-端序列分析鉴定的切割位点以箭头表示。成熟KGF(163个氨基酸)的氨基酸自N-端起连续编号。
图3.用胰蛋白酶或纤溶酶以多种酶浓度消化KGF和FGF-10。KGF(1.74μM)或FGF-10(1.74μM)用胰蛋白酶或纤溶酶以多种浓度消化。电泳和蛋白染色与图1相同。KGF及其切割片段(dN23KGF)的OD大小与FGF-10及其切割片段(～16kDa)的一起显示。
3a)KGF和纤溶酶；
3b)KGF和胰蛋白酶；
3c)FGF-10和纤溶酶；以及
3d)FGF-10和胰蛋白酶。
图4.胰蛋白酶或纤溶酶对KGF延长的消化。电泳和蛋白染色与图1相同。
4a)KGF(1.74μM)用胰蛋白酶(1380nM)或纤溶酶(960nM)消化。在于37℃温育后1小时或6小时取样。显示了胰蛋白酶或纤溶酶处理后KGF(对照没有酶处理)及其切割片段(dN23KGF)的OD大小；和
4b)KGF(1.74μM)用纤溶酶(2400nM)消化。在于37℃温育后30分钟或3小时取样。显示了切割片段(dN23KGF)的OD大小。
图5.细胞增殖测定。KGF用胰蛋白酶、纤溶酶或胰凝乳蛋白酶在与图1相同的条件下处理，除了各酶的酶浓度高2倍。反应混合物与FBS混合，并于含0.5％FBS的EMEM中稀释，之后施加给Balb/MK细胞。在于37℃温育48小时后，添加MTT染料。另外温育4小时后添加细胞裂解液。细胞在湿室中保持过夜，之后测量570nm的OD。
图6.在血纤蛋白凝胶和角质形成细胞介导的血纤蛋白溶解中，KGF和纤溶酶原(″Plg″)组合对角质形成细胞迁移和增殖的影响。
6a)将细胞种植到24孔板的血纤蛋白凝胶上(1000细胞/孔)，然后用KGF、纤溶酶原或其组合处理。在于37℃温育5天后，到达并粘附于板表面的细胞在胰蛋白酶消化后用血球计数器计数；和
6b)在24孔板的由或未由KGF预处理(37℃3小时)的Balb/MK细胞(5000细胞/孔)上形成有或无纤溶酶原的血纤蛋白凝胶。于37℃温育3小时后，从各孔取出残余的血纤蛋白凝胶连同培养基，并在10,000g离心5分钟。通过BCA测定确定上清中可溶蛋白的浓度。
图7.创伤液对KGF的切割。KGF用在术后2天或4天从完整厚度的猪皮收集的创伤液在存在或不存在bdelin时处理。通过凝胶电泳分离并转移到Immobilon-P膜上的蛋白用抗-KGF抗体探测。
7a)10μl反应体积中在术后2天或4天收集的创伤液(5μl)对KGF的切割；和
7b)12.5μl反应体积中多种量的Bdelin抑制4天创伤液(5μl)对KGF的切割。标准分子量(kDa)示于顶部。电泳方向以实心箭标示。
图8.纤溶酶对天然KGF的切割。从小鼠成纤维细胞系929细胞中分离的天然KGF用纤溶酶连同重组人类KGF一起处理。处理后，通过凝胶电泳分离蛋白，转移到Immobilon-P膜上，并用兔抗-KGF C-末端抗体探测。重组KGF及其切割片段(dN23KGF；～16kDa)分别以闭合和开口的箭头标示，而天然KGF及其切割片段(～16kDa)分别以闭合和开口的箭标示。标准分子量(kDa)示于顶部。电泳方向以实心箭标示。
优选实施方案的详细说明
缩写：
下列缩写将在文中使用：aFGF，酸性成纤维细胞生长因子；Arg，精氨酸；BCA，bicinchoninic acid；bFGF，碱性成纤维细胞生长因子；CMC，羧甲基纤维素；dN23KGF，缺失N-端头23各氨基酸的KGF分子；EGF；表皮生长因子；FGF，成纤维细胞生长因子；HGF，肝细胞生长因子；IGF-I，胰岛素样生长因子I；KGF，角质形成细胞生长因子；Ser，丝氨酸；tPA，组织纤溶酶原激活剂；转化生长因子-α(TGF-α)；转化生长因子-β(TGF-β)；uPA，尿激酶纤溶酶原激活剂；uPAR，纤溶酶原激活剂受体。
术语：
术语“创伤”是指组织和器官完整性的外部或内部的任何破坏。它也与术语“损伤”互换使用。创伤可能涉及许多不同类型的细胞，包括上皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞，以及多种免疫细胞例如巨噬细胞。涉及上皮起源的细胞的损伤包括那些处于皮肤、粘膜表面、口腔、消化道、眼睛或肺中或其表面的损伤。
术语“重组蛋白”是指在原核或真核系统中由携带编码该蛋白的合适的表达载体产生的蛋白或蛋白的活性部分。编码蛋白的DNA序列可以是合成的，或者利用本领域众所周知的分子生物学技术由细胞mRNA克隆的。
术语“核酸表达载体”是指任何类型的基因构建体，包含编码能够转录的RNA的核酸。术语“表达载体”也可与之互换使用。
如本文所用的，术语生长因子、胞外基质降解蛋白酶或纤溶酶原激活剂“功能上的生物学等同体”，是天然具有或者被改造包含不同的氨基酸序列，而同时与野生型生长因子、酶或酶激活剂相比又具有相似或改善的生物学活性的多肽。
术语“载体”是指将核酸递送到细胞或生物体内的任何介质。实例包括质粒载体、病毒载体、脂质体或阳离子脂质。
术语“切割”是指将分子切开或拆分为两个或多个片段，可能(possibility)是至少一个片段是不能再被切开的稳定产物，如用给定技术所检测的那样，并且可能保留全部或多数与该分子相关的原始活性。
术语“降解”是指将分子切开或拆分为用给定技术不可检测的小片段。
术语“相关酶”是指在功能、特异性、结构上与另一个有关的酶，或者是相同酶级联反应中的一部分。
术语“相关生长因子”是指在功能或结构上与另一个有关的生长因子。
分子生物学技术包括那些用于核酸和蛋白分子分离、纯化、生产、分析、修饰和操纵的技术。重组DNA技术是指那些用于分离、纯化和操纵DNA序列的技术。这些技术在Current Protocols of MolecularBiology(Ausubel等编辑，vol.1-4，John Wiley & Sons)以及MolecularCloning(Sambrook J等，vol.1-3，第二版，1989，Cold Spring HarborPress)中有充分描述。这些技术的实例包括核酸或蛋白的分离和纯化、逆转录、PCR(聚合酶链式反应)、体外诱变、限制性酶切、克隆到多种(质粒)载体中、转染、转化以及原核(细菌)或真核细胞(酵母、昆虫或哺乳动物)中的蛋白表达。
虽然现有技术教导创伤或损伤可用蛋白水解酶或蛋白生长因子独立治疗，但同时使用两者最初似乎是不合直觉的，即使蛋白生长因子和酶的功能似乎是令人称赞的。这种推理最明显的理由是蛋白水解酶行使水解(消化)蛋白的能力。因而，对本领域普通技术人员而言，蛋白生长因子(如KGF)和消化蛋白的酶(如纤溶酶)的组合作为创伤愈合的疗法最初似乎是起反作用的，达不到目标的。然而，本发明提供了这样的结果，它表明了通过生长因子和蛋白水解酶组合的协同效应。尤其期望此类组合制剂得以生产并基于其在体内条件下复杂的相互作用加以利用。
