ES2367169T3 - Proteína activadora de protrombina. - Google Patents

Abstract

Uso de una proteasa de veneno de serpiente (SVP) aislada que está codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comparte una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia de la figura 20A, en la fabricación de un medicamento para aumentar la coagulación y/o disminuir la pérdida de sangre en un sujeto.

Description

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de polipéptidos de proteasa de veneno de serpiente novedosos y a secuencias de ácido nucleico que codifican para los mismos, por ejemplo, para promover la hemostasia y prevenir la pérdida de sangre tal como durante cirugía o para el tratamiento de heridas resultantes de accidentes y otros tipos de lesión o traumatismo. También se dan a conocer métodos de preparación de las proteasas de veneno de serpiente.

Antecedentes de la invención

La hemostasia, denominada comúnmente como coagulación de la sangre o formación de coágulos en la sangre, es una respuesta biológica clave para heridas o lesiones que previene la pérdida de sangre excesiva. Se entiende bien la cascada bioquímica que controla la hemostasia en mamíferos. Una etapa crucial en esta ruta es la activación de la protrombina mediante un complejo de protrombinasa para producir trombina, que a su vez activa el factor XIIIa, que reticula la fibrina para formar un coágulo estable (Stubbs & Bode, 1994, Curr. Opin. Struct. Biol. 4 823-32).

En mamíferos, el complejo activador de protrombina in vivo consiste normalmente en una serina proteinasa, factor Xa, y un cofactor Va formado en membranas de fosfolípidos en presencia de iones calcio (Suttie y Jackson, 1977, Physiol. Rev. 57 1). El complejo de protrombinasa de mamíferos consiste en un cofactor, factor Va, y una serina proteasa, factor Xa. El factor Xa solo activa la protrombina muy lentamente, sin embargo, en presencia de proteínas auxiliares que incluyen el cofactor no enzimático factor Va, iones calcio (Ca2+) y fosfolípido, la activación de protrombina se potencia muchas veces. In vivo, el factor Xa se une a la membrana de fosfolípidos de las plaquetas de la sangre mediante residuos de ácido gamma-carboxiglutámico y tiene escisión preferencial para uniones Arg274-Thr275 seguido por uniones Arg323-Ile324 en la protrombina para formar trombina.

Debido a la importancia de controlar la pérdida de sangre durante cirugía o tras una lesión o traumatismo, la identificación de reguladores que o bien promuevan la formación de coágulos en la sangre o bien inhiban la disolución de coágulos (tal como mediante la ruta plasmina/plasminógeno fibrinolítica; Royston et al., 1990, Blood Coagul. Fibrinol. 1 53; Orchard et al., 1993, Br. J. Haematol. 85 596) ha pasado a ser un área de gran interés.

En particular, los venenos de serpiente han pasado a ser fuentes útiles de proteínas que pueden o bien prevenir la fibrinólisis o bien promover la formación de coágulos en la sangre, como resultado de pérdida de sangre durante cirugía, traumatismo en mamíferos. Por ejemplo, se han aislado inhibidores de fibrinólisis a partir del veneno de la serpiente marrón común australiana Pseudonaja textilis (publicación internacional WO 99/58569). Con respecto a activadores de protrombina derivados de veneno de serpiente, también se hace referencia a la patente china 1298017 que da a conocer activadores de protrombina aislados a partir del veneno de la serpiente taipán Oxyuranus scutellatus: la enzima activadora de protrombina (denominada Os-II) y el factor Xa activado. El grupo chino propuso que para promover la hemostasia tal como en el caso de una herida sangrante, la Os-II se añade de manera óptima una hora antes de la adición del factor Xa para de ese modo activar la protrombina. Propusieron que la acción simultánea de los dos puede activar la protrombina y elevar el rendimiento de trombina.

