CN1659184B - 活化凝血酶原的蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛇毒蛋白酶多肽及其编码核酸序列。本发明还涉及制备和使用该蛇毒蛋白酶的方法，例如，促进止血和预防血液流失如手术过程中，或者用于治疗意外事故以及其它类型损伤或外伤导致的伤口。

Description

活化凝血酶原的蛋白
本申请请求此前于2002年4月3日提交的申请号为PS1483和2003年3月7日提交的申请号为2003901033的澳大利亚临时申请的优先权，其内容在此引入作为参考。
技术领域
本发明涉及新的蛇毒蛋白酶多肽及其编码核酸序列。本发明还涉及制备和使用该蛇毒蛋白酶的方法，例如，在如手术过程中促进止血和预防血液流失，或者用于治疗意外事故以及其它类型损伤或创伤导致的伤口。
背景技术
止血，通常是指血液凝血或血液凝块，是创伤或损伤时防止血液过量流失的重要生物学反应。这种控制哺乳动物止血的生化级联反应已被研究得很透彻。该途径中的一个关键步骤是通过凝血酶原酶复合物活化凝血酶原产生凝血酶，然后凝血酶活化因子XIIIa，因子XIIIa与血纤蛋白发生交联形成稳定的血凝块(Stubbs&Bode，1994，Curr.Opin.Struct.Biol.4 823-32)。
在哺乳动物体内，所述凝血酶原激活剂复合物通常由在钙离子存在的条件下形成于磷脂膜上的丝氨酸蛋白酶因子Xa和辅因子Va组成(Suttie&Jackson，1977，Physiol.Rev.57 1)。所述哺乳动物凝血酶原酶复合物由辅因子即因子Va和丝氨酸蛋白酶即因子Xa组成。因子Xa单独活化凝血酶原的速度很慢，但是，在辅助蛋白包括非酶辅因子因子Va、钙离子(Ca2+)和磷脂存在下，凝血酶原活化的速度提高了很多倍。在体内，因子Xa通过γ-羧基谷氨酸残基结合血小板的磷脂膜，并优先切割凝血酶中的Arg274-Thr275键随后切割Arg323-Ile324键而生成凝血酶。
由于在外科手术过程中或损伤或创伤后控制血液流失有着重要的意义，所以，能够促进血液凝块或抑制血凝块溶解(例如通过溶解血纤蛋白的纤溶酶/纤溶酶原途径；Royston等，1990，Blood Coagul.fibrinol.153；Orchard等，1993，Br.J.Haematol.85 596)的调节因子的鉴定已经成为研究的焦点。
具体而言，蛇毒已经成为哺乳动物外科手术、创伤中血液流失时阻止血纤蛋白溶解或促进血液凝块的蛋白质的有效来源。
例如，现已经从澳大利亚常见的棕蛇Pseudonaja textilis的蛇毒中分离出了血纤蛋白溶解的抑制剂(国际公开WO 99/58569)。就蛇毒-来源的凝血酶原活化剂而言，也可参考中国专利1298017，该专利公开了分离自太攀蛇Oxyuranus scutellatus蛇毒的凝血酶原活化剂：凝血酶原活化酶(命名为Os-II)和活化的因子Xa。中国的研究小组提出：例如伤口流血时为了促进止血，最好在加入因子Xa前1小时添加Os-II从而活化凝血酶原。他们指出：这两者的同时作用能活化凝血酶原并提高凝血酶的产量。
也可参见Joseph等，1999，Blood 94 621，该文献公开了一种分离自澳大利亚粗鳞蛇(Tropidechis carinatus)蛇毒的因子Xa-样凝血酶原活化剂(trocarin)。Trocarin形成凝血酶原活化剂复合物，在磷脂、因子Va和钙离子存在下，该复合物能在体外催化凝血酶原形成凝血酶。
目前，使用牛或人来源血液制品成分代替各种因子，用来在哺乳动物外科手术、创伤中血液流失时阻止血纤蛋白溶解或促进血液凝块。但是，使用牛或人来源的血液制品成分可能会使患者受到病毒污染及其它有害事件的威胁。
发明概述
本发明部分上以凝血酶原活化的多肽的发现为基础，该多肽在本申请中称为“蛇毒蛋白酶或SVP’s”，是因子非依赖性的。蛇毒蛋白酶具有与因子Xa和trocarin的氨基酸序列类似的氨基酸序列，因子Xa和trocarin是凝血酶原活化剂，它们在活化时需要钙、磷脂及因子Va的参与。但是，本发明的蛇毒蛋白酶是完全或部分完全的凝血酶原活化剂，因此不需要人因子Xa或trocarin活化剂所需的辅因子。换句话说，它们能在无钙、磷脂和/或因子Va等辅因子存在下处理凝血酶原生成凝血酶。例如，来自棕蛇、海岸太攀蛇和凶猛太攀蛇蛇毒的蛇毒蛋白酶是完全的凝血酶原因子，因为它们能在无钙、磷脂和/或因子Va存在下，处理凝血酶原生成凝血酶凝血酶。这些SVP’s显示包含一个内部结构域，即图23中第292-305位残基，这一结构域使得它们无须依赖宿主提供的因子Va。来自红腹蛇、虎蛇和粗鳞蛇的蛇毒蛋白酶是部分完全凝血酶原活化剂，因为它们能在无钙和磷脂存在下处理凝血酶原，但是需要有因子Va的存在。此外，本发明优选的SVP’s能切割去羧基凝血酶原，去羧基凝血酶原是人因子X的不良(poor)底物。
因此，一个方面，本发明涉及蛇毒蛋白酶多肽，及其生物活性或抗原性片段，它们是完全或部分完全凝血酶原活化剂，可以用作例如促进凝血的试剂。另一方面，本发明提供了具有活化凝血酶原的活性的蛇毒蛋白酶多肽。
一个实施方案中，所述蛇毒蛋白酶包括一个或多个轻链和重链或其生物活性片段。优选的轻和重链蛋白在长度上等同或非常类似于(例如有1或2个残基的差别)其天然存在形式。另一实施方案中，所述蛇毒蛋白酶包括原肽、轻链、活化肽和重链。所有的处理中间体，无论是否天然存在，都在本发明的范围之内。因此，在另一实施方案中，本发明的蛇毒蛋白酶多肽包括轻链、活化肽和重链。优选的实施方案包括轻链和重链，其中的原肽结构域和一或多种活化肽已经被切去。纯化制剂可以包括或具有切割后的原肽结构域和纯化掉的切割片段(cleavage fragments purified away)。
一个优选实施方案中，活化SVP的完全或部分完全凝血酶原包括一个或多个以及一些情况下包括所有下列结构域(编号与指图23中的编号一致)：
第一或原肽结构域，对应于图23中第1-40位残基。优选实施方案中，该结构域与图23列出5个序列中任一个的相应结构域之间具有至少31、40、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。优选的活性产物当然不含有原肽结构域。一些情况下，期望修饰蛇原肽结构域使其与人X之间更为相似，或者用人原肽结构域取代蛇原肽结构域。除了红腹黑蛇中V→E的单个氨基酸改变之外，原肽结构域在所有6种蛇中100％保守。与人相应序列比较发现相同的残基数为12/40(30％同一性)。保守残基中的大部分是疏水的；
位于图23中第40-41位残基之间的轻链切割位点；
对应于图23中第41-85位残基的结构域。该结构域在功能上类似于人因子X的GLA(γ-羧基谷氨酸)结构域。优选实施方案中，该结构域与图23列出6个序列中任一个的相应结构域之间具有至少71、75、80、85、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。一些实施方案中，可取地保留该区域中的11个谷氨酸残基中的一个或多个。这些残基中的10个在人因子X序列与所有6种蛇序列之间保留，包括46/47，54，56，59/60 65/66，69，72。值得注意的是在人序列中第79位也是γ-羧基化的，图23所有6种蛇序列另外在第76和78位残基还有2个潜在残基。许多实施方案中，该区域的起始残基就是产物的轻链的起始位点。一个优选实施方案中，该区域与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少85％的序列同一性；
对应于图23中第86-122位残基的结构域。该结构域在功能上类似于人因子X的EGF结构域。优选实施方案中，该结构域与图23列出6个序列中任一个的相应结构域之间具有至少71、75、80、85、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。与蛇共有序列的同一性为25/37。该结构域与人序列之间具有70％的同一性。一个优选实施方案中，该结构域与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少70％的序列同一性；
对应于图23中6种蛇序列中任一种的第123-165位残基的结构域。该结构域在功能上类似于人因子X的第二EGF结构域。优选实施方案中，该结构域与图23列出的6个序列中任一个的相应结构域之间具有至少36、50、75、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。与蛇共有序列的同一性为15/43。该结构域与人序列之间具有35％的同一性。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少50％的序列同一性；
对应于图23中6种蛇序列中的第166-179位残基的结构域。优选实施方案中，该结构域与图23列出6个序列中任一个的相应结构域之间具有至少75、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。一个优选实施方案中，该结构域与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少70％的序列同一性；
对应于图23中第180-182位残基的结构域。优选实施方案中，该结构域与图23列出的6序列中的任一序列之间可以具有至少1、2或3个相同的残基。优选地该结构域不出现于活性产物中。
对应于图23中第183-209位残基的结构域。该结构域在功能上类似于人因子X中的活性肽。优选实施方案中，该结构域与图23列出6个序列中任一个的相应结构域之间具有至少17、50、75、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。与蛇共有序列的同一性为8/51。该结构域与人序列之间具有16％的同一性。该结构域是处理蛋白酶的轻链和重链时被切去的那个区域，并优选不出现于活性产物中。对于人因子X该结构域长51个氨基酸，对于每一种蛇该结构域长27个氨基酸。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少50％的序列同一性；
对应于图23中第210-467位(就棕蛇、海岸太攀蛇、凶猛太攀蛇或红腹黑蛇而言)或第210-456位残基(就虎蛇或粗鳞蛇而言)的重链结构域。该结构域在功能上类似于人因子X中的重链。优选实施方案中，该结构域与图23列出6个序列中任一个的相应结构域之间具有至少50、75、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。该结构域与蛇共有序列的同一性为135/268，与人序列之间具有50％的同一性。人因子X的催化结构域含有重要的活性位点三联体H236、D282和S379。这3个残基在所有6种蛇中都保留，如图23中的H251，D309和S406，并且它们在本发明的SVP’s的优选实施方案中保留。第292-305位氨基酸提供因子Va样活性，或与序列292-305之间不同残基数不超过1、2、3、4或5个的序列应该出现于完全SVP’s中。一个优选实施方案中，该结构域与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少75％的序列同一性。
如上所述，一个优选实施方案包括完全处理后的轻链和重链的二聚体分子，该分子是从原肽结构域和活化或切割结构域中切割而来。优选实施方案中，所述轻链包括：轻链的第57和62位、第90和101位、第95和110位、第112和121位、第129和140位、和/或第151和164位残基间的链内Cys-Cys键，重链的第216和221、第236和252、第377和391，和/或第402和430位残基间的链内Cys-Cys键，以及轻链第172位残基与重链第329位残基间的链间Cys-Cys键。优选实施方案中，所述SVP是一种完全或部分完全凝血酶原活化剂，因而能在无辅因子存在下，表现出比不完全活化因子例如人因子X或trocarin明显高的活性。优选地，所述完全或部分完全凝血酶原活化剂的活性比单独的不完全活化剂例如人因子X或trocarin的活性高至少1.5，2，4，10，15，20，50，或100倍(两个数量级)。这一比较结果是在相同或近似条件下例如无Ca和磷脂存在下，对蛇毒蛋白酶和不完全活化剂进行测定得出的。优选实施方案中，完全或部分完全活化剂活性的％(即完全或部分完全活化剂在无Ca和磷脂存在下的活性与该活化剂在有Ca和磷脂存在下的活性之间的％)比不完全活化剂例如人因子X或trocarin表现的相应％高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000或4000倍。优选的完全或部分完全活化剂在约10-10～10-06M，例如10-8或10-7M浓度下能使柠檬酸化血浆凝块，凝快时间约50-15秒，这表明其是Ca2+和磷脂非依赖性的。因此，所述凝血酶原活化剂在约10-10～10-06M浓度的范围内，表现辅因子(钙离子和/或磷脂)非依赖性的动力学特性，这是一个适于减少血液流失的工作范围。
一个优选实施方案中，活化SVP的完全或部分完全凝血酶原包括一个或多个以及一些情况下包括所有下列结构域(编号参照图22中的共有编号)：
第一或原肽结构域，对应于图22中5种蛇序列的第1-40位残基(或凶猛太攀蛇的相应序列)。优选实施方案中，该结构域与图22列出5个序列中任一个的相应结构域(或凶猛太攀蛇的相应序列)之间具有至少31、40、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。优选的活性产物当然不含有原肽结构域；
对应于图22中5种蛇序列的第41-120位残基(或凶猛太攀蛇的相应序列)的结构域，该结构域与图22列出5个序列中任一个的相应结构域(或凶猛太攀蛇的相应序列)之间具有至少67、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少90％的序列同一性。
对应于图22中5种蛇序列的第121-132位残基(或凶猛太攀蛇的相应序列)的结构域，该结构域与图22列出5个序列中任一个的相应结构域(或凶猛太攀蛇的相应序列)之间具有至少43、60、65、80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少60％的序列同一性。
对应于图22中5种蛇序列的第133-182位残基(或凶猛太攀蛇的相应序列)的结构域，该结构域与图22列出5个序列中任一个的相应结构域(或凶猛太攀蛇的相应序列)之间具有至少80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少80％的序列同一性。
对应于图22中5种蛇序列的第183-233位残基(或凶猛太攀蛇的相应序列)的结构域，该结构域与图22列出5个序列中任一个的相应结构域(或凶猛太攀蛇的相应序列)之间具有至少17、30、50、95、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。优选的活性产物当然缺乏活化结构域。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少90％的序列同一性。
对应于图22中5种蛇序列的第234-378位残基(或凶猛太攀蛇的相应序列)的结构域，该结构域与图22列出5个序列中任一个的相应结构域(或凶猛太攀蛇的相应序列)之间具有至少80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少80％的序列同一性。
对应于图22中5种蛇序列的第379-394位残基(或凶猛太攀蛇的相应序列)的结构域，该结构域与图22列出5个序列中任一个的相应结构域(或凶猛太攀蛇的相应序列)之间具有至少39、30、50、80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少50％的序列同一性。
对应于图22中5种蛇序列的第395-456位残基(或凶猛太攀蛇的相应序列)的结构域，该结构域与图22列出5个序列中任一个的相应结构域(或凶猛太攀蛇的相应序列)之间具有至少80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3、5或10个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少80％的序列同一性。
对应于图22中5种蛇序列的第457-467位残基(或凶猛太攀蛇的相应序列)的结构域，该结构域与图22列出5个序列中任一个的相应结构域(或凶猛太攀蛇的相应序列)之间具有至少90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸残基数不超过1、2、3或5个，具体地是与名称为棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名称为红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇序列的部分完全SVP’s之一的相应结构域之间。一个优选实施方案中，与本申请公开的6种蛇毒蛋白酶中的一种的相应结构域之间具有至少90％的序列同一性。
如上所述，一个优选实施方案包括完全处理后的轻链和重链的二聚体分子，该分子从原肽结构域和活化或切割结构域切割而来。优选实施方案中，所述轻链包括：轻链的第57和62位、第90和101位、第95和110位、第112和121位、第129和140位、和/或第151和164位残基间的链内Cys-Cys键，重链的第216和221、第236和252、第377和391，和/或第402和430位残基间的链内Cys-Cys键，以及轻链第172位残基与重链第329位残基间的链间Cys-Cys键。优选实施方案中，所述二聚体SVP是一种完全凝血酶原活化剂，在其它方案中，它是一种部分完全凝血酶原活化剂。优选实施方案中，所述SVP是一种完全或部分完全凝血酶原活化剂，因为其能在无辅因子存在表现出比不完全活化因子例如人因子X或trocarin明显高的活性。优选地，所述完全或不完全凝血酶原活化剂的活性比单独的不完全活化剂例如人因子X或trocarin的活性高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000，或4000倍(2-4个数量级)。这一比较结果是在相同或近似条件下例如无Ca和磷脂存在下，对蛇毒蛋白酶和不完全活化剂进行测量得出的。优选实施方案中，完全或部分完全活化剂活性的％(即完全或部分完全活化剂在无Ca和磷脂存在下的活性与该活化剂在有Ca和磷脂存在下的活性之间的％)比不完全活化剂例如人因子X或trocarin表现的相应％高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000或4000倍。优选的完全或部分完全活化剂在约10-10～10-06M，例如10-8或10-7M浓度下能使柠檬酸化血浆凝块，凝快时间约50-15秒，这表明其是Ca2+和磷脂非依赖性的。因此，所述凝血酶原活化剂在约10-10～10-06M浓度范围内表现辅因子(钙离子和/或磷脂)非依赖性的动力学特性，这是一个适于减少血液流失的工作范围。
本发明的SVP’s不包括trocarin，例如图21所示。优选实施方案中，完全SVP的处理后的轻链与trocarin的处理后的轻链之间有至少1，3，5，10，15或20个不同残基。优选实施方案中，完全SVP的处理后的重链与trocarin的处理后的重链之间有至少5，10，15，20或30个不同残基。(不同指同一性不同或者是通过插入或缺失，除非另有说明)。
优选实施方案中，本发明的完全SVP的序列具有一种或多种下列特征，第41位残基不为丝氨酸(所有编号参照图21中的共有编号)，第48位残基不为异亮氨酸，第50位残基不为脯氨酸，第74位残基不为天冬酰胺，第104位残基不为脯氨酸，第105位残基不为天冬酰胺，第123位残基不为赖氨酸，第127位残基不为谷氨酰胺，第142位残基不为精氨酸，第145-7位残基不为丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸，第154位残基不为丝氨酸，第156位残基不为精氨酸，第159位残基不为缬氨酸，第167位残基不为谷氨酸，第169位残基不为天冬氨酸，第178位残基不为丙氨酸；包含出自图21中棕蛇、太攀蛇、红腹蛇、虎蛇、粗鳞蛇序列中任一序列的序列181-208(或者凶猛太攀蛇中相应序列)中的至少1个残基；第228位残基不为异亮氨酸，第229位残基不为天冬酰胺，第233位残基不为甘氨酸，第232位残基不为谷氨酸，第245位残基不为组氨酸，第258-9位残基不为丝氨酸、缬氨酸；包含出自图21中棕蛇、太攀蛇、红腹蛇、虎蛇、粗鳞蛇序列中任一序列的序列260-270(或者凶猛太攀蛇中相应序列)中的至少1个残基；第274位残基不为精氨酸，第286位残基不为苏氨酸，第292-300位残基不为天冬酰胺-酪氨酸-酪氨酸-酪氨酸-缬氨酸-组氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺，第303位残基不为精氨酸，第305位残基不为丙氨酸，第314位残基不为精氨酸，第338位残基不为谷氨酸，第345位残基不为丝氨酸，第353-360位残基不为RIQFKQPT，第367位残基不为异亮氨酸，第368位残基不为苏氨酸，第382位残基不为天冬氨酸，第384位残基不为精氨酸，第387位残基不为谷氨酰胺，第389位残基不为天冬酰胺，第424位残基不为异亮氨酸，第342位残基不为精氨酸，第451位残基不为赖氨酸，第454-455位残基不为丝氨酸、亮氨酸；或者包含出自图21中棕蛇、太攀蛇、红腹蛇、虎蛇、粗鳞蛇序列中任一序列的序列457-467(或者凶猛太攀蛇中相应序列)中的至少1个残基；
优选实施方案中，部分完全SVP的处理后的轻链与trocarin的处理后的轻链之间有至少1，3，5，10或15个不同残基。优选实施方案中，完全SVP的处理后的重链与trocarin的处理后的重链之间有至少5，10，15，20或30个不同残基。
优选实施方案中，本发明的部分完全SVP的序列出自图21中棕蛇、太攀蛇、红腹蛇、虎蛇、粗鳞蛇序列中任一序列的序列181-208(或者凶猛太攀蛇中相应序列)中的至少1个残基；或包含出自图21中棕蛇、太攀蛇、红腹蛇、虎蛇、粗鳞蛇序列中任一序列的序列260-270(或者凶猛太攀蛇中相应序列)中的至少1个残基。
一个优选实施方案中，所述SVP是一种完全凝血酶原活化剂，包括轻链和/或重链，其中所述轻链与图24中共有序列之间具有至少87、89或90％的序列同一性或者之间的不同残基数不超过16、14或13个，所述重链与图24中共有序列之间具有至少82、85或84％同一性或者之间的不同残基数不超过45、39或40个。
优选实施方案中，完全SVP包括轻链和/或重链，其中所述链与图24所示棕蛇、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇SVP序列相同或具有至少84、86或86％的序列同一性或者之间的不同残基数不超过61或53个。
一个优选实施方案中，所述SVP是一种部分完全凝血酶原活化剂，包括轻链和/或重链，其中所述链与图24所示序列之间具有至少84％序列同一性或者之间的不同残基数不超过61或53个。
优选实施方案中，部分完全SVP包括1条轻链或1条重链或者同时包括轻链和/或重链，其中所述链与图24所示红腹黑蛇、虎蛇或粗鳞蛇SVP序列相同或具有至少84、80或82％的序列同一性或者之间的不同残基数不超过61、76、68个。
其它实施方案中，本发明提供了蛇毒蛋白酶多肽，例如，具有下列氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列编码的氨基酸序列；基本上等同于SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列或SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列编码的氨基酸序列的氨基酸序列；或者与所列氨基酸序列之一具有至少85，90，95，98或99％序列同一性或之间的不同残基数不超过1，2，5，10，15，或20个的序列。
其它实施方案中，本发明提供了蛇毒蛋白酶轻链多肽，例如，具有下列氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示任一氨基酸序列中第41-179位氨基酸残基(编号参照图23中共有序列的编号)，或SEQ IDNO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列编码的氨基酸序列中的第41-179位氨基酸残基；基本上等同于SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列中第41-179位氨基酸残基，或基本上等同于SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列编码的氨基酸序列；或者与所列氨基酸序列之一具有至少85，90，95，98或99％序列同一性或之间的不同残基数不超过1，2，5，10，15，或20个的氨基酸序列。
其它实施方案中，本发明提供了蛇毒蛋白酶重链多肽，例如，具有下列氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示任一氨基酸序列中第235-至少453位氨基酸残基，或SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示核酸序列编码的氨基酸序列中的第235-至少453位氨基酸残基；基本上等同于SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列中第235-至少453位氨基酸残基，或基本上等同于SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列编码的氨基酸序列中第235-至少453位氨基酸残基的氨基酸序列；或者与所列氨基酸序列之一具有至少85，90，95，98或99％序列同一性或之间的不同残基数不超过1，2，5，10，15，或20个的氨基酸序列。
在一个相关方面，本方面提供了包含本申请所述蛇毒蛋白酶核酸分子的核酸构建体。
在一个相关方面，本方面提供了蛇毒蛋白酶多肽或其片段，该多肽或片段可操作连接于蛇毒蛋白酶多肽以形成融合蛋白。一个实施方案中，可以将编码蛇毒蛋白酶轻链、激活剂多肽和蛇毒蛋白酶重链中一个或多个序列连接于编码非蛇毒凝血酶原活化多肽的原肽的序列，例如，人因子Xa原肽编码序列。另一个实施方案中，可以用编码非蛇毒凝血酶原活化多肽的核酸序列将编码蛇毒蛋白酶轻链的序列和编码蛇毒蛋白酶重链的序列彼此连接在一起，例如用人因子X激活剂肽编码序列。其它实施方案中，可将SVP序列融合于一序列，优选融合于易于切割的序列，这样可使分离得以实现，例如，融合于GST部分或表位标签。
另一方面，本发明涉及一种分离的蛋白质，其含有下列氨基酸序列之一或全部：
KREASLPDFVQS[SEQ ID NO：19]；
LKKSDNPSPDIR[SEQ ID NO：20]；和
SVX1VGEIX2X3SR[SEQ ID NO：21]。
X1，X2和X3可以为任一氨基酸。
优选地，X1为缬氨酸或异亮氨酸，X2为天冬酰胺或天冬氨酸，以及X3为精氨酸、赖氨酸或异亮氨酸。
一个实施方案中，所述分离的蛋白质进一步含有选自下列组的氨基酸序列：
MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK[SEQ ID NO：22]和
ANRFLQRTKR[SEQ ID NO：23]
一个具体的实施方案中，本发明所述凝血酶原活化蛋白分离自蛇毒。优选地，本发明所述凝血酶原活化蛋白可获自选自下列非限制组的澳大利亚蛇的蛇毒：任何棕蛇(Psuedonaja sp.)包括常见棕蛇(Pseudonaja textilis)、太攀蛇(Oxyuranus scutellatus)、大陆虎蛇(Notechis scutatus)、粗鳞蛇(Tropidechis carinatus)以及红腹黑蛇(Pseudechis porphyriacus)。
另一方面，本发明涉及编码本发明所述蛇毒蛋白酶多肽或其生物活性片段的分离的核酸。一个优选实施方案中，所述的分离的核酸分子编码的多肽具有SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示的氨基酸序列。其它实施方案中，本方面提供了分离的核酸分子，其具有SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列，或者SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18的全长互补序列。其它实施方案中，本方面提供了基本等同于SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列的核酸分子(例如，天然存在的等位变体)。其它实施方案中，本方面提供了一种核酸分子，其能在本申请所述严谨条件下与含有SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示核苷酸序列的核酸分子杂交，其中所述核酸编码全长蛇毒蛋白酶多肽或其活性片段。
在一个相关的方面，本方面进一步还提供了核酸构建体，其中包含编码蛇毒蛋白酶或其部分的核酸分子，例如，如本发明所述。一些实施方案中，本发明所述核酸分子可操作地连接于天然或异源调控序列。其它实施方案中，所述核酸分子含有：编码原肽的核酸、编码蛇毒蛋白酶轻链的核酸序列、编码激活剂肽的核酸序列以及编码蛇毒蛋白酶重链的核酸序列，其中编码原肽序列和编码激活剂肽的序列中的一个或多个不是来自蛇毒蛋白酶。例如，原肽编码序列和激活剂肽编码序列中的一个或多个可以来自哺乳动物凝血酶原激活剂，例如，人凝血酶原激活剂，例如人因子Xa。另外，本发明还提供了含有本发明所述核酸分子的载体和宿主细胞，例如，适于制备蛇毒蛋白酶核酸分子及多肽的载体和宿主细胞。
另一相关方面，本方面提供了适于作为引物或杂交探针以检测或扩增蛇毒蛋白酶-编码核酸的核酸片段。例如，本发明包括用于扩增下列物质的分离的引物：全长蛇毒蛋白酶，例如本申请所述蛇毒蛋白酶，或本申请所述蛇毒蛋白酶的任一结构域或区域。
另一相关方面，本方面提供了与蛇毒蛋白酶-编码核酸分子的反义核酸分子。
本发明还包括本发明上述的分离的蛋白质和核酸的生物活性片段、变体、衍生物以及同系物。
另一方面，本发明涉及一种抗体，该抗体能够结合分离的蛇毒蛋白酶多肽，例如，本申请所述的蛇毒蛋白酶多肽。一个实施方案中，所述抗体能结合：本申请所述的蛇毒蛋白酶多肽的原肽或其片段、本申请所述的蛇毒蛋白酶多肽的轻链或其片段、本申请所述的蛇毒蛋白酶多肽的激活剂多肽或其片段、或者本申请所述的蛇毒蛋白酶多肽的重链或其片段。另一实施方案中，所述抗体能够结合蛇毒蛋白酶的部分，该部分含有本申请所述的蛇毒蛋白酶多肽的轻链和重链。抗体可用于，例如，从样品中分离蛇毒蛋白酶。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其中含有一种分离的蛇毒蛋白酶多肽(例如，本申请所述的分离的蛇毒蛋白酶多肽)或其生物活性片段以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。一个实施方案中，所述组合物，例如药物组合物，其pH值为约5-9，优选约6.5-7。所述组合物，例如药物组合物，可以进一步含有，例如，稳定剂，如多元醇。所述实施方案中，所述组合物，例如药物组合物可以含有约5％、10％、20％或更多的一种多元醇(或多种多元醇)。可用于所述组合物的多元醇的一个实例为甘油。一些实施方案中，所述组合物，例如药物组合物，不含有辅因子。另一实施方案中，所述组合物，例如药物组合物含有一种或多种辅因子，例如，钙、磷脂和因子Va中的一种或多种。
另一方面，本方面提供了用于筛选药剂(agents)的方法，例如，辅因子等化合物，其能调节蛇毒多肽活性，例如能调节血液凝血反应和/或将凝血酶原处理为凝血酶过程的化合物。一个实施方案中，所述方法包括：提供一种凝血酶原与蛇毒蛋白酶的反应混合物，例如本申请所述蛇毒蛋白酶，然后让反应混合物与一种或多种辅因子(例如，钙、磷脂、因子Va和维生素例如维生素K中的一种或多种)。所述反应混合物可以进一步包括，例如血纤蛋白原。所述方法可以进一步包括：将在有和无所述制剂例如辅因子存在情况下比较蛇毒蛋白酶处理凝血酶原的活性。另一实施方案中，所述方法包括：提供一种样品(例如，血样)，让该样品与蛇毒蛋白酶在有和无所述制剂例如辅因子存在的情况下接触，并比较辅因子对蛇毒蛋白酶凝血作用的影响。另一实施方案中，所述方法包括：让血小板与蛇毒蛋白酶在有和无所述制剂例如辅因子存在情况下接触，测定所述药剂对血小板活化的作用。
一个实施方案中，本发明涉及通过柠檬酸盐抗凝血化的全血或其血浆级分测定活性水平的方法，所述柠檬酸盐抗凝血化的全血或其血浆级分可用于通过测量固体血凝块形成的时间来测定蛇毒多肽(蛋白酶)的活性。这种测定可手工操作或者使用任一自动血凝测量装置进行。另外，蛋白酶的活性还可以通过使用连接有对硝基苯胺(p-nitroanilide)的四肽(显色底物)测量，这种四肽与蛋白酶底物(凝血酶原)的特异性结构域相类似。这种测定方法是一种测量溶液中p-硝基苯胺形成速率的简单的比色测定法。