发现人类KGF在N-端Arg23-Ser24键处可由纤溶酶或胰蛋白酶切割，并且所得的片段dN23KGF(缺失N-端头23个氨基酸的KGF)是稳定的、抵抗酶消化的。需要注意的是用胰蛋白酶时，只有高酶浓度导致dN23KGF轻微降解。此外，uPA和tPA，其将纤溶酶原转变为纤溶酶，对KGF没有作用。同样重要的是，dN23KGF仍然具有与完整KGF一样的活性。由胰凝乳蛋白酶去除另外两个氨基酸产生dN25KGF(缺失N-端头25个氨基酸的KGF)，具有降低的生物学活性。这些结果与以前通过重组DNA技术对KGF的功能结构域分析一致，即，可去除KGF N-末端直到氨基酸23(精氨酸)而不丧失任何生物学活性(Ron等，J.Biol.Chem.268，2984-2988(1993)；Osslund等，Protein Science 7，1681-1690(1998))。纤溶酶在精氨酸或赖氨酸残基处切割蛋白，而且因为根据其一级序列(即它具有10个精氨酸和17个赖氨酸残基)，KGF中存在许多潜在的纤溶酶切割位点，在Arg23特定位点切割产生稳定的活性片段(dN23KGF)是出乎预料的。
也发现KGF被创伤液中的纤溶酶切割，并且从成纤维细胞中分离的天然KGF也被纤溶酶切割，产生具有与由重组KGF获得的dN23KGF相同大小的C-末端片段。此外，纤溶酶原和KGF的组合协同地提高角质形成细胞介导的血纤蛋白溶解以及角质形成细胞的迁移和增殖。因而，尽管不希望被理论束缚，似乎KGF和纤溶酶在创伤愈合期间或上皮再形成过程中作用于上皮细胞功能的两个独立而协同的方面；KGF刺激上皮细胞增殖，而纤溶酶(或者间接地纤溶酶原激活剂)通过清除血纤蛋白凝块和相关胞外基质组分促进其迁移。
尽管不希望被理论束缚，dN23KGF可能具有增强的生物学活性，该活性可能不会由所用的当前的体外测定系统显示，并且可能归因于许多因素，包括对细胞受体的亲和力和/或蛋白结构稳定性提高。同时，切割也可作为整个生长因子降解过程的初始步骤。′278专利披露对于Δ23KGF(缺失N-端头23个氨基酸的KGF分子)观察到提高的促有丝分裂活性，这与dN23KGF相似，如果不是完全相同的话。
血浆中的纤溶酶原浓度很高(1.5-2μM或135-180μg/ml)(Collen和Lijnen，Fibrinolysis and the Control of Hematostasis，in TheMolecular Basis of Blood Diseases(G.S.Stamatoyannopoulos，A.W.Nienhuis，P.W.Majerus和H.Varmus编辑).W.B.Saunders Co(1994)，Pages 725 to 752)。未详细检测创伤或创伤液中的纤溶酶浓度。据报道，角膜创伤愈合期间泪液中的纤溶酶浓度为～37.9μg/ml(van Setten等，Current Eye Research 8：1293-1298，1989)。尽管不希望被理论束缚，可能的最高纤溶酶浓度是血浆中假设不涉及特异性富集机制的急性纤溶酶原浓度。创伤中的纤溶酶浓度很可能受uPA和/或tPA的表达水平以及创伤情况的影响。本实验所用的最高纤溶酶浓度是2400nM或213μg/ml，这超出体内条件下可能的最高生理学浓度。在该浓度的1/5时，纤溶酶彻底切割1.74μM或33μg/ml的KGF。在所有测试的纤溶酶浓度下在延长的37℃温育期内，切割片段(dN23KGF)仅有最低程度(＜5％)的或者没有降解。
并非所有的生长因子蛋白在降解条件下都是稳定的。例如，FGF-10是同一FGF家族的另一成员，并且由于其与KGF的相似性，也被称之为KGF-2。KGF和FGF-10都主要地作用于上皮细胞，但就肝素结合强度、受体结合特异性以及创伤中的表达水平而言有差异。我们的实验证明FGF-10被纤溶酶和胰蛋白酶降解，没有稳定的切割片段。这些结果进一步强调了KGF与存在于创伤环境中的蛋白酶效应有关的独特性。
从而，可制备KGF和纤溶酶/纤溶酶原独特的组合，并用于治疗涉及上皮细胞的损伤。此种组合用FGF-10不能实现，至少和纤溶酶(活性酶)不行。尽管不希望被理论束缚，当恰当地配制于药物组合物中时，这种组合能够将对于上皮再形成过程(即刺激上皮细胞增殖/分化并通过清除血纤蛋白凝块和相关的胞外基质组分促进其迁移)必不可少的两个独立但协同的功能结合起来。的确，该组合在体外测定系统中展示了对角质形成细胞增殖和迁移的协同刺激。另外，当KGF被创伤液中的纤溶酶切割时，它加强了KGF和纤溶酶/纤溶酶原组合的生理学相关性和潜在的益处。该观念可进一步由分离自成纤维细胞的天然KGF也被纤溶酶切割，产生具有与由重组KGF所获得的dN23KGF相同大小的C-末端片段的发现加强。
从而，本发现优选的实施方案是胞外基质降解蛋白酶和与上皮细胞功能相关的生长因子的组合，其用于治疗涉及上皮起源的细胞或生长因子可能影响的任何其它细胞类型的创伤或疾病状况。该组合如下实现：
1)在施用前或期间，在物理上一齐混合两者；
2)一个在前一个继后施用；或
3)使用轮流的治疗方案(即，在一个治疗周期内用一个治疗疾病状况，之后在下一个治疗周期内用另一个治疗)。
优选生长因子不被活性形式的胞外基质降解蛋白酶失活。另外，生长因子与上皮细胞功能相关，并且优选是KGF或相关的生长因子。而且，蛋白酶直接或间接地与胞外基质降解相关，并且优选是纤溶酶/纤溶酶原或相关的酶。该组合被用于治疗涉及上皮细胞及生长因子可能影响的其它细胞类型的创伤或损伤。生长因子和酶可作为天然蛋白从人类或动物血液、组织或培养的细胞中分离，或者作为重组蛋白通过重组DNA技术在原核或真核系统中生产。
由于可对根据本发明的多核苷酸和/或蛋白进行修饰和/或改变，而同时获得具有相似或改善特征的分子，此类生物学上的功能等同体也涵盖在本发明之内。
A.修饰的多核苷酸和多肽
生物学功能等同体可包括被改造以包含不同序列而同时保留编码“野生型”或标准蛋白的能力的多核苷酸。这可由于遗传密码子的简并性实现，即编码同一氨基酸的多密码子的存在。在一个实例中，本领域技术人员可能希望在多核苷酸中引入限制性酶识别序列，而不破坏该多核苷酸编码蛋白的能力。
在另一个实例中，多核苷酸可以是(并编码)具有更加显著变化的生物学功能等同体。蛋白结构中某些氨基酸可被其它氨基酸取代而与结构的交互结合能力没有可感知的损失，例如象抗体的抗原结合区、底物分子、受体等的结合位点。所谓的“保守”变化不破坏蛋白的生物学活性，因为结构变化并不冲击该蛋白实施其原意功能的能力。因而发明人考虑可在本文公开的基因和蛋白序列中进行多种变化，而依然实现本发明的目的。
就功能等同体而言，熟练技术人员将充分理解，“生物学上的功能等同体”蛋白和/或多核苷酸定义中所固有的，是在保留分子可接受水平的等同生物学活性的同时，在分子限定部分可能进行的改变数目有个限度的概念。生物学上的功能等同体因而在文中被定义为其中选择的氨基酸(或密码子)可被取代的那些蛋白(和多核苷酸)。
B.改变的氨基酸
本发明在许多方面有赖于在细胞中介由合适多核苷酸的转录和翻译合成肽和多肽。这些肽和多肽将包括20个“天然”氨基酸，及其翻译后修饰。不过，体外肽合成允许使用修饰的和/或不寻常的氨基酸，而不偏移本发明的总体范围。
C.模拟物
除了上文所讨论的生物学功能等同体，本发明人也考虑结构上相似的化合物，其可配制以模拟本发明的肽或多肽的关键部分。此类化合物，可称之为肽模拟物，可以与本发明的肽相同的方式利用，因而也是功能等同体。
模拟蛋白二级和三级结构元件的某些模拟物由Johnson等(1993)描述。利用肽模拟物潜在的基本原理在于蛋白的肽主链存在主要是为了以促进分子相互作用的方式定位氨基酸侧链，例如抗体和/或抗原。从而设计肽模拟物以允许类似于天然分子的分子相互作用。