Se hace referencia también a Joseph et al., 1999, Blood 94 621 que dan a conocer un activador de protrombina similar al factor Xa (trocarina) aislado a partir del veneno de la serpiente de escamas rugosas australiana Tropidechis carinatus. La trocarina forma un complejo activador de protrombina que cataliza la formación de trombina a partir de protrombina in vitro en presencia de fosfolípido, factor Va e iones calcio.

Los agentes hemostáticos actuales usan componentes de productos sanguíneos derivados de seres humanos o bovinos para reemplazar diversos factores para prevenir la fibrinólisis o promover la formación de coágulos en la sangre, como resultado de la pérdida de sangre durante cirugía, traumatismo en mamíferos. El uso de componentes de productos sanguíneos derivados de seres humanos o bovinos puede exponer potencialmente los pacientes a contaminación viral u otros eventos adversos.

Sumario de la invención

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de los polipéptidos activadores de protrombina, denominados en el presente documento “proteasas de veneno de serpiente o SVP”, que son independientes del factor. Las proteasas de veneno de serpiente comparten cierta similitud de secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos del factor Xa y la trocarina que son activadores de protrombina que requieren calcio, fosfolípidos y factor Va para su activación. Sin embargo, las proteasas de veneno de serpiente de la invención son activadores de protrombina parcialmente completos o completos y por tanto no tiene los requisitos de cofactor del factor Xa humano

o la trocarina. En otras palabras, pueden procesar la protrombina para dar trombina en ausencia de cofactores tales como calcio, fosfolípidos y/o factor Va. Por ejemplo, las proteasas de veneno de serpiente del veneno de serpiente marrón, taipán de la costa y taipán del interior son factores de protrombina completos porque pueden procesar la protrombina para dar trombina en ausencia de calcio, fosfolípidos y factor Va. Estas SVP parecen incluir un dominio interno, los residuos 292-305 de la figura 23, que las hacen independientes del factor Va suministrado por el huésped. Las proteasas de veneno de serpiente, por ejemplo, de veneno de serpiente negra de vientre rojo, tigre y de escamas rugosas son activadores de protrombina parcialmente completos porque pueden procesar la protrombina en ausencia de calcio y fosfolípidos pero requieren la presencia de factor Va. Además, las SVP preferidas de la invención pueden escindir la descarboxiprotrombina, que es un sustrato pobre para el factor X humano.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención presenta el uso de una proteasa de veneno de serpiente (SVP) aislada que está codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comparte una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia de la figura 20A, en la fabricación de un medicamento para aumentar la coagulación y/o disminuir la pérdida de sangre en un sujeto o una proteasa de veneno de serpiente aislada que está codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comparte una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia de la figura 20A, para su uso en el aumento de coagulación y/o la disminución de la pérdida de sangre de manera terapéutica en un sujeto. También se dan a conocer polipéptidos de proteasa de veneno de serpiente, y fragmentos antigénicos o biológicamente activos de los mismos, que son activadores de protrombina parcialmente completos o completos y que son útiles, por ejemplo, como reactivos para aumentar la coagulación y polipéptidos de proteasa de veneno de serpiente que tienen actividad activadora de protrombina.

Las proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento pueden incluir una o más de una cadena ligera y una cadena pesada o fragmentos biológicamente activos de las mismas. Las proteínas de cadena ligera y pesada preferidas tienen una longitud igual o muy similar (difiriendo, por ejemplo, en 1 ó 2 residuos) que las especies que se producen de manera natural. Las proteasas de veneno de serpiente pueden incluir un propéptido, una cadena ligera, un péptido de activación y una cadena pesada. Todos los productos intermedios de procesamiento que estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, estén o no presentes en la naturaleza, se encuentran dentro de la invención. Los polipéptidos de la proteasa de veneno de serpiente dados a conocer en el presente documento incluyen una cadena ligera, un péptido de activación y una cadena pesada. Las proteasas de veneno de serpiente pueden incluir una cadena ligera y una cadena pesada a partir de las que se han escindido el dominio de propéptido y un péptido o péptidos de activación. Las preparaciones purificadas pueden incluir o tener eliminados por purificación los dominios de propéptido escindidos y los fragmentos de escisión.