另一方面，本发明涉及治疗受试者的方法，例如通过诱导止血。该方法包括向受试者施用本发明的蛇毒蛋白酶，从而例如通过诱导止血治疗受试者。
一个优选实施方案中，治疗受试者以抑制该受试者体表或体内部位的流血。所述治疗可用于抑制与医学处理例如外科手术相关的流血。其它实施方案中，治疗对象为伤口、创伤或其它伤害。
一些实施方案中，所述受试者为缺陷患者，不能形成或维持血凝块。这种缺陷可以是基因缺陷也可以是医学处理导致的，例如因施用会减弱受试者形成或维持血凝块能力的药物导致的，例如苄芮酮香豆素钠(coumadine)或华法令(Warfarin)。
一个实施方案中，将所述蛇毒蛋白酶施用给受试者之外的人，而在其它实施方案中，所述蛇毒蛋白酶为自体-施用。所述的受试者之外的人可以是卫生保健提供者(health care provider)但在一些情况下也可以不是卫生保健提供者。例如，一些实施方案中，所述产品可用于治疗战场外伤，由除卫生保健提供者之外的人给药。
一些实施方案中，将所述蛇毒蛋白酶提前提供给需要使用它的受试者，例如，因缺陷而不能形成或维持血凝块的受试者，或者被认为是易受创伤的个体，例如军人、操作危险机械的人、或者经常从事危险职业的人，例如农业或采矿业。所述蛇毒蛋白酶附有文字、音频或视频、或者口头的使用说明书。
一些实施方案中，所述蛇毒蛋白酶以能使得使用者(受试者或向受试者用药的人)可按计量好的剂量施用的形式提供。因此，可将所述蛇毒蛋白酶置于分配装置，例如，分配液体、液滴、气溶胶、干粉等的装置，优选按计量好的剂量分配。
另一方面，本方面提供了一种活化凝血酶原的方法。该方法包括让凝血酶原与本发明的蛇毒蛋白酶接触，从而活化所述凝血酶原。所述凝血酶原可以在体外或体内活化。一个实施方案中，所述凝血酶原包括脱羧凝血酶原。
具体实施方案中，所述诱导止血和/或凝血酶原活化的组合物和方法可以用于阻止血液从伤口流失。一个这样的实施方案中，所述组合物可以是组织封闭剂和/或血纤蛋白胶的组合物。还应该想到的是抗血纤蛋白溶解药剂可以作为此类实施方案的部分。抗血纤蛋白溶解剂可以选自包括下列物质的非限制组：textilinin(国际公开号WO 99/58569)，抑酶肽和EACA，其中的任一个都可以加入进去，通过抑制纤溶酶或纤溶酶激活剂的作用从而阻止血凝块的溶解。
另一方面，本发明涉及一种用于获得蛋白质、核酸、或文库、或者核酸或蛋白质的序列信息的方法，例如，如本发明所述。例如，用于获得蛇蛋白质，例如SVP，例如本申请所述的SVP；编码蛇蛋白质的核酸，例如编码SVP的核酸，例如本申请所述的SVP；或者本申请所述的任一文库。这些方法在本申请中称为“以采集为基础(collection based)的方法”。该方法包括：采集选自下列蛇组成的非限制组的澳大利亚蛇：棕蛇(Pseudonajatextilis)、西部拟眼镜蛇(Pseudonaja nuchalis)、Pseudonaja affinis、Pseudonajainframacula、太攀蛇(Oxyuranus scutellatus)、凶猛太攀蛇(Oxyuranusmicrolepidotus)、大陆虎蛇(Notechis scutatus)、Notechis ater niger，Notechisater serventyi，Hoplocephalus stephansii、红腹黑蛇(Pseudechis porphyriacus)、Australaps surperba、粗鳞蛇(Tropidechis carinatus)(或者从所述这些蛇采集组织或者采集用所述这些蛇制备成的组织，例如，卵，或丢弃的组织如脱落的皮肤)以及从蛇或从蛇的后代获取蛋白质、核酸、或文库，或者从来自蛇或蛇后代的蛋白质或核酸中获取序列信息。
所述方法可以包括采集死亡的澳大利亚蛇或者捕获活的澳大利亚蛇或活的受伤的澳大利亚蛇。一个实施方案中，所述方法进一步包括：从蛇获取样品，例如从蛇获取蛇毒样品；以及从所述样品，例如从蛇毒样品获取蛋白质或蛋白质文库。其它实施方案包括：从蛇获取样品；以及从所述样品，例如从毒腺获取核酸或核酸文库。
所述方法还可包括从取自蛇或其后代的材料测定核酸或蛋白序列。
所述方法还可包括用采集到的蛇或其后代制备蛋白或核酸文库。
所述方法还可包括获取多肽，用于例如动物、人或植物保健，工业处理或诊断。
另一个实施方案中，所述方法还可包括：采集蛇或样品，然后将采集来的蛇或样品送达乙方，例如在另外一个国家执行该方法后续步骤的一方。
另一个方面，本发明涉及蛋白质、核酸、或文库，或者核酸或蛋白质的序列信息，例如，如本发明所述到的，其是用本申请所述方法制备或生产的，例如本申请所述的一种采集方法。在优选的实施方案中，本发明涉及一种蛇蛋白，例如一种SVP，如一种本申请所述的SVP，或者编码蛇蛋白的核酸，例如编码SVP例如本申请所述的SVP的核酸；或者用本申请所述方法，例如用本申请所述方法，例如本文的采集方法产生或制备的本文所述任一文库或本申请所述任一核酸或蛋白的序列信息。
一个方面，，本发明涉及含有下列序列的分离的多肽：
MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKX1ANRFLQRTKRX2NSLX3EEX4X5X6GNIERECIEEX7CSKEEAREX8FX9DX10EKTEX11FWNVYVDGDQCSSNPCHYX12GX13CKDGIGSYTCTCLX14X15YEGKNCEX16X17LX18X19SCRX20X21NGNCWHFCKX22VQX23X24X25QCSCAEX26YX27LGX28DGHSCVAX29GX30FSCGRNIKX31RNKREASLPDFVQSX32X33AX34X35KKSDNPSPDIRIX36NGMDCKLGECPWQAX37LX38X39X40X41X42X43X44FCGGTILSPIX45VLTAAHCIX46X47X48X49X50X51SVX52VGEIX53X54SRX55X56X57X58X59LLSVDK60YVHX61KFVX62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77YDYDIAIX78X79X80KTPIQFSENVVPACLPTADFAX81X82VLMKQDX83GIX84SGFGX85X86X87X88X89X90X91X92SX93X94LKX95X96X97VPYVDRHTCMX98SSX99X100X101ITX102X103MFCAGYDTLPX104DACQGDSGGPHITAYX105DTHFX106TGIX107SWGEGCAX108X109GX110YGX111YTKX112SX113FIX114WIKX115X116MX117X118X119Z，
其中X1，X10，X12-13，X15-16，X19-23，X25，X27-30，X33-34，X37，X39，X42-47，X50，X53-56，X58-62，X64，X79，X81-83，X85-94，X96，X99-105，X108-109，X113-115和X117-119彼此独立地选自任一种氨基酸残基；
X2，X6，X11，X14，X26，X31，X48，X57和X63均为小的氨基酸残基；
X3，X4，X8，X17，X18，X35-36，X38，X51-52，X78，X80，X84，X95，X98，X106-107，X111-112和X116均为疏水氨基酸残基；
X5，X7和X110均为碱性氨基酸残基；
X9，X40-41和X49均为带电氨基酸残基；
X24为酸性氨基酸残基；
X32为中性/极性氨基酸残基；
X65-67，X70-72和X75各自独立地缺失或者各自独立地选自任一种氨基酸残基；
X68和X74各自独立地缺失或者各自独立地选自酸性氨基酸残基；
X69，X73和X76各自独立地缺失或者各自独立地选自疏水氨基酸残基；
X77缺失或为一种小的氨基酸残基；以及
Z缺失或为一种长度为1-20个氨基酸的肽。
一些实施方案中，X1选自疏水或酸性氨基酸残基，例如Val或其修饰形式，或者Glu或其修饰形式。一些实施方案中，X2选自Ala或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X3选自Tyr或Phe或其修饰形式。一些实施方案中，X4选自Phe或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X5选自Lys或Arg或其修饰形式。一些实施方案中，X6选自Pro或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X7选自Arg或Lys或其修饰形式。一些实施方案中，X8选自Val或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X9选自Glu或Lys或其修饰形式。
一些实施方案中，X10为中性/极性或酸性氨基酸残基，例如X10选自Asp或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X11选自Thr或Ala或其修饰形式。一些实施方案中，X12为一种小的或碱性氨基酸残基或其修饰形式，例如，X12选自Gly或Arg或其修饰形式。一些实施方案中，X13为一种疏水或小的氨基酸残基或其修饰形式，例如，X13选自Ile或Thr或其修饰形式。一些实施方案中，X14选自Pro或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X15为一种小的或中性/极性氨基酸残基，例如，X15选自Gly或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X16为一种碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X16选自Arg，His或Lys或其修饰形式。一些实施方案中，X17选自Val或Leu或其修饰形式。一些实施方案中，X18选自Tyr或Phe或Leu或其修饰形式。一些实施方案中，X19为一种碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X19选自Lys或Gln或其修饰形式。
一些实施方案中，X20为一种疏水或小的氨基酸残基，例如，X20选自Val，Phe或Ala或其修饰形式。一些实施方案中，X21为一种酸性或疏水氨基酸残基，例如，X21选自Asp或Phe或其修饰形式。一些实施方案中，X22为一种小的或碱性氨基酸残基，例如，X22选自Pro，Asp或Phe或其修饰形式。一些实施方案中，X23为一种中性/极性或小的氨基酸残基，例如，X23选自Asn或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X24选自Asp或Glu或其修饰形式。一些实施方案中，X25为一种疏水或小的氨基酸残基，例如，X25选自Ile或Thr或其修饰形式。一些实施方案中，X26选自Gly或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X27为一种疏水或碱性氨基酸残基，例如，X27选自Leu或Arg或其修饰形式。一些实施方案中，X28为一种酸性或疏水氨基酸残基，例如，X28选自Glu，Asp或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X29为一种小的或酸性氨基酸残基，例如，X29选自Gly或Glu或其修饰形式。
一些实施方案中，X30为一种中性/极性或酸性氨基酸残基，例如，X30选自Asn或Asp或其修饰形式。一些实施方案中，X31选自Thr或Ala或其修饰形式。一些实施方案中，X32选自His或Gln或其修饰形式。一些实施方案中，X33是中性/极性或碱性氨基酸残基，例如，X33选自Asn或Lys或其修饰形式。一些实施方案中，X34为一种小的或疏水氨基酸残基，例如，X34选自Thr或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X35选自Leu或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X36选自Val或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X37为一种小的或疏水氨基酸残基，例如，X37选自Ala或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X38选自Val，Leu或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X39为一种酸性或中性/极性氨基酸残基，例如，X39选自Asp或Asn或其修饰形式。
一些实施方案中，X40选自Asp，Glu或Lys或其修饰形式。一些实施方案中，X41选自Lys或Glu或其修饰形式。一些实施方案中，X42为一种带电的或小的氨基酸残基，例如，X42选自Lys，Glu或Gly或其修饰形式。一些实施方案中，X43为一种小的或酸性氨基酸残基，例如，X43选自Gly，Asp或Glu或其修饰形式。一些实施方案中，X44为一种小的或疏水氨基酸残基，例如，X44选自Ala或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X45为一种疏水或中性/极性氨基酸残基，例如，X45选自Tyr或His或其修饰形式。一些实施方案中，X46为一种小的或中性/极性氨基酸残基，例如，X46选自Thr或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X47为一种酸性或中性/极性氨基酸残基，例如，X47选自Glu或Gln或其修饰形式。一些实施方案中，X48选自Thr或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X49选自Glu或Lys或其修饰形式。
一些实施方案中，X50为一种小的、疏水的或中性/极性氨基酸残基，例如，X50选自Thr，Met，His或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X51选自Ile或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X52选自Val或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X53为一种酸性或中性/极性氨基酸残基，例如，X53选自Asp或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X54为一种碱性或疏水氨基酸残基，例如，X54选自Arg或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X55为一种小的或碱性氨基酸残基，例如，X55选自Ala或Lys或其修饰形式。一些实施方案中，X56为一种酸性或中性/极性氨基酸残基，例如，X56选自Glu或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X57选自Pro或Thr或其修饰形式。一些实施方案中，X58为一种小的或碱性氨基酸残基，例如，X58选自Gly或Arg或其修饰形式。一些实施方案中，X59为一种小的、碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X59选自Pro，Arg或His或其修饰形式。
一些实施方案中，X60为一种疏水或小的氨基酸残基，例如，X60选自Val，Ile或Ala或其修饰形式。一些实施方案中，X61为一种、中性/极性或小的氨基酸残基，例如，X61选自Lys，Gln或Thr或其修饰形式。一些实施方案中，X62为一种小的或疏水氨基酸残基例如，X62选自Pro或Leu或其修饰形式。一些实施方案中，X63选自Pro或Ala或其修饰形式。一些实施方案中，X64为一种碱性、小的或中性/极性氨基酸残基例如，X64选自Lys，Thr或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X65存在时为一种碱性、小的或疏水氨基酸残基例如，X65选自Lys，Ser或Tyr或其修饰形式。一些实施方案中，X66存在时为一种小的或疏水氨基酸残基，例如，X66选自Ser，Gly或Tyr或其修饰形式。一些实施方案中，X67存在时为一种中性/极性或疏水氨基酸残基，例如，X67选自Gln或Tyr或其修饰形式。一些实施方案中，X68当存在时为Glu或其修饰形式。一些实施方案中，X69存在时选自Phe或Val或其修饰形式。
一些实施方案中，X70存在时为一种疏水或中性/极性氨基酸残基，例如，X70选自Tyr或His或其修饰形式。一些实施方案中，X71存在时为一种酸性或中性/极性氨基酸残基，例如，X71选自Glu或Gln或其修饰形式。一些实施方案中，X72存在时为一种碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X72选自Lys或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X73存在时选自Phe或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X74存在时为Asp或其修饰形式。一些实施方案中，X75存在时为一种疏水或碱性氨基酸残基，例如，X75选自Leu或Arg或其修饰形式。一些实施方案中，X76存在时选自Val或Phe或其修饰形式。一些实施方案中，X77存在时选自Ser或Ala或其修饰形式。一些实施方案中，X78选自Ile或Leu或其修饰形式。一些实施方案中，X79为一种中性/极性或碱性氨基酸残基，例如，X79选自Gln或Arg或其修饰形式。
一些实施方案中，X80选自Met或Leu或其修饰形式。一些实施方案中，X81为一种中性/极性或碱性氨基酸残基，例如，X81选自Asn或Lys或其修饰形式。一些实施方案中，X82为一种中性/极性或酸性氨基酸残基，例如，X82选自Gln或Glu或其修饰形式。一些实施方案中，X83为一种疏水或小的氨基酸残基，例如，X83选自Phe或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X84选自Val或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X85为一种小的、碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X85选自Gly，Arg或His或其修饰形式。一些实施方案中，X86为一种疏水或小的氨基酸残基例如，X86选自Ile或Thr或其修饰形式。一些实施方案中，X87为一种疏水、碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X87选自Phe，Arg或Gln或其修饰形式。一些实施方案中，X88为一种酸性、小的或疏水氨基酸残基，例如，X88选自Glu，Ser或Phe或其修饰形式。一些实施方案中，其中X89为一种碱性、小的或疏水氨基酸残基，例如，X89选自Arg，Lys，Gly，或Ile或其修饰形式。
一些实施方案中，X90为一种小的或中性/极性氨基酸残基，例如，X90选自Gly，或Gln或其修饰形式。一些实施方案中，X91为一种小的、中性/极性或疏水氨基酸残基，例如，X91选自Pro，Gln或Tyr或其修饰形式。一些实施方案中，X92为一种中性/极性或小的氨基酸残基，例如，X92选自Asn，Gln或Thr或其修饰形式。一些实施方案中，X93为一种碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X93选自Lys或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X94为一种小的或疏水氨基酸残基例如，X94选自Thr或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X95选自Leu，Val或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X96为一种碱性或小的氨基酸残基，例如，X96选自Lys或Thr或其修饰形式。一些实施方案中，X97选自Val或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X98选自Leu或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X99为一种中性/极性或酸性氨基酸残基，例如，X99选自Asn，Glu或Asp或其修饰形式。
一些实施方案中，X100为一种疏水或小的氨基酸残基，例如，X100选自Phe或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X101为一种小的或碱性氨基酸残基，例如，X101选自Pro或Arg或其修饰形式。一些实施方案中，X102为一种小的或中性/极性氨基酸残基，例如，X102选自Pro或Gln或其修饰形式。一些实施方案中，X103为一种小的或中性/极性氨基酸残基，例如，X103选自Thr或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X104为一种中性/极性或碱性氨基酸残基，例如，X104选自Gln或Arg或其修饰形式。一些实施方案中，X105为一种碱性或小的氨基酸残基，例如，X105选自Arg或Gly或其修饰形式。一些实施方案中，X106选自Ile或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X107选自Val或Ile或其修饰形式。一些实施方案中，X108为一种碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X108选自Arg，Gln或Lys或其修饰形式。一些实施方案中，X109为一种碱性或小的氨基酸残基，例如，X109选自Lys或Thr或其修饰形式。
一些实施方案中，X110选自Arg或Lys或其修饰形式。一些实施方案中，Xx选自Ile或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X112选自Leu或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X113为一种碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X113选自Lys或Asn或其修饰形式。一些实施方案中，X114为一种小的或疏水氨基酸残基，例如，X114选自Pro或Leu或其修饰形式。一些实施方案中，X115为一种碱性或小的氨基酸残基，例如，X115选自Arg，Lys或Ala或其修饰形式。一些实施方案中，X116选自Ile或Val或其修饰形式。一些实施方案中，X117为一种碱性或小的氨基酸残基，例如，X117选自Arg或Ser或其修饰形式。一些实施方案中，X118为一种中性/极性、碱性或疏水氨基酸残基，例如，X118选自Gln，Lys或Leu或其修饰形式。一些实施方案中，X119为一种碱性或中性/极性氨基酸残基，例如，X119选自Lys或His或其修饰形式。
一些实施方案中，Z存在并且含有序列X118PSTESSTGRL，其中X118为任一氨基酸残基。一些实施方案中，X118为一种疏水或中性极性氨基酸残基，例如，X118选自Leu或Gln或其修饰形式。
一些实施方案中，X65-77代表一段长为n个氨基酸的序列，其中n为0-13个氨基酸残基，例如，所述序列选自KX119X120EFYEKFDLVS、SYYQNIDRFA或YYYVHQNFDRVA，其中X119为一种小的氨基酸残基，例如，X119选自Ser或Gly或其修饰形式；以及X120为任一氨基酸残基，例如，X120选自Gln或Tyr或其修饰形式。
本发明的其它特点和优势可以从下面的发明详述部分和权利要求中显而易见的看出。
表格和附图的说明
表1：使用Sephacryl S-300纯化棕蛇蛇毒蛋白酶过程中的样品鉴定。
表2：使用Superdex 200纯化棕蛇蛇毒蛋白酶过程中的样品鉴定。
表3：采用方案1纯化棕蛇蛇毒蛋白酶过程中的样品鉴定。
表4：采用方案2纯化棕蛇蛇毒蛋白酶过程中的样品鉴定。
表5：采用方案3纯化棕蛇蛇毒蛋白酶过程中的样品鉴定。
表6：采用方案4纯化棕蛇蛇毒蛋白酶过程中的样品鉴定。
表7：在加和不加辅助成分时，S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶复合物作用下的水解情况(单独使用棕蛇蛇毒蛋白酶复合物，棕蛇蛇毒蛋白酶复合物加10mM CaCl2以及棕蛇蛇毒蛋白酶复合物加10mM CaCl2和磷脂)。
表8：柠檬酸化血浆在下列物质作用下的凝血时间：单独使用棕蛇蛇毒蛋白酶复合物、棕蛇蛇毒蛋白酶复合物加10mM CaCl2，以及棕蛇蛇毒蛋白酶复合物加10mM CaCl2和磷脂。
表9：柠檬酸化血浆凝血试验±Ca2+的凝血时间，添加了源自P.textilis(棕蛇)的分离的蛇毒蛋白酶。
表10：柠檬酸化血浆在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的凝血情况。
表11：在源自P.textilis的分离的蛇毒蛋白酶作用下，S-2222水解的初始速度，加或未加Ca2+。
表12：柠檬酸化人血浆产生血凝块的大致凝血时间，其使用棕蛇蛇毒蛋白酶加40mM CaCl2，或棕蛇蛇毒蛋白酶，以及单独使用40 CaCl2。
表13：用各种方法测定棕蛇蛇毒蛋白酶的分子量。
表14：尾静脉出血小鼠模型用棕蛇蛇毒蛋白酶处理时的血液流失。
表15：棕蛇蛇毒蛋白酶(测试)及盐水(对照)处理小鼠的血液流失情况。可以看到每一测试小鼠个体的数据以及平均血液流失土标准偏差(SD)。
表16：柠檬酸化人血浆在各种澳大利亚本地以及外来蛇蛇毒作用下的凝血情况。
图1：棕蛇蛇毒(10mL；233mg)用ConA-Sepharose 4B层析柱(2.5×16cm)层析后以0.05M Tris-HCl，pH 7.4洗脱的图谱。A.层析曲线的模式描迹(Trace of chromatography pattern)。在箭头B所指处将洗脱缓冲液(0.02M甲基α-D甘露吡喃糖苷溶于0.05M Tris-HCl)应用到层析柱。将具有S-2222水解活性的级分汇总并浓缩(A线标示的那段)。
图2：ConA-Sepharose 4B层析峰汇总并浓缩后的SDS PAGE。泳道1：分子量标志(大小用kDa表示)，泳道2：没加β-巯基乙醇的棕蛇蛇毒蛋白酶复合物，泳道3：加入了β-巯基乙醇的棕蛇蛇毒蛋白酶复合物。
图3：源自棕蛇的蛇毒蛋白酶复合物经0.8M NaSCN处理后，对柠檬酸化血浆凝血时间以及S-2222水解的影响。
图4：棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的HPLC数据。
图5：SDS PAGE±β-Me。泳道1：10μl BIO-RAD分子量标志；泳道2：20μl棕蛇蛇毒；泳道3：20μl完整的Pt-PA；泳道4：20μl Sephacryl S-300(1)汇总级分30-43；泳道5：20μl Sephacryl S-300(2)汇总级分25-29；泳道6、7和8：10μl Sephacryl S-300(3)汇总级分25-29；泳道9：20μl SephacrylS-300(3)汇总级分25-29+β-Me；以及泳道10：20μl完整血清蛇毒蛋白酶复合物+β-Me。
图6：棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的SDS-PAGE，加或未加β-Me。泳道1：BIO-RAD分子量标志；泳道2：完整棕蛇蛇毒；泳道3：Sephacryl S-300(3)混合级分30-43；泳道4：Sephacryl S-300(#3)；泳道5：S-300(#3)+β-Me；泳道6：S300(#3)；泳道7：Sephacryl S-300(#3)+β-Me；泳道8：Sephacryl S-300(3)混合级分30-43+β-Me；泳道9：完整棕蛇蛇毒蛋白酶复合物+β-Me；以及泳道10：BIO-RAD分子量标志。#代表棕蛇蛇毒蛋白酶复合物按照上述进行Sephacryl S-300层析后混合并浓缩所得的活性峰。所有样品都为10μl等份溶液。
图7A：棕蛇蛇毒蛋白酶复合物(18mL；50.4mg)在Superdex 200层析柱(2.5×90cm)的0.05M Tris-HCl，pH 7.4，0.8M NaSCN中进行层析步骤1后的洗脱曲线。混合并浓缩具有S-2222活性的级分，即A线所标示的那段。
图7B：用与图7A相同的条件进行层析步骤2。
图7C：棕蛇蛇毒蛋白酶经Superdex 200纯化所得样品的SDS PAGE。泳道1&2.层析步骤1所得混合浓缩物，加β-巯基乙醇(2)，不加β-巯基乙醇(1)；泳道3&4.层析步骤2所得混合浓缩物，加β-巯基乙醇(5)，不加β-巯基乙醇(4)；泳道5.分子量标志物(大小用kDa表示)；箭头A、B和C指示泳道4中的杂质。
图8A：无辅助成分存在时，柠檬酸化血浆在棕蛇蛇毒蛋白酶(称为Pt-PA蛋白酶)作用下的凝血情况(数据点是双份平行测量的平均值)。
图8B：加入10mM CaCl2时，柠檬酸化血浆在棕蛇蛇毒蛋白酶(“Pt-PA”)作用下的凝血情况。
图8C：加入10mM CaCl2和磷脂时，柠檬酸化血浆在棕蛇蛇毒蛋白酶(“Pt-PA”)作用下的凝血情况。
图9A：无辅助成分存在时，S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶(称为Pt-PA蛋白酶)作用下的水解情况(数据点是双份平行测量的平均值)。
图9B：加入10mM CaCl2且无辅助成分存在时，S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的水解情况(数据点是双份平行测量的平均值)。
图9C：加入10mM CaCl2和磷脂且无辅助成分存在时，S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的水解情况(数据点是双份平行测量的平均值)。
图9D：图9A、图9B和9C中各个图线的斜率和R2值。R2值是直线的相关系数。
图10：凝血酶原在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的活化情况。在X轴所示的时间段内，凝血酶原(100μL 1.3mg/mL的制剂)在棕蛇蛇毒蛋白酶(20μL 1.3mg/mL的制剂)作用下转化为凝血酶，反应的总体积为500μL。然后每一反应物取一等份加入柠檬酸化血浆凝血试验，测量凝血时间(Y-轴)。
图11A：凝血酶原经棕蛇蛇毒蛋白酶孵育后的非还原性SDS PAGE。在第0分钟时将棕蛇蛇毒蛋白酶加入凝血酶原(时间，t＝0)；泳道1，分子量标志物(大小用kDa表示)；泳道2，t＝0；泳道3，t＝6分钟；泳道4，t＝24小时；泳道5，t＝48小时。PT，凝血酶原；PT1，p前凝血酶1；T，凝血酶；F1.2，片段1.2；PT2，前凝血酶2；F1，片段1。
图11B：S-2238在由棕蛇蛇毒蛋白酶-生成的凝血酶作用下的水解情况。
图12：我们提出的凝血酶原在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下活化的模型。箭头标示的是被凝血酶和棕蛇蛇毒蛋白酶切割的键。
图13：血纤蛋白凝块在β-巯基乙醇存在下的SDS PAGE。泳道1.分子量标志物(大小用kDa表示)；泳道2.柠檬酸化血浆在22μg棕蛇蛇毒蛋白酶单独作用下获得的血纤蛋白凝块；泳道3.柠檬酸化血浆在22μg棕蛇蛇毒蛋白酶加40mM CaCl2作用下获得的血纤蛋白凝块；泳道4.单独使用40mM CaCl2得到的血纤蛋白凝块；泳道5.人血纤蛋白原。凝胶右边的希腊字母表示人血纤蛋白原的链，包括Aα(α单体和血纤肽A)，Bβ(β单体与血纤肽B)以及γ链。
图14：蛋白酶活性位点的图谱。经过及未经DNS-GGACK处理的纯化的棕蛇蛇毒蛋白酶的SDS PAGE。泳道1和2.被DNS-GGACK抑制的棕蛇蛇毒蛋白酶复合物，有β-巯基乙醇(2)和无β-巯基乙醇(1)。泳道3和4.经DNS-GGACK抑制的棕蛇蛇毒蛋白酶，有β-巯基乙醇(4)和无β-巯基乙醇(3)。泳道5-8是未经DNS-GGACK抑制的泳道1-4的重复，用考马氏蓝染色。泳道9.分子量标志物(大小用kDa表示)。
图15：棕蛇蛇毒蛋白酶、trocarin和人因子Xa中含推定活性位点的蛋白片段的氨基酸序列比对，提议的相互作用性组氨酸用粗体表示。
图16：推测的棕蛇蛇毒蛋白酶重链与Trocarin的部分氨基酸序列比对。期望值(E)是一种参数，反映在NCBI数据库中搜索时偶然发现的命中(hit)数。期望值越接近0，序列的匹配就越显著。E值随两序列之间的匹配分值而呈指数减小，该数值还取决于所比较序列的长度。期望值为1表示在数据库内偶然出现1个匹配得到一个近似分值。分值＝39.7，期望值＝0.004；同一性＝11/11(100％)，相似性(positives)＝11/11(100％)。