肽模拟物概念某些成功的应用集中于已知是高度抗原性的蛋白内β-转角的模拟物。有可能多肽内的β-转角结构可通过以计算机为基础的算法预测，如本文所讨论的那样。一旦确定了转角的组成氨基酸，可构建模拟物以实现氨基酸侧链中必要元件相似的空间取向。
其它方法集中于利用含多二硫键的小蛋白作为引诱结构模板，用以生产模拟大蛋白的生物学活性构象。Vita等(1998)。某些毒素中看起来进化上保守的结构基序是小(30-40氨基酸)的、稳定的并高度允许突变。该基序由在内部核心以三个二硫键桥接的β片层和α螺旋组成。
利用环状L-五肽和具有D-氨基酸的那些环状五肽已成功地模拟了β-II转角。Weisshoff等(1999)。并且，Johannesson等(1999)报道了具有反向转角诱导性质的双环三肽。
产生特定结构的方法已在本领域公开。例如，α螺旋模拟物在美国专利No.5,446,128、5,710,245、5,840,833和5,859,184中公开。这些结构使得肽或蛋白更加热稳定，并且也提高对蛋白水解降解的抗性。也公开了6、7、11、12、13及14元的环结构。
例如，产生构象上受限的β转角和β凸起的方法在美国专利No.5,440,013、5,618,914和5,670,155中公开。β-转角允许改变侧链取代基而不改变相应的主链构象，并通过标准合成操作在肽中掺入了合适的界标。其它类型的模拟转角包括反向转角和γ转角。反向转角模拟物公开在美国专利No.5,475,085和5,929,237中，而γ转角模拟物公开在美国专利No.5,672,681和5,674,976中。
另外，本发明优选的实施方案可如实施例10所概括的以多种技术制备。此种组合可用多种替代酶或生长因子制备是有可能的。与胞外基质降解基质直接或间接相关的替代酶的实例包括uPA、tPA、链激酶、葡萄球菌激酶、普通吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶和金属蛋白酶。也可以利用与纤溶酶享有相同特异性的酶。与上皮细胞功能相关的替代生长因子的实例包括EGF、FGF-10、TGF-α、TGF-β、IGF-I、HGF和aFGF。尤其是，FGF-10可与纤溶酶原(无活性酶原)或相关酶组合是有可能的。
受最近证明KGF也刺激其它细胞类型(包括微血管内皮细胞和肝细胞)的发现的启示，上述组合也可用于治疗涉及这些细胞的疾病状况。也已知纤溶酶原和纤溶酶原激活剂通过促进内皮细胞迁移参与血管生成。在治疗不同细胞类型时，有可能组合中的KGF可用不同的生长因子替换，只要生长因子不被基质降解蛋白酶失活或降解。
实施例1
胰蛋白酶、纤溶酶和胰凝乳蛋白酶对KGF的切割
利用若干蛋白酶处理由Promega(Madison，Wis.)或PeproTech(Rocky Hill，N.J.)获得的重组人类KGF(163个氨基酸)。胰蛋白酶(13,000单位/mg蛋白)、胰凝乳蛋白酶(60单位/mg蛋白)以及猪纤溶酶(3.2单位/mg蛋白)或人血纤溶酶(5.7单位/mg蛋白)由SigmaChemical Co获得。人类尿液两链尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)(100,000单位/mg蛋白)和人类组织纤溶酶原激活剂(tPA)由Calbiochem(San Diego，Calif.)获得。将KGF和酶都融解在TN缓冲液(25mM Tris，150mM NaCl，pH7.4)中。它们以所示的浓度混合，并于37℃水浴温育1小时或更长时间，之后与等体积样品缓冲液混合，并置于15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上在变性条件下电泳。当染料(溴酚兰)前移到接近凝胶终端时终止电泳。蛋白条带通过考马斯亮兰染色观察。染色凝胶的图像利用带CCD相机的GS-5000数字成像系统(AlphaInfotech Co.)在允许以全灰级别获取的设置下获取。蛋白条带的光密度分析利用公共结构域NIH Image 1.62程序(由美国国立卫生研究院研发)在Macintosh计算机上进行。测量各带的未校准光密度(OD)。仅在同一凝胶上的条带之间进行比较。
结果显示胰蛋白酶、纤溶酶和胰凝乳蛋白酶切割KGF(1.74μM)产生～16kDa的片段(图1)。由胰蛋白酶和纤溶酶产生的片段表现出相同的大小，而胰凝乳蛋白酶产生的片段似乎稍微更小。相同的条件下，TPA和uPA对KGF没有作用(图1)。当提高uPA和tPA的浓度16倍分别到3.04μM和4.16μM时，KGF保持完整。uPA和tPA的天然底物纤溶酶原作为酶活的对照。uPA和tPA分别在1.2nM和0.1μM时彻底切割或激活2.4μM纤溶酶原。这些结果表明uPA和tPA对KGF没有任何影响。
实施例2
KGF的切割位点
对由胰蛋白酶、纤溶酶或胰凝乳蛋白酶产生的片段进行N-末端序列分析。在凝胶电泳分离后，将用胰蛋白酶、纤溶酶或胰凝乳蛋白酶消化的KGF(2μg)转移到Immobilon-P膜(Millipore，Bedford，MA.)上。蛋白由0.1％考马斯亮兰在40％甲醇和10％乙酸中染色20秒，然后在40％甲醇中脱色。然后用去离子水洗膜并风干。将酶产生的～16kDa片段切下利用Edman测序法在Hewlett-Packard G1000A自动化蛋白测序仪上进行N-末端氨基酸序列分析。测序结果允许鉴定切割位点。这样，所有的酶在N-末端切割KGF，胰蛋白酶和纤溶酶在Arg23-Ser24处，而胰凝乳蛋白酶在Tyr25-Asp26处(表1，图2)。因此，胰蛋白酶和纤溶酶产生dN23KGF(缺失N-端头23个氨基酸的KGF)而胰凝乳蛋白酶产生dN25KGF(缺失N-端头25个氨基酸的KGF)。
利用缀合于KLH(Sigma-Genosys，Woundlands，Tex.)的合成肽产生兔抗-KGF C-末端肽(CGKKTKKEQKTAHFLPMAIT)抗体。纤溶酶处理或未处理的KGF通过电泳分离，并印迹到Immobilon-P膜上。膜用抗-肽抗体探测，用碱性磷酸酶缀合的抗-兔IgG和酶底物BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚膦酸盐/硝基兰四唑)检测。结果显示dN23KGF同KGF一样，与抗-肽抗体强烈反应，表明dN23KGF C-末端是完整的，或者说未发生涉及多于C-末端20个氨基酸的切割。这与dN23KGF的大小(～16kDa)一致，另外缺失C-末端20个氨基酸将会使dN23KGF的大小降至～14kDa。
从而，dN23KGF在N-末端与Δ23KGF-144Q和Δ23KGF完全相同。如数据所提示的，假如在dN23KGF的C-末端不发生切割，它在C-末端可能也与后者相同。Δ23KGF-144Q和Δ23KGF都已经证明具有增强的促有丝分裂效应或热稳定性或两者兼而有之。
实施例3
酶浓度对dN23KGF稳定性的影响
酶消化于37℃如实施例1进行1小时，但在多种酶浓度下。结果证明KGF的切割是酶浓度依赖性的。利用13.8nM或更高的胰蛋白酶实现完整KGF(1.74μM)＞50％的切割(图3b)。事实上，几乎所有的KGF分子在13.8nM时切割，并且在13.8nM时实现相当可观的切割。在另一方面，纤溶酶在480nM时切割所有的KGF分子，但在48nM时仅切割其中小部分，这小于胰蛋白酶在1.38nM时所切割的(图3a和3b)。人或猪纤溶酶获得相同的结果。因而，在KGF切割中纤溶酶不如胰蛋白酶有效，小～34倍(图3a和3b)。
