CN111593037A

CN111593037A - 一种高效的爬行动物来源的凝血酶及其应用

Info

Publication number: CN111593037A
Application number: CN202010542620.3A
Authority: CN
Inventors: 王勇军; 王莹洁; 梁浩
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2040-06-15
Also published as: WO2021253695A1; CN111593037B

Abstract

本发明公开了一种爬行动物来源的凝血酶，采用基因克隆方法获取多疣壁虎凝血酶原2(Prethrombin‑2)的序列；构建Prethrombin‑2真核表达重组质粒，转染293T细胞，诱导表达Prethrombin‑2重组蛋白并纯化；利用锯鳞蝰蛇毒(Ecarin)激活Prethrombin‑2重组蛋白，得到具有凝血酶活性的壁虎凝血酶(Gecko Thrombin,gTM)。本发明所述的凝血酶在弱碱性(pH8.0)和37℃的条件下，活性最高，Kcat/Km为13475.41M^‑1S^‑1；在pH中性条件下，壁虎凝血酶活性显著高于人的凝血酶活性，提示壁虎凝血酶有望成为一种高效的止血剂，特别是为中枢神经快速止血提供潜在的靶向药物。

Description

一种高效的爬行动物来源的凝血酶及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高效的爬行动物来源的凝血酶及其应用。

背景技术

凝血酶(Thrombin)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶，由凝血因子Xa裂解其前体凝血酶原后形成，是凝血级联反应中的关键酶。凝血酶除了发挥止血功能外，还对神经细胞产生多种影响。由于凝血酶在止血与凝血、组织修复等方面起到极大的作用,已成为国内外研究的焦点。

目前市售的凝血酶制品中大部分来源于人或牛血浆，考虑到使用牛源性凝血酶存在传播疯牛病病毒的风险性，人们对重组人凝血酶进行了研究。

凝血酶原2(Prethrombin-2)是α凝血酶(α-thrombin)的前体，由凝血酶原(Prothrombin)切除N端的271个氨基酸产生(不包括N-端43个氨基酸信号肽)。凝血酶原2断开其Arg320-Ile321之间的肽键，形成A亚基和B亚基。B亚基由蛋白链和N-糖链组成。A、B两亚基通过二硫键连接组成凝血酶，B亚基含有凝血酶的活性功能区，A亚基对凝血酶的活性起稳定作用。Hiroshi等人公开了一种大规模的生产重组人基因型凝血酶的生产系统，以重组Ecarin激活的凝血酶原-2制备高产量的凝血酶。该重组凝血酶与血浆来源的人凝血酶(野生型)活性相似，可用于替代临床人或牛血浆中提取的酶-凝血酶。(Preparation ofRecombinant α-Thrombin:High-Level Expression of Recombinant HumanPrethrombin-2 and Its Activation by Recombinant Ecarin.J.Biochem.135,577–582(2004))。

自然界中一些低等脊椎动物如两栖类和鱼类具有附肢损伤后可以快速止血并再生相应的组织器官的特点。研究低等脊椎动物的凝血酶的特征及其功能，对开发新的具有止血功能的药物具有一定的意义。

发明内容

本发明以爬行动物壁虎作为研究对象，克隆了多疣壁虎凝血酶原(Prothrombin)的cDNA序列，该序列开放阅读框编码621氨基酸序列(XP_015262498)。本发明对多疣壁虎、人以及小鼠凝血酶原氨基酸序列进行同源比对分析，推测多疣壁虎Prothrombin存在三个切割位点，分别是205-206的Thrombin切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-1)、316-317的Xa因子切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-2)和364-365的Xa因子切割位点(产生凝血酶中间体Meizthrombin)。将317-621的氨基酸序列定义为Prethrombin-2，以此为模板，设计引物扩增相应的核苷酸序列，构建了Prethrombin-2真核表达质粒，通过转染293T细胞，诱导表达、纯化得到重组蛋白Prethrombin-2。经Ecarin剪切激活，得到酶活力明显高于重组人凝血酶的高效凝血酶(最高可达3.63倍，4℃，pH7.0)。

本发明技术方案如下

一种凝血酶原或其片段，来源于爬行动物，具有产生凝血酶原Prethrombin-1的切割位点、产生凝血酶原Prethrombin-2的切割位点和产生凝血酶原Meizthrombin的切割位点中的一种、两种或三种。

优选的，所述的凝血酶原为Prethrombin-2。

优选的，本发明所述的爬行动物选自壁虎、龟、鳖、鳄鱼、蛇、蜥蜴。更优选壁虎。本发明具体的示例中，研究对象为多疣壁虎凝血酶原，优选多疣壁虎凝血酶原2(Prethrombin-2)，氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明进一步提供了一种凝血酶，采用凝血酶原激活物激活以本发明所述爬行动物来源的凝血酶原或其片段得到。