图17：推测的棕蛇蛇毒蛋白酶重链与人因子Xa之间的部分氨基酸序列比对。
图18：推测的棕蛇蛇毒蛋白酶轻链与Trocarin之间的部分氨基酸序列比对。
图19：推测的棕蛇蛇毒蛋白酶轻链与小鼠因子X之间的部分氨基酸序列比对。分值＝24.8，期望值＝116；同一性＝9/12(75％)，相似性＝9/12(76％)。
图20A：编码P.textilis(常见棕蛇)蛇毒蛋白酶的核苷酸序列[SEQ ID NO：1]。
图20B：P.textilis(常见棕蛇)蛇毒蛋白酶的氨基酸序列[SEQ ID NO：2]。
图21.分离自下列澳大利亚蛇的毒腺的蛇毒蛋白酶与Trocarin[SEQ IDNO：31]之间的氨基酸序列比对：P.textilis(棕蛇)[SEQ ID NO：2]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQ ID NO：5]，P.porphyriacus(红腹黑蛇)[SEQ IDNO：11]，N.scutatus(大陆虎蛇)[SEQ ID NO：14]，T.carinatus(粗鳞蛇)[SEQID NO：17]。
图22.分离的蛇毒蛋白酶与人Xa[SEQ ID NO：27]之间的氨基酸序列比对。给出的是源自下列蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列：棕蛇[SEQ ID NO：2]，海岸太攀蛇[SEQ ID NO：5]，红腹黑蛇[SEQ ID NO：11]，粗鳞蛇“Roughie”[SEQ ID NO：14]以及大陆虎蛇[SEQ ID NO：17]。
图23.分离自下列澳大利亚蛇毒腺的蛇毒蛋白酶之间的氨基酸序列比对：P.textilis(棕蛇)[SEQ ID NO：2]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQ ID NO：5]，O.microepidotus(凶猛太攀蛇)[SEQ ID NO：8]，P.porphyriacus(红腹黑蛇)[SEQ ID NO：11]，N.scutatus(大陆虎蛇)[SEQ ID NO：14]和T.carinatus(粗鳞蛇)[SEQ ID NO：17]。
图24.分离自下列澳大利亚蛇的毒腺的蛇毒蛋白酶与共有序列[SEQ IDNO：]之间的氨基酸序列比对：P.textilis(棕蛇)[SEQ ID NO：2]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQ ID NO：5]，O.microepidotus(凶猛太攀蛇)[SEQ ID NO：8]，P.porphyriacus(红腹黑蛇)[SEQ ID NO：11]，N.scutatus(大陆虎蛇)[SEQ IDNO：14]和T.carinatus(粗鳞蛇)[SEQ ID NO：17]。
图25.编码下列澳大利亚蛇蛇毒蛋白酶的核酸的核苷酸序列比对：P.textilis(棕蛇)[SEQ ID NO：1]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQ ID NO：4]，O.microlepidotus(凶猛太攀蛇)[SEQ ID NO：7]，P.porphyriacus(红腹黑蛇)[SEQID NO：10]，N.scutatus(大陆虎蛇)[SEQ ID NO：13]，和T.carinatus(粗鳞蛇)[SEQ ID NO：16]。
图26.编码下列澳大利亚蛇蛇毒蛋白酶的核酸与因子Xa[SEQ ID NO：26]之间的核苷酸序列比对：P.textilis(棕蛇)[SEQ ID NO：1]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQ ID NO：4]，P.porphyriacus(红腹黑蛇)[SEQ ID NO：10]，N.scutatus(大陆虎蛇)[SEQ ID NO：13]和T.carinatus(粗鳞蛇)[SEQ ID NO：16]。
图27：显示的是经和未经棕蛇蛇毒蛋白酶处理的小鼠尾巴(注意：经蛋白酶处理形成大的血凝块)。
图28：小鼠出血结果的箱形图(Box plot)。每个箱形图表示包括50％数值的一个范围。其中须线(whisker)是从箱体向最高和最低值延伸的线。贯穿箱体的线代表中间值。
发明详述
蛇毒富含能通过抑制和/或活化血小板聚集，血纤蛋白溶解和凝血级联反应途径中的因子从而影响哺乳动物止血机制的蛋白质以及其它成分。特别值得一提的是蛇毒蛋白酶是澳大利亚蝙蝠蛇所独有的。通常，凝血酶原经蛋白水解切割成为其活性形式凝血酶是由哺乳动物系统中的凝血酶原酶复合物催化的。凝血酶原酶中功能性的蛋白酶是因子Xa。但是，为显示最佳活性，在钙离子和磷脂存在下，Xa酶还需要因子Va作为辅因子。
本发明部分是以从澳大利亚蛇中分离蛇毒蛋白酶为基础的。澳大利亚蛇的实例包括澳大利亚常见的棕蛇，海岸太攀蛇，凶猛太攀蛇，大陆虎蛇，粗鳞蛇和红腹黑蛇以及蝙蝠蛇科的其它蛇。本发明所述蛇毒蛋白酶在体内模拟因子Xa的作用，将凝血酶原切割为凝血酶，但是它们在无辅因子例如因子Va、磷脂和钙存在下也能发挥作用。因此，本申请所述蛇毒蛋白酶可以作为完全或部分完全凝血酶原活化剂起作用。本申请使用的“完全凝血酶原活化剂”是指在无钙、磷脂和因子Va存在下能将凝血酶原处理成为凝血酶的蛇毒蛋白酶。可作为完全凝血酶原活化剂的蛇毒蛋白酶的实例包括来自棕蛇和太攀蛇的蛇毒蛋白酶。本申请使用的“部分完全凝血酶原活化剂”是指在可以无钙、磷脂存在，但必需有因子Va存在的条件下能将凝血酶原处理成为凝血酶的蛇毒蛋白酶。
在一个具体的实施方案中，本方面提供了分离自下列蛇的蛇毒的分离的蛇毒蛋白酶：常见的澳大利亚棕蛇(P.textilis)、海岸太攀蛇或凶猛太攀蛇(Oxyuranus scutellatus)、大陆虎蛇(Notechis scutatus)、粗鳞蛇(Tropidechiscarinatus)和红腹黑蛇(Pseudechis porphyriacus)。
本发明的蛇毒蛋白酶可以分离自本申请中称之为″蛇毒蛋白酶复合物″的凝血酶原酶复合物。所述蛇毒蛋白酶复合物可以含有数种蛋白质和/或辅因子。本发明的蛇毒蛋白酶包括，例如，图23中所示的那些蛋白质及其蛋白水解的亚片段。图23图示了来自棕蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQID NO：2)；来自海岸太攀蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)；来自凶猛太攀蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)；来自红腹黑蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)；来自虎蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)；以及来自粗鳞蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。
本发明的蛇毒蛋白酶含有大量相互共有的结构特征。“家族”一词当用来指本发明的蛋白质及核酸分子时，意味着两种或多种蛋白质或核酸分子，其具有共同的结构域或基序，并且具有如本申请所述的足够的氨基酸或核苷酸序列同源性。这类家族的成员可以是天然存在的或者也可以是非天然存在的，可以来自相同或不同物种。家族成员还可以具有共同的功能特性。
本申请中使用的“蛇毒蛋白酶活性”、“蛇毒蛋白酶生物活性”或“蛇毒蛋白酶功能活性”，是指蛇毒蛋白酶蛋白、多肽或核酸分子显示的活性。例如，蛇毒蛋白酶活性可以是下列能力中的一种或多种：可将凝血酶原处理成为凝血酶的活性(例如，能够在凝血酶原的第274位精氨酸残基和第275位苏氨酸残基之间，以及凝血酶原的第323位精氨酸残基和第324位异亮氨酸残基之间切割凝血酶原，例如，能够在凝血酶原的第274位精氨酸残基和第275位苏氨酸残基之间，以及凝血酶原的第323位精氨酸残基和第324位异亮氨酸残基之间切割凝血酶原，但不能在凝血酶原的第155位精氨酸和第156位丝氨酸残基之间和/或在第286位精氨酸和第287位苏氨酸残基之间切割凝血酶原)；让柠檬酸处理后的血浆中生成血凝块的活性；在无钙和磷脂存在下处理凝血酶原和/或产生血凝块的活性。本发明所述分离的蛇毒蛋白酶特征在于具有很大程度上不依赖于钙的凝血酶原酶活性，例如，如表8-12所示。
本发明涉及蛇毒多肽及其生物活性片段，它们是完全或部分完全的凝血酶原活化剂。在没有辅因子例如没有人因子X或trocarin存在下，完全或部分完全活化剂显示出比不完全活化剂明显高更的活性。本发明的完全或部分完全凝血酶原活化剂的实施方案的活性水平为完全凝血酶原活化剂与Ca2+和磷脂结合时活性的约0.4％。在优选的实施方案中，完全或部分完全凝血酶原活化剂单独作用时的活性比不完全活化剂例如人因子Xa或trocarin单独使用时的活性高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000，或4000倍(2-4个数量级)。这种比较是在同样或类似条件下测定的蛇毒蛋白酶和不完全活化剂之间进行的，例如在无Ca和磷脂存在下。优选实施方案中，完全或部分完全活化剂的活性％(即，完全或部分完全活化剂在无Ca和磷脂下的活性与有Ca和磷脂存在下活性的％)比不完全活化剂例如人因子X或trocarin显示的同种活性％高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000，或4000倍。优选的完全或部分完全活化剂在浓度为约10-10-10-06M，例如10-8或10-7M时，能使柠檬酸化的血浆凝血，凝血时间为约50-15秒，这表明其是非Ca2+和磷脂依赖性的。因此，所述凝血酶原活化剂在约10-10-10-06M浓度范围内表现出非辅因子(钙离子和/或磷脂)依赖性的动力学特性，这是能够减少血液流失的合适工作范围。
蛇毒蛋白酶、其片段，以及SEQ ID NO：2，5，8，11，14和17所示序列的衍生物及其它变体，统称为“本发明的多肽或蛋白质”或者“蛇毒蛋白酶多肽或蛋白”。编码所述多肽或蛋白的核酸统称为“本发明的核酸”或者“蛇毒蛋白酶的编码核酸”。蛇毒蛋白酶分子是指蛇毒蛋白酶核酸、多肽及抗体。
在本申请中，“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)以及DNA或RNA的类似物。DNA或RNA类似物可以是从核苷酸类似物合成的。所述核酸分子可以是单链或双链，但是优选是双链DNA。图26图示的是编码来自棕蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQ ID NO：1，编码区SEQ ID NO：3)；编码来自海岸太攀蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQ ID NO：4，编码区SEQ ID NO：6)；编码来自凶猛太攀蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQ ID NO：7，编码区SEQ ID NO：9)；编码来自红腹黑蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQ ID NO：10，编码区SEQ ID NO：12)；编码来自虎蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQ ID NO：13，编码区SEQ IDNO：15)；以及编码来自粗鳞蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQ ID NO：16，编码区SEQ ID NO：18)。
“分离的核酸分子”或“纯化的核酸分子”包括从天然环境中存在的其它核酸分子中分离出来的核酸分子。例如，就基因组DNA而言，“分离的”包括从基因组DNA天然结合的染色体分离出来的核酸分子。优选地，“分离的”核酸中不含有这样的序列，即天然地侧接于该核酸所来源的生物体的基因组DNA中的核酸的那些序列(即，位于该核酸5′和/或3′末端的序列)。例如，在不同的实施方案中，所述的分离的核酸分子可包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然侧接于该核酸所来源细胞的基因组DNA中的核酸分子。而且，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，在用重组技术制备时可以基本上不含有其它细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含有化学前体或其它化合物。
本申请中使用的“在低度严谨、中度严谨、高度严谨或极高度严谨条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。杂交反应的操作指南可参见CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，在此引入作为参考。该参考文献中描述了含水方法和无水方法(Aqueous andnonaqueous methods)，这两种方法均可使用。本申请提及的具体杂交条件如下所述：1)低度严谨杂交条件是指，在约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在至少50℃(对于低度严谨条件洗涤温度可以增至55℃)用0.2X SSC，0.1％SDS洗涤两次；2)中度严谨杂交条件是指，在约45℃在6XSSC中杂交，然后在60℃用0.2X SSC，0.1％SDS洗涤一次或多次；3)高度严谨杂交条件是指，在约45℃在6X SSC中杂交，然后在65℃用0.2X SSC，0.1％SDS洗涤一次或多次；以及优选地4)极高度严谨杂交条件是指，在约65℃在0.5M磷酸钠、7％SDS中杂交，然后在65℃用0.2X SSC，0.1％SDS洗涤一次或多次。极高度严谨条件(4)是优选的条件，并且是应该使用的条件除非另有专门说明。
优选地，本申请分离的核酸分子能够在本申请所述严谨条件下与SEQID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示序列杂交，其相应于天然存在的核酸分子。
本申请中的“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子，例如，天然存在的核酸分子能够编码天然蛋白质。
本申请中使用的“基因”和“重组基因”是指至少包含编码蛇毒蛋白酶蛋白的至少开放阅读框架的核酸分子。所述基因可任选进一步包含非编码序列，例如，调控序列和内含子。
“分离的”或“纯化的”多肽或蛋白质基本上不含来自该蛋白所来源细胞或组织源的细胞物质或其它污染蛋白，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化合物。“基本上不含”意指蛇毒蛋白酶蛋白制剂有至少10％的纯度。一个优选实施方案中，蛇毒蛋白酶蛋白制剂含有低于约30％、20％、10％以及更优选低于约5％(以干重计算)的非蛇毒蛋白酶蛋白(本申请中又称“污染蛋白”)或者化学前体或非蛇毒蛋白酶化合物。当所述蛇毒蛋白酶蛋白或其生物活性部分是重组制备时，还优选基本上不含有培养基，即，培养基低于蛋白制剂体积的约20％，优选低于约10％，以及最优选低于约5％。本发明包括干重为至少0.01、0.1、1.0和10mg的分离的或纯化的制剂。
″非必需″氨基酸是指蛇毒蛋白酶野生型序列中发生变化而不消除或基本上不改变该蛇毒蛋白酶活性的那些氨基酸残基。优选地所述变化基本上不改变蛇毒蛋白酶活性，例如，所述活性为野生型活性的至少20％、40％、60％、70％或80％。“必需”氨基酸是指这样的氨基酸，其从蛇毒蛋白酶野生型序列中变化时，会消除蛇毒蛋白酶活性从而只留存了野生型活性的不足20％。例如，预期蛇毒蛋白酶之间的保守氨基酸残基，例如图24中的蛇毒蛋白酶尤其不能变化。
“保守性氨基酸取代”是指用具有类似侧链的氨基酸残基来代替原来的氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已为本领域定义。这些家族包括带有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不带电的极性侧链氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及带有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基取代蛇毒蛋白酶蛋白中被推测为非必需氨基酸残基。可选地，另一实施方案中，例如通过饱和诱变在蛇毒蛋白酶编码序列的全长或部分处随机引入突变，然后对产生的突变体进行蛇毒蛋白酶生物活性筛选以鉴定出保留活性的突变体。SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18在诱变后，可以重组表达所编码的蛋白质，并且可以测定该蛋白质的活性。
氨基酸残基通常可以进一步分为下列主要亚类：
酸性氨基酸残基：这种残基在生理pH值下失去H离子而带有负电荷，当含有该残基的肽存在于生理pH值的含水介质中时，该残基被水溶液吸引从而可搜寻所述肽构象中的表面位置。带有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
碱性氨基酸残基：这种残基在生理pH值下或者在其1或2个pH单位内(例如，组氨酸)结合H离子而带有正电荷，当含有该残基的肽存在于生理pH值的含水介质中时，该残基被水溶液吸引至所述肽构象中的表面位置。带有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
带电的氨基酸残基：这种残基在生理pH值下带有电荷，因而包括带有酸性和碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。
疏水氨基酸残基：这种残基在生理pH值下不带电荷，当含有该残基的肽存在于含水介质中时，该残基被水溶液排斥至所述肽构象中的内部位置。带有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
中性/极性氨基酸残基：这种残基在生理pH值下不带电荷，但是当含有该残基的肽存在于含水介质中时，该残基却不足以能被水溶液排斥至所述肽构象的内部位置。带有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
本说明书中还将一些氨基酸定义为“小的”的氨基酸，因为它们所带的侧链的大小(即使极性基团缺失)不足以赋予疏水性。除了脯氨酸外，“小的”氨基酸是指当极性基团位于侧链上时含有4个或低于4个碳原子的氨基酸或者当极性基团不位于侧链时含有3个或低于3个碳原子的氨基酸。带有小的侧链的氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸脯氨酸是一个具体情况，这是由于其已知能够影响肽链的二级结构。脯氨酸的结构不同于所有其它天然存在的氨基酸，因为它的侧链键与α氨基的氮原子和α碳原子结合。但几种氨基酸相似性矩阵(例如，PAM120矩阵和PAM250矩阵)公开于例如Dayhoff等(1978)A model ofevolutionary change in proteins。Matrix for determining distance relationships InM.O.Dayhoff，(ed.)，Atlas of protein sequence and structure，Vol.5，pp.345-358，National Biomedical Research Foundation，Washington DC；and by Gonnet等，1992，Science 256(5062)：144301445)，将脯氨酸包含在与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸相同的组。因此，在本发明中，脯氨酸也被归入“小的”氨基酸。
由于分类为极性或非极性所需要的吸引或排斥的程度是可以自行制定的，因此本发明特别涉及的氨基酸都已被归类为了极性或非极性。大多数没有特别命名的氨基酸可以根据已知行为来归类。氨基酸残基还可以分为环状氨基酸或非环状氨基酸，以及芳香族氨基酸或非芳香族氨基酸，根据残基侧链取代基团的自明性分类(self-explanatory classifications with respectto the side-chain substituent groups ofthe residues)，以及分为小的氨基酸或大的氨基酸。所述残基若含有总数为4个或低于4个的碳原子(包括羧基碳原子在内)，只要还存在另一极性取代，就被认为是小的残基；当不存在另一极性取代时，若该残基含有的碳原子(包括羧基碳原子在内)的总数是3个或低于3个，那么该残基就被称为是小的残基。当然，小的残基全部是非芳香族的。
就天然存在蛋白质氨基酸而言，根据上述方案进行的分类列于下表。
                        氨基酸亚分类
    亚类     氨基酸
    酸性氨基酸     天冬氨酸，谷氨酸
    碱性氨基酸     非环状：精氨酸、赖氨酸；环状：组氨酸
    带电氨基酸     天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，赖氨酸，组氨酸
    小的氨基酸     甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸，苏氨酸
    极性/中性氨基酸 天冬酰胺，组氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸
    极性/大的氨基酸 天冬酰胺，谷氨酰胺
    疏水氨基酸 酪氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，色氨酸
基因编码的二级氨基酸脯氨酸是一个例外，由于其已知能够影响肽链的二级结构，因而没有被分类。
可以包含入SVPs的“修饰的”氨基酸是基因编码氨基酸，它们已经经过了基因的翻译后处理，例如，通过添加甲基，或者通过共价连接其它取代基或氧化或还原或其它共价修饰而进行的衍生。可以通过对修饰后形式进行特征分析将得到的修饰后的氨基酸归类。例如，如果赖氨酸经过了在ε-氨基上酰化的修饰，那么修饰后形式就不能再归类为碱性而应该是极性/中性氨基酸。
一些不是基因密码子编码的常见氨基酸，包括，例如，β-丙氨酸(β-Ala)，或其它Ω-氨基酸，例如3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(2，3-diaP)、4-氨基丁酸等，α-氨基异丁酸(Aib)，肌氨酸(Sar)，鸟氨酸(Orn)，瓜氨酸(Cit)，t-丁基丙氨酸(t-BuA)，t-丁基甘氨酸(t-BuG)，N-甲基异亮氨酸(N-MeIle)，苯基甘氨酸(Phg)，和环己基丙氨酸(Cha)，去甲亮氨酸(Nle)，2-萘基丙氨酸(2-Nal)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；蛋氨酸亚砜(MSO)；和高精氨酸(Har)。这些氨基酸也不能方便地归入具体的类别。
根据上述定义，Sar、β-Ala和Aib是小的氨基酸；t-BuA，t-BuG，N-MeIle，Nle，Mvl，Cha，Phg，Nal，Thi和Tic为疏水氨基酸；2，3-diaP，Orn和Har是碱性氨基酸；Cit，乙酰Lys和MSO为中性/极性/大氨基酸。根据氨基酸的大小可以将不同Ω-氨基酸分为小(β-Ala和3-氨基丙酸)或大的氨基酸以及疏水氨基酸(所有其它Ω-氨基酸)。基因编码氨基酸的其它氨基酸取代物也可以归入属于本发明范围的SLEs，也可以根据其结构归入这种常规方案。
在所有本发明的SVPs中，可以任选地将1个或多个酰胺键(--CO--NH--)用另一种电子等排的键取代，例如--CH2NH--，--CH2S--，--CH2CH2，--CH＝CH--(顺式和反式)，--COCH2--，--CH(OH)CH2-以及--CH2SO--。这种取代可以用本领域已知方法完成。下列文献描述了含有这些替代-连接基团肽类似物的制备方法：Spatola，A.F.，Vega Data(March 1983)，Vol.1，Issue 3，“Peptide Backbone Modifications”(综述)；Spatola，A.F.，in“Chemistry andBiochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins”，B.Weinstein，eds.，MarcelDekker，New York，p.267(1983)(综述)；Morley，J.S.，Trends Pharm Sci(1980)pp.463-468(综述)；Hudson，D.，等，Int J Pept Prot Res(1979)14：177-185(--CH2NH--，--CH2CH2--)；Spatola，A.F.，等，Life Sci(1986)38：1243-1249(--CH2--S)；Hann，M.M.，J Chem Soc Perkin Trans I(1982)307-314(--CH--CH--，顺式和反式)；Almiquist，R.G.，等，J Med Chem(1980)23：1392-1398(--COCH2--)；Jennings-White，C.，等，Tetrahedron Lett(1982)23：2533(--COCH2--)；Szelke，M.，等，欧洲专利申请EP 45665(1982)CA：97：39405(1982)(--CH(OH)CH2--)；Holladay，M.W.，等，TetrahedronLett(1983)24：4401-4404(--C(OH)CH2--)；和Hruby，V.J.，Life Sci(1982)31：189-199(--CH2--S--)。
本申请中使用的蛇毒蛋白酶蛋白″生物活性部分″包括参与相互作用的蛇毒蛋白酶蛋白片段，例如，分子内或分子间相互作用。分子内-相互作用可以是特异性结合的相互作用或酶的相互作用(例如，所述相互作用可以是瞬时的且可使共价键形成或断裂)。分子间-相互作用可以是蛇毒蛋白酶分子和非蛇毒蛋白酶分子之间的相互作用，例如凝血酶原，或者第一蛇毒蛋白酶分子，例如蛇毒蛋白酶轻链，和第二蛇毒蛋白酶分子之间的相互作用例如，二聚体化相互作用)。蛇毒蛋白酶蛋白的生物活性部分包括含有具有下述特征氨基酸序列的肽：即与蛇毒蛋白酶蛋白的氨基酸序列足够同源或源自蛇毒蛋白酶蛋白的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列，这些肽含有的氨基酸比全长蛇毒蛋白酶蛋白少而且显示了蛇毒蛋白酶蛋白的至少1种活性。通常，生物活性部分含有具有蛇毒蛋白酶蛋白至少1种活性的结构域或基序，例如，如在无钙和/或磷脂存在下，将凝血酶原处理成为凝血酶的能力。蛇毒蛋白酶蛋白的生物活性部分可以是长度为例如10、25、50、100、200或更多个氨基酸的多肽。优选地，所述片段是一种“生物活性部分”，具有本申请所述蛇毒蛋白酶的不低于凝血酶原处理活性的1％，优选不低于10％，更优选不低于25％，以及甚至更优选不低于50％。
本发明包括本发明所述蛇毒蛋白酶的“片段”，“片段”一词的范围内包括蛇毒蛋白酶的重链和轻链。一个实施方案中，所述片段是一种含有如下所述氨基酸序列的肽(残基编号如图27所示)：
KREASLPDFVQS(第181-192位残基)[SEQ ID NO：19]
LKKSDNPSPDIR(第198-209位残基)[SEQ ID NO：20]
SVXVGEIXXSR(第260-270位残基)[SEQ ID NO：21]
MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK(残基1-29)[SEQ ID NO：22]
ANRFLQRTKR(第31-40位残基)[SEQ ID NO：23]
KREASLPDFVQSXXAXXLKKSDNPSPDIR(第181-209位残基)[SEQID NO：24]
MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKXANRFLQRTKR(第1-40位残基)[SEQ ID NO：25]
X可以为任一氨基酸。
应该理解的是，上述肽片段的肽亚片段也包括在本发明范围之内，例如SEQ ID NO：19和20所示肽分别是SEQ ID NO：24所示肽的亚片段。其它片段和亚片段可以为本领域技术人员筛选。另一实施方案中，“片段”是一种小肽，例如至少6个，优选至少10个以及更至少20个氨基酸的长度。本发明还提供了含有不止1个肽段的较大片段，这种片段可以通过使用常规重组核酸技术获得或者用常规液相或固相合成技术合成。可选地，可以通过用蛋白酶消化本发明所述多肽来制备这样的肽，所述蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄状球菌V8-蛋白酶。消化后的片段可以通过，例如，高效液相色谱(HPLC)技术纯化。
序列间同源性或序列同一性(本申请中这两名词可以交互使用)按下述方法计算：
为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的同一性百分比，将所述序列比对从而优化对比的目的(例如，为进行比对，可以向第一和第二氨基酸或核酸序列中的之一或所有两个中引入间隔，并且可以将非同源序列删去)。一个优选实施方案中，用于比较的比对参照序列的长度为参照序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％、60％，甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后对相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一序列中的位置被与第二序列中对应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占居，那么该分子在该位置上是同一性的(本申请中的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。
两序列间的同一性百分比是这两序列共有的同一性位置数目的函数，其中将为这两序列优化比对而引入的间隔的数目和长度也考虑在内。
序列间的比较和同一性百分比的测定可以用数学算法来完成。一个优选实施方案中，两氨基酸序列间的同一性百分比是用Needleman and Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法测定的，该算法已被引入GCG软件包中的GAP程序(可从http：//www.gcg.com获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，间隔权重为16，14，12，10，8，6或4，长度权重为1，2，3，4，5或6。另一优选实施方案中，两核苷酸序列间同一性百分比是用入GCG软件包中的GAP程序(可从http：//www.gcg.com获得)测定的，使用NWSgapdna.CMP矩阵，间隔权重为40，50，60，70或80，长度权重为1，2，3，4，5，或6。具体优选的一套参数(除非另有说明就应该使用的一套参数)使用Blossum 62计分矩阵，间隔罚分为12，间隔距离(extend)罚分为4，移码间隔罚分为5。
两核苷酸序列间同一性百分比可以用  E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4：11-17)算法测定，该算法已被引入ALIGN程序(2.0版)，使用PAM120权重残基表(weight residue table)，间隔长度罚分为12，间隔罚分为4。
本申请所述核酸和蛋白序列可用作″查询序列″，在公共数据库中进行搜索，例如以鉴定其它家族成员或相关序列。这种搜索可以用Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)完成。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序，分值＝100，字节长度＝12，获得与本发明53010核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以使用XBLAST程序，分值＝50，字节长度＝3获得与本发明53010个蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得比较用的带间隔的比对(gapped alignment)，可以使用Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402一文中的GappedBLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如，XBLAST和NBLAST)。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.