观察到尽管KGF分子全部或几乎全部被切割，但胰蛋白酶在高酶浓度(1380nM)时产生的dN23KGF片段比较低酶浓度(138nM和13.8nM)时产生的分别小17％和20％(图3b)。这表明dN23KGF在高胰蛋白酶浓度(1380nM)时被进一步降解到某种程度。不过，该观察结果也证明将胰蛋白酶浓度从13.8到138nM提高10倍，不显著增加dN23KGF片段的降解。
除去KGF N-末端头23个氨基酸导致14％的质量降低。与该计算相一致的是，通过光密度测量观察到在测试的所有酶浓度下(480和960nM)纤溶酶实现100％切割时，dN23KGF占原始KGF的90％(图3a和4)。这表明dN23KGF在所用的浓度下对纤溶酶是稳定的。类似地，在较低酶浓度下(138和13.8nM)用胰蛋白酶时，dN23KGF占原始KGF的86％，尽管在高酶浓度(1380nM)时由于进一步降解它仅占71％(图3b)。
尽管不希望被理论束缚，纤溶酶在血纤蛋白溶解中的作用是降解血纤蛋白。作为酶活对照，利用与KGF消化相同的条件用纤溶酶和胰蛋白酶处理纤维蛋白原。纤溶酶在48nM或更高时将纤维蛋白原(490nM)彻底地降解为较小的片段，尽管在4.8nM时仅最小程度地降解。胰蛋白酶同纤溶酶一样，也可以切割血纤蛋白(纤维蛋白原)，产生相似的切割产物。Komorowicz等，Biochemistry 37：9112-9118(1998)。在13.8nM时胰蛋白酶与在4.8-48nM浓度的纤溶酶以相似的程度切割纤维蛋白原(490nM)。因而，与高34倍的KGF效率相比，在纤维蛋白原降解中，胰蛋白酶至多仅比纤溶酶有效3倍。这样，纤溶酶似乎能更为有效地切割纤维蛋白原而不是KGF。
实施例4
延长的酶消化对dN23KGF稳定性的影响
为进一步评价暴露于胰蛋白酶或纤溶酶的dN23KGF的稳定性，延长37℃下的消化并在多个时间取样。酶以比实现完全切割更高的浓度使用(图3a和3b)。结果证明与温育1小时后产生的dN23KGF的量相比，在另外5小时的温育之后，用960nM(86μg/ml)的纤溶酶仅再有5％的降低(图4a)。此外，随着纤溶酶浓度升至2,400nM(213μg/ml)，当将温育30分钟后的产生的dN23KGF的量与另外温育2.5小时后的量进行比较时，再次只观察到5％的降低(图4b)。
用1380nM(33μg/ml)的胰蛋白酶，另外温育5小时后，dN23KGF的量有18％的降低(图4a)。有些观察到的用胰蛋白酶或纤溶酶的dN23KGF量的降低可能归因于非酶相关因子，例如粘附于试管表面和/或自身降级。温育期间此类损失很明显，特别是反应中总蛋白浓度低(如KGF对照)且延长温育周期时；KGF对照另外温育5小时后，注意到27％的降低(图4a)。在相同的摩尔酶浓度下，胰蛋白酶反应中的总蛋白浓度(w/v)将比纤溶酶反应中的浓度低3倍。
综上所述，这些结果，连同实施例3中所描述的那些结果，证明dN23KGF对纤溶酶消化是稳定的。它对胰蛋白酶消化也相对稳定，特别是在较低的酶浓度时。
实施例5
dN23KGF的生物学活性
使用小鼠角质形成细胞系Balb/MK。Weissman和Aaronson，Cell32：599-606(1983)。细胞在具有10％FBS和5ng/ml表皮生长因子(Promega，Madison，Wis.)的低钙培养基EMEM(Biofluids，Washington，D.C.)中培养。对于增殖测定，将细胞以1-3×103细胞/孔种植到96孔板中并于37℃温育过夜。KGF在与图1中相同的条件下用酶处理，除了各酶的酶浓度高2倍，以确保KGF的完全切割，这通过凝胶电泳验证。
KGF或酶处理的KGF首先与等体积的FBS混合，然后在含0.5％FBS的EMEM中进行系列稀释，之后添加给细胞(100μl/孔)。37℃温育48小时后，用来自Promega(Madison，WI.)的试剂盒(CellTiter 96)进行MTT(四唑盐)增殖测定。简要地，向孔中添加MTT染料(15μl/孔)，37℃温育4小时后，添加增溶液(100μl/孔)。板在湿室中保持过夜，之后测量570nm的光密度(OD)。
结果证明胰蛋白酶或纤溶酶产生的dN23KGF依然同完整KGF有一样的活性。胰凝乳蛋白酶产生的片段(dN25KGF)比完整KGF活性低(图5)。酶单独对细胞增殖没有作用。
实施例6
[0100]纤溶酶原和KGF组合对角质形成细胞迁移和增殖以及角 质形成细胞介导的血纤蛋白溶解的影响
[0101]血纤蛋白凝胶涂敷表面上的角质形成细胞迁移测定被用来评估纤溶酶原和KGF组合对角质形成细胞迁移和增殖的影响。Balb/MK细胞如上培养。将EMEM(3mg/ml)中的人类无纤溶酶原纤维蛋白原(Calbiochem，San Diego，CA.)与0.02单位/ml的牛凝血酶(Sigma Chemical Co，St.Louis，Mo.)混合，然后置于24孔板(0.5ml/孔)中。板于37℃保持3小时，以形成血纤蛋白凝胶。用胰蛋白酶从烧瓶中取Balb/MK细胞，用含10％FBS的EMEM洗涤3次，悬浮于含10％FBS的EMEM(无EGF)中，并种植到血纤蛋白凝胶(1000细胞/孔)中。温育过夜后，除去培养基并替换为含纤溶酶原(0、1或5μg/ml)、KGF(0或50ng/ml)或者纤溶酶原和KGF的EMEM。然后细胞在37℃培养。
[0102]在24小时后在纤溶酶原存在下清晰可见血纤蛋白凝胶上单个细胞周围的清晰消化圈。对照(仅培养基)和KGF处理的细胞在48小时后也注意到微弱的消化圈，而且KGF处理细胞周围的消化圈看起来比对照细胞更突出。单个细胞周围清晰消化圈的出现表明血纤蛋白溶解是细胞介导的过程；细胞具有纤溶酶原结合位点并表达激活纤溶酶原的uPA。48小时后，用5μg/ml纤溶酶原(有或无KGF)处理的细胞消化穿过血纤蛋白凝胶，并粘附于板表面。培养5天后，依然只有用5μg/ml纤溶酶原处理的彻底消化穿过血纤蛋白凝胶。不过，只有用纤溶酶原(5μg/ml)和KGF组合处理的那些细胞增殖了(图6a)。这些结果表明对于角质形成细胞穿过血纤蛋白凝胶迁移并增殖，KGF和纤溶酶原都是必要的，并且KGF在纤溶酶/纤溶酶原存在下有功能。当首先将纤溶酶原和/或KGF掺入到血纤蛋白凝胶时获得相同的结果。
[0103]为进一步评价纤溶酶/纤溶酶原和KGF组合对血纤蛋白基质清除的影响，进行角质形成细胞的血纤蛋白消化测定。该测定是基于纤溶酶消化产生的血纤蛋白切割片段是可溶的事实。将角质形成细胞(Balb/MK)种植到24孔板中(5000细胞/孔)。细胞在具有10％FBS的EMEM中于37℃培养24小时，然后在无FBS的EMEM中培养另外24小时。部分细胞首先用KGF(50ng/ml)处理3小时。然后洗涤细胞，并接受处于有或无纤溶酶原(10μg/ml)的无血清EMEM(5mg/ml)中的0.5ml纤维蛋白原溶液。在施用前向纤维蛋白原溶液中现加入凝血酶(0.02单位t/ml)。然后细胞培养另外3小时。从各孔取出残余的血纤蛋白凝胶连同培养基，并在10,000g离心5分钟。取上清，并通过BCA测定确定其蛋白含量。无血清EMEM用作为本底对照。结果证明仅有纤溶酶原诱导显著的血纤蛋白溶解(图6b)。含纤溶酶原的血纤蛋白凝胶空孔中未观察到血纤蛋白溶解。用KGF预处理细胞进一步使纤溶酶原诱导的血纤蛋白溶解增加几乎20％(图6b)。同等重要的是，KGF和纤溶酶原联合治疗导致更多的细胞呈现迁移细胞表型，即它们是具有长胞浆突出物的成纤维细胞样细胞。这些结果证明KGF和纤溶酶原协同促进血纤蛋白溶解，并促进角质形成细胞的迁移。尽管不希望被理论束缚，它们最可能反映KGF提高角质形成细胞中uPA表达的事实，从而导致将更多的纤溶酶原转化纤溶酶，这依次增加了血纤蛋白溶解。