Una SVP activadora de protrombina parcialmente completa o completa puede incluir uno o más y en algunos casos todos los siguientes dominios (la numeración se refiere a la numeración consenso en la figura 23):

un primer o un dominio de propéptido que corresponde a los residuos 1-40 de la figura 23. Este dominio puede tener una similitud de secuencia de al menos el 31, 40, 80, 90, 95 o el 98% con, o diferir en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 6 secuencias presentadas en la figura 23, y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Los productos activos carecerán por supuesto del dominio de propéptido. Puede ser deseable en algunos casos modificar el dominio de propéptido de la serpiente para hacerlo más similar al dominio de propéptido del factor X humano, o reemplazar el dominio de propéptido de la serpiente por un dominio de propéptido humano. Los dominios de propéptido se conservan al 100% en las 6 serpientes con la excepción de un cambio de un solo aminoácido V→E en la serpiente negra de vientre rojo. Una comparación con la secuencia humana correspondiente revela 12/40 residuos idénticos (una identidad del 30%). La mayoría de los residuos conservados son hidrófobos;

un sitio de escisión de cadena ligera entre los residuos 40 y 41 de la figura 23;

un dominio que corresponde a los residuos 41-85 de la figura 23. Este dominio puede ser funcionalmente análogo al dominio GLA (ácido gamma-carboxiglutámico) del factor X humano. Este dominio puede tener una similitud de secuencia de al menos el 71, 75, 80, 85, 90, 95 o el 98% con, o diferir en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 6 secuencias presentadas en la figura 23, y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Puede ser deseable conservar uno o más de los 11 residuos de ácido glutámico en esta región. Diez de éstos se conservan entre la secuencia del factor X humano y las 6 secuencias de serpiente que incluyen los residuos 46/47, 54, 56, 59/60, 65/66, 69, 72. Obsérvese que 79 está también gamma-carboxilado en la humana y hay otros 2 sitios potenciales en las 6 secuencias de serpiente de la figura 23 en los residuos 76 y 78. En muchas realizaciones dadas a conocer en el presente documento, el residuo inicial de este dominio es el residuo inicial de la cadena ligera del producto. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 85% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 86-122 de la figura 23. Este dominio puede ser funcionalmente análogo al primer dominio EGF del factor X humano. Este dominio puede tener una similitud de secuencia de al menos el 71, 75, 80, 90, 95 o el 98% con, o diferir en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 6 secuencias presentadas en la figura 23, y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. La identidad con el consenso de serpiente es de 25/37. El dominio tiene una identidad del 70% con la secuencia humana. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 70% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 123-165 de cualquiera de las 6 secuencias de serpiente de la figura 23. Este dominio puede ser funcionalmente análogo al segundo dominio EGF del factor X humano. Este dominio puede tener una similitud de secuencia de al menos el 36, 50, 75, 80, 90, 95 o el 98% con, o diferir en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 6 secuencias presentadas en la figura 23, y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. La identidad con el consenso de serpiente es de 15/43. El dominio tiene una identidad del 35% con la secuencia humana. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 166-179 de entre las 6 secuencias de serpiente de la figura 23. Este dominio puede tener una similitud de secuencia de al menos el 75, 80, 90, 95 o el 98% con, o diferir en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 6 secuencias presentadas en la figura 23, y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 70% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 180-182 de la figura 23. Este dominio puede tener al menos 1, 2 ó 3 residuos que son los mismos que los observados en cualquiera de las 6 secuencias presentadas en la figura 23. Este dominio está ausente preferiblemente en un producto activo;

un dominio que corresponde a los residuos 183-209 de la figura 23. Este dominio puede ser funcionalmente análogo al péptido de activación en el factor X humano. Este dominio puede tener una similitud de secuencia de al menos e l17, 50, 75, 80, 90, 95 o el 98% con, o diferir en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 6 secuencias presentadas en la figura 23, y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. La identidad con las secuencias consenso de serpiente es de 8/51. Hay una identidad del 16% con la secuencia humana. Ésta es la región que se elimina por escisión cuando se procesan las cadenas ligera y pesada de la proteasa, y preferiblemente no está presente en los productos activos. La secuencia es de 51 aminoácidos para el factor X humano y de 27 para cada una de las serpientes. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