本发明具体优选的蛇毒蛋白酶多肽具有基本上等同于SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示的氨基酸序列的氨基酸序列。在氨基酸序列的范畴内，本申请使用的“基本上等同”是指第一氨基酸序列含有足够或最少数目的氨基酸残基，所述氨基酸残基与第二核酸序列中的比对氨基酸i)相同或ii)是其保守取代，从而使得这两氨基酸序列具有共同结构域和/或共同功能活性。例如，含有具有下述特征共同结构域的氨基酸序列为基本上等同的：即与SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17具有至少约60％或65％同一性，很可能75％同一性，更可能85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。
在核苷酸序列的范畴内，本申请使用的“基本上等同”是指第一核酸序列含有足够或最少数目的相同核苷酸，所述氨基酸与第二核酸序列的比对核苷酸相同，从而使得第一和第二核苷酸序列能够编码出具有相同功能活性的多肽或者编码出相同结构的多肽结构域或相同功能多肽活性。例如，与SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18具有至少约60％或65％同一性，很可能75％同一性，更可能85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的核酸序列为基本上等同的。
本申请中使用的″受试者″是指人和非人动物。本发明的“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，例如非人灵长类(特别是较高等的灵长类)，绵羊、狗、啮齿类(如，小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔，以及非哺乳动物，例如鸡，两栖动物，爬行动物等。一个优选实施方案中，所述受试者为人。另一实施方案中，所述受试者是实验动物或适合作为疾病模型的动物。
本申请使用的″细胞的纯化制备物″是指体外细胞制备物在细胞源自多细胞生物体的情况(例如，植物和动物)，细胞的纯化制备物是获自生物体的细胞子集，而非整个完整的生物体。在细胞源自单细胞微物的情况(例如，培养物细胞和微生物细胞)，细胞的纯化制备物是由至少10％，更优选至少50％的受试者细胞制备物组成的。
所有变体都落在本发明蛇毒蛋白酶蛋白“同系物”的范围之内。
本申请通常使用的“同系物”与本发明的核酸或氨基酸序列之间具有一定程度的核苷酸或氨基酸序列相互关系，具体程度视情况而定。源自不同蛇的本发明蛇毒蛋白酶蛋白彼此互为同系物。
所述同系物中包括“直向同源物”，这些直向同源物是蛇毒蛋白酶蛋白及其编码核酸，分离自除Pseudonaja textilis，Oxyuranus scutellatus，Notechisscutatus，Tropidechis carinatus和Pseudechis porphyriacus之外的生物体。另外，上述源自蛇种之一的蛇毒蛋白酶蛋白是上述任一其它蛇种的直向同源物。例如，源自P.textilis的蛇毒蛋白酶蛋白是源自O.scutellatus的蛇毒蛋白酶蛋白的直向同源物。
本发明涉及的其它衍生物包括，但不限于，侧链修饰、非天然氨基酸和/或它们的衍生物，在肽、多肽或蛋白合成过程中的掺入，以及使用交联剂和向本发明多肽、片段及变体施加结构限定的方法。本发明所涉及侧链修饰实例包括氨基酸修饰，例如，用乙酸酐对氨基进行酰化；用丁二酸酐和四氢化邻苯二甲酸酐对氨基进行酰化；用乙酰亚胺甲酯(methylacetimidate)酰胺化；用氰酸盐对氨基进行甲氨酰化；用5-磷酸吡哆醛对赖氨酸进行吡哆醛化(pyridoxylation)然后NaBH4还原；通过与乙醛反应进行还原性烷基化，然后用NaBH4还原；以及用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苯磺酸化(trinitrobenzylation)。
可以通过下述操作对羧基进行修饰：通过形成O-乙酰异尿素(O-acylisourea)，然后衍生为例如相应的酰胺实现碳化二亚胺活化。
精氨酸残基的胍基可以通过与2，3-丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛等试剂形成杂环缩合产物完成修饰。
可以用来修饰巯基的方法有，例如，过甲酸氧化为半胱氨酸；用氯化汞基苯磺酸(chloromercuriphenylsulphonic acid)、4-氯高汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚，氯化苯汞以及其它汞剂形成汞剂衍生物(mercurialderivatives)；用其它硫羟基化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它取马来酰亚胺反应；用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；以及在碱性pH用氰酸盐进行甲氨酰化。
色氨酸残基可以通过下列方法修饰，例如，用2-羟基-5-硝基溴化物或磺酰卤化物将吲哚环烷基化，或者用N-溴丁二酰亚胺氧化。
酪氨酸可以通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生。
组氨酸残基的咪唑环可以通过下述方法修饰：即用焦碳酸二乙酯进行N乙酯基化(N-carbethoxylation)或者用碘乙酸衍生物进行烷基化。
在肽合成过程中引入非天然氨基酸及衍生物的实例包括但不限于，使用4-氨基丁酸，6-氨基己酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(phenylpentanoic acid)，4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，t-丁基甘氨酸，去甲亮氨酸，去甲缬氨酸，苯基甘氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构物。
本发明的分离的凝血酶原活化蛋白(包括其片段、变体、衍生物和同系物)可以用本领域技术人员已知的任一合适方法制备。
本发明的各个方面将在下文作进一步详述。
分离的核酸分子
一个方面，本发明提供了一种分离的或纯化的核酸分子，该核酸分子编码本申请所述蛇毒蛋白酶多肽，例如，全长蛇毒蛋白酶蛋白或其片段，例如蛇毒蛋白酶蛋白的生物活性片段。本发明还包括适于用作杂交探针的核酸片段，该核酸片段可用于例如鉴定编码本发明多肽的核酸分子，蛇毒蛋白酶mRNA，以及适于用作引物的片段，例如，用于扩增或突变核酸分子的PCR引物。
一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示的核苷酸序列，或这些核苷酸序列中任一的部分。一个实施方案中，所述核酸分子包括蛇毒蛋白酶蛋白的编码序列(即，SEQ ID NO：1，4，7，10，13或16的″编码区″，分别如SEQ ID NO：3，6，9，12，15或18所示)，以及5’非翻译序列。可选地，所述核酸分子可以只含有SEQID NO：1，4，7，10，13或16的″编码区″(例如，分别为SEQ ID NO：3，6，9，12，15或18)，例如，没有任何通常情况下伴随该靶序列的侧翼序列。另一实施方案中，所述核酸分子编码相应于蛋白片段的序列。例如，所述核酸分子编码蛇毒蛋白酶原肽、轻链、活化肽和重链中的一种或多种。另一实施方案中，所述核酸分子可编码一种或多种本申请所述结构域或区域。
另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括互补的核酸分子，例如，SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列的全长互补链，或者这些核苷酸序列中任一的部分，例如，编码本申请所述结构域或区域的任一部分。其它实施方案中，本发明所述的核酸分子与SEQID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列充分互补以致于其能够与SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列(例如，在本申请所述严谨条件下)杂交从而形成稳定的双链体。
一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括与SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列全长具有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高同源性的核苷酸序列或其一部分，优选与这些核苷酸序列中任一个等长。
蛇毒蛋白酶核酸片段
本发明的核酸分子可以只含有SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列的一部分。例如，所述核酸分子可以含有可用作探针或引物的片段或者编码部分蛇毒蛋白酶蛋白的片段，例如，蛇毒蛋白酶蛋白的免疫原性部分或生物活性部分，例如，本申请所述蛇毒蛋白酶蛋白的免疫原性部分或生物活性部分。所述片段可以含有SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示的那些核苷酸，其编码例如蛇毒蛋白酶的原肽、轻链、活化肽、重链、GLA结构域、EGF-1结构域、EGF-2结构域、或本申请所述任一其它结构域或区域。从蛇毒蛋白酶基因的克隆测得的核苷酸序列可以用于下述用途的探针和引物：从其它物种中鉴定和/或克隆其它蛇毒蛋白酶家族成员、或其片段、以及蛇毒蛋白酶同系物或其片段。
另一个实施方案中，所述核酸含有的核苷酸序列包括部分或全长编码区，并延伸入5′和/或3′非编码区。其它实施方案含有的片段包括编码本申请所述氨基酸片段的核苷酸序列。核酸片段可以编码本申请所述特定结构域或位点或其片段，具体为其长度为50，100，150，200，250，300，350，400，450，500或550氨基酸的片段。片段还包括对应于上述特定氨基酸序列或其片段的核酸序列。核酸片段不应该被理解为包括在本发明之前已经公开的那些片段。
核酸片段可包括与本申请所述结构域、区域或功能位点对应的序列。核酸片段还可以包括一个或多个本申请所述结构域、区域或功能位点。因此，例如，蛇毒蛋白酶核酸片段可以包括与GLA结构域、EGF结构域或因子Va-样结构域对应的序列。
本发明还提供了蛇毒蛋白酶探针和引物。通常，核酸/探针是一种分离或纯化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包括一个具有下述特征的核苷酸序列区域：即在本申请所述严谨条件下能够与SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16和/或18的有义或反义序列中至少约7、12或15个，优选约20或25个，更优选约30，35，40，45，50，55，60，65或75个连续核苷酸杂交，或者与SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18的天然存在的等位基因变体或突变体杂交。优选地，寡核苷酸序列的长度少于约200，150，120或100个核苷酸。一个优选实施方案中，所述蛇毒蛋白酶探针或引物能够与蛇毒蛋白酶的编码核酸的区杂交，但是不与人因子Xa和/或trocarin的区域杂交。
一个实施方案中，将所述探针或引物附着于固相支持物，例如，本申请所述固相支持物。
一个范例性的引物试剂盒含有：与编码链退火的正向引物和与非编码链退火的反向引物。所述正向引物能够与起始密码子退火，例如，编码SEQID NO：2，5，8，11，14或17的第1位氨基酸残基的核酸序列。所述反向引物能够与最后一位密码子退火，例如，紧邻于终止密码子之前的密码子，例如，编码SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17的第581位氨基酸残基的密码子。一个优选实施方案中，正向引物和反向引物的退火温度之间相差不超过5、4、3或2℃。
一个优选实施方案中，所述核酸为一探针，长度为至少10，12，15，18，20个且少于200个，更优选少于100个，或少于50个核苷酸。它应该与本申请公开的序列等同或者相差1或2个，或少于5或10个核苷酸。如果作这种比较需要比对，那么应该将该序列做最大化同源性的比对。由于缺失或插入或错配导致被“环”切去掉(loop out)的序列就是二者的差异部分。
探针或引物可以源自编码下列物之的核酸的有义或反义链：原肽、轻链、活化肽、重链或其部分(或者这些区域中的结构域)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一套引物，例如，适于用于PCR的引物，其可用于扩增蛇毒蛋白酶序列的选择区域，例如，本申请所述结构域、区域、位点或其它序列。所述引物的长度应该至少5，10或50个碱基对，并且少于100或少于200个碱基对。所述引物应该与本申请公开的序列或者天然存在变体等同或相差1个碱基。例如，提供了适于扩增任一下列区域全长或部分的引物：原肽、轻链、活化肽、重链或其部分(或者这些区域中的结构域和位点)。
核酸片段可以编码带有本申请所述多肽区域的表位。
编码″蛇毒蛋白酶多肽的生物活性部分″可以通过下述方法制备：分离SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列中的一部分，该部分编码的多肽具有蛇毒蛋白酶生物活性(例如，本申请所述的蛇毒蛋白酶蛋白的生物活性)；表达蛇毒蛋白酶蛋白的编码部分(例如，通过体外重组表达)；以及对所述蛇毒蛋白酶蛋白的编码部分的活性进行评估。编码蛇毒蛋白酶多肽的生物活性的核酸片段可以含有长度大于300或更多个核苷酸的核苷酸序列。
优选实施方案中，核酸含有长度至少约300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400或更多个核苷酸的核苷酸序列，并且能够与SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示核酸分子在本申请所述严谨条件下杂交。
蛇毒蛋白酶核酸变体
本申请还包括有别于SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示核苷酸序列的核酸分子。这种差别是由于遗传密码简性的存在，并产生编码与本申请所述核苷酸序列编码的蛇毒蛋白酶蛋白相同的核酸。另一实施方案中，本发明的分离的核酸分子具有这样一种核苷酸序列，其编码的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列相差至少1个，但低于5，10，20，50或100个氨基酸残基。如果作这种比较需要比对，那么应该将所述序列做最大化同源性的比对。编码的蛋白质相差不超过5，4，3，2，或1个氨基酸。由于缺失或插入或错配导致被“环”切去掉的序列就是二者的差异部分。
可以选择具体表达系统优选或非优选密码子的本发明的核酸。例如，所述核酸可以是其中的至少1个密码子，优选密码子中的至少10％或20％已经改变以至该序列适于在大肠杆菌、酵母、人、昆虫或CHO细胞中表达。
核酸变体可以是天然存在的，例如等位基因变体(同一座位)，同系物(不同座位)，以及直向同源(不同生物体)，或者非天然存在的。非-天然存在变体可以通过诱变技术制备，包括那些可用于多核苷酸、细胞或生物体的诱变技术。所述变体可包括核苷酸取代、缺失、倒位和插入。改变可以发生于编码区和/或非编码区二者或其中之一。改变能产生保守和非保守氨基酸取代(与编码产物相比)。一个实施方案中，核酸同系物是分离自除下列蛇之外其它蛇的直向同源核酸：Pseudonaja textilis，Oxyuranus scutellatus，Notechis scutatus，Tropidechis carinatus和Pseudechis porphyriacus。
一个优选实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18之间具有例如如下所述的差异：至少1个但少于10，20，30或40个核苷酸；至少1个但少于目的核酸中核苷酸总数的1％，5％，10％或20％。所述核酸可以相差不超过5，4，3，2，或1个核苷酸。如果作这种分析需要比对，那么应该将该序列做最大化同源性的比对。缺失或插入或错配导致被“环”切去掉的序列就是二者的差异部分。
直向同源物、同系物和等位基因变体可以用本领域已知方法鉴定。这些变体含有编码多肽的核苷酸序列或该序列的片段，该核苷酸序列与SEQID NO：2，5，8，11，14或17所示核苷酸序列通常具有至少约70-75％，更通常至少约80-85％，以及最通常至少约90-95％或更高的同一性，并且优选具有蛇毒蛋白酶活性。所述核酸分子可以根据能够与SEQ ID NO 2，5，8，11，14，17所示核苷酸序列或其片段在本申请所述严谨条件下杂交很容易地鉴定出来。相应于本发明蛇毒蛋白酶cDNA的直向同源物、同系物和等位基因变体的核酸分子还可以通过对蛇毒蛋白酶基因相同的染色体或座位做图而分离。
优选的变体包括那些具有蛇毒蛋白酶活性的变体，例如，在钙、磷脂和因子Va中一种或多种不存在时能够诱导凝血。
蛇毒蛋白酶的等位基因变体包括功能及非功能蛋白。功能性等位基因变体是蛇毒蛋白酶蛋白的天然存在的氨基酸序列变体，其保留了处理凝血酶原的能力。功能性等位基因变体通常只含有SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17中一或多个氨基酸的保守性取代，或者该蛋白非关键区内非关键残基的取代、缺失或插入。蛇毒蛋白酶的等位基因变体包括功能及非功能蛋白。功能性等位基因变体是蛇毒蛋白酶蛋白的天然存在的氨基酸序列变体，其不具有处理凝血酶原的能力。非功能性等位基因变体通常含有SEQ IDNO：2，5，8，11，14，17所示氨基酸序列的非保守性取代、缺失或插入或未成熟截短(premature truncation)，或者该蛋白关键区内关键残基的取代、缺失或插入。
另外，编码其它蛇毒蛋白酶家族成员的核酸分子，从而其具有不同于SEQ ID NO：1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示蛇毒蛋白酶序列的核苷酸序列，这些核酸分子也在本发明的范围之内。
本发明的分离的核酸同系物也可以通过使用核酸序列扩增技术的方法制备。
一个实施方案中，所述方法包括下列步骤：
(i)从宿主细胞或动物获取核酸提取物；
(ii)制备一种或多种引物，可任选为简并性的，其中所述每一引物都对应本发明的分离的核酸的一部分；以及
(iii)使用所述引物通过核酸扩增技术从所述核酸提取物中扩增出一种或多种扩增产物。
合适地，所述一种或多种引物设计为能够与本发明双链核酸中一条或另一条在扩增通常使用的退火和引物延伸条件下退火。就简并性引物而言，引物与分离的核酸序列之间的序列差异是有意引入的目的是为了解决例如由于同源编码序列之间简并性导致的可能的序列变化。
合适的扩增技术已为本领域技术人员所熟知，包括例如Ausubel等同上第15章中所述的聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)；例如美国专利5,422,252中描述的链取代扩增(SDA)；例如国际专利申请WO92/01813和国际专利申请WO 97/19193中公开的滚环复制(RCR)；例如Sooknanan等，1994，Biotechniques 17 1077中所述的基于核酸序列的扩增(NASBA)；以及例如Tyagi等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 5395中描述的Qβ复制酶扩增；但不仅限于这些。
优选的核酸序列扩增技术是PCR。
本申请使用的“扩增产物”是指用本申请泛指的核酸扩增技术制备的核酸产物。
核酸同系物可以编码蛋白质同系物。因此，上述用于分离核酸同系物的方法也可以用于分离蛋白质同系物。
分离的蛇毒蛋白酶多肽
另一方面，本发明涉及一种分离的蛇毒蛋白酶蛋白或片段，例如，能够用作免疫原或抗原以激发或测试(或者更常见的是结合)抗-蛇毒蛋白酶抗体的生物活性部分。所述蛇毒蛋白酶蛋白可以用常规蛋白纯化技术分离自细胞或组织来源。一个实施方案中，所述蛇毒蛋白酶分离自下列蛇：Pseudonaja textilis，Oxyuranus scutellatus，Notechis scutatus，Tropidechiscarinatus或Pseudechis porphyriacus。优选地，所述蛇毒蛋白酶分离自澳大利亚蛇的毒腺，例如，本申请所述的澳大利亚蛇。蛇毒蛋白酶蛋白或其片段可以用重组DNA技术或化学合成制备。
本发明的多肽包括由于可变翻译和翻译后事件存在而生成的多肽。所述多肽可以在系统中表达，例如在培养物细胞中表达，从而产生与当该多肽在天然细胞中表达时基本上相同的翻译后修饰；或者该多肽在这样的系统中表达，其导致该多肽在天然细胞中表达时出现的翻译后修饰(例如糖基化或切割)的改变或省略。
一个优选实施方案中，蛇毒蛋白酶多肽具有一种或多种下列特性：
(i)能够处理凝血酶原；
(ii)其具有分子量例如推导分子量，优选忽略蛇毒蛋白酶多肽(例如SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示多肽)的翻译后修饰，氨基酸组成或其它物理特性的任何影响；
(iii)其与蛇毒蛋白酶多肽(例如与SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示多肽)具有至少60％，更优选至少70，80，90，或95％的总体序列相似性；
(iv)其与一种或多种本申请所述结构域或区域具有基本上等同的序列，例如，如本申请所述。
一个优选实施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白或其片段不同于SEQ IDNO：2，5，8，11，14或17中的相应序列。一个实施方案中，相差至少1个但少于15、10或5个氨基酸残基。另一个优选实施方案中，与SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17中相应序列间相差至少1个残基，但相差少于SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17中相应序列中的残基的20％，15％，10％或5％。(如果作这种比较需要比对，那么应该将所述序列做最大化同源性的比对。缺失或插入或错配导致被“环”切去掉的序列就是二者的差异部分。)这些差异优选是在非必需残基上的差异或改变或者是保守取代。
其它实施方案包括氨基酸序列中含有1处或多处变化的蛋白质，例如，非活性所必需氨基酸残基的变化。这些蛇毒蛋白酶蛋白的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17，但仍保留生物活性。
一个实施方案中，所述蛋白质含有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17具有至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更高的同源性，且具有蛇毒蛋白酶生物活性。
一个实施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白生物活性部分包括一种或多种下列结构域：GLA结构域、EGF-1结构域、EGF-2结构域和因子Va样结构域。另外，其它生物活性部分(其中所述蛋白的其它区域缺失)，可以通过重组技术制备，并对天然蛇毒蛋白酶蛋白的一种或多种功能活性进行评估。
一个优选实施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白具有SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示的氨基酸序列。其它实施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白基本上等同于SEQ ID NO：2，5，8，11，14，或17，且保留有SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示蛋白的生物活性，详见上文章节中的描述。一个优选实施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白保留了在钙、磷脂和因子Va中的一种或多种不存在时处理凝血酶原的能力，优选保留了在钙和磷脂都不存在时处理凝血酶原的能力。
蛇毒蛋白酶的嵌合蛋白或融合蛋白
另一方面，本方面提供了蛇毒蛋白酶的嵌合或融合蛋白。本申请使用的蛇毒蛋白酶″嵌合蛋白″或″融合蛋白″包括与非蛇毒蛋白酶多肽相连的蛇毒蛋白酶多肽。″非蛇毒蛋白酶多肽″是指一种多肽，其具有不同于蛇毒蛋白酶蛋白并源自相同或不同的生物体的蛋白的相应氨基酸序列。融合蛋白的蛇毒蛋白酶多肽可以对应于蛇毒蛋白酶氨基酸序列的全长或部分，例如本申请所述的片段。一个优选实施方案中，蛇毒蛋白酶融合蛋白含有至少一种(或两种)蛋白酶蛋白的生物活性部分。可将所述非蛇毒蛋白酶多肽融合于所述蛇毒蛋白酶多肽的N-末端或C-末端。一个实施方案中，所述“非蛇毒蛋白酶多肽”是除蛇毒蛋白酶之外的来自凝血酶原活化蛋白的原肽，例如，它是哺乳动物因子Xa的原肽，例如人因子Xa。另一实施方案中，所述“非蛇毒蛋白酶多肽”可以含有除蛇毒蛋白酶之外的凝血酶原活化蛋白的活化肽，例如，哺乳动物因子Xa，例如人因子Xa的活化肽。另一实施方案中，所述嵌合或融合多肽含有来自“非蛇毒蛋白酶多肽”，例如，来自哺乳动物因子Xa多肽(如人因子Xa多肽)的原肽和活化肽。
所述融合蛋白可以包含具有对配体具有具有高亲合力的部分。例如，所述融合蛋白可以是GST-蛇毒蛋白酶融合蛋白，其中蛇毒蛋白酶序列融合于GST序列的C-末端。所述融合蛋白能有助于重组蛇毒蛋白酶的纯化。可选地，所述融合蛋白可以是在其N-末端含有异源信号序列的蛇毒蛋白酶蛋白。在一些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，可以通过使用异源信号序列增强蛇毒蛋白酶的表达和/或分泌。
融合蛋白可以包含全长或部分血清蛋白，例如，IgG恒定区，或人血清白蛋白。
本发明所述的蛇毒蛋白酶融合蛋白可以引入药物组合物，施用到受试者体内。所述蛇毒蛋白酶融合蛋白可用于改变蛇毒蛋白酶底物的生物利用度。
另外，本发明所述的蛇毒蛋白酶融合蛋白可以用作免疫原，在受试者体内制备抗-蛇毒蛋白酶抗体，用于纯化蛇毒蛋白酶配体以及在筛选试验中鉴定能抑制蛇毒蛋白酶与蛇毒蛋白酶底物相互作用的分子。
已经编码融合部分(例如，GST多肽)的表达载体可从商业化途径购得。可以将蛇毒蛋白酶编码核酸克隆入所述表达载体从而将所述融合部分连接入蛇毒蛋白酶蛋白的阅读框内。
蛇毒蛋白酶蛋白的变体
另一方面，本发明还提供了一种蛇毒蛋白酶多肽的变体，例如，可用作激动剂(模拟物)或拮抗剂的变体。蛇毒蛋白酶蛋白的变体可通过下述方法制备：例如，诱变例如离散点突变(discrete point mutation)，序列的插入或缺失，或蛇毒蛋白酶蛋白的截短。蛇毒蛋白酶蛋白的激动剂可基本上保留了蛇毒蛋白酶蛋白天然存在形式的完全相同的或部分生物活性。蛇毒蛋白酶蛋白拮抗剂能抑制蛇毒蛋白酶蛋白天然形式的一种或多种活性，例如通过竞争性调控蛇毒蛋白酶蛋白的蛇毒蛋白酶介导的活性。因此，用具有限制功能的变体处理能激发特定生物反应。
蛇毒蛋白酶蛋白的变体可以通过对蛇毒蛋白酶蛋白的变体，例如截短变体的文库进行激动剂或拮抗剂活性筛选而鉴定。
例如，蛇毒蛋白酶蛋白编码序列的片段文库，例如N末端、C末端或内部片段的文库可用于制备一组千差万别的片段，用于筛选以及随后选择蛇毒蛋白酶蛋白变体。具有下述特征的变体是特别优选的：即添加或缺失了半胱氨酸残基的变体，添加或缺失了钙结合残基例如羧基谷氨酸残基或天冬酰胺残基的变体，添加或缺失了糖基化残基的变体。
从用定点诱变或截短方法制备的重组文库中筛选基因产物的方法，以及从cDNA文库中筛选具有选定特性的基因产物的方法都已为本领域所知。这类方法调整后可用于对通过蛇毒蛋白酶蛋白进行组合诱变后制得文库进行快速筛选。回归整体诱变(Recursive ensemble mutagenesis)(REM)是一项用于提高文库中功能突变体出现频率的新技术，可与筛选试验结合鉴定蛇毒蛋白酶变体(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6：327-331)。
另一方面，本发明涉及一种制备蛇毒蛋白酶多肽的方法，例如，一种具有非野生型活性的肽，例如，天然存在的蛇毒蛋白酶多肽的拮抗剂、激动剂或超激动剂，例如，天然存在的蛇毒蛋白酶多肽。该方法包括：改变蛇毒蛋白酶多肽的序列，例如通过对一或多个残基进行取代或缺失改变本文公开的非保守区，结构域或残基的序列；然后检测改变后的多肽的所需活性。
另一方面，本发明涉及制备蛇毒蛋白酶多肽的片段或类似物的方法，该片段或类似物具有天然蛇毒蛋白酶多肽的生物活性。该方法包括：例如通过对蛇毒蛋白酶多肽的一或多个残基进行取代或缺失改变本文所述的序列，例如改变本文所述非保守区、结构域或残基的序列；然后检测改变后多肽的所需活性。
抗蛇毒蛋白酶抗体
另一方面，本方面提供了抗蛇毒蛋白酶抗体或其片段(例如，其抗原结合片段)。本申请中使用的“抗体”是指免疫球蛋白分子或其免疫原性活性部分，即抗原结合部分。本申请中使用的“抗体”是指含有至少1个且优选两个重(H)链可变区(本申请中缩写为VH)以及至少1个且优选两个轻(L)链可变区(本申请中缩写为VL)的蛋白质。所述的VH和VL区可进一步分为名为“互补决定区”(″CDR″)的高变区，其中分散有的较为保守的区域即“骨架区”(FR)。骨架区和CDR的范围已作精确限定(参见，Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，andChothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917，这些文献在此引入作为参考)。每一个VH和VL都是由3个CDR和4个Fs组成，从N-末端到C-末端按下列顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