实施例7
[0104]多种酶对FGF-10的降解
[0105]FGF-10也称之为KGF-2，是类似于KGF的FGF。因而FGF-10(R&D systems，Minneapolis，Minn.)用切割KGF的酶在与图1相同的条件下处理。结果证明胰蛋白酶、纤溶酶和胰凝乳蛋白酶都切割FGF-10(19kDa)，但不产生稳定的切割片段。纤溶酶和胰蛋白酶确实产生了瞬时的～16kDa片段，其显然被进一步降解。
[0106]为确定在较低酶浓度时能够产生稳定的FGF-10片段，FGF-10用胰蛋白酶和纤溶酶以多种浓度在与图3a和3b中KGF相同的条件下处理。结果证明没有哪种酶浓度下，～16kDa切割产物大于原始FGF-10的20％，尽管在所用的酶浓度范围内实现了完整FGF-10的完全切割(图3c和3d)。这与这两种酶对KGF的切割形成强烈对比；在完整分子实现完全或几乎完全切割酶浓度下，切割产物(dN23KGF)占原始KGF的至少70％(图3a和3b)。这表明胰蛋白酶或纤溶酶产生的FGF-10～16kDa片段以接近原始FGF-10初始切割的效率被进一步降解。
实施例8
创伤液对KGF的切割以及纤溶抑制BDelin的抑制作用
[0108]在雌性小猪(40-45磅)的后背(背部)通过手术制备完整厚度的皮肤创伤。各创伤覆以浸泡了生理盐水的纱布海绵敷料，然后是非渗透性的膜敷料。从术后2天和4天更换敷料期间取下的浸泡了生理盐水的纱布海绵中收集创伤液。从4个不同的创伤中得到总计8个创伤液样品并加以利用。KGF(0.25μg)与5μl创伤液在存在和不存在多种浓度的Bdelin(Sigma Chemical Co.St.Louis，Mo.)时在10或12.5μl反应体积中混合。37℃温育1小时后，混合物通过凝胶电泳分离，并印迹到Immobilon-P膜上。膜用羊抗-人KGF或兔抗-人KGF C-末端肽探测(见实施例2)。用碱性磷酸酶缀合的抗-羊IgG或抗-兔IgG和酶底物BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚膦酸盐/硝基兰四唑)检测。光密度分析如实施例1进行。
[0109]结果证明创伤液切割KGF并产生与纤溶酶切割的(dN23KGF)相同大小的片段(图7a)。切割主要发生在4天的创伤液中(图7a)。4天的创伤处于上皮再形成过程的早期阶段。切割以剂量依赖性方式被纤溶酶抑制剂bdelin抑制，并且产生的切割片段被所用的最高量的Bdelin(2.5μg)减少4.6倍(图7b)。这表明创伤液中负责KGF切割的酶是纤溶酶，并且产生的片段是dN23KGF。创伤液产生的切割片段(dN23KGF)也与抗-KGF C-末端肽抗体强烈反应。
[0110]综上所述，这些结果证明KGF可被创伤液中的纤溶酶切割，产生dN23KGF。
实施例9
[0111] 纤溶酶对天然KGF的切割。
[0112]哺乳动物细胞产生的天然KGF被糖基化且大小(24-28kDa)大于重组KGF。该实验是为了确定纤溶酶是否也切割从已知表达KGF的鼠929成纤维细胞中分离的天然KGF。细胞在具有5％FBS的DMEM中培养。收集培养基并通过0.2μm过滤器过滤。向各500ml培养基中添加0.5ml肝素-琼脂糖珠子浆液(50％)。培养基室温下振摇放置1小时。珠子用TN缓冲液洗涤，并置于旋转柱上除去过量的缓冲液。用1M NaCl洗脱结合到珠子上的蛋白。洗脱液逆TN缓冲液透析。然后如上所述用人类纤溶酶处理。重组KGF用作对照。蛋白通过凝胶电泳分离，并印迹到Immobilon-P膜上。膜用兔抗-人KGF C-末端肽探测(见实施例2)。用碱性磷酸酶缀合的抗-兔IgG和酶底物BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚膦酸盐/硝基兰四唑)检测。光密度分析如
实施例1进行。
[0113]天然KGF象预期的那样，确实具有比重组KGF更大的大小(26kDa)(图8)。酶消化实验证明天然KGF被纤溶酶切割，产生具有与由同一酶由重组KGF产生的dN23KGF相同的大小的C-末端切割片段。
实施例10
[0114]用于治疗创伤或其它疾病状况的KGF和纤溶酶/纤溶酶原 组合或相关酶的组合：配制和加工
[0115]上述发现清楚地说明KGF和纤溶酶/纤溶酶原组合或相关酶的组合可用于治疗涉及上皮细胞的创伤或其它疾病状况。该组合不仅加速细胞增殖/分化，而且通过清除血纤蛋白凝块和相关胞外基质促进细胞迁移。
[0116]组合通过物理混合KGF或选自但不限于列表A中的那些相关生长因子(0.00001％-0.1％(w/v)浓度)与纤溶酶/纤溶酶原或选自但不限于列表B中的那些相关胞外基质降解蛋白酶(处于选自但不限于列表C中的那些药学上可接受的载体中，0.0001％-1％(w/v)浓度)实现。所述组合可进一步包括药学上可接受的选自但不限于列表D中的那些增稠剂。
列表A：   列表B：        列表C：    列表D：
EGF        胰蛋白酶        溶液        CMC
FGF-10     tPA             悬液        白明胶
HGF        uPA             乳剂        HPMC
TGF-α            链激酶          固体剂型    HEC
TGF-β            葡萄球菌激酶                葡聚糖
IGF-I      金属蛋白酶                  透明质酸
aFGF                                   果胶
                                       藻酸盐
                                       壳聚糖