本发明所述凝血酶原激活物可以为本领域熟知的能够激活凝血酶原成为凝血酶的物质，例如FⅩa和/或FⅤa，FⅪa、Ca²⁺和磷脂形成的复合物，FⅦa、组织因子和Ca²⁺形成的复合物，肿瘤坏死因子或蛇毒中的一种或几种。

进一步的，所述蛇毒选自来源于Echis carinatus的Ecarin或来源于Bothropsatrox、Bothrops neuwiedi或Bothrops erythromelas的酶类中的一种或几种。

本发明具体的示例中，使用的凝血酶原激活物为锯鳞蝰蛇毒Ecarin(Echiscarinatus ecarin)。

本发明具体的示例中，采用基因克隆方法获取多疣壁虎凝血酶原2(Prethrombin-2)核苷酸序列；构建Prethrombin-2真核表达重组质粒，转染293T细胞，诱导表达重组Prethrombin-2蛋白并纯化；利用锯鳞蝰蛇毒(Ecarin)激活剪切重组Prethrombin-2蛋白，得到具有凝血酶活性的壁虎凝血酶(gTM)。

本发明另一目的在于提供本发明所述凝血酶在制备止血剂、受伤组织粘合剂、治疗假性动脉瘤药物中的应用。优选的，所述止血剂为中枢神经止血剂。

本发明优点

本发明首次对爬行动物的凝血酶原进行了研究，通过对多疣壁虎、人以及小鼠凝血酶原氨基酸序列进行同源比对分析，推测多疣壁虎Prothrombin的切割位点，根据推测位点设计了仅含有364-365的Xa因子切割位点的Prethrombin-2。不仅能够被Ecarin激活剪切，剪切后的片段经过自组装，具有凝血酶活性。证明了本发明对多疣壁虎Prothrombin的活性切割位点的预测是正确的。

研究结果显示，本发明所述的壁虎凝血酶(Gecko Thrombin,gTM)活性显著高于人的凝血酶活性(最高可达3.63倍)，可代替人凝血酶，用于制备止血剂、受伤组织粘合剂、治疗假性动脉瘤药物。并且，0-10μg/ml的gTM对神经元活力、神经元分化和突起生长没有毒性影响，提示壁虎凝血酶(gTM)用于中枢神经止血是安全有效的。

附图说明

图1为多疣壁虎、人及小鼠凝血酶原氨基酸序列同源比对分析。

图2为Prothrombin不同位点剪切产生的各种剪切体。

图3为纯化的Prethrombin-2重组表达蛋白的SDS-PAGE图。

图4为采用Ecarin激活Prethrombin-2获得凝血酶Thrombin(gTM)的SDS-PAGE图。

图5为pH 7.0时，本发明所述凝血酶gTM和人重组凝血酶hTM在4℃、30℃和37℃条件下K_cat/K_m值。

图6为37℃时，本发明所述凝血酶gTM和人重组凝血酶hTM在pH6.0、pH7.0和pH8.0条件下的K_cat/K_m值。

图7为本发明所述凝血酶gTM对PC12细胞的毒性测定结果。

图8为本发明所述凝血酶gTM对PC12细胞分化及神经元突起生长的影响。

具体实施方式

实施例1多疣壁虎凝血酶生物信息学分析

为了了解多疣壁虎凝血酶的生物学特征，本实施例克隆了多疣壁虎凝血酶原(Prothrombin)的cDNA序列，该序列开放阅读框编码621氨基酸序列(XP_015262498)。对多疣壁虎、人以及小鼠凝血酶原氨基酸序列的同源比对分析，如图1所示。根据比对，推测多疣壁虎Prothrombin含有Gla结构域(50-97gecko)、Kingle I结构域(113-144gecko)、KingleII结构域(216-297gecko)以及Typsin结构域(316-616gecko)。多疣壁虎Prothrombin存在三个切割位点，分别是205-206的Thrombin切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-1)、316-317的Xa因子切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-2)和364-365的Xa因子切割位点(产生凝血酶中间体Meizthrombin)。当316-317及364-365的Xa因子切割位点同时被切割时，才能产生具有酶活性的凝血酶序列(图2)。