抗蛇毒蛋白酶抗体还可以包括重链和轻链恒定区，从而分别形成免疫球蛋白的重链和轻链。一个实施方案中，所述抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中所述免疫球蛋白重链和轻链通过二硫键交联在一起。重链的恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。轻链的恒定区由1个结构域CL组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统中的第一组分(Clq)。
本申请使用的“免疫球蛋白”是指一或多种基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽所组成的蛋白质。识别的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及无数的可变区基因。全长的免疫球蛋白“轻链”  (约25KDa或214个氨基酸)是由NH2-末端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH-末端的κ或λ恒定区基因编码的。全长的免疫球蛋白“重链”(约50KDa或446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其它上述恒定区基因中的1种例如γ(编码约330个氨基酸)编码。
本申请中使用的抗体的“抗原结合片段”(或者简称为″抗体部分″或″片段″)是指全长抗体中的1个或多个片段，其保留有特异性结合抗原的能力，例如，蛇毒蛋白酶多肽或其片段。抗蛇毒蛋白酶抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，由通过绞链区二硫桥连接在一起的两个Fab片段组成的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单个臂上的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。另外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由分离基因编码的，但是它们可以用重组方法通过一个合成接头连接在一起，使得它们能被制成一单个蛋白链，其中VL和VH区域配对形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。所述单链抗体也包括在抗体的″抗原结合片段″范围内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的重组技术制备的，筛选片段从而使其使用方式与完整抗体相同。
所述抗蛇毒蛋白酶抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。其它实施方案中，所述抗体可重组制备，例如，通过噬菌体展示或通过组合方法(combinatorial method)制备。
用于制备抗蛇毒蛋白酶抗体的噬菌体展示和组合方法已为本领域所知(描述见，例如，Ladner等，美国专利5,223,409；Kang等，国际公开WO92/18619；Dower等，国际公开WO 91/17271；Winter等，国际公开WO92/20791；Markland等，国际公开WO 92/15679；Breitling等，国际公开WO93/01288；McCafferty等，国际公开WO 92/01047；Garrard等，国际公开WO92/09690；Ladner等，国际公开WO 90/02809；Fuchs等，(1991)Bio/Technology9：1370-1372；Hay等，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等，(1989)Science 246：1275-1281；Griffths等，(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等，(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等，(1991)Nature352：624-628；Gram等，(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等，(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等，(1991)Nuc Acid Res19：4133-4137；and Barbas等，(1991)PNAS 88：7978-7982，所有文献内容在此引入作为参考)。
在优选的实施方案中，抗体是用下列物质免疫制得的：纯化的蛇毒蛋白酶抗原或其片段，例如本申请所述片段；组织，例如组织粗提物；全细胞，优选活细胞；裂解后的细胞或细胞碎片。
全长蛇毒蛋白酶蛋白或蛇毒蛋白酶抗原性肽片段可用作免疫原，或者可用于对用其它免疫原，例如细胞、膜制备物等制得的抗蛇毒蛋白酶抗体进行鉴定。蛇毒蛋白酶的抗原性肽应该含有SEQ ID NO：2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列中的至少8个氨基酸残基，并且包括蛇毒蛋白酶的表位。优选地，所述抗原性肽含有10个氨基酸残基，更优选至少15个氨基酸残基，甚至更优选至少20个氨基酸残基，以及最优选至少30个氨基酸残基。优选实施方案中，所述抗蛇毒蛋白酶抗体能结合本申请所述的蛇毒蛋白酶区域、结构域或位点。本发明提供了与这些区域之一或本申请所述其它区域或结构域反应的或对其具有特异性的抗体。
只结合原始蛇毒蛋白酶蛋白抗体，或只结合变性或其它非原始蛇毒蛋白酶蛋白的抗体，或者二者都结合的抗体，都在本发明的范围内。带有线性或构象表位的抗体也在本发明的范围内。构象表位有时可以根据能与原始蛇毒蛋白酶蛋白结合但不能与变性蛇毒蛋白酶蛋白结合来鉴定。
抗原性肽含有的优选表位是位于轻链或重链亲水区的蛇毒蛋白酶区域以及具有高抗原性的区域。
优选实施方案中，抗体能与下列物质中的1种或多种结合：纯化抗原；组织，例如组织切片；全细胞，优选活细胞；裂解的细胞或细胞成分。
所述抗蛇毒蛋白酶抗体可以是一种单链抗体。单链抗体(scFV)可以改造(参见，例如，Colcher，D.等，(1999)Ann N Y Acad Sci 880：263-80；和Reiter，Y.(1996)Clin Cancer Res 2：245-52)。可以将单链抗体二聚化或多聚化制得对同一目标蛇毒蛋白酶蛋白上不同表位特异的多价抗体。
可以将所述抗体偶联于一化合物，例如，标记物(如放射性核素)，或显像剂，如放射性、酶促或其它显像剂，例如，显像剂如NMR对比剂。能产生可检测的放射性发射信号或荧光的标记物是优选的。
抗蛇毒蛋白酶抗体(例如，单克隆抗体)可用于通过常规技术分离蛇毒蛋白酶，例如通过亲合层析或免疫沉淀。另外，抗蛇毒蛋白酶抗体可用于检测蛇毒蛋白酶蛋白(例如，在细胞裂解物或细胞上清中)来评价蛋白质表达的丰度和模式。在诊断学上，抗蛇毒蛋白酶抗体可用于临床测试方法中监测组织中的蛇毒蛋白酶水平。可以通过将抗体偶联(即，物理连接)于可检测物质(即，抗体标记)促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基(prostheticgroups)、荧光物质、发光材料、生物发光材料以及放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉亲合素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺(luminal)；生物发光材料的实例包括萤光素酶、发光素和水母蛋白，合适的放射性物质的实例包括125I，131I，35S或3H。所述标记物可以选自：生色原(chromogen)、催化剂、酶、荧光团、化学发光分子、稀土离子如铕(Eu34)、放射性同位素以及直接可见标记物。就直接可见标记物而言，可以利用下列形式：胶体金属或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或其它含有信号产生物质的颗粒等。
大量可用作标记物的酶公开于美国专利说明书4,366,241，4,843,000，和4,849,338，在此引入作为参考。可用于本发明的酶标记物包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。所述酶标记物可单独使用也可与溶于溶液中的第二种酶结合使用。
重组表达载体、宿主细胞以及遗传构建细胞
另一方面，本发明包括载体，优选为表达载体，其中含有编码本申请所述多肽的核酸。本申请使用的″载体″一词是指能运送与其连接的另一核酸的核酸分子，并包括质粒、粘粒或病毒载体。所述载体能自主复制或者能整合入宿主DNA。病毒载体包括，例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒以及腺伴随病毒。
载体包括以适于表达宿主细胞中的核酸的形式而存在的蛇毒蛋白酶核酸。优选地，所述重组表达载体含有可操作连接于待表达序列的1或多个调控序列。″调控序列″包括启动子、增强子和其它表达调控元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。调控序列包括那些指导核苷酸序列组成型表达的调控序列，以及组织特异性调控序列和/或可诱导的序列。可以根据下列因素设计表达载体：例如待转化宿主细胞的选择、目的蛋白的表达水平等。可以将本发明所述的表达载体导入宿主细胞从而制备出由本申请所述核酸编码的蛋白质或多肽，包括融合蛋白或多肽(例如，蛇毒蛋白酶蛋白、融合蛋白等)。
本发明所述的重组表达载体可以设计用于在原核或真核细胞中表达蛇毒蛋白酶蛋白。例如，本发明所述多肽可在大肠杆菌、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适宿主细胞的进一步讨论见Goeddel，(1990)Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。可选地，所述重组表达载体可以体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
原核细胞中的蛋白质表达最常见的是在大肠杆菌进行，使用含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体。融合载体对其中编码的蛋白添加了许多氨基酸，通常是在重组蛋白的氨基末端。所述融合载体通常用于下列三种目的：1)增加重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的的溶解度；以及3)通过作为亲合纯化配体辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合部分与重组蛋白的结合处导入蛋白水解切割位点，使得能将重组蛋白从融合部分中分离出来，以纯化融合蛋白。所述酶，及其同源(cognate)识别序列，包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。常用融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.and Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)这三种载体分别把谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合于目的重组蛋白。
在大肠杆菌中最大化重组蛋白的表达是指在蛋白水解切割该重组蛋白能力缺陷的宿主菌中表达该蛋白(Gottesman，S.，(1990)Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California 119-128)。另一种策略是改变待插入表达载体的核酸序列从而使编码每一氨基酸的单个密码子都是大肠杆菌优选的(Wada等，(1992)NucleicAcids Res.20：2111-2118)。本发明核酸序列的这种改变可以通过常规DNA合成技术实现。
所述蛇毒蛋白酶表达载体可以是酵母表达载体、在昆虫细胞中表达的载体如杆状病毒表达载体以及其它适于在哺乳动物细胞中表达的载体。
当用于哺乳动物细胞时，所述表达载体的控制功能可通过病毒调控元件提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒，腺病毒2，巨细胞病毒和猿猴病毒40。
另一个实施方案中，所述启动子是诱导型启动子，例如，受类固醇激素调控的启动子，受多肽激素调控的启动子(例如，通过信号传导途径)，或受异源多肽调控的启动子(例如，四环霉素诱导系统，“Tet-On”和“Tet-Off”；参见，例如，Clontech Inc.，CA，Gossen and Bujard(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89：5547，and Paillard(1989)Human Gene Therapy 9：983)。
另一个实施方案中，所述重组哺乳动物表达载体能指导特定细胞类型中优选核酸的表达(例如，组织特异性调控元件可用于表达核酸)。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性的；Pinkert等，(1987)Genes Dev.1：268-277)；淋巴样细胞特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，具体为T细胞受体启动子(Winoto andBaltimore(1989)EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等，(1983)Cell 33：729-740；Queen and Baltimore(1983)Cell 33：741-748)；神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)；胰腺特异性启动子(Edlund等，(1985)Science230：912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利4,873,316和欧洲专利申请公开号264,166)。还包括发育调控启动子，例如小鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science 249：374-379)和α-甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3：537-546)。
一些实施方案中，当用于哺乳动物细胞时，所述表达载体可表达蛇毒蛋白酶轻链和重链，以及表达来自非蛇毒蛋白酶多肽(例如非蛇毒蛋白酶凝血酶原活化蛋白)的原肽结构域和/或活化肽，例如，来自哺乳动物因子X，如人因子X的原肽和/或活化肽。
本发明进一步提供了一种重组表达载体，其包含以反义方向克隆入表达载体的本发明DNA分子。可以对可操作连接于以反义方向克隆的核酸的调控序列(例如，病毒启动子和/或增强子)进行选择，所述调控序列指导反义RNA在多种细胞类型中的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。所述反义表达载体的使用形式可以是重组质粒、噬粒或减毒病毒。
本方面另一方面提供了一种宿主细胞，其中含有本申请所述核酸分子，例如，位于重组表达载体内的蛇毒蛋白酶核酸分子，或含有能使其同源重组入宿主细胞基因组特定位点的序列的蛇毒蛋白酶核酸分子。“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本申请中可以换用。这种词汇不仅指具体的目的细胞还指目的细胞的后代或潜在后代。由于随后的代次中由于突变或环境影响会发生一些修饰，所以后代实际上不可能与亲代细胞完全相同，但是仍包括在本发明的范围之内。
宿主细胞可以是任一原核或真核细胞。例如可将蛇毒蛋白酶蛋白可以在以下细胞中表达：细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞(非洲绿猴肾细胞CV-1原代SV40细胞；Gluzman(1981)CellI23：175-182))。其它合适的宿主细胞已为本领域所知。
可以通过常规转化或转染技术将载体DNA导入宿主细胞。本申请使用的″转化″和″转染″都是用来指本领域所认可的用于将外源核酸(例如，DNA)导入宿主细胞多种技术，包括磷酸钙和氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染法(lipofection)或电穿孔。
本发明的宿主细胞可用于制备(即表达)蛇毒蛋白酶蛋白。因此，本发明进一步还提供了使用本发明所述宿主细胞制备蛇毒蛋白酶蛋白，例如，本申请所述蛇毒蛋白酶蛋白的方法。一个实施方案中，所述方法包括：在合适的培养基中培养本发明所述宿主细胞(其中已经导入了编码蛇毒蛋白酶蛋白的重组表达载体)，从而制备出蛇毒蛋白酶蛋白。另一实施方案中，所述方法进一步还包括从培养基或宿主细胞分离蛇毒蛋白酶蛋白。
另一方面，本发明涉及一种人细胞，例如，造血干细胞，该细胞用编码目的蛇毒蛋白酶多肽的核酸转化。
信息学(informatics)
蛇毒蛋白酶的序列可以在多种有助于其使用的载体中提供。与蛋白质和核酸不同，记录序列可以作为制品提供。所述制品能以一种形式提供核苷酸或氨基酸序列(例如，开放阅读框)，这种形式可以使用不可直接用于检测核苷酸或氨基酸序列或其子集的工具，例如通过序列分析程序或直接观察，来对制品进行检测，就如同它们以天然或纯化形式存在那样。序列信息可包括但不限于，SVP全长核苷酸和/或氨基酸序列，部分核苷酸和/或氨基酸序列，多态性序列(包括单核苷酸多态性(SNPs))，表位或结构域序列等。一个优选实施方案中，所述制品是一种机读载体，例如，磁、光学、化学或机械信息存储设备。
本申请使用的“机读载体”是指可被机器直接阅读或访问的载体，例如，数字计算机或模拟计算机。计算机的非限制性实例包括台式PC，便携式电脑，大型电脑(mainframe)，服务器(例如网络服务器、互连网服务器，或服务器田)，便携式数字助理(handheld digital assistant)，呼叫器，移动电话等等。所述计算机可以是单机也可以是联网，例如，局域网(例如VPN或内网)，广域网(例如，外网或因特网)，或电话网(例如，无线，DSL，或ISDN网络)。机读载体包括但不限于：磁存储载体，例如软盘，硬盘存储载体，和磁带；光学存储载体例如CD-ROM；电子存储载体例如RAM，ROM，EPROM，EEPROM，快闪记忆(flash memory)等；以及这些类别的杂合体例如磁/光存储载体
多种数据存储结构都可以被本领域技术人员用于制备机读介质，其上记录本发明所述核苷酸或氨基酸序列。数据存储结构的选择通常根据获取存储信息的方法来选择。此外，可用多种数据处理器程序和格式将本发明所述核苷酸序列存储在计算机可读载体上。序列信息可以保存为文字处理文本文件，格式化于商业化软件例如WordPerfect和Microsoft Word，或者保存为ASCII文件，存储于数据库应用，例如DB2，Sybase，Oracle等中。本领域技术人员可以很容易地采集任意数目的数据处理器结构格式(例如，文本文件或数据库)，以获得记录了本发明核苷酸序列信息的计算机可读载体。
一个优选实施方案中，所述序列信息存储于相关数据库(例如Sybase或Oracle)。该数据库具有用于存储序列(核酸和/或氨基酸序列)的第一表格(firsttable)。可以将序列信息存入表行的一个字段(field)(例如，第一列)，并将序列的注册码(identifier)存入该行的另一字段(例如，第二列)。该数据库可以有第二表格，例如，存储标注(annotation)。第二表格可以具有：一个序列注册码的字段、一个描述信息块(descriptor)或标注文本(annotation text)(例如，描述信息块可指序列的功能)的字段、一个标注所指的序列起始位置的字段，以及一个标注所指的序列最后位置的字段。氨基酸序列标注的非限制性实例包括多肽结构域，例如，本申请所述结构域；活性位点及其它功能氨基酸；以及修饰位点。
通过以计算机可读形式提供本发明所述核苷酸或氨基酸序列，本领域技术人员通常可以为多种目的而常规获得序列信息。例如，本领域技术人员可以使用计算机可读形式的本发明所述核苷酸或氨基酸序列，将靶序列或靶结构基序与数据存储工具中的序列信息进行比较。可以用搜索来鉴别与具体靶序列或目的基序匹配的本发明的片段或区域。所述搜索可以是BLAST搜索或其它常用序列比较。例如，本申请所述的搜索。
因此，一个方面，本发明提供了一种分析SVP序列的方法，例如，分析结构、功能或者与其它1种或多种核酸或氨基酸序列的相关度。该方法包括：提供SVP核酸或氨基酸序列；将SVP与第二序列进行比较，所述第二序列为例如，一种更优选为来自序列集的多种列，例如，核酸或蛋白数据库，从而分析SVP。该方法可在机器例如计算机上进行，或者由本领域技术人员手工操作。
该方法可以包括评估SVP序列与第二序列之间的序列同一性，例如，数据库序列。也可以通过在第二位置处访问数据库来实施该方法，例如在互联网上。
本申请使用的“靶序列”可以是六个或更多个核苷酸中的任一DNA或者是两个或多个氨基酸的氨基酸序列。本领域技术人员可以很容易地认识到：靶序列越大，那么靶序列在数据库中随机出现的可能性就越小。靶序列的常见序列长度为约10-100个氨基酸或约30-300个核苷酸残基。但是，很容易理解的是：商业意义的片段，例如，参与基因表达和蛋白处理的序列片段的长度可以较短一些。
电脑软件是公众能够得到的，所以本领域技术人员能够访问计算机可读载体提供的序列信息，进行分析及与其它序列比较。多种已知算法都已向公众公开，而且多种用于进行搜索的商业化软件可用于本发明中以电脑为基础的系统。所述软件的实例包括但不限于，MacPattern(EMBL)，BLASTN和BLASTX(NCBI)。
因此，本发明涉及一种制备SVP序列的序列计算机可读记录的方法，其中包括将该序列记录在计算机可读矩阵上。一个优选实施方案中，所述记录包括1种或多个下列过程：鉴定ORF；鉴定结构域、区域或位点；鉴定转录起始位点；鉴定转录终止子；蛋白的全长氨基酸序列或其成熟形式；翻译区的5’末端。
另一方面，本发明涉及一种分析序列的方法。该方法包括：提供一种SVP序列，或其机读形式的记录；比较第二序列与该SVP序列，例如，分析该SVP序列中有无特定基序或结构域；从而分析该序列。比较包括比较序列的同一性或测定一个序列是否包含在另一序列内，例如，测定所述SVP序列是否含有所比较的序列。一个优选实施方案中，所述SVP或第二序列存储于第一个计算机，例如，在第一位置，并在第二个计算机，例如在第二位置，进行比较、阅读或记录。例如，可将SVP或第二序列保存于一台计算机的公共或专属数据库，在第二台计算机上计算，阅读和记录比较的结果。一个优选实施方案中，所述记录包括1种或多个下列过程：鉴定ORF；鉴定结构域、区域或位点；鉴定转录起始位点；鉴定转录终止子；蛋白的全长氨基酸序列或其成熟形式；翻译区的5’末端。
文库
本发明包括源自本申请所述蛇的核酸或蛋白文库，例如，棕蛇、凶猛太攀蛇、海岸太攀蛇、红腹蛇、虎蛇或粗鳞蛇。核算文库可以是基因组文库或cDNA文库。cDNA文库可源自特定组织，例如，毒腺组织。通常，一个文库含有至少102，103，104，105或更多个不同成员。所述核酸文库成员可插入载体，例如，表达载体如诱导型表达载体之中。
蛋白质文库可以用多种方式展示，例如，噬菌体展示或细胞展示系统。
阵列及其用途
另一方面，本发明涉及一种阵列，其中包括具有众多地址的底物(substrate)。所述阵列可以是核酸阵列或蛋白质阵列。核酸阵列能展示源自1种或多种本申请所述蛇的核酸文库。蛋白阵列能展示源自1种或多种本申请所述蛇的蛋白、多肽或肽文库。将蛋白质或核酸成员置于该阵列上的可鉴定地址。所述阵列的密度为至少小于10，50，100，200，500，1,000，2,000，或10,000或更多个地址/cm2，以及介于其间的范围(ranges between)。一个优选实施方案中，所述众多地址包括至少10，100，500，1,000，5,000，10,000，50,000个地址。一个优选实施方案中，所述众多地址包括等于或少于10，100，500，1,000，5,000，10,000，或50,000个地址。所述底物可以是一种二维底物例如玻片、晶片(例如，硅或塑料)、质谱板，或者三维底物，例如凝胶垫。可以将所述众多地址之外的地址置于阵列上。
一个优选实施方案中，在众多地址中的至少1个含有核酸俘获探针，该探针能与核酸文库中的成员特异性杂交，例如，有义或反义链。一个优选实施方案中，众多地址中的一个地址子集含有针对核酸文库成员的核酸俘获探针。该子集中的每一地址都可以含有能与文库成员的不同区域杂交的俘获探针。
可以用各种方法制备阵列，例如，用光蚀刻方法(参见，例如，美国专利5,143,854；5,510,270；和5,527,681)，机械算法(例如，导向流算法，描述见美国专利5,384,261)，基于针的算法(pin-based method)(例如，描述见美国专利5,288,514)，以及基于小珠的技术(bead-based technique)(例如，描述见PCT US/93/04145)。
另一优选实施方案中，众多地址中的至少1个地址含有能与SVP多肽或其片段特异性结合的俘获探针。所述多肽可以是SVP多肽天然存在的相互作用配偶体。优选地，所述多肽是一种抗体，例如，本申请所述抗体(参见“抗-SVP抗体”上文)，例如单克隆抗体或单链抗体。
药物组合物
本发明还提供了药物组合物，其中包括本发明所述的蛇毒蛋白酶多肽和可药用的载体。本申请中使用的″可药用的载体″包括与药物施用相匹配的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂及抗真菌剂、等渗及吸收延缓剂等。这些载体可选自但不限于：蔗糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽，明胶，滑石粉，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，褐藻酸，磷酸盐缓冲溶液，乳化剂，聚乙二醇及其不同分子量形式，等渗盐水和盐如无机酸盐包括氢氯化物，溴化物和硫酸盐，有机酸盐如醋酸盐，丙酸盐和丙二酸盐以及无热原水。
描述可药用的载体、稀释剂及赋形剂的一本有用的参考书是Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，在此引入作为参考。另外也可将补充活性化合物并入所述组合物。
本发明的药物组合物可用于促进或加速血液凝血。使用的实例包括向如外科手术过程中的流血伤口或损伤或创伤后的伤口给药。
一个方面，蛇毒蛋白酶多肽是所述药物组合物中唯一的凝血成分。本发明药物组合物的一个优点是血液凝血快速发生且无需多种成分如辅因子的后续或组合作用。例如，附加成分如钙离子、因子Va和磷脂是非必需的。因此，一些实施方案中，所述药物组合物不含有任一辅因子，例如，钙、磷脂、因子Va或维生素K之一。其它实施方案中，所述药物组合物可以含有钙、磷脂、和因子Va中的1或多种，但非全部。
一些实施方案中，所述药物组合物可以含有附加成分或佐剂。例如，所述组合物可以含有下列物质中的1或多种：抗微生物剂，例如，抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂，抗炎症剂，抗组胺剂，抗纤维溶解剂和生长因子。抗生素的实例包括四环素，环丙沙星，庆大霉素，环孢菌素，头孢噻唑(cefataxim)等。抗病毒剂的实例包括更昔洛韦(gangcyclovir)，齐多夫定(zidovudin)，三环癸胺(amantidine)，阿糖腺苷(vidarabin)，病毒唑(ribaravin)，三氟胸苷(trifluridine)，阿昔洛韦(acyclovir)，二脱氧尿苷(dideoxyuridine)等。抗真菌剂包括但不限于大扶康(diflucan)，ketaconizole，制霉菌素(nystatin)等。抗寄生虫剂包括例如喷他脒(pentamidine)可以使用。所述组合物还可进一步含有抗炎症剂例如I-1-抗-胰蛋白酶，I-1-抗糜蛋白酶等。可并入所述组合物的生长因子的实例是促进伤口愈合的生长因子，包括但不限于，血管生成素；内皮素；肝细胞生长因子和角质细胞生长因子；成纤维细胞生长因子，包括成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)；血小板源性的生长因子(PDGF)；胰岛素结合生长因子(IGF)，包括胰岛素结合生长因子-1和胰岛素结合生长因子-2；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，包括转化生长因子-I和转化生长因子
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软骨诱导因子(CIF)，包括CIP-A和CIP-B；类骨质(osteoid)诱导因子(OIF)；成骨素以及其它生长因子；骨形态发生生长因子(bone morphogenic growth factor)(BMP)，包括BMP-l和BMP-2；胶原生长因子；肝素结合生长因子，包括肝素结合生长因子-和肝素结合生长因子-2；细胞因子；干扰素；激素。可并入所述组合物的其它化合物包括：血管收缩剂例如肾上腺素，或麻醉剂，例如，局部麻醉剂。
所述药物组合物可以经过配制提高蛇毒蛋白酶的稳定性，例如，减少对蛇毒蛋白酶的消化，如自身消化。可以通过下述方法提高蛇毒蛋白酶的稳定性：例如，将蛇毒蛋白酶以pH约5-9的组合物的形式提供，优选约6.5-7。蛇毒蛋白酶稳定性的提高还可以通过将蛇毒蛋白酶以另外含有稳定剂(如多元醇)的药物组合物来实现。这些实施方案中，所述药物组合物可以含有约5％，10％，20％或更多的多元醇(或多种多元醇)。可用于所述药物组合物的多元醇的一个实例是甘油。其它方面，可以将蛇毒蛋白酶以结晶、冷冻-干燥或冻干的形式提供来提高蛇毒蛋白酶的稳定性。如果所述组合物是冷冻的，那么就应该在使用前融化。另一实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中含有蛇毒蛋白酶，例如，本申请所述的蛇毒蛋白酶，其pH为约5-9，优选约6.5-7。本发明还提供了一种组合物，其中含有蛇毒蛋白酶(例如本申请所述的蛇毒蛋白酶)和稳定剂(例如多元醇，如甘油)。所述多元醇的量为约5％，10％或20％。
含蛇毒蛋白酶组合物的剂量依据蛇毒蛋白酶的具体用途而定，但是所述剂量应该是该组合物能实现期望作用的有效量。可以使用从细胞培养试验和动物试验获得的数据计算人用的剂量范围。通常，由于含蛇毒蛋白酶的组合物是含水溶液，所以认为约1ml～约50ml的所述组合物组以增加纤维蛋白血凝块的形成。但是，根据所述组合物的用途，剂量范围可以为约1ml～约200ml。