[0117]列表A中的生长因子连同KGF，都已被证明刺激上皮细胞增殖。它们多数也已被证明刺激动物和人类的创伤愈合，包括EGF、aFGF、KGF、FGF-10和TGF-β。在人类临床研究中，它们已被用来治疗多种类型的创伤，包括压迫性溃疡、静脉淤积溃疡和烧伤。在动物研究(小鼠、大鼠、兔或猪)中，最常用完全或部分厚度的内切或外切创伤。在多数情况下，将生长因子直接局部施用到创伤表面。各种生长因子剂量为0.1-100μg/cm2的典型范围使用。生长因子或者处于生理盐水、缓冲盐溶液、药膏中、或者处于胶原海绵基质中应用。某些制剂含增稠剂。在治疗前，可清洗创伤或或去除碎片。治疗后，创伤可用多种类型的敷料覆盖，包括非粘附性可渗透或不可渗透的膜敷料，取决于创伤的类型和实际的创伤情况。使用多种类型的治疗方案，包括每天一次及每周两次。完整的疗程可持续数周。结果通过多种标准判断，包括上皮再形成、粒组织形成、血管生成、胶原含量、创伤破坏强度以及创伤闭合。根据这些标准中的一种或多种，在许多动物和人类研究中使用这些生长因子取得了阳性结果。(Clark R.A.F.(编辑).The molecular and cellular biology of wound repair，Part II.Growth factor in soft tissue healing.pp 171-310.1996.Plenum press.New York；Robson和Smith，Topical use of growth factors to enhancehealing.In Cutaneous wound healing，Vincent F.(编辑.)pp379-398.2001.Martin Dunitz.London)
[0118]在列表C中，固体剂量形式可以包括但不限于片剂、胶囊、粉末、膜、胶带、海绵、泡末、垫片及其它基质或组合物形式。
[0119]保留了全部或部分原始活性的生长因子或酶的活性部分或片段或修饰形式可用在该组合中。例如，dN23KGF可代替KGF使用，而小纤溶酶/纤溶酶原可代替纤溶酶/纤溶酶原使用。另外，可使用活性形式的酶或者作为酶原失活形式使用。应当清楚如果使用活性酶例如纤溶酶与KGF组合，制剂中将会产生dN23KGF。在另一方面，如果使用失活酶如纤溶酶原，则不会产生dN23KGF。
[0120]本发明的一个实施方案涉及装有具有生长因子(如列表A)的容器以及具有胞外基质降解蛋白酶或激活剂(如列表B)的容器的试剂盒。各容器的内含物可处于载体溶液(如列表C或列表D)中，或者与载体溶液(如列表C或列表D)冻干置于第三容器内以备用户重建组分。试剂盒用户能够明白将试剂盒组分混合并置于动物或人类损伤处，用于促进创伤愈合的方案。备选地，试剂盒的单独组分可以前后或相继的次序置于损伤处。
[0121]生长因子和酶都可以作为天然蛋白通过从人类或动物血液、组织或培养的细胞中分离产生，或者作为重组蛋白通过重组DNA技术在原核或真核系统中产生。递送核酸转化用于本发明的器官、细胞、组织或生物体的合适的方法被认为包括了如本文所述的或者本领域普通技术人员将会知晓的能够将核酸(如DNA)引入到器官、细胞、组织或生物体的几乎任何方法。此类方法包括，但不限于直接递送DNA，例如通过离体转染；通过注射(美国专利No.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，分别特此并入作为参考)，包括微注射(美国专利No.5,789,215，特此并入作为参考)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，特此并入作为参考；通过磷酸钙沉淀；通过使用DEAE-葡聚糖，继之以聚乙二醇；通过直接超声荷载；通过脂质体介导的转染和受体介导的转染；通过微注射的枪轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利No.5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且分别特此并入作为参考)；通过siliconcarbide纤维搅拌(美国专利No.5,302,523和5,464,765，分别特此并入作为参考)；通过农杆菌介导的转化(美国专利No.5,591,616和5,563,055，分别特此并入作为参考)；通过PEG-介导的原生质体转化(美国专利No.4,684,611和4,952,500，分别特此并入作为参考)；通过解析/抑制介导的DNA摄取以及此类方法的任何组合。通过应用诸如此类的技术，可稳定或瞬时转化器官、细胞、组织或器官。
[0122]蛋白或DNA载体组合可配制为液体或干燥的形式。组合可以皮下、肌内、静脉内、口服、局部、鼻内给药，或者通过肺递送，取决于疾病状况和药剂。
[0123]熟练技术人员将会知晓，组合中任一组分的量可根据待治疗的疾病状况和给药路径改变，以能够在临床上有效。此外，不作为混合物或组合配制，酶和生长因子可分别配制，并在用前才混合到一起，或者首先施用酶(例如局部、口服、肠胃外或通过注射)，接着是生长因子，或者反之亦然。甚至可以使用交替的治疗方案，使用生长因子治疗期，之后是酶治疗期或反之亦然。添加每一组分之间的时间可根据创伤情况和愈合状态改变。
[0124]本发明包括组合蛋白酶和生长因子以实现对细胞功能的协同作用的原理。本领域普通技术人员应当理解，其它实施方案可合并上述说明书和实施例中的概念、方法、生长因子、蛋白酶和装置。说明书和文中所含的实施例并不旨在限制本发明的范围，而只是用于举例说明的目的。应当理解可建立本发明的其它实施方案，并落在本发明及权利要求的精神和范围之内。
表1由胰蛋白酶、纤溶酶和胰凝乳蛋白酶产生的KGF切割片段的N-末端序列
酶              切割片段的N-末端    原始产率    重复产率(％)
                序列*               (pmol)
纤溶酶          S-Y-D-Y-M           2.6         88.3
胰蛋白酶        S-Y-D-Y-M           9.7         88.2
胰凝乳蛋白酶    D-Y-M-E-G           3.19        ND
*各序列仅在全长KGF氨基酸序列(163个氨基酸)中发现一处。其在序列中的位置见图2。ND，未测。

Claims (77)

1.组合物，包含：
通过混合包含与上皮细胞功能相关的生长因子和胞外基质降解蛋白酶的成分形成的混合物。
2.权利要求1的组合物，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括成纤维细胞生长因子(″FGF″)或其功能上的生物学等同体。
3.权利要求1的组合物，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括角质形成细胞生长因子(″KGF″)或其功能上的生物学等同体。
4.权利要求1的组合物，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括表皮生长因子(″EGF″)、dN23KGF、KGF-2、酸性成纤维细胞生长因子(″aFGF″)、转化生长因子-α(″TGF-α″)、转化生长因子-β(″TGF-β″)、胰岛素样生长因子-I(″IGF-I″)、肝细胞生长因子(″HGF″)或其功能上的生物学等同体。
5.权利要求1的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括与纤溶酶、纤溶酶原或其功能上的生物学等同体相关的酶。
6.权利要求1的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶或其功能上的生物学等同体。
7.权利要求1的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