根据上述分析推测结果，设计Prethrombin-2，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

实施例2 Prethrombin-2的制备

1.Prethrombin-2表达载体构建

取多疣壁虎血，Trizol法提取细胞总RNA后，利用诺唯赞逆转录试剂盒制备cDNA，使用Takara公司PCR试剂盒对SEQ ID No：2所示的Prethrombin-2序列进行PCR扩增(扩增引物：forward primer 5'-GAA TTC ACA GCT GCC CAA CAG CGC GAA CTC TTC-3'(SEQ IDNo:3)；reverse primer 5'-AAG CTT ATT TCC ATG CTT CTC-3'(SEQ ID No:4)。扩增条件：1μl cDNA模板，19μl PCR反应buffer其中含有2.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTPs,正反引物0.5μmol/L,DNA聚合酶0.2μl以及1×DNA聚合酶buffer；反应条件94℃for 5min；94℃for30sec,40个循环；60℃for 30sec；72℃for 30sec)；制备1％的琼脂糖凝胶(0.5g琼脂糖粉、50ml 1×TAE微波炉反复煮沸3次后，待溶液温度降低至50℃左右后以1:10,000比例加入5μl Gel Red)，250V电泳15分钟。拍照记录。进行胶回收PCR产物，然后测序。

Prethrombin-2的PCR产物和pCDNA3.1(-)表达载体(诺唯赞公司)分别经ECoR I和HindIII酶切，采用DNA连接酶(Takara公司)按说明书方法连接。His标签设计位于重组蛋白C-末端，构建完整的表达载体。

2.细胞转染293T细胞，诱导表达Prethrombin-2蛋白并纯化

大量抽提重组质粒以备转染用。将经DMEM稀释后的质粒，加入Transfectionreagent混匀后，加入提前培养至对数期的293T细胞，37℃条件下培养6小时，随后更换新鲜的完全培养基培养48小时。取培养基上清样进行Western blot检测，细胞以1×PBS清洗3遍，收集细胞。4000rpm离心10分钟，弃上清，细胞加入裂解液4℃裂解30分钟。11,000rpm离心20分钟，取上清及沉淀进行凝胶电泳检测。将收集的上清蛋白质混合液先用0.22μm过滤器过滤，以1ml/min的流速上样Ni-NTA柱，用相对应的缓冲液洗柱至流出液不含蛋白，在分别以梯度浓度的咪唑洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色，对收集的洗脱液组分进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。结果如图3所示。

实施例3凝血酶Thrombin(gTM)的激活

将不同浓度的重组蛋白Prethrombin-2与不同浓度的Ecarin混匀，使得混合物中Prethrombin-2:Ecarin的比例分别为3μg:0.2U，3μg:0.15U，3μg:0.1U，3μg:0.05U和3μg:0.01U，在37℃条件下孵育16个小时。随后将蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝室温染色4小时，室温下脱色摇床脱色48小时。结果如图4所示(自左向右，泳道依次为Prethrombin-2、Marker，1～5对应0.2U、0.15U、0.1U、0.05U、0.01Uecarin激活Thrombin的情况)。结果显示Prethrombin-2能够被Ecarin激活，剪切为A链和B链两条链(SDS-PAGE电泳时Thrombin的A、B链的二硫键被还原，显示两条条带)。当Prethrombin-2:Ecarin的比例别为3μg:0.01U时，Prethrombin-2未被全部剪切。Prethrombin-2:Ecarin的比例分别为3μg:0.05U时，Prethrombin-2被完全剪切，且得到两条链，而随着Ecarin比例增加，B链会被进一步切割，3μg:0.2U，3μg:0.15U，3μg:0.1U对应的泳道，B链条带出现减弱。因此采用Prethrombin-2:Ecarin＝3μg:0.05U的比例激活Prethrombin-2为佳。

实施例4凝血酶Thrombin(gTM)的纯化及鉴定

将Prethrombin-2:Ecarin＝3μg:0.05U，37℃混合孵育16小时。4℃的条件下，通过镍磁珠进行纯化，使gTM与Ecarin分离。将纯化得到的gTM用超滤管进行除盐。最后保存在0.01M的PBS Buffer中，测定蛋白浓度为0.284mg/ml。

实施例5 Thrombin的K_m、K_cat、K_cat/K_m测定

S-2238为凝血酶特异性底物，可被凝血酶特异性切割产生在405nm处高吸收峰的物质pNP。

用0.01M的PBS将S-2238配成0.2mM、0.4mM、0.6mM梯度浓度。预热或预冷10分钟。之后加入gTM或人重组凝血酶hTM(Sigma,USA，T7009-1KU)在特定温度和pH条件下反应(pH6.0和pH7.0,30℃或37℃，5分钟；4℃，20分钟；pH8.0，37℃，2分钟)，多功能酶标仪在405nm处测量吸光度。利用双倒数法求出K_m、K_cat、K_cat/K_m。结果如表1和表2，图5和6所示。