una cadena pesada que corresponde a los residuos 210-467 (en el caso de la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa, taipán del interior o negra de vientre rojo) o 456 (en el caso de la secuencia de serpiente tigre y de escamas rugosas) de la figura 23. Este dominio puede ser funcionalmente análogo a la cadena pesada en el factor X humano. Este dominio puede tener una similitud de secuencia de al menos el 50, 75, 80, 90, 95 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 6 secuencias presentadas en la figura 23, y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. La identidad con las secuencias consenso de serpiente es de 135/268 dando una identidad del 50% con la secuencia humana. El dominio catalítico del factor X humano contiene una triada de sitios activos esenciales H236, D282 y S379. Estos 3 residuos se conservan en las 6 serpientes como H251, D309 y S406 en la figura 23. Los aminoácidos 292-305 parecen contribuir a la secuencia y actividad similar a la del factor Va, o uno que difiera en no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 residuos de una secuencia de 292-305 debe estar presente en las SVP completas. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 75% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento.

Tal como se hace alusión anteriormente, las proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento pueden incluir una molécula dimérica de una cadena pesada y cadena ligera procesada completamente, que se han escindido del dominio de propéptido y dominios de escisión o activación. La cadena ligera incluye enlaces Cys-Cys intracadena entre 57 y 62, 90 y 101, 95 y 110, 112 y 121, 129 y 140, y/o 151 y 164 de la cadena ligera, enlaces Cys-Cys intracadena entre 216 y 221, 236 y 252, 377 y 391, y/o 402 y 430 de la cadena pesada, y enlaces Cys-Cys intercadena entre 172 de la cadena ligera y 329 de la cadena pesada. En realizaciones preferidas, la SVP es un activador de protrombina parcialmente completo o completo porque muestra una actividad significativamente mayor en ausencia de cofactores que un activador incompleto, por ejemplo, el factor X humano o la trocarina. La actividad del activador de protrombina parcialmente completo o completo dado a conocer en el presente documento es al menos 1,5, 2, 4, 10, 15, 20, 50 ó 100 veces (dos órdenes de magnitud) superior a la de un activador incompleto, por ejemplo, factor Xa humano, o trocarina, solo. Esta comparación se hace entre una proteasa de veneno de serpiente y un activador incompleto medidos en condiciones similares o iguales, por ejemplo, en ausencia de Ca y fosfolípidos. El % de actividad (es decir, la actividad de los activadores parcialmente completos

o completos dado a conocer en el presente documento en ausencia de Ca y fosfolípido como un % del observado con el mismo activador en presencia de Ca y fosfolípidos) de uno parcialmente completo o completo es al menos 1,5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000 o 4000 veces superior al mismo % mostrado por un activador incompleto, por ejemplo, factor X humano o trocarina. Los activadores parcialmente completos o completos dados a conocer en el presente documento coagularán plasma citratado a una concentración de aproximadamente 10-10 a 10-06 M, por ejemplo, a 10-8 ó 10-7 M, dando tiempos de coagulación de aproximadamente 50 a 15 segundos, demostrando independencia de Ca2+ y fosfolípido. Por consiguiente, el activador de protrombina muestra propiedades cinéticas de independencia de cofactor (iones calcio y/o fosfolípido) en el intervalo de concentración de aproximadamente 10-10 a 10-06 M, siendo el intervalo de concentración un intervalo de trabajo adecuado para reducir la pérdida de sangre.