8.权利要求1的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括小纤溶酶、小纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
9.权利要求1的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括微纤溶酶、微纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
10.权利要求1的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金属蛋白酶、胶原酶或其功能上的生物学等同体。
11.权利要求1的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原激活剂或其功能上的生物学等同体。
12.权利要求11的组合物，其中纤溶酶原激活剂包括尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、链激酶或其功能上的生物学等同体。
13.组合物，包括：
通过混合包括成纤维细胞生长因子和胞外基质降解蛋白酶的成分形成的混合物。
14.权利要求13的组合物，其中成纤维细胞生长因子包括角质形成细胞生长因子(″KGF″)或其功能上的生物学等同体。
15.权利要求13的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括与纤溶酶、纤溶酶原或其功能上的生物学等同体相关的酶。
16.权利要求13的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶或其功能上的生物学等同体。
17.权利要求13的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
18.权利要求13的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括小纤溶酶、小纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
19.权利要求13的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括微纤溶酶、微纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
20.权利要求13的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金属蛋白酶、胶原酶或其功能上的生物学等同体。
21.权利要求13的组合物，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原激活剂或其功能上的生物学等同体。
22.权利要求21的组合物，其中纤溶酶原激活剂包括尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、链激酶或其功能上的生物学等同体。
23.权利要求13的组合物，其中成纤维细胞生长因子的浓度为0.00001％[w/v]-0.1％[w/v]，而胞外基质降解蛋白酶的浓度为0.0001[w/v]-1％[w/v]。
24.权利要求13的组合物，进一步包含载体。
25.权利要求24的组合物，其中载体包括缓冲液、盐溶液、增稠剂、乳剂或软膏。
26.试剂盒，包含：
第一容器的第一载体中包含与上皮细胞功能相关的生长因子的第一组分；以及第二容器的第二载体中包含胞外基质降解蛋白酶的第二组分。
27.权利要求26的试剂盒，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括成纤维细胞生长因子(″FGF″)或其功能上的生物学等同体。
28.权利要求26的试剂盒，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括角质形成细胞生长因子(″KGF″)或其功能上的生物学等同体。
29.权利要求26的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括与纤溶酶、纤溶酶原或其功能上的生物学等同体相关的酶。
30.权利要求26的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶或其功能上的生物学等同体。
31.权利要求26的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
32.权利要求26的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括小纤溶酶、小纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
33.权利要求26的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括微纤溶酶、微纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
34.权利要求26的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金属蛋白酶、胶原酶或其功能上的生物学等同体。
35.权利要求26的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原激活剂或其功能上的生物学等同体。
36.权利要求35的试剂盒，其中纤溶酶原激活剂包括尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、链激酶或其功能上的生物学等同体。
37.权利要求26的试剂盒，其中第一载体与第二载体相同或不同。
38.权利要求26的试剂盒，其中第一载体包括水、缓冲液、盐溶液、增稠剂、乳剂或软膏。
39.权利要求26的试剂盒，其中第二载体包括水、缓冲液、盐溶液、增稠剂、乳剂或软膏。
40.试剂盒，包含：
第一容器中包含与上皮细胞功能相关的生长因子的第一组分；第二容器中包含胞外基质降解蛋白酶的第二组分；以及第三容器中包含载体的第三组分。
41.权利要求40的试剂盒，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括成纤维细胞生长因子(″FGF″)或其功能上的生物学等同体。
42.权利要求40的试剂盒，其中成纤维细胞生长因子包括角质形成细胞生长因子(″KGF″)或其功能上的生物学等同体。
43.权利要求40的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括与纤溶酶、纤溶酶原或其功能上的生物学等同体相关的酶。
44.权利要求40的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶或其功能上的生物学等同体。
45.权利要求40的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