一些实施方案中，将本发明的药物组合物局部施用于伤口、手术缝合处或其它需防止血液流失的位置。为此，绷带、补片、纱布、手术用胶带、棉签或其它吸附材料或支持物都可以用含本发明所述蛇毒蛋白酶组合物包被、注入或与其结合，以用于局部给药。另外，还提供了一种血纤蛋白凝胶或手术密封剂形式的药物组合物。本发明的组合物可以是乳膏、洗液、凝胶、喷雾或气溶胶形式，用于关闭腹腔镜或开放性手术或创伤伤口。这些情况下还需局部施用。此外，可以使用用含蛇毒蛋白酶组合物包被或与其发生化学结合的手术缝线和钉。
可以将所述药物组合物与使用说明书一起包装入容器、试剂包或分液器。
另外本发明还提供了一种可加入以防止血凝块溶解的抗血纤蛋白溶解剂，其是通过组织凝血酶原活化剂例如textilinin(描述见国际公开WO99/58569)，抑肽酶和EACA起作用的。
本发明还提供了其中含有本申请所述蛇毒蛋白酶或其部分的试剂盒。该试剂盒可以含有1或多种其它成分，包括：使用说明书；其它试剂，例如，1或多种辅因子(例如，钙、磷脂及因子Va中的1或多种)，和/或其它治疗剂(例如，下列药剂中的1或多种：抗微生物剂，例如，抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂，抗炎症剂，抗组胺剂，抗纤维溶解剂、止痛剂和生长因子)；稀释剂；器具，例如，容器，例如，无菌容器，或用于制备施用用蛇毒蛋白酶的其它物质；可药用的载体(例如，稳定剂)；以及用于向受试者给药的器具或其它物质(例如，注射器、涂药器、绷带、喷雾或气溶胶装置)。所述说明书包括治疗应用说明书，包括建议剂量和/或施用方式，例如，对体外和/或体内出血的患者而言。一些情况下，在给要前让蛇毒蛋白酶与其它成分反应，例如，1或多种辅因子。其它情况下，可以将蛇毒蛋白酶与其它成分(例如，1或多种辅因子)联合给药，且所述试剂盒可以包括记载蛇毒蛋白酶及其它成分的用量、剂量及给药时间的说明书。
一些实施方案中，所述蛇毒蛋白酶可以冻干或冷冻干燥形式提供。这些实施方案中，所述试剂盒可包括下列中的1或多种：融化和/或水解说明书，以及可药用的载体或稀释剂。一些实施方案中，所述试剂盒可含有稀释剂或预定量的稀释剂的说明。
用途
本发明的蛇毒蛋白酶能通过将凝血酶原处理成为凝血酶而有效地活化凝血酶原。凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，能切割血纤蛋白原产生血纤蛋白，并能够作用于数种血因子包括因子V、VIII和XIII以稳定血纤蛋白单体间相互作用，从而加速血凝块的形成。因此，本发明涉及活化凝血酶原以及通过给药本申请所述蛇毒蛋白酶促进止血的方法。该方法包括：向受试者所需部位给要能促进或加速血纤蛋白凝块形成的有效量的蛇毒蛋白酶，从而增加凝血和/或减少血液或体液的流失。“所需部位”是指需要形成血纤蛋白凝块的部位。可以将所述组合物直接施用到伤口、其它组织或其它需要的位置。通常，对于外伤，该组合物可以任一方式直接施用，包括向伤口喷雾。也可以内部施用，例如在手术过程中。
优选实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。由于本申请所述蛇毒蛋白酶不是来自血液，所以消除了对获自血液成分的密封剂、，粘合剂和止血剂中可能出现血液携带的病原体或其它感染因子危险的担心。
蛇毒蛋白酶和含有本申请蛇毒蛋白酶的组合物可用于各种用途，包括作为手术密封剂、粘合剂(例如，局部或手术粘合剂)，或者作为止血剂。
本发明的方法、试剂盒或药物组合物可用于，例如，连接组织或器官、制止或减少流血、防止或抑制出血、愈合伤口和/或封闭伤口。所述方法、试剂盒或药物组合物可用于各种手术系列，包括：神经系统手术；鼻、口、咽的手术；呼吸系统手术；心血管系统手术；血液或淋巴系统手术；消化系统手术；泌尿系统手术；生殖系统手术；肌肉骨骼系统手术；皮肤系统手术；整形手术；矫形手术和移植手术。例如，所述蛇毒蛋白酶可用于血管外科手术，包括在下列情况下用于止血：冠脉远端吻合的针孔(stitchhole)、左室缝线、主动脉切开术和插管处的出血；再次手术时出现的弥漫性心外肌膜出血；以及静脉出血部位的渗血，例如，在心房、腔静脉或右室水平。本发明还可用于移植前缝合涤纶动脉移植物，体外组织缝合，受伤脾、肝及其它实质性器官的止血(从而挽救所述器官)；封闭气管和支气管吻合口及肺气漏或裂伤；封闭支气管切除残端(stumps)、支气管瘘和食管瘘；以及用于无缝线无痕手术(sutureless seamless healing)(″Zipper″技术)。本发明还可用于角膜移植、鼻出血、扁桃腺切除手术后、拔牙以及其它情况中的止血。参见G.F.Gestring and R.Lermer，Vascular Surgery，294-304，September/October 1983。另外，本发明所述的药物组合物特别适合凝血缺陷的个体，例如血友病(例如，血友病A和血友病B)。
另外还发现：与因子Xa和trocarin不同，本发明的蛇毒蛋白酶能活化脱羧凝基血酶原。脱羧凝血酶原发现于，例如，经抗凝血剂例如华法林(coumadin)治疗后的受试者。因此，本发明的方法、试剂盒和药物组合物可用于活化凝血酶原，并促进用抗凝血剂如华法林治疗过的受试者的止血。本申请所述方法和组合物可在手术或创伤时用于这些受试者，且无需抑制或减少华法林的治疗。
如上所述，可将蛇毒蛋白酶配制成伤口敷料、绷带、补片、纱布、手术用胶带、棉签或其它吸收材料或支持基质的一部分。敷料和绷带简单易用，不需高级技术知识或技能就能操作。它们甚至可用作突发事件急救措施而自身施用。所述伤用敷料和绷带可用于各种野外用途，例如，用于战士、救护人员/护理队、消防人员的伤口包扎；用于由医院和门诊部急诊室人员进行先期外伤急救处理，特别是灾难情况下。所述敷料还可用于急救箱，供一般公众或医务人员使用。含蛇毒蛋白酶的伤用敷料或绷带还可包括下列物质中的1种或多种：钙、磷脂、稳定剂或例如本申请所述的其它化合物或药剂。例如，所述伤用敷料或绷带还可包括：止痛剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂，抗炎症剂，抗组胺剂，抗纤维溶解剂和生长因子。
可以向组合物添加除蛇毒蛋白酶之外的一种以上化合物，可以同时施用，或者可以各自以预定时间释放。添加至组合物的附加化合物(或多种化合物)可以一定浓度添加以致其有效地达到预期目的，例如，抗生素抑制微生物的生长，止痛剂减轻疼痛，等等。一些实施方案中，所述敷料或绷带可以包括粘合剂层和/或支持层。所述敷料或绷带的支持层可以是常规的非再吸收材料，例如，硅酮补片或塑料材料；或者其可以是生物相容性的再吸收材料，例如，壳质或其衍生物。
对于其它用途，例如用作手术密封剂或手术粘合剂，所述药物组合物可以是血纤蛋白凝胶或手术密封剂形式，其可制成乳膏、洗液、凝胶、喷雾、泡沫或气溶胶形式，就喷雾、泡沫或气溶胶而言，可将所述组合物存储在带有加压推进装置的罐或槽内，从而使所述成份以可膨胀的泡沫或喷雾形式递送到伤口。一个优选实施方案中，所述喷雾、泡沫或气溶胶被定量提供。这些实施方案中，所述方法包括：向受试者定量提供喷雾、泡沫或气溶胶，以及向受试者提供(例如，向伤口给药)喷雾、泡沫或气溶胶的说明书。说明书可以是自身施用或向他人施用。
尽管所述组合物形成凝块的速度一定程度根据具体情况而定的，例如，动脉伤口及出血组织损伤的快速情况，骨组织伤口处理的较缓的情况。优选地，凝块要在应用后10分钟内明显出现。最优选，凝块要在应用后2-8分钟内明显出现。
本发明还通过下列实施例进一步说明，这些实施例不应该理解为有限制作用。本申请全文中引用的所有文献、专利以及公开的专利申请在此引入作为参考。
实施例
材料和方法
材料
棕蛇蛇毒蛋白酶复合物制备方法的描述见Masci等，1988，Biochem.Int.17 825，在此引入作为参考。将4mg/ml的凝血酶原活化剂在保存于-20℃的50％甘油中。Sephacryl S-300获自Amersham Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden，合成发色底物S-2222获自Chromogenex，Stockholm，Sweden。过期的柠檬酸化血浆是由Princess Alexandra医院血库从正常的经过病毒筛选的志愿者制备获得的。Hampton 1和2筛选试剂盒获自Hampton Research，美国。Wizard 1和2筛选试剂盒获自Emerald Biostructures，英国。
棕蛇蛇毒蛋白酶的纯化
ConA-Sepharose 4B
P.textilis-蛇毒蛋白酶纯化的第一步是从粗制蛇毒中分离棕蛇蛇毒蛋白酶复合物，描述见Masci等，1988，同上。将Con A-Sepharose 4B填充入2.5×16cm柱体，按厂商推荐方法洗涤，用起动缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH 7.4)平衡。将P.textilis蛇毒(233mg干重)重配于10ml起动缓冲液，然后置于37℃水浴直至溶解。将样品上样于上述柱体，用过柱缓冲液洗涤直至底线归零。将洗脱缓冲液(0.02M甲基α-D吡喃甘露糖苷溶于0.05MTris-HCl)施加柱体，从Con A-Sepharose 4B上洗脱出结合蛋白(棕蛇蛇毒蛋白酶复合物)。过柱的流速是52ml/小时。将双波长紫外检测器设置为280mm且衰减0.32和0.64吸光度单位满量程(AUFS)。收集具有S-2222水解活性的级分，在405型Amicon浓缩器中用YM3膜浓缩，流速为48mL/小时。将纯化后的棕蛇蛇毒蛋白酶复合物保存于-20℃的50％甘油中。
从棕蛇蛇毒蛋白酶复合物中纯化棕蛇蛇毒蛋白酶
Sephacryl S-300层析
Sephacryl S-300层析凝胶按照厂商推荐洗涤。87cm×2.5cm的Sephacryl S-300层析柱6℃填充，用起动缓冲液(0.05M Tris-HCl缓冲液，pH 7.4)平衡，然后在上样前再用两倍体积的同种缓冲液添加0.8M NaSCN来平衡。将10ml 4mg/ml凝血酶原活化剂与10ml 1.6M NaSCN孵育10分钟，然后上样于层析柱。为了将流速控制在40ml/小时，在Gilson蠕动泵上安装一个紫/黑色小室。将Altex双波长紫外检测器设置为A280且衰减0.32AUFS，将Cole Palmer 2 pen chart记录仪设置为1cm/hr，进行使用。使用LKB 7000级分收集器按时间收集级分，开始按10min/管的间隔收集级分，随后变至12min/管，分别收集6.5和8ml级分。进行上述的发色试验，将混合后在42型Amicon浓缩器中用YM3膜浓缩的具有S-2222水解活性的级分进行评估。将该操作重复三次。
Superdex 200凝胶层析
另外，还使用了Superdex 200高分离度凝胶层析从棕蛇蛇毒蛋白酶复合物中纯化蛋白酶。Superdex 200按照厂商推荐洗涤，填充入2.5×90cm柱体，用过柱缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH 7.4，0.8M NaSCN)平衡。将含9mL 5.6mg/mL棕蛇蛇毒蛋白酶复合物的溶液与9mL 1.6M NaSCN孵育30分钟，然后上样于层析柱。流速为48mL/小时。280nm处波长检测仪的衰减为0.32或0.64AUFS。混合具有S-2222活性的级分，在52型Amicon浓缩器中用YM3膜浓缩。然后将混合并浓缩的样品(5mL)在相同的层析柱上再层析。将最终的蛋白酶制剂在0.05M Tris-HCI，pH 7.4中透析过夜，除去溶液中的NaSCN。该制剂(保存于10％甘油/Tris缓冲液-20℃)用于所有功能和结构特性研究。
高效液相层析(HPLC)
反向-HPLC在25℃进行，使用由6000A双活塞泵和M45A泵组成的Waters(TM)系统、调至A280nm的490波长检测器，以及Wisp样品注射器和Phemonenex Jupiter C18-层析拄(KHO-4154)(1.4mm×250mm)。层析采用在60分钟内线性梯度的模式，使用起动溶液(A)溶于蒸馏水的0.1％TFA，用(B)洗脱，(B)是溶于(A)的80％乙腈。使用Waters Millenium version 1.01软件操作该系统并整理数据。
十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
SDS PAGE基本上按照Laemlli，1970，Nature 227 680描述进行。将SDS-PAGE样品置于含或不含β-巯基乙醇(β-Me)的SDS样品缓冲液中煮沸10分钟。凝胶用考马斯兰染色，然后用甲醇、乙酸及水(45∶10∶45)脱色。
N-末端氨基酸测序
测序采用Edman降解法。使用Applied Biosytems Procine 492cLC蛋白测序系统对棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶测序。参考Applied Biosystems使用手册no.904 244部分，修订本D关于设备的详细描述。然后用ExPAsy/NCBIblast进行搜索，鉴定爬行动物丝氨酸蛋白酶和因子Xa与T.carinatus因子Xa样丝氨酸蛋白酶之间的序列同源性。
第一链cDNA合成和cDNA末端扩增
取1μg分离自蛇腺体的总RNA用于cDNA合成。为了制备5’RACE-Ready cDNA，我们使用了来自SMART RACE cDNA扩增试剂盒的5’-CDS[5’-(T)25 N-1 N-3’；N＝A，C，G，或T；N-1＝A，G，或C][SEQ ID NO：32]和SMART II A oligo[5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’][SEQ ID NO：33]引物，为了制备3’RACE ready cDNA-使用了来自同一试剂盒的3’-CDS引物A[5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 N-1N-3’；N＝A，C，G，或T；N-1＝A，G，或C][SEQ ID NO：34]，还使用了同一试剂盒中的PowerScript反转录酶。这两种cDNA均加入100μl水稀释，然后用于cDNA末端快速扩增(RACE)，按照使用手册(SMART RACE cDNAAmplification Kit，Clontech)描述的方案进行。
对于3’RACE PCR：3’RACE cDNA，UPM[通用引物混合物A5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(长)[SEQ ID NO：35]和5’-CTAATACGACT CACTATAGGGC-3’(短)[SEQ IDNO：36]以及简并GSP-2(正向)引物[AAYGGWATGGAYTGYAA；Y＝C+T，W＝A+T][SEQ ID NO：37]都基于N-末端氨基酸序列IVNGMD。用高保真1聚合酶混合物(Advantage 2 Polymerase Mix)(Clontech)启动反应。热个循环仪：1个循环：95℃1min；25个循环：95℃30sec，65℃1min，68℃3min；1个循环：68℃3min。用QIAquick Gel提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离出主要PCR-产物(1.5kbp)，克隆入pGEM-T Easy Vector。筛选后，用QIAprep Spin小量抽提试剂盒(Qiagen)从35个集落中分离出小量抽提物。
DNA测序
DNA测序采用BigDye Terminator和针对pGEM-T Easy Vector的正向引物(GTTTTCCCAGTCACGAC)[SEQ ID NO：38]来进行。结果发现只有2个克隆在大约500bp内不含有终止密码子。用For2引物(ATCGTTAGTGGATTTGG)[SEQ ID NO：39]对这些克隆进行测序。结果发现了终止密码子。这两个克隆的全序列相似，3’-DNA的长度从GSP-2到第1个终止密码子为776bp。
使用3’cDNA序列设计反向引物GSP-1：GAAATCGTCTCGGTCTCATTA[SEQ ID NO：40]。对于5’RACE PCR 5’cDNA，使用UPM(见上文)，GSP-1和高保真2聚合酶混合物(Clontech)。PCR反应条件与3’RACE PCR相同。分离主要PCR产物(1kbp)，克隆入pGEM-T Easy Vector。选出15个克隆进行测序，6个结果相同，不含有终止密码子。使用两种测序引物：针对pGEM-T Easy Vector的正向引物(见上文)和反向引物GSP-1。所有6个克隆都含有ATG，且从起始位置到对应于GSP-2引物序列的位置长度为628bp。使用3’和5’cDNA序列设计针对全长cDNA的正向及反向引物：SE(正向)ATGGCTCCTCAACTACTCCTCTG[SEQ ID NO：41]和SE(反向)TTAGAGCCGACCAGTGCTTGACTC[SEQ ID NO：42]。将PCR-产物(1.407bp)克隆入测序用pGEM-T Easy Vector以备测序。
棕蛇蛇毒蛋白酶复合物的发色凝血酶原活化试验
进行一系列试验，获得S-2222水解速度相对棕蛇蛇毒蛋白酶复合物或棕蛇蛇毒蛋白酶用量的标准曲线。用0.05M Tris-HCl，pH 7.4对棕蛇蛇毒蛋白酶复合物(4mg/ml)和蛋白酶(1mg/ml)分别稀释为1/10-1/10,000，然后保存于冰上。
通过下述方法测定P.textilis丝氨酸蛋白酶或棕蛇蛇毒蛋白酶复合物对S-2222的水解活性：将含或不含10mM CaCl2的0.05M Tris-HCl，pH 7.4，缓冲液0.93ml与50μl 3.0mM S-2222置于Hitachi 557分光光度计1ml小室中25℃平衡。通过加入20μl不同浓度的蛋白酶(0.4mg/ml)启动反应。在405nm处监测p-硝基苯胺的释放情况。试验使用0.91ml 0.05M Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，其中含有0.8M NaSCN，50μl S-2222和40μl 0.4mg/ml棕蛇蛇毒蛋白酶复合物，时间间隔为0，1，2，5和10分钟。1个活性单位相当于水解1μmol底物/分钟。
棕蛇蛇毒蛋白酶的凝血酶原活化试验
将棕蛇蛇毒蛋白酶(5μg)加入2mL凝血酶原溶于0.05M Tris-HCl，pH 7.4中浓度为0.25mg/mL的溶液。在不同时间间隔取等份(20μL)的该溶液，用凝血酶-选择性底物S-2238进行发色试验。这些试验由930μL 0.05MTris-HCl，pH 7.4，50μL S-2238和20μL样品组成。在405nm处测定底物水解速度。在每一时间间隔取两个20μL溶液等份，进行SDS PAGE分析±β-巯基乙醇。
凝血试验
柠檬酸化血浆凝血试验使用Hyland-Clotek机器，按照BlackwellScientific Publishers，Oxford UK 1975中的在：A laboratory manual of bloodcoagulation。Austen&Rhymes方法进行。试验由100μl 0.05M Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，100μl柠檬酸化人血浆和20μl不同浓度蛋白酶组成。同样的试验也在加或不加0.04M CaCl2以及加0.8M NaSCN的情况下进行，按时间间隔取等份溶液。
通过棕蛇蛇毒蛋白酶在柠檬酸化血浆中形成血纤蛋白
将人柠檬酸化血浆(970μl)与下列混合：
(1)20μl 1.16mg/mL蛋白酶；
(2)20μl 1.16mg/mL蛋白酶和10μl 4M CaCl2，使Ca2+终浓度为40mM(浓度从无Ca2+～10mM)；
(3)10μl 4M CaCl2。
向每一溶液中加入0.05M Tris-HCl，pH 7.4使其体积达到1mL。将这三种溶液放置4小时，将得到的血凝块压实，然后用dH2O洗涤数次，以便从血纤蛋白凝块中除去其它血浆蛋白。然后，将得到的血凝块加入装有500μL含β-巯基乙醇和4M尿素的4x SDS样品缓冲液的Eppendorf管中。向每个Eppendorf管中再加入一滴β-巯基乙醇，放置过夜。样品煮沸5分钟，每一样品取10μL，按照本申请所述进行SDS PAGE丙烯酰胺凝胶电泳分析。
棕蛇蛇毒蛋白酶复合物和棕蛇蛇毒蛋白酶活性位点的标记
让棕蛇蛇毒蛋白酶复合物(4mg/mL)和棕蛇蛇毒蛋白酶(2mg/mL)的溶液样品(120μl)与15μL 40mM DNS-GGACK(在0.05M Tris-HCl，pH 7.4中的终浓度为4mM)反应1小时。然后，用磁力搅拌器在4℃用0.05MTris-HCl，pH 7.4将样品透析过夜，除去多余的抑制剂。然后，用加或不加β-巯基乙醇的SDS PAGE对标记和未标记的棕蛇蛇毒蛋白酶复合物和蛋白酶进行电泳分析。将带有活性位点标记后的蛋白的凝胶置于紫外线灯下观察，而其它凝胶用考马氏兰染色。
血纤蛋白胶研究
将过期的(outdated)柠檬酸化血浆(3.5ml)分配于37℃水浴中的20ml锥形塑料小管内。向两个小管中都加入20μl 2mg/ml棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶。其中一个管中加入0.025M CaCl2，另一个管中加入盐水。肉眼观察监视凝血时间，当血凝块形成时，将其置于no.54滤纸上并按压。得到压实的血凝块用蒸馏水强力洗涤后4℃保存过夜。给血凝块拍照评价纹理(texture)。
结果
如本申请所示，以P.textilis为例，所述的蛇毒蛋白酶复合物中含有具有因子Xa样丝氨酸蛋白酶特性的蛋白酶和大量功能未知的其它蛋白质。来自P.textilis，O.scutellatus，N.scutatus，T.carinatus和P porphyriacus的分离的蛇毒蛋白酶可用于制备局部用药的血纤蛋白″胶(glue)″或“粘合剂(sealant)”形式的药物组合物。
本申请中的一些试验使用的是来自P.textilis的样品和蛋白质。但是，本领域技术人员应该理解的是：这些试验是一些对蛇毒蛋白酶复合物和蛇毒蛋白酶定性的实例，它们也适用于本发明的其它蛇毒蛋白酶。
蛇毒蛋白酶的纯化
棕蛇蛇毒蛋白酶复合物的纯化(ConA-Sepharose 4B)
纯化P.textilis-蛇毒蛋白酶的第一步是从粗制蛇毒中分离棕蛇蛇毒蛋白酶复合物。使用的方法以Masci et al，1988，同上描述的方法为基础。将233mg干重的粗制P.textilis蛇毒在ConA-Sepharose 4B上层析，将得到的280nm洗脱曲线图示于图1(原始层析图的描绘)。
蛇毒分为了两个主要的蛋白峰，其中一个结合ConA-Separose 4B，具有抗因子Xa的底物S-2222的活性(图1中A线标示的那段)。根据A280计算，活性峰占总蛇毒蛋白的约30％。
从ConA-Sepharose 4B层析得到的混合的棕蛇蛇毒蛋白酶复合物浓缩物，其SDS-PAGE电泳分析如图2所示；泳道1：分子量标志物(大小用kDa表示)，泳道2：没加β-巯基乙醇的棕蛇蛇毒蛋白酶复合物，泳道3：加入了β-巯基乙醇的棕蛇蛇毒蛋白酶复合物。
泳道2中箭头A指示完整棕蛇蛇毒蛋白酶的条带，而泳道3中箭头B和C指示的分别是棕蛇蛇毒蛋白酶的重链和轻链(见下文)。
棕蛇蛇毒蛋白酶复合物，在没加β-巯基乙醇时(泳道2)，包括约150-200kDa处的1条单个的明显的蛋白条带和其它3条分子量约60、50和45kDa的主要条带。泳道2中3条主要条带的大约分子量的总和得到整个混合物的计算分子量为300-350kDa。
棕蛇蛇毒蛋白酶复合物在加入了β-巯基乙醇时(泳道3)分离成为几条表观分子量为110，93，80，55，46，40的蛋白带和一条约32-34kDa宽的条带(可能是条带二联体)。泳道2和3的差异表明：二硫键将复合物中的一些多肽连接在一起。
棕蛇蛇毒蛋白酶复合物中的蛋白酶成分在泳道2中呈约50-60kDa的肉眼可见的二联体，如箭头A所指。蛋白酶的重链显示为一约40kDa的条带(如箭头B所指)，蛋白酶轻链的大约分子量为32kDa(如箭头C所指)。A、B和C对SDS PAGE条带的指示得到了本申请所述分离和定性试验的验证。图2中的一些条带可能代表的是棕蛇蛇毒蛋白酶复合物中的蛇毒杂质。
从棕蛇蛇毒蛋白酶复合物中纯化蛋白酶成分
Sephacryl S-300层析
为了分离棕蛇蛇毒蛋白酶复合物中棕蛇蛇毒因子Xa样丝氨酸蛋白酶成分，需要解离该复合物。Speijer et al(1986)表明：0.8M NaSCN能有效解离O.scutellatus-凝血酶原活化剂，但是没有试图用0.8M NaSCN通过层析方法纯化它。为了说明用0.8M NaSCN能够解离棕蛇蛇毒蛋白酶复合物，进行下列试验，结果提供于图3。棕蛇蛇毒蛋白酶复合物加入0.8M NaSCN导致柠檬酸化血浆凝血活性快速减弱，从不足10秒延长至超过60秒，但是S-2222活性却大部分都仍保留。
棕蛇蛇毒蛋白酶复合物用0.8M NaSCN处理后，在已用含0.8MNaSCN的缓冲液平衡过的Sephacryl S-300层析柱上进行凝胶过滤层析，分离成单个成分。
级分30-43表现出S-2222水解活性。为了减少级分的数目，在剩余层析步骤中将级分体积从6.5ml/管增至8ml/管。对混合和浓缩后的级分30-43进行第二次Sephacryl S-300层析。级分25-29表现出S-2222水解活性。对混合和浓缩后的级分25-29进行第三次Sephacryl S-300层析。级分25-29中基本上只有一个具有S-2222水解活性的蛋白峰。高度同质性得到了HPLC的证实(图4)。根据HPLC，所述棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的纯度大于95％。
表1-6概括了成套试验的纯化结果及样品鉴定。
Sephacryl S-300凝胶过滤产物的SDS PAGE±β-Me
对来自所有层析步骤的混合级分进行SDS PAGE电泳，结果图示于图5。泳道4(含Sephacryl S-300，层析步骤1，混合级分30-43)表明混合的棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的同质制剂已经不复存在，因为有分子量约107kDa的污染物存在。泳道5(含Sephacryl S-300，层析步骤2，混合级分25-29)表明55-56kDa成分所占比例更大，但是仍含有污染物需要第3步层析。泳道6-8中是不同量的来自第3层析步骤的Sephacryl S-300混合级分25-29，表明是同质制剂。完整棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的分子量为55-56kDa，如泳道5-8所示。
已经将棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶与整个P.textilis蛇毒(泳道2)以及加入(泳道10)和没有加β-Me(泳道3)的完整棕蛇蛇毒蛋白酶复合物进行了比较。结果表明了棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶在复合物及整个蛇毒中所占的位置。
图5中的泳道9显示的是用β-Me还原来自层析步骤3的SephacrylS-300混合级分25-29。能够看到分子量约31kDa的单个条带。进行第二次凝胶分离，鉴定棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶还原应该得到的预期两条带。该凝胶图示于图6。
图6中看到的是：Sephacryl S-300的混合浓缩级分25-29在加或没加β-Me条件下的SDS PAGE。泳道3(包括Sephacryl S-300，层析步骤3，混合级分25-29)、4和6(包括来自第3次层析的Sephacryl S-300混合浓缩级分25-29 )表明已经成功得到了棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的同质制剂。但是，泳道3和6中的条带都很淡。棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的分子量为55-56kDa，与图5的结果一致。
泳道5(包括来自第3次层析的Sephacryl S-300混合浓缩级分25-29，加入β-Me)表明所述棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶含有3个亚单位，但是最后的那个条带可能是染料前沿，染料前沿在Laemlli方法中经常可以看到，或者它可以是自身消化的产物。泳道7(包括Sephacryl S-300，层析步骤3，混合且浓缩的级分25-29+β-Me)中没有出现任何条带，泳道8(包括SephacrylS-300，来自层析步骤3，混合且浓缩的级分25-29+β-Me)表明棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶包括重链和轻链。根据相应的因子Xa和O.scutellatus丝氨酸蛋白酶的结构可以断定，棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶包括重链和轻链。棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶重链的分子量为约31kDa，与图5的结果一致，轻链的分子量为约18kDa。将P.textilis整个蛇毒(泳道2)以及加有β-Me的完整棕蛇蛇毒蛋白酶复合物(泳道9)也包括在凝胶内，这样可与代表棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的条带做比较。
Superdex 200凝胶过滤
在试图提高棕蛇蛇毒蛋白酶纯度的尝试中，使用高分辨率的凝胶过滤介质(Superdex 200)代替Sephacryl S-300。在NaSCN存在下用Superdex 200层析和再层析棕蛇蛇毒蛋白酶复合物后得到的280nm洗脱曲线图示于图7A和7B。图7A和7B给出的是洗脱曲线，这些曲线是棕蛇蛇毒蛋白酶复合物(18mL；50.4mg)于Superdex 200层析柱(2.5×90cm)上含0.8MNaSCN的0.05M Tris-HCl，pH 7.4中层析得到的。图7A图示了层析步骤1，图7B图示了层析步骤2。将每一步骤中具有S-2222活性的级分(即A线标示的那段)混合并浓缩。