表1 gTM、hTM在pH 7.0不同温度下的酶动力学常数测定结果

表2 gTM、hTM在37℃不同pH下的酶动力学常数测定结果

结果显示，在pH 7.0条件下，4℃、30℃和37℃时，gTM对底物S2238的酶活力(K_cat/K_m值)均高于hTM，且在37℃时，K_cat/K_m值最高。37℃条件下，检测pH6.0、pH7.0和pH8.0时gTM酶活力。结果表明，当pH中性或者偏碱时，gTM的K_cat/K_m值大于hTM，在pH 7.0时，差异最为显著。

实施例6 gTM对PC12细胞的毒性测定

在96孔板中培养PC12细胞系4x10³～1x10⁵，加入gTM，使得gTM终浓度为0、1、5、10和20μg/ml，30℃、无血清条件下培养24小时，随后更换新鲜培养基，加入CCK-8继续培养4小时，随后测定450nm处吸光度。结果如图7所示。结果表明采用0-20μg/ml的gTM处理PC12细胞株，CCK-8检测发现gTM不会影响细胞活力。

实施例7 gTM对PC12细胞分化及神经元突起生长的影响

1.gTM对未分化的神经元突起生长状况的影响

制备未分化的PC12细胞的细胞爬片，设置两个组别，对照组和10μg/ml凝血酶组。除去完全培养基，更换无血清培养基，向10μg/ml凝血酶组加入gTM使最终浓度达到10μg/ml。37℃条件下培养24小时。然后固定，用β-tubulin、Hoechst33342进行染色，拍照，比较突起长度。

2.gTM对高分化的神经元突起的影响

制备高分化的PC12细胞的细胞爬片，设置两个组别，对照组和10μg/ml凝血酶组。撤去完全培养基，更换无血清培养基，向10μg/ml凝血酶组加入gTM使最终浓度达到10μg/m。37℃条件下培养24小时。然后固定，用β-tubulin、Hoechst33342进行染色，拍照，比较突起长度。

3.gTM对神经元分化过程中的突起长度的影响

制备高分化的PC12细胞的细胞爬片，设置两个组别，对照组和10μg/ml凝血酶组。撤去完全培养基，更换无血清培养基，向10μg/ml凝血酶组加入gTM使最终浓度达到10μg/ml。37℃条件下培养24小时。随后更换含有50ng/ml NGF的完全培养基，同时保持10μg/ml凝血酶组中gTM的浓度仍然为10μg/ml，培养48小时。然后固定，用β-tubulin、Hoechst33342进行染色，拍照，比较突起长度。

结果如图8所示.图8A为0、10μg/ml的gTM处理未分化的PC12细胞24h，β-tubulin(红色)和Hoechst33342(蓝色)的染色结果。(bar＝20μm)；图8B为为0、10μg/ml的gTM处理未分化PC12细胞24h，加入NGF继续培养48h，β-tubulin(红色)和Hoechst33342(蓝色)的染色结果(bar＝50μm)；图8C为PC12细胞经诱导分化后，采用0、10μg/ml浓度的gTM处理24h，β-tubulin(红色)和Hoechst33342(蓝色)的染色结果。(bar＝25μm)。图8D为图8B的统计图，图8E为图8C的统计图。结果显示，未分化的PC12细胞，呈现卵圆形，且易抱团生长。采用10μg/ml的gTM处理24h后，细胞形态未见明显变化(图8A)。

未分化的PC12细胞，采用10μg/ml的gTM培养24h，再加入NGF诱导分化，继续培养48h，分化的PC12细胞突起也未见明显差异(图8B、图8D)。PC12细胞经过诱导分化，形成较长的突起。采用10μg/ml的gTM处理24h，细胞形态和突起生长没有发生显著变化(图8C、图8E)。上述结果表明，gTM对PC12细胞分化和神经元突起生长没有显著影响。

序列表

<110> 南通大学

<120> 一种高效的爬行动物来源的凝血酶及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Ala Ala Gln Gln Arg Glu Leu Phe Phe Asp Thr Arg Ser Phe Gly

1 5 10 15

Gln Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Arg Lys

20 25 30

Ile Ala Asp Asp Phe Glu Gln Glu Leu Leu Glu Ser Met Gly Gly Arg

35 40 45

Ile Val Lys Gly Gln Asp Ala Gln Ser Gly Ser Ala Pro Trp Gln Val

50 55 60

Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gln Asp Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu

65 70 75 80

Ile Ser Asp Arg Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Phe Tyr Pro

85 90 95

Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Ala Asp Asp Leu Val Val Arg Ile Gly