46.权利要求40的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括小纤溶酶、小纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
47.权利要求40的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括微纤溶酶、微纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
48.权利要求40的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金属蛋白酶、胶原酶或其功能上的生物学等同体。
49.权利要求40的试剂盒，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原激活剂或其功能上的生物学等同体。
50.权利要求49的试剂盒，其中纤溶酶原激活剂包括尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、链激酶或其功能上的生物学等同体。
51.权利要求40的试剂盒，其中载体包括缓冲液、盐溶液、增稠剂、乳剂或软膏。
52.治疗动物或人类损伤的方法，包括：
向损伤处施加包含通过混合包含与上皮细胞功能相关的生长因子和胞外基质降解蛋白酶的成分形成的混合物的组合物。
53.权利要求52的方法，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括成纤维细胞生长因子(″FGF″)或其功能上的生物学等同体。
54.权利要求52的方法，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括角质形成细胞生长因子(″KGF″)或其功能上的生物学等同体。
55.权利要求52的方法，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括表皮生长因子(″EGF″)、dN23KGF、KGF-2、酸性成纤维细胞生长因子(″aFGF″)、转化生长因子-α(″TGF-α″)、转化生长因子-β(″TGF-β″)、胰岛素样生长因子-I(″IGF-I″)、肝细胞生长因子(″HGF″)或其功能上的生物学等同体。
56.权利要求52的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括与纤溶酶、纤溶酶原或其功能上的生物学等同体相关的酶。
57.权利要求52的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶或其功能上的生物学等同体。
58.权利要求52的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
59.权利要求52的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括小纤溶酶、小纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
60.权利要求52的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括微纤溶酶、微纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
61.权利要求52的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金属蛋白酶、胶原酶或其功能上的生物学等同体。
62.权利要求52的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原激活剂或其功能上的生物学等同体。
63.权利要求62的方法，其中纤溶酶原激活剂包括尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、链激酶或其功能上的生物学等同体。
64.权利要求52的方法，其中损伤涉及上皮起源的细胞，包括处于皮肤、口腔、消化道、粘膜表面、眼或肺之内或之上的那些细胞。
65.权利要求52的方法，其中损伤涉及生长因子也影响的其它细胞类型，包括内皮细胞、成纤维细胞或肝细胞。
66.治疗动物或人类损伤的方法，包括：
向损伤处施加两种组分：
(a)与上皮细胞功能相关的生长因子；和
(b)胞外基质降解蛋白酶，其中组分(b)在组分(a)之后施加，或者组分(a)在组分(b)之后施加。
67.权利要求66的方法，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括成纤维细胞生长因子(″FGF″)或其功能上的生物学等同体。
68.权利要求66的方法，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括角质形成细胞生长因子(″KGF″)或其功能上的生物学等同体。
69.权利要求66的方法，其中与上皮细胞功能相关的生长因子包括表皮生长因子(″EGF″)、dN23KGF、KGF-2、酸性成纤维细胞生长因子(″aFGF″)、转化生长因子-α(″TGF-α″)、转化生长因子-β(″TGF-β″)、胰岛素样生长因子-I(″IGF-I″)、肝细胞生长因子(″HGF″)或其功能上的生物学等同体。
70.权利要求66的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括与纤溶酶、纤溶酶原或其功能上的生物学等同体相关的酶。
71.权利要求66的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶或其功能上的生物学等同体。
72.权利要求66的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
73.权利要求66的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括小纤溶酶、小纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
74.权利要求66的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括微纤溶酶、微纤溶酶原或其功能上的生物学等同体。
75.权利要求66的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括胰蛋白酶、金属蛋白酶、胶原酶或其功能上的生物学等同体。
76.权利要求66的方法，其中胞外基质降解蛋白酶包括纤溶酶原激活剂或其功能上的生物学等同体。
77.权利要求66的方法，其中纤溶酶原激活剂包括尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、链激酶或其功能上的生物学等同体。
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