如图7C所示，将用Superdex 200纯化得到的棕蛇蛇毒蛋白酶样品，在每一纯化步骤后通过SDS PAGE电泳分离。泳道1和2：层析步骤1得到的混合浓缩物，加有(泳道2)及没加(泳道1)β-巯基乙醇；泳道3和4：层析步骤2得到的混合浓缩物，加有(泳道5)及没加(泳道4)β-巯基乙醇；泳道5：分子量标志物(大小用kDa表示)；箭头A、B和C指示的是泳道4中的杂质。
Superdex 200纯化时使用的起始物质的比活性基本上低于SephacrylS-300层析所使用起始物质的比活性(表2)。这可能反映了不同蛇毒样品的不同活性。Superdex 200纯化得到的最终产物的比活性为1.1U/mL/A280，不及Sephacryl S-300产物的2.4U/mL/A280的一半。
提供的其它分离方法包括：离子交换层析、用尿素作为另一种解离剂、使用ConA-Sepharose 4B一步纯化法从粗制P.textilis蛇毒中纯化棕蛇蛇毒蛋白酶、基于蛋白酶底物特异性的亲合方法以及其它本领域已知方法。下列是适于分离本发明的凝血酶原活化蛋白的方法的实例，以分离棕蛇蛇毒蛋白酶为例。表3-6给出的是纯化过程中不同步骤得到样品的特性。
方案1
ConA-Sepharose(07-01-03)
·起动缓冲液，0.05M Tris-HCl，pH 7.4
·洗脱缓冲液，0.05M Tris-HCl，0.02M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷
·加载的样品：将Venom Supplies来源的干的蛇毒(重量：541mg)重配于10ml起动缓冲液
*1ml溶液的A280：13.5
*加载的总A280单位(Total A280 units loaded)：135
*样品活性：38U/ml
*加载的总活性单位(Total activity units loaded)：377
·混合具有S-2222活性的级分
*浓缩混合物的A280为6.8，共10ml。
*混合后的总的A280单位：68
*混合物活性：2.6U/ml
*混合后的总活性单位：26.0
Superdex 200(13-01-03)
·起动缓冲液，0.05M Tris-HCl，pH 7.4，0.8M NaSCN
·加载的样品：从加有0.8M NaSCN的ConA-Sepharose层析得到的混合且浓缩峰的一部分(A280 8.9，10ml，3.25U/ml)
*A280总加载单位：89
*总加载活性单位：32.5
·混合具有S-2222活性的级分
*浓缩混合物的A280为0.350，共20ml
*混合后的总的A280单位：7
*浓缩混合物的活性：0.46U/ml
*混合后的总活性单位：9.2
Superdex 200(14-01-03)
·起动缓冲液，0.05M Tris-HCl，pH 7.4，0.8M NaSCN
·加载的样品：从提前Superdex 200层析得到的混合且浓缩级分(A2800.350，20ml，0.46U/ml)
*A280总加载单位：7
*总加载活性单位：9.2
·混合具有S-2222活性的级分
*浓缩混合物的A280为0.076，共40ml
*混合后的总的A280单位：3.0
*浓缩混合物的活性：0.11U/ml
*混合后的总活性单位：4.4
方案2
ConA-Sepharose(21-01-03)
·起动缓冲液，0.05M Tris-HCl，pH 7.4
·洗脱缓冲液，0.05M Tris-HCl，0.02M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷，然后0.05M Tris-HCl，pH 7.4，0.8M NaSCN
·加载的样品：将来自John Weigel的干的蛇毒(重量：432mg)重配于10ml起动缓冲液
*1ml溶液的A280：25.6
*A280总加载单位：256
*样品活性：102.9U/ml
*总加载活性单位：1028
·混合具有S-2222活性的级分
*制备2个级分混合物
1.用甲基-α-D-吡喃甘露糖苷洗脱并浓缩的级分(应用于苯基-Sepharose层析柱)
*浓缩混合物的A280为0.95，共22ml
*混合后的总的A280单位：20.9
*混合物活性：5.0U/ml
*混合后的总活性单位：110
2.用NaSCN洗脱并浓缩的级分(只将其中一半用于下面的2个完全相同Superdex 200层析步骤)。
            200层析柱如下所述
*浓缩混合物的A280为1.85，共27ml
*混合后的总的A280单位：68
*混合物活性：2.6U/ml
*混合后的总活性单位：26.0
Superdex 200(29-01-03和30-01-03)
·起动缓冲液，0.05M Tris-HCl，pH 7.4，0.8M NaSCN
·加载的样品：从上述ConA-Sepharose层析得到的混合浓缩峰的一部分。进行2个完全相同的层析步骤。加载的样品由来自上述ConA-Sepharose层析的混合浓缩峰添加0.8M NaSCN组成：
*1ml溶液的A280：1.2
*A280总加载单位：19.2
*样品活性：15.7U/ml
*总加载活性单位：250.6
·将从每一层析步骤得到的具有高且相同比活性的级分混合并浓缩(其它级分也具有S-2222活性但是所述比活性较低，将这些级分另行混合)：
*浓缩混合物的A280为1.9，共9ml
*混合后的总的A280单位：17.1
*浓缩混合物的活性：25.7U/ml
*混合后的总活性单位：231.3
Superdex 200(04-02-03)
·起动缓冲液，0.05M Tris-HCl，pH 7.4(不含NaSCN)
·加载的样品：得自前述Superdex 200层析的混合且浓缩级分(A2801.9，9ml，25.7U/ml)
*A280总加载单位：17.1
*总加载活性单位：231.3
·混合具有S-2222活性的级分(下列结果包括具有最高S-2222活性的级分，其它级分也具有S-2222活性，将这些级分另行混合)
*浓缩混合物的A280为1.7，共9.5ml
*混合后的总的A280单位：16.2
*浓缩后混合物的活性：17.7U/ml
*混合后的总活性单位：168.2
方案3
ConA-Sepharose(10-02-03)
·起动缓冲液，0.05M Tris-HCl，pH 7.4
·洗脱缓冲液，0.025M Tris-醋酸，pH 6.5，4M尿素
·加载的样品：将干的蛇毒(重量：557mg)重配于25ml起动缓冲液
*1ml溶液的A280：28
*A280总加载单位：700
*样品活性：83.4U/ml
*总加载活性单位：2087
·混合具有S-2222活性的级分
*混合物的A280为0.592，共640ml。
*混合后的总的A280单位：379
*混合物活性：0.152U/ml
*混合后的总活性单位：97.3
CM-Sepharose(12-02-03)
·起动缓冲液，0.025M Tris-醋酸，pH 6.5，4M尿素
·加载的样品：来自ConA-Sepharose层析的混合级分(A280 0.592，640ml，0.152U/ml)
*加载的总A280单位：379
*加载的总活性单位：97
·一旦将全部样品加载到层析柱，就应用0-0.5M NaCl梯度。
·混合具有S-2222活性的级分
*浓缩混合物的A280为4.5，共17.5ml。
*混合后的总的A280单位：79
*浓缩后混合物的活性：1.44U/ml
*混合后的总活性单位：25
Superdex 200(13-02-03)
·起动缓冲液，0.05M Tris-醋酸，pH 6.5
·加载的样品：来自CM-SEPHAROSE层析的混合且浓缩的级分(A2804.5，17.5ml，1.44U/ml)
*A280总加载单位：79
*总加载活性单位：25
·混合具有S-2222活性的级分(下列结果是指混合的对称峰，其它级分也具有S-2222活性)
*浓缩混合物的A280为0.330，共7.5ml
*混合后的总的A280单位：2.5
*浓缩后混合物的活性：0.146U/ml
*混合后的总活性单位：1
方案4
苯基Sepharose(15-02-03)
·起动缓冲液，0.8M NaSCN-磷酸，pH 6.5
·加载的样品：来自ConA-Sepharose层析的混合且浓缩的级分(A2800.95，22ml，5.03U/ml)
*A280总加载单位：20.9
*总加载活性单位：110
·一旦将全部样品加载到层析柱，就应用0.8-0M NaSCN梯度。
·混合具有S-2222活性的级分
*浓缩混合物的A280为0.485，共9.5ml
*混合后的总的A280单位：4.6
*浓缩后混合物的活性：1.4U/ml
*混合后的总活性单位：13
Superdex 200(18-02-03)
·起动缓冲液，0.05M Tris-醋酸，pH 6.5
·加载的样品：来自苯基Sepharose层析的混合且浓缩的级分(A2800.485，10ml，1.4U/ml)
*A280总加载单位：4.85
*总加载活性单位：14
·混合具有S-2222活性的级分(制备2个混合物，下面描述的这个含有具有最大活性的级分)
*浓缩混合物的A280为0.327，共3.5ml
*混合后的总的A280单位：1.14
*混合物活性：1.83U/ml
*混合后的总活性单位：6.4
P.textilis-蛇毒蛋白酶复合物的特性
Ca2+ 对棕蛇蛇毒蛋白酶复合物水解发色底物S-2222的影响
为了测定蛇毒蛋白酶复合物因子Xa样切割特异性，使用因子Xa特异性发色底物S-2222进行发色试验。棕蛇蛇毒蛋白酶复合物能够水解S-2222，无论有无加入Ca2+。无Ca2+时的初始水解速度与Ca2+存在下近似，但只有当棕蛇蛇毒蛋白酶复合物浓度大于2μg/ml时才这样(数据未给出)。
试验中，棕蛇蛇毒蛋白酶复合物水解S-2222的速度相对棕蛇蛇毒蛋白酶复合物的量近乎呈线性(如表7中的R2值所示，图未给出)。
加入Ca2+或加入Ca2+与PL基本上不影响棕蛇蛇毒蛋白酶复合物对S-2222的水解，这与分离的棕蛇蛇毒蛋白酶类似。对S-2222被棕蛇蛇毒蛋白酶复合物水解与被棕蛇蛇毒蛋白酶水解的情况进行比较表明：在单位/μg水平的速度是近似的。由于棕蛇蛇毒蛋白酶复合物中只有约10-15％是蛋白酶(按质量计算)，所以在摩尔水平，棕蛇蛇毒蛋白酶复合物中蛋白酶水解S-2222的速度比分离的蛋白酶高约10倍。
用棕蛇蛇毒蛋白酶复合物使柠檬酸化血浆凝血
使用棕蛇蛇毒蛋白酶复合物与使用分离的棕蛇蛇毒蛋白酶的柠檬酸化血浆凝血试验，以比较凝血特性。这些试验的结果显示于表8。表8中的数据来自于与下述凝血有关的数据，即在有和无辅助成分存在时柠檬酸化血浆在棕蛇蛇毒蛋白酶复合物作用下的凝血(即，单独使用棕蛇蛇毒蛋白酶复合物、使用棕蛇蛇毒蛋白酶复合物时加入40mM CaCl2、以及使用棕蛇蛇毒蛋白酶复合物时加入40mM CaCl2和磷脂)。
结果表明Ca2+和PL不影响棕蛇蛇毒蛋白酶复合物的凝血效率。
Ca2+对柠檬酸化血浆在棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶作用下的凝血时间的影响
为了研究棕蛇蛇毒蛋白酶的凝血特性，将柠檬酸化血浆在无Ca2+时的凝血时间与有Ca2+存在时的凝血时间进行比较。表9和10的结果表明：棕蛇蛇毒蛋白酶复合物不需要Ca2+就能使血凝血。例如，39μg/mL的分离的棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶在无Ca2+存在时使柠檬酸化血浆凝血的时间不足30秒。Ca2+加入使凝血时间为70秒所需要的棕蛇蛇毒蛋白酶的量减少了200倍(表10)。这表明棕蛇蛇毒蛋白酶在无Ca2+存在时能将凝血酶原转化为凝血酶，Ca2+有助于凝血酶原的切割。
图8A-8C给出的是在有无辅助成分存在时柠檬酸化血浆在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的凝血情况(数据点值是双份平行测量的平均值)。图8A：单独使用棕蛇蛇毒蛋白酶，图8B：使用棕蛇蛇毒蛋白酶时加入10mM CaCl2，以及图8C：使用棕蛇蛇毒蛋白酶时加入10mM CaCl2和磷脂(platelin)。
Ca2+也能促进棕蛇蛇毒蛋白酶产生的凝血酶对血纤蛋白原的活化(Mankad and Codispoti，2001，Am J Surg 182 21S)，因此Ca2+加入对凝血的影响对于凝血酶原的活化是次要的。PL也有助于凝血酶原被棕蛇蛇毒蛋白酶的切割，导致凝血所需棕蛇蛇毒蛋白酶的量进一步减少了10倍，如表14所示。
Ca2+对S-2222发色底物被凝血酶原活化蛋白切割的影响
为了测定棕蛇蛇毒蛋白酶复合物因子Xa样切割特异性，使用因子Xa特异性发色底物S-2222进行发色试验。S-2222是一种在Xa作用下显色的合成发色底物(Aurell等，1977，Thrombin Res 11 595)。S-2222水解释放p-硝基苯胺，p-硝基苯胺可以通过405nm处吸光度的增加来检测。酶活性相对于棕蛇蛇毒蛋白酶量的图线(plot)基本上是线性的，如图12A-12D所示。结果表明S-2222水解的速度不受Ca2+或Ca2+和PL存在的影响，因而催化位点是不受Ca2+和PL影响的。从0.002U/μg蛋白酶的斜率可知，纯化制剂的比活性是2U/mg。
图9A-9D显示的是在有和无辅助成分存在时S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的水解情况(数据点值是双份平行测量的平均值)。图9A：单独使用棕蛇蛇毒蛋白酶，图9B：使用棕蛇蛇毒蛋白酶时加入10mM CaCl2，以及图9C：使用棕蛇蛇毒蛋白酶时加入10mM CaCl2和PL，以及图9D：图12A-12C各自显示的每一图线的斜率和R2值。R2值是直线的相关系数。
从表11看出：棕蛇蛇毒蛋白酶在加入或不加Ca2+时都能水解S-2222，虽然无Ca2+时的水解初始速度比有Ca2+时略微低一点。
相反，合成的因子Xa底物在Textarin作用下的水解却因为加入Ca2+和PL而增强(Stocker等，1994，Toxicon 32 1227)，与源自粗鳞蛇蛇毒的因子Xa样丝氨酸蛋白酶Trocarin的情况一样(Joseph等，1999，Blood 94 621)。
分离的棕蛇蛇毒蛋白酶对凝血酶原的活化
不受理论的限制，可以认为：凝血的发生通过两步反应完成：(1)凝血酶原在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下转化为凝血酶，接着(2)凝血酶切割血纤蛋白原成血纤蛋白并活化因子XIII。
图10显示的是棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶活化凝血酶原，在10分钟的反应时间内，棕蛇蛇毒蛋白酶将凝血酶原转化为凝血酶，这足以将柠檬酸化血浆的凝血时间从65秒减少到12秒的基线水平。
凝血酶原被棕蛇蛇毒蛋白酶活化
下面的试验结果表明：在没有Ca2+、PL或辅助蛋白样因子Va时，棕蛇蛇毒蛋白酶能将凝血酶原转化为凝血酶。
S-2222试验的结果表明：棕蛇蛇毒蛋白酶与因子Xa水解凝血酶原中相同的键。棕蛇蛇毒蛋白酶对凝血酶原的作用通过下述操作进行了测定：使用人凝血酶原(0.5mg溶于2mL 0.05M Tris-HCl缓冲液)与5μg棕蛇蛇毒蛋白酶(酶∶底物为1∶100)反应。反应产物用非还原SDS PAGE电泳分析，如图11A所示。此外，通过S-2238水解监测凝血酶形成速率，如图11B所示。S-2238通常用于测定凝血酶的酶活性(Kornalik and Blomback，1975，Nature 227 680)，在此引入作为参考。
图11A显示的是凝血酶原被棕蛇蛇毒蛋白酶切割时程(time course)的SDS PAGE电泳结果。约40kDa的蛋白条带(泳道5)表明：凝血酶(分子量36.7kDa)是主要终产物。该蛋白条带的浓度随时间增强表明：凝血酶原(PT)在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下转化为凝血酶(T)。凝血酶原在48小时时间点基本上不复存在(泳道5)。图11B表明：起初的抗S-2238活性很低，然后增加了约20倍。从SDS PAGE凝胶电泳可预知，S-2238活性在48小时达到最大。
这些试验中使用的人凝血酶原并不是完全纯的，如图11A泳道2中的条带所示。其实应该只在72kDa处出现凝血酶原(PT)条带(Mann，1976，Methods Enzymol 1976 132)。在约55kDa处的较淡的蛋白条带表明有一些前凝血酶1(PT1)存在，可能是由于凝血酶切割凝血酶原得到的，如图12所示。前凝血酶1不是一种活性酶，这一点通过t＝0时凝血酶原溶液的S-2238试验得到证实。
前凝血酶1条带随时间增强然后减弱。可能是由于凝血酶存在于凝血酶原溶液中，但是是S-2238试验所无法检测的。更可能的是，孵育过程中产生的凝血酶导致前凝血酶1的形成。
为了有助于理解结果，已经提出了凝血酶原在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下活化的机制，原理图如图12所示。但是本发明并不受该原理图的限制。
分离的棕蛇蛇毒A蛋白酶对凝血酶原的活化以及交联血纤蛋白的形成
从上述结果可知，棕蛇蛇毒蛋白酶能够活化凝血酶原形成凝血酶。随后活化的凝血酶将血纤蛋白原转化为血纤蛋白。为了查明这一过程，将柠檬酸化血浆与棕蛇蛇毒蛋白酶在有或无Ca2+存在下孵育。这导致血凝块的形成，用水洗涤然后通过SDS PAGE电泳分离，与之同时获得一种通过向柠檬酸化血浆单独添加Ca2+的形成并经洗涤的血纤蛋白血凝块(代表由于Ca2+独自活化凝血级联反应而在正常情况下体内血凝块的形成)。该试验的结果图示于图13，从中可以看出在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下产生的血纤蛋白具有与正常血纤蛋白类似的结构，交联血纤蛋白的形成是应答下述过程而发生的：凝血酶在棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶作用下活化以及因此而发生的因子XIII活化。各个试验的大致凝血时间也记录了下来(表12)。
使用分子量标准物(泳道1)以及图13中的血纤蛋白原(泳道5)和Ca2+作用下产生的血纤蛋白血凝块(泳道4)二者的链结构，可以对条带进行鉴定。泳道2和3(分别为未加和加入了Ca2+的棕蛇蛇毒蛋白酶)中约100kDa的条带代表γ-二聚体(γ-γ)。γ-二聚体分子量为105kDa，是两个γ-单体在因子XIIIa作用下共价交联形成的(McKee等，1970，Proc Natl Acad Sci 66738)。
在这些泳道中还可以看到分别代表血纤蛋白α-单体(α)和β-单体(β)链的约70和60kDa的条带。α-单体的分子量为73kDa，而β单体的分子量为60kDa(McKee等，1970，同上)。分子量大于400kDa的条带(凝胶的上方)代表α-多聚体(αp)，是α-单体在因子XIIIa作用下发生赖氨酸-谷氨酸共价交联得到的(Gaffney and Brasher，1974，Nature 251 53)。另外，在泳道2-4中还可以看到约～38kDa的α-链降解产物(α1)。
可以看出：棕蛇蛇毒蛋白酶作用下得到的凝血酶能够以与正常α-凝血酶类似的方式将血纤蛋白原转化为血纤蛋白。通过将正常途径(通过向柠檬酸化血浆添加Ca2+)产生的血凝块的条带模式与加和未加Ca2+(分别为泳道3和2)时棕蛇蛇毒蛋白酶作用下产生的血凝块的条带模式进行比较，可以看出这一点。与加入Ca2+(泳道3)时的情况相比，在棕蛇蛇毒蛋白酶单独作用下(泳道2)产生的血凝块中存在着大量未交联的α-单体。这说明这时因子XIIIa的活性在形成前一种血凝块方面不一样。这与文献记载一致：这是由于Ca2+存在下活化的因子XIIIa的活性比无Ca2+存在时活化的该酶的活性高(Turner and Maurer，2002，Biochemistry 41 7947)。α-单体在因子XIIIa作用下交联是一种比γ-链交联更慢的过程，这就解释了为什么γ-链在所有三种血凝块中都充分地交联。将血凝块放置4小时以上可以让α-单体完全交联。
在使用棕蛇蛇毒蛋白酶Ca2+产生的血凝块与象征正常体内形成(Ca2+单独)的血凝块中观察到了极相似的条带模式，但是这两种血凝块的凝血时间不同(表12)。使用棕蛇蛇毒蛋白酶加Ca2+血凝块的凝血时间比单独使用Ca2+快约30倍。这说明凝血取决于棕蛇蛇毒蛋白酶对柠檬酸化血浆的作用而非Ca2+的作用。添加钙使柠檬酸化血浆在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的凝血时间略微缩短(从120秒降为60秒)。这与使用棕蛇蛇毒蛋白酶加Ca2+的柠檬酸化血浆凝血试验的结果一致。
P.textilis-蛇毒蛋白酶的结构特征
棕蛇蛇毒蛋白酶活性位点的标记
丹磺酰基-L-谷氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基氯甲基酮(DNS-GGACK)是一种抑制剂，能够将丝氨酸蛋白酶(包括因Xa)的组氨酸活性位点特异性烷基化，从而将其活化(Kettner and Shaw，1981，Methods Enzymol 80 826)。为了测定哪条或哪几条SDS PAGE条带中含有催化位点，将棕蛇蛇毒蛋白酶和完整棕蛇蛇毒蛋白酶复合物分别与DNS-GGACK孵育，然后SDS PAGE电泳分离。DNS-GGACK的荧光特性使得掺入了共价结合的抑制剂的棕蛇蛇毒蛋白酶可以用紫外灯观察。该试验的结果图示于图14。
泳道3中看到醒目的荧光条带，与完整的棕蛇蛇毒蛋白酶对应(泳道7)。β-巯基乙醇存在时(泳道4)，所述荧光抑制剂仅仅掺入蛇毒蛋白酶的重链(泳道8中约37kDa的条带)。这表明：棕蛇蛇毒蛋白酶的活性位点位于重链而非轻链。这些结果以及棕蛇蛇毒蛋白酶在棕蛇蛇毒蛋白酶复合物条带模式中的位置在泳道1和2以及7和8中得到验证。
哺乳动物因子Xa的重链含有一个酶活性位点(Bock等，1989，ArchBiochem Biophys 273 375)。因子Xa在DNS-GGACK作用下失活的肽消化试验已显示：重链第42位的组氨酸形成了活性位点的一部分。通过序列比对得出，Trocarin和棕蛇蛇毒蛋白酶的活性位点组氨酸残基与因子Xa的活性位点组氨酸在同一位置，如图15所示。推导的组氨酸活性位点用粗体字母表示。
棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的N-末端氨基酸测序，以及与因子Xa和T. carinatus因子Xa样丝氨酸蛋白酶之间的序列同一性。
对推定的棕蛇蛇毒蛋白酶轻链和重链进行N-末端氨基酸序列测定。另外，还需要短序列帮助对来自P.textilis毒腺cDNA文库的棕蛇蛇毒蛋白酶进行cDNA克隆。
棕蛇蛇毒蛋白酶复合物和棕蛇蛇毒蛋白酶在β-巯基乙醇存在下通过SDS PAGE电泳分离，然后转移到PVDF膜上。从该膜上可以进行蛋白条带的测序。
开始，得到了棕蛇蛇毒蛋白酶重链的部分氨基酸序列：IVNGMD(C)KLGE[SEQ ID NO：43]。要注意的是(C)意味着这个循环是空白，表示半胱氨酸可能出现但是不一定。该半胱氨酸残基的出现在随后对相应cDNA测序后得到了验证。
棕蛇蛇毒蛋白酶的重链是第一种被转移到PVDF膜上并测序的蛋白质。重链片段的N-末端包含氨基酸序列：IVNGMDCKLGE[SEQ ID NO：43]。同源性搜索表明：该序列与Trocarin重链的N-末端序列100％相同(参见图16)。该序列可用于设计能成功扩增棕蛇蛇毒蛋白酶cDNA的核酸引物。另外，还发现棕蛇蛇毒蛋白酶与人因子Xa重链在N-末端序列之间具有相似性，如图17所示。
棕蛇蛇毒蛋白酶轻链也进行了氨基酸测序。对应于轻链的条带的N-末端序列为ANSLVXXFKSGNI[SEQ ID NO：44]。“X”代表在第6和第7个测序循环中这些位置是空白。这说明这些氨基酸序列要么是半胱氨酸，在测序过程中被降解，要么是含有翻译后修饰的残基。从相应cDNA推导出的棕蛇蛇毒蛋白酶氨基酸序列显示：“X”氨基酸残基两个都是谷氨酸。氨基酸序列中的“X”被这些残基所取代。本发明轻链测序后的N-末端与Trocarin之间的序列同源性图示于图18。另外通过将部分棕蛇蛇毒轻链序列与小鼠因子Xa轻链的N-末端序列比对也发现了相似性，如图19所示。图18-23中所示的比对表明棕蛇蛇毒蛋白酶与Trocarin以及与因子Xa之间具有同源性。
还发现了棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶与因子Xa之间在另一序列上的序列同源性。同源性大于55％。
在trocarin氨基酸序列与获自棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的N-末端序列之间进行了比较。
如上述获得了棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的全长cDNA以及编码的蛋白序列，这两序列见图25-30。
棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶和trocarin之间的全序列比较见图21。序列同一性的总体水平是81％，但是棕蛇蛇毒蛋白酶在N-末端原肽序列(40个氨基酸)上有很多不为trocarin所具有的独一无二特性。可以预料所述原肽切割位点是在原肽末端的R和A之间，如图23所示。这一点得到BLAST搜索的支持，BLAST搜索揭示了一系列止血因子，包括因子X、IX、VII以及它们的与棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶相关的前体。原肽末端序列KRANS------EE-----EREC以及对于Ca2+结合功能具有重要意义的另外的谷氨酸残基都高度保守。实际上，保守的序列有多组(block)，包括切割位点及其位于重链和轻链之间的部分RIVNGMD[SEQ ID NO：45]，紧接于第200位残基之后。
在比对中与trocarin的另一区别是：棕蛇蛇毒蛋白酶中的28个氨基酸(第182-209位残基)在trocarin中不存在。该序列向上通到轻链和重链间的预测的切割位点，如图21和23所示。Trocarin的轻链由141个残基组成，末端氨基酸序列为KARNK[SEQ ID NO：46](Joseph等，1999，Blood 94 621)。棕蛇蛇毒蛋白酶轻链的预测氨基酸序列含有一段类似序列(KTRNK)[SEQ IDNO：47]，起始于图23中的第176位氨基酸。棕蛇蛇毒蛋白酶的轻链可能在该位点切割从而除去位于重链起点之前的这最后28个氨基酸。经过计算棕蛇蛇毒蛋白酶的分子量为43,587Da，假如就在上述指出的那个点切割，预计重链和轻链的分子量分别为27,952和15,652Da(参见表13)。
另外，还使用SDS PAGE分离中蛋白的迁移距离测算棕蛇蛇毒蛋白酶及其组成链的分子量(数据未给出)。根据SDS PAGE数据测定，完整棕蛇蛇毒蛋白酶及其重链和轻链的大约分子量分别为53kDa、35kDa和29kDa(参见表13)。
cDNA核苷酸序列没有显示蛋白质是否被切割或者其是否有翻译后修饰。因此，由于天然Trocarin的氨基酸序列(通过蛋白测序测定)和棕蛇蛇毒蛋白酶翻译后的cDNA核苷酸序列十分类似，所以使用Trocarin作为模型。天然Trocarin的分子量估计为46,515Da(Joseph等，1999，同上)。从没有任何翻译后修饰的Trocarin氨基酸序列计算出的分子量为约42,455Da。因此，约有4,060Da的翻译后修饰，包括Glu残基、N-糖基化和O-糖基化。Trocarin和棕蛇蛇毒蛋白酶非常相似，因此可以预见：棕蛇蛇毒蛋白酶具有与trocarin类似的翻译后修饰。根据这一推测，带有翻译后修饰和切割的轻链的棕蛇蛇毒蛋白酶的分子量为47,647Da，这与试验测定的数值53和48kDa相符。因子Xa的分子量为46kDa(Di Scipio等，1977，Biochemistry 6799)。这种计算的分子量47,647Da可用于测定溶液中棕蛇蛇毒蛋白酶的浓度。
蛇源蛇毒蛋白酶蛋白的比较
从活的路边受损标本获取海岸太攀蛇、凶猛太攀蛇、棕蛇、虎蛇、红腹黑蛇以及粗鳞蛇的毒腺，通过RNA提取用的TRI Reagent
Figure 10003_0
方法提取总RNA(Sigma，Castle Hill，Australia)。然后从RNA合成出第一链cDNA。然后使用根据由棕蛇蛋白酶推导的初步氨基酸序列设计的简并引物通过PCR方法从cDNA筛选因子Xa样蛇毒蛋白酶基因。要注意的是扩增蛋白酶的不同区域要使用不同的引物对，特别是因子Xa样组分的重链。将所有PCR产物用1.5％TAE琼脂糖凝胶分离，用QIAEX II凝胶提取试剂盒提取(Qiagen，Hilden，Germany)，然后克隆入pGEM-T载体系统(Promega，Annandale，Australia)，接着用ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequence ReadyReaction试剂盒(Perkin-Elmer，Boston，U.S.A.)测序。然后对分离自所有5种蛇的蛋白酶进行序列比对。图21显示了本发明所述的棕蛇、海岸太攀蛇、红腹黑蛇、虎蛇以及粗鳞蛇蛋白酶与trocarin之间的氨基酸比对情况。图22显示的是本发明的这些蛋白酶与人因子Xa之间的氨基酸比对情况。图23显示的是所有本发明所述的棕蛇、海岸太攀蛇、凶猛太攀蛇、红腹黑蛇、虎蛇以及粗鳞蛇的蛋白酶的比对情况，其中还显示了原肽、轻链及重链结构域。
太攀蛇、虎蛇、粗鳞蛇和红腹黑蛇的蛇毒蛋白酶蛋白的编码核酸的克 隆和测序
将编码太攀蛇、虎蛇、粗鳞蛇和红腹黑蛇的蛇毒蛋白酶蛋白的全长核酸分别克隆并测序。将上述蛇源核酸的核苷酸序列与来自普通棕蛇的蛇毒蛋白酶进行比对，结果表明有大量的兴趣点。这其中包括在40个氨基酸的原肽氨基酸序列(图23和24所示的第1-40位残基)间近乎100％的同源性，其不考虑红腹黑蛇中的单个氨基酸改变。另外，在位于原肽和轻链之间、轻链和重链之间的切割位点的区域也表现出高度保守(参见图23)。总体而言这5种蛇之间的同源程度为72％。来自太攀蛇的蛋白酶与普通棕蛇的蛋白酶最接近，同源性为92％，因此可以认为二者都是C组凝血酶原活化剂。同样地，来自大陆虎蛇和粗鳞蛇的D组凝血酶原活化剂之间具有95％的同源性区，而红腹黑蛇蛋白酶是5种当中亲缘关系最远的。最后一个兴趣点是重链内的低同源性，其中在虎蛇、红腹黑蛇和粗鳞蛇内观察到了缺失，另外，虎蛇和粗鳞蛇的蛋白酶在末端提前11个氨基酸而终止。
蛇毒蛋白酶中存在保守的新区域，所述区域与trocarin和人因子Xa以及所有其它已知蛋白都不同。这些区域包括下列序列，它们也作为共有序列图示于图21-23。
KREASLPDFVQS(残基181-192)[SEQ ID NO：19]；
LKKSDNPSPDIR(残基198-209)[SEQ ID NO：20]；和