100 105 110

Lys His Asn Arg Arg Ile His Glu Lys Thr Arg Glu Lys Ile Val Leu

115 120 125

Leu Asp Lys Ile Ile Ile His Pro Lys Tyr Asn Trp Lys Glu Asn Leu

130 135 140

Asp Arg Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu Arg Lys Pro Val Pro Phe Ser

145 150 155 160

Asp Tyr Ile Gln Pro Val Cys Leu Pro Thr Lys Glu Thr Val Gln Ser

165 170 175

Leu Leu Leu Ser Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu

180 185 190

Tyr Glu Thr Trp Gly Ser Ser Ala Ala Leu Pro Thr Tyr Leu Gln Leu

195 200 205

Val Asn Leu Pro Ile Val Asp Arg Asp Thr Cys Lys Ala Ser Thr Lys

210 215 220

Ile Lys Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Pro Glu Asp

225 230 235 240

Ser Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val

245 250 255

Met Lys Asn Pro Gln Asp Asn Arg Trp Tyr Gln Val Gly Ile Val Ser

260 265 270

Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His

275 280 285

Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp Leu Lys Lys Thr Val Glu Lys His Gly

290 295 300

Asn

305

<210> 2

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acagctgccc aacagcgcga actcttcttt gacactaggt catttggcca aggtgaagca 60

gactgtggtc tccgtccctt gtttgagaag aggaagattg ctgacgattt tgagcaggag 120

ctcctagaat ccatgggcgg acgaattgta aagggacaag atgctcagtc aggcagtgct 180

ccttggcaag tgatgctgtt caggaaaagc cctcaagact tgctgtgtgg tgccagcctc 240

atcagtgatc gctggatcct gactgctgct cattgtatct tctacccacc ctgggataag 300

aacttcacgg cagacgacct tgttgtccga attggcaaac ataacagaag aatacatgag 360

aagaccaggg aaaaaattgt cttgctggac aaaatcatca tccatcccaa atacaactgg 420

aaggagaatc tagatcggga tattgcactg ttgcgcttga ggaagcctgt tcctttcagt 480

gactacatcc agccagtctg cttgcccacc aaagaaactg tgcaaagcct gctgttgtca 540

gggtacaaag gacgtgtgac tggctgggga aacctttatg agacctgggg ctctagcgct 600

gccttaccca catatttgca gttggtgaac ctccccattg tagatcgaga cacctgtaag 660

gcatctacca aaattaaaat cacagacaac atgttctgtg cagggtacag tcctgaagac 720

tctaagagag gggatgcttg tgaaggtgac agcggaggcc catttgtcat gaagaaccca 780

caagataaca ggtggtatca ggtgggtatc gtctcgtggg gagaaggctg tgatcgggac 840

ggtaaatatg gattctatac ccatgtattc cgtctgaaga agtggctgaa aaagactgta 900

gagaagcatg gaaat 915

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaattcacag ctgcccaaca gcgcgaactc ttc 33

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcttattt ccatgcttct c 21

Claims

1.一种凝血酶原或其片段，其特征在于来源于爬行动物，具有产生凝血酶原Prethrombin-1的切割位点、产生凝血酶原Prethrombin-2的切割位点和产生凝血酶原Meizthrombin的切割位点中的一种、两种或三种。

2.如权利要求1所述的凝血酶原或其片段，其特征在于所述爬行动物选自壁虎、龟、鳖、鳄鱼、蛇或蜥蜴。

3.如权利要求1所述的凝血酶原或其片段，其特征在于所述爬行动物为壁虎。

4.如权利要求1所述的凝血酶原或其片段，其特征在于为Prethrombin-2。

5.如权利要求4所述的凝血酶原或其片段，其特征在于为多疣壁虎凝血酶原2，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

6.一种凝血酶，其特征在于以凝血酶原激活物激活权利要求1-5任一项所述爬行动物来源的凝血酶原或其片段得到。

7.如权利要求6所述的凝血酶，其特征在于所述凝血酶原激活物选自FⅩa和/或FⅤa，FⅪa、Ca²⁺和磷脂形成的复合物，FⅦa、组织因子和Ca²⁺形成的复合物，肿瘤坏死因子或蛇毒中的一种或几种。

8.如权利要求7所述的凝血酶，其特征在于所述蛇毒选自来源于Echis carinatus的ecarin或来源于Bothrops atrox、Bothrops neuwiedi或Bothrops erythromelas的酶类中的一种或几种。

9.如权利要求6-8任一项所述的凝血酶在制备止血剂、受伤组织粘合剂、治疗假性动脉瘤药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述止血剂为中枢神经止血剂。