SVX1VGEIX2X3SR(残基260-270)[SEQ ID NO：21]
X1，X2和X3可以为任一氨基酸，但是优选X1是V或I，X2为D或N以及X3为R或I。
MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK(残基1-29)[SEQ ID NO：22]和
ANRFLQRTKR(残基31-40)[SEQ ID NO：23]
KREASLPDFVQSXXAXXLKKSDNPSPDIR(残基181-209))[SEQ IDNO：24]，其中X可以为任一氨基酸
MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKXANRFLQRTKR(残基1-40)[SEQ ID NO：25]，其中X可以为任一氨基酸
应该可以理解的是：SEQ ID NO：23，24和25对应的是含有第1-40位氨基酸的预测原肽，如图23所示，因此不能在一个实施方案中形成蛋白水解后消化后成熟蛋白的一部分。
本领域技术人员根据图21-23提供的数据能够鉴定出本发明所述凝血酶原活化蛋白的其它新的保守区域。
类似地，也可以从图24提供的比对数据中确定出编码本发明所述凝血酶原活化蛋白的新的保守核酸。所述新的保守核酸可以用于，例如设计特异性核酸引物和/或探针，来扩增、测序和/或鉴定本发明的核酸。
血纤蛋白胶
加入了棕蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶的柠檬酸化血浆在有及无10mM Ca2+存在下都非常快速的凝血。这两种血凝块的肉眼可见纹理因这两种制剂的不同而不同。
小鼠尾静脉出血模型
使用尾静脉出血的小鼠模型测试纯化棕蛇蛇毒蛋白酶作为抗出血剂的效果。这些试验的结果显示于表14和15以及图27-28。
小鼠尾静脉出血试验除极微小改动外基本上按照Masci et al(2000)的描述进行。结果显示于图27和28以及表14和15。将P.textilis蛋白酶(250μL；P.textilis蛋白酶在0.02M Tris-HCl，pH 7.4，10mM CaCl2中的浓度为65μg/mL的溶液)在受伤严重尾巴的开放伤口应用3分钟。用预先称重的eppendorf管计算血液流失。精确度规定血液流失要用重量计算而非体积。值得注意的是所有用蛋白酶局部处理后的小鼠都在受伤部位出现了大的血凝块，如图27所示。通过脱颈椎让小鼠安乐死去。
表15和图28的数据获自试验，其中将受伤严重的小鼠尾巴的开放伤口浸没于加入65μg或未加棕蛇蛇毒蛋白酶的250μl 0.9％氯化钠(盐水对照)中3分钟。血液流失用重量计算。如表15和图28所示，血液凝块并不需要辅因子。
如表14和15以及图28所示，与对照动物(0.542±0.160)相比，棕蛇蛇毒蛋白酶使小鼠的血液流失显著减少(0.169g±0.086)(Mann Whitney U检验，p＝0.021)，已修正了技术误差。
实例
从P.textilis的毒腺制备cDNA文库从而建立种间比较以及药物筛选所 用的微阵列芯片
使用SMART cDNA文库合成试剂盒，将从目的蛇的毒腺提取的信使RNA扩增为cDNA，然后将大于600bp的片段克隆入λTriplEx2载体(Clontech，Palo Alto，U.S.A.)。制备太攀蛇和棕蛇的cDNA文库，每一文库取约30个转录本进行初步序列分析。该过程包括：PCR扩增检测插入片段的存在和大小，然后将λTriplEx2转化为pTriplEx2质粒并测序。
由于其平均增大的插入片段的大小及变化，决定选择太攀蛇cDNA文库建立微阵列芯片。然后，为了大规模PCR扩增和纯化，随机分离4800个cDNA克隆，然后使用可从Queensland Institute of Medical Research获得的GMS 417阵列点样器将这些克隆以双份平行方式点样于包被后的玻片上。然后使用改良的Eberwine反义RNA扩增方法将来自上述蛇毒腺的RNA以线性方式扩增(使RNA浓度增高最多70倍)用于芯片杂交。
讨论
本发明的蛇毒蛋白酶具有独特的结构和功能特性。另外它们还与因子Xa和O.scutellatus-凝血酶原活化剂之间具有一定的相似性。本发明的蛇毒蛋白酶能够在无Ca2+存在下使柠檬酸化血浆凝血。在体内，为了正常凝血，因子Xa还需要有Ca2+的存在。因此，在没有因子例如磷脂、因子Va或Ca2+存在下本发明的蛇毒蛋白酶能够使血液凝血，这是一种全新且令人惊奇的发现。
因子Xa特异性发色底物S-2222可被本发明所述的蛇毒蛋白酶切割。这表明该蛇毒蛋白酶与因子Xa具有极为相似的特异性。另外，值得注意的是：只有当棕蛇蛇毒蛋白酶复合物的浓度低于2μg/ml时Ca2+才能提高S-2222的水解速度。另外，当将NaSCN加入棕蛇蛇毒蛋白酶复合物时，S-2222活性没有完全保留。这些发现与Speijer等(1986)关于O.scutellatus-凝血酶原活化剂所作工作不同。
从纯化所需层析的次数可以明显看出，使用Sephacryl S-300的简易凝胶过滤方法对于从棕蛇蛇毒蛋白酶复合物中分离丝氨酸蛋白酶成分的效果是相对较差的。不过继续纯化最终得到了同质制剂，是通过HPLC和无β-Me的SDS PAGE测定的。
SDS PAGE结果表明：棕蛇蛇毒蛋白酶的天然分子量为55-56kDa。棕蛇蛇毒蛋白酶在大小上与54kDa哺乳动物因子Xa(Mann et al，1987)比与60kDa O.scutellatus因子Xa样蛋白酶(Speijer et al，1987，J.Biol.Chem.26113258)更为近似。另外，棕蛇蛇毒蛋白酶链结构表明：与因子Xa之间比与O.scutellatus因子Xa样丝氨酸蛋白酶之间更为相似。
SDS PAGE(+β-Me)表明：棕蛇蛇毒蛋白酶包括两个肽链，可能是通过二硫键连接在一起。这一点还得到在棕蛇蛇毒蛋白酶测序时发现两个N-末端氨基酸的事实的支持。从这些结果可知，重链和轻链的大小分别为约31和18kDa，但是这与全蛋白酶分子量55-56kDa不相符。与本发明的棕蛇蛇毒蛋白酶不同，发现O.scutellatus因子Xa样丝氨酸蛋白酶是由大小都为30kDa的两条链组成(Speijer et al，1986，同上)。
一个值得注意的发现是：T.carinatus因子Xa样丝氨酸蛋白酶的开始的11个氨基酸与本发明的棕蛇蛇毒蛋白酶具有100％的序列同源性。这表明：在这两种澳大利亚蛇蛇毒凝血酶原活化剂的进化的全过程中，出现了一定程度的氨基酸序列保守性(用棕蛇蛇毒蛋白酶全长氨基酸序列发现)。序列同源性还存在于因子Xa与棕蛇蛇毒蛋白酶之间，这表明一些氨基酸在蛇和哺乳动物的进化中是保守的。但是，如图27和28所示，本发明的蛇毒蛋白酶具有全新的保守区域，这些区域不同于因子Xa和Trocarin以及所有申请人已知的其它蛋白质。
因子Xa具有丝氨酸蛋白酶所有典型的特征，具有两个相似的结构域、结构域内二硫键以及其它(Stubbs&Bode，1994，同上)。但是，丝氨酸蛋白酶的差异赋予了其特异性功能。例如，因子Xa活性位点裂口比凝血酶的裂口更敞开(Stubbs&Bode，1994，同上)，这使得因子Xa切割特异性在Arg274-Thr275和Arg323-Ile324。
本发明蛇毒蛋白酶的一个新的治疗用途是作为试剂制备局部用血纤蛋白胶。本发明的蛇毒蛋白酶在制备血纤蛋白胶上比目前方法能提供更有效的治疗作用。用本发明蛇毒蛋白酶制备而成的局部用血纤蛋白胶可以大大减少创伤的出血从而能够挽救许多人和非人动物的生命。例如，可以给医疗急救箱装配灌满了含有本发明蛇毒蛋白酶的血纤蛋白胶的绷带和其它器具以便防止意外出血。
缩写
A405-405nm处的吸光度
Arg-精氨酸
AUFS-280nm处的满量程的吸光度单位
C-半胱氨酸
Ca2+-钙离子
CaCl2-氯化钙
cm-厘米
D-天冬氨酸
E-谷氨酸
F-苯丙氨酸
G-甘氨酸
HPLC-高效液相层析
hr-小时
I-异亮氨酸
Ile-异亮氨酸
K-赖氨酸
kDa-千道尔顿
L-亮氨酸
M-蛋氨酸
M-摩尔
mg-毫克
min-分钟
ml-毫升
mM-毫摩尔
N-天冬酰胺
NaSCN-硫氰酸钠
nm-纳米
O.scutellatus-太攀蛇(Oxyuranus scutellatus)
P.textilis-棕蛇(Pseudonaja textilis)
PAGE-聚丙酰胺凝胶电泳
PEG-聚乙二醇
Q-谷氨酰胺
S-丝氨酸
SDS-十二烷基硫酸钠
sec-秒
T-苏氨酸
T.carinatus-粗鳞蛇(Tropidechis carinatus)
TFA-三氟乙酸
Thr-苏氨酸
TOF-飞行时间
V-缬氨酸
Y-酪氨酸
β-Me-β-巯基乙醇
μl-微升
μmol-微摩尔
表1
步骤     样品体积(mL)     总A280     总活性(单位)  比活性(单位/mL/A280)     产率(％)   纯化
用NaSCN孵育棕蛇SVP复合物     20.0     80.0     106.5     1.3     100   -
步骤1     15.0     25.7     51.2     2.0     48.1   1.5
步骤2     8.0     13.0     27.3     2.1     25.6   1.6
步骤3     5.5     7.3     17.2     2.4     16.1   1.8
表2
步骤     样品体积(mL)     总A280     总活性(单位)   比活性(单位/mL/A280)   产率(％)   纯化
用NaSCN孵育棕蛇SVP复合物     18.0     50.4     40.1   0.8   100   -
步骤1     5.0     13.0     13.1   1.0   32.6   1.2
步骤2     3.5     10.4     10.9   1.1   27.2   1.3
表3
步骤     样品体积(mL)     总A280     总活性(单位)     比活性(单位/mL/A280)     产率(％)   纯化
棕蛇SVP复合物+NaSCN     10.0     89.0     32.5     0.4     100   -
Superdex 200(步骤1)     20.0     7.0     9.2     1.3     28.3   3.25
Superdex 200(步骤2)     40     3.0     4.4     1.5     13.5   3.75
表4
步骤     样品体积(mL)     总A280     总活性(单位)   比活性(单位/mL/A280)   产率(％)   纯化
棕蛇SVP复合物     32.0     38.4     501.2   13.1   100   -
Superdex 200(步骤1)     9.0     17.1     231.3   13.5   46.1   1.0
Superdex 200(步骤2)     9.5     16.2     168.2   10.4   33.6   0.8
表5
步骤     样品体积(mL)     总A280     总活性(单位)     比活性(单位/mL/A280)     产率(％)   纯化
蛇毒     25.0     700     2087     2.97     100   -
ConA 4B     640.0     379.0     97.3     0.257     4.6   0.09
CMSepharose     17.5     79.0     25.0     0.32     1.2   0.12
Superdex 200     7.5     2.5     1     0.442     0.05   0.15
表6
步骤     样品体积(mL)   总A280     总活性(单位)   比活性(单位/mL/A280)   产率(％)     纯化
棕蛇SVP复合物     22.0   20.9     110   5.3   100     -
苯基Sepharose     10   4.85     14   2.9   12.7     0.55
Superdex 200     3.5   1.14     6.4   5.6   5.8     1.1
表7
 条件     斜率     R2
 A-单独使用棕蛇SVP复合物     0.0022     0.9965
 B棕蛇SVP复合物w/10mM CaCl2     0.0025     0.9884
 C棕蛇SVP复合物w/10mM CaCl2+磷脂     0.0041     0.9852
表8
Figure G03812810119960328D000951
表9
    棕蛇SVP(μg/mL)   凝血时间(sec)-Ca2+   凝血时间(sec)+Ca2+
    39.000     27.3     14.9
    26.000     35.1     18.7
    13.000     38.4     23.4
    6.500     51.6     24.0
    2.600     ＞100     27.6
    1.300     ＞100     34.5
    0.650     ＞100     34.7
表10
Figure G03812810119960328D000952
表11
    棕蛇SVP(μg/mL)   ΔA405/分钟-Ca2+     ΔA405/分钟+Ca2+
    39     0.70     1.11
    19.5     0.33     0.90
    13     0.26     0.36
    6.5     0.15     0.24
    2.6     0.12     0.11
    1.3     0.06     0.09
    0.65     0.03     0.05
    0.33     0.01     0.01
表12
血凝块类型 时间(sec)
棕蛇SVP 120
棕蛇SVP加40mM CaCl2 60
单独使用CaCl2 1800
表13
Figure G03812810119960328D000961
表14
处理   血液流失(克)(n＝2) 相对血液保留率(Relativeblood conserved)(％)
盐水   0.4335 -
蛋白酶/10mM Ca2+   0.0166 96.17
表15
  测试     血液流失(g)   对照     血液流失(g)
  1     0.12   1     0.64
  2     0.16   2     0.71
  3     0.29   3     0.42
  4     0.10   5     0.39
  平均血液流失(g)±SD     0.169g±0.086   平均血液流失(g)±SD     0.542±0.160
表16
蛇毒     蛇毒浓度(mg/mL)     凝血时间(sec±0.5secs)
A
棕蛇(Pseudonaja textilis)-昆士兰(Qld)     2.0     3.9
棕蛇(Pseudonaja textilis)-南澳大利亚(SA)     2.0     5.4
棕蛇(Pseudonaja textilis)-Goyder lgaoon     2.0     8.4
西部拟眼鏡蛇(Pseudonaja nuchalis)     2.0     8.7
Pseudonaja affinis     2.0     5.5
Pseudonaja inframacula     2.0     7.9
太攀蛇(Oxyuranus scutellatus)     200.0     24.1
凶猛太攀蛇(Oxyuranus microlepidotus)     500.0     19.7
大陆虎蛇(Notechis scutatus)     500.0     34.9
Notechis ater niger     500.0     27.7
Notechis ater serventyi     1,000.0     31.1
Hoplocephalus stephansii     1,000.0     36.2
Pseudechis porphiracus     500.0     48.6
Australaps surperba     1,000.0     38.7
Tropedechis carinatus     500.0     34.9
B
Australaps ramsayii     1,000.0     250＞凝血＜600
Pseudechis guttatus     1,000.0     250＞凝血＜600
棕伊澳蛇(Pseudechis australis)     1,000.0     ＞100；不凝血
克氏伊澳蛇(Pseudechis colletti)     1,000.0     ＞100；不凝血
Acanthopis antarcticus     1000.0     ＞100；不凝血
Cryptophis nigrescens     1,000.0     ＞100；不凝血
C
美洲矛头蝮(Bothrops jararaca)     100.0     11.7
Agkistradom rhodasroma     100.0     6.3
圆斑蝰蛇(Vipera russelli)     500.0     ＞200
Naja naja     500.0     ＞200
Naja naja miolepis     500     ＞200
锯鳞蝰(Echis carinatus)     200.0     10.4
巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)     100.0     5.3
金环蛇(Bungarus fasciatus)     50.0     12.6
眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)     100.0     ＞200；弱凝血
说明书中实现了描述了本发明优选实施方案的目的，但是绝非意将本发明限制在任一技术方案或具体特征组。因此，本领域技术人员理解的是：根据本申请公开的内容可以对例举的具体实施方案做出各种修饰和改动而不脱离本发明的范围。
Figure IYZ00000609981090000021
Figure IYZ00000609981090000031
Figure IYZ00000609981090000041
Figure IYZ00000609981090000051
Figure IYZ00000609981090000061
Figure IYZ00000609981090000071
Figure IYZ00000609981090000081
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Figure IYZ00000609981090000101
Figure IYZ00000609981090000111
Figure IYZ00000609981090000121
Figure IYZ00000609981090000131
Figure IYZ00000609981090000141
Figure IYZ00000609981090000151
Figure IYZ00000609981090000161
Figure IYZ00000609981090000171
Figure IYZ00000609981090000181
Figure IYZ00000609981090000191
Figure IYZ00000609981090000201
Figure IYZ00000609981090000211
Figure IYZ00000609981090000221
Figure IYZ00000609981090000231
Figure IYZ00000609981090000241
Figure IYZ00000609981090000251
Figure IYZ00000609981090000261
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Figure IYZ00000609981090000281
Figure IYZ00000609981090000291

Claims (36)

1.分离的蛇毒蛋白酶在制备增加受试者中凝血和/或减少血液流失的药物中的用途，其中所述蛇毒蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。
2.权利要求1的用途，其中所述蛇毒蛋白酶在缺乏钙和磷脂的情况下，在10-10～10-06M使柠檬酸化血浆凝块。
3.权利要求2的用途，其中凝块时间约50-15秒。
4.权利要求1的用途，其中所述蛇毒蛋白酶含有原肽结构域。
5.权利要求1的用途，其中所述蛇毒蛋白酶含有活化结构域，其中所述活化结构域为处理蛋白酶的轻链和重链时被切去的那个区域。
6.权利要求1的用途，其中所述蛇毒蛋白酶具有轻链和重链蛋白，并且与天然存在形式长度相等或相差有1或2个残基。
7.权利要求6的用途，其中所述的轻链和重链序列都在同一个多肽链上。
8.权利要求1的用途，其中所述蛇毒蛋白酶包括一种由轻链和重链组成的二聚分子，其中轻链和重链从原肽结构域和活化或切割结构域中切割而来。 
9.权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述蛇毒蛋白酶使用下述分离的核酸重组产生，该核酸选自：
a) 编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的核酸序列；或
b) SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸分子；或
c)SEQ ID NO：1的全长互补序列。
10.权利要求9的用途，其中所述核酸分子进一步含有载体核酸序列。
11.权利要求9的用途，其中所述核酸分子是载体形式的。
12.权利要求9所述的用途，其中所述核酸分子包含于宿主细胞中。
13.权利要求1-8中任一项所述的用途，其中蛇毒蛋白酶由下述制备，包括将权利要求12中所描述到的宿主细胞在能使所述核酸分子表达的条件下培养。
14.权利要求1-8中任一项所述的用途，其中药物的pH值为5-9。
15.权利要求14的用途，其中所述pH值为6.5-7。
16.权利要求1-8中任一项所述的用途，其中药物含有多元醇。
17.权利要求16所述的用途，其中所述多元醇是甘油。
18.权利要求1-8中任一项所述的用途，其中蛇毒蛋白酶与可药用的载体配制。
19.一种试剂盒，其中含有权利要求1-8中任一项所述分离的蛇毒蛋白酶以及一种或多种下列物质：使用说明书；稀释剂；用于制备蛇毒蛋白酶以便施用的器具；可药用的载体；以及对受试者给药的器具，其中所述试剂盒用于增加受试者中凝血和/或减少血液的流失。 
20.权利要求19的试剂盒，其中该试剂盒含有选自下列物质中的一或多种：辅因子，抗微生物剂，抗炎症剂，抗组胺剂，抗纤维溶解剂、止痛剂或生长因子。
21.权利要求20中的试剂盒，其中抗微生物剂选自抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生虫剂。
22.权利要求20或21的试剂盒，其中进一步含有一种或多种选自下列辅因子：钙、磷脂和因子Va。
23.权利要求1-8的任一项所述的用途，其中所述药物抑制所述受试者体表或体内部位的流血。
24.权利要求23的用途，其中所述部位是一种药物或手术干预部位或意外创伤部位。
25.权利要求23的用途，其中所述受试者在形成或保持血液凝块能力方面有缺陷。
26.权利要求25的用途，其中所述缺陷是由于基因缺陷或者因向受试者施用了能使受试者形成或保持血液凝块能力减弱的药物而导致的。
27.权利要求23的用途，其中所述蛇毒蛋白酶是由受试者以外的其它人配好后施用的。
28.权利要求24的用途，其中所述蛇毒蛋白酶是由受试者本人配好后自用的。
29.权利要求24的用途，其中所述蛇毒蛋白酶是在需要使用前就提前提供给受试者。
30.权利要求24的用途，其中所述蛇毒蛋白酶是以防液体包装连同使用说明书一起提供的。
31.权利要求1-8任一项的用途，该所述蛇毒蛋白酶放置于不透水或不透气的容器内。
32.权利要求31中的用途，其中所述容器的构成使得蛇毒蛋白酶能以液体、喷雾、气溶胶、粉末或晶体的形式分配。
33.权利要求32的用途，其中所述容器的构成使得蛇毒蛋白酶能按计量或预定剂量分配。
34.权利要求1-8任一项的用途，其中蛇毒蛋白酶置于装置上，该装置与受试者接触时，能够分配出足以抑制流血的蛇毒蛋白酶量。 
35.权利要求34的用途，其中所述装置是下列中的任一种：绷带、伤用敷料、缝合线或一种布料制品。
36.权利要求35的用途，其中所述装置是敷布。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007040905A (ja) * 2005-08-04 2007-02-15 Hitachi High-Technologies Corp クロマトグラフデータ処理装置
CA2631715C (en) * 2005-12-22 2013-07-16 Zymogenetics, Inc. Method for activating prethrombin-1
WO2008151032A2 (en) * 2007-05-31 2008-12-11 Washington University In St. Louis Arrays and methods comprising m. smithii gene products
AU2008341008A1 (en) * 2007-12-20 2009-07-02 The University Of Queensland Haemostasis- modulating compositions and uses therefor
US10385381B2 (en) * 2010-09-20 2019-08-20 Paul Masci Serum preparation
US9364199B2 (en) 2013-03-14 2016-06-14 Covidien Lp Medical devices
WO2015066625A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Washington University Methods to establish and restore normal gut microbiota function of subject in need thereof
US20160030253A1 (en) * 2014-07-29 2016-02-04 Abbas M. Husain Nosebleed treatment device with position indicator
TWI673358B (zh) * 2016-11-10 2019-10-01 日商三得利控股股份有限公司 含有微乳膠之固體肥皂組成物

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4363319A (en) * 1980-06-30 1982-12-14 Applied Medical Devices, Inc. Ready-to-use bandage incorporating a coagulant composition and method of preparing same
EP0768377A1 (en) 1988-09-02 1997-04-16 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5102360A (en) * 1990-06-27 1992-04-07 Eycleshimer Robert G Shipboard container for survival equipment
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
DK1279731T3 (da) 1991-03-01 2007-09-24 Dyax Corp Fremgangsmåde til udvikling af bindende miniproteiner
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AUPP345098A0 (en) 1998-05-11 1998-06-04 National Institute Of Biological Standards And Control, United Kingdom Novel anti-fibrinolytic agents
JP4480270B2 (ja) 1998-05-19 2010-06-16 ジ・アメリカン・ナショナル・レッド・クロス 止血サンドウィッチ包帯

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CN ,A,1091315 ,1994.08.31,说明书第35页第21行. *
CN ,A,1308683 ,2001.08.15,摘要. *
Joseph J S et al.Snake Venom Prothrombin Activators Homologous toBloodCoagulation Factor Xa.Haemostasis31.2001,31234-240. *
Rosing J et al.Structural and Functional Properties of Snake VenomProthrombin Activators.Toxicon30 12.1992,30(12),1515-1527. *
唐为钢等.多肽噬菌体展示.生物化学与生物物理进展24 3.1997,24(3),第203页第1栏-第2栏第4行. *

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Publication number Publication date
JP2006510342A (ja) 2006-03-30
CA2480904A1 (en) 2003-10-09
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