Las SVP activadoras de protrombina parcialmente completas o completas dadas a conocer en el presente documento pueden incluir uno o más y en algunos casos todos de los siguientes dominios (la numeración se refiere a la numeración consenso en la figura 22):

un primer o un dominio de propéptido que corresponde a residuos 1-40 de entre las cinco secuencias de serpiente de la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior). Este dominio puede tener una similitud de secuencia de al menos el 31, 40, 80, 90, 95 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 5 secuencias presentadas en la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior), y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Los productos activos dados a conocer en el presente documento pueden carecer por supuesto del dominio de propéptido;

un dominio que corresponde a los residuos 41-120 de las cinco secuencias de serpiente de la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior) que tiene una similitud de secuencia de al menos el 67, 90, 95 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 5 secuencias presentadas en la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior), y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 90% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 121-132 de entre las cinco secuencias de serpiente de la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior) que tiene una similitud de secuencia de al menos el 43, 60, 65, 80, 85, 90, 96 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 5 secuencias presentadas en la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior), y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 60% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 133-182 de entre las cinco secuencias de serpiente de la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior) que tiene una similitud de secuencia de al menos el 80, 85, 90, 96 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 5 secuencias presentadas en la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior), y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 80% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 183-233 de entre la secuencia de serpiente de la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior) que tiene una similitud de secuencia de al menos el 17, 30, 50, 95, 96 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 5 secuencias presentadas en la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior), y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Los productos activos dados a conocer en el presente documento pueden carecer por supuesto de los dominios de activación. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 90% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 234-378 de entre las cinco secuencias de serpiente de la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior) que tiene una similitud de secuencia de al menos el 80, 85, 90, 96 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 5 secuencias presentadas en la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior), y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 80% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 379-394 de entre las cinco secuencias de serpiente de la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior) que tiene una similitud de secuencia de al menos el 39, 30, 50, 80, 85, 90, 96 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 5 secuencias presentadas en la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior), y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 395-456 de entre las cinco secuencias de serpiente de la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior) que tiene una similitud de secuencia de al menos el 80, 85, 90, 96 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3, 5 ó 10 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 5 secuencias presentadas en la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior), y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 80% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

un dominio que corresponde a los residuos 457-467 de entre las cinco secuencias de serpiente de la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior) que puede estar ausente, o si está presente, tiene una similitud de secuencia de al menos el 90, 96 o el 98% con, o difiere en no más de 1, 2, 3 ó 5 residuos de aminoácido de, el dominio correspondiente de cualquiera de las 5 secuencias presentadas en la figura 22 (o la secuencia correspondiente de la serpiente taipán del interior), y en particular con respecto al dominio correspondiente de una de las SVP completas de, concretamente la secuencia de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior, o una de las SVP parcialmente completas, concretamente la de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas. Este dominio puede compartir una identidad de secuencia de al menos el 90% con el dominio correspondiente de una de las seis proteasas de veneno de serpiente dadas a conocer en el presente documento;

Tal como se hace alusión anteriormente, la proteasa de veneno de serpiente dada a conocer en el presente documento puede incluir una molécula dimérica de una cadena pesada y cadena ligera procesada completamente, que se han escindido del dominio de propéptido y dominios de escisión o activación. La cadena ligera incluye enlaces Cys-Cys intracadena entre 57 y 62, 90 y 101, 95 y 110, 112 y 121, 129 y 140, y/o 151 y 164 de la cadena ligera, enlaces Cys-Cys intracadena entre 216 y 221, 236 y 252, 377 y 391, y/o 402 y 430 de la cadena pesada, y enlaces Cys-Cys intercadena entre 172 de la cadena ligera y 329 de la cadena pesada. La SVP dimérica dada a conocer en el presente documento puede ser un activador de protrombina parcialmente completo o un activador de protrombina completo. La SVP dada a conocer en el presente documento es un activador de protrombina parcialmente completo o completo porque muestra una actividad significativamente mayor en ausencia de cofactores que un activador incompleto, por ejemplo, factor X humano o trocarina. La actividad del activador de protrombina parcialmente completo o completo es al menos 1,5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000 ó 4000 veces (de dos a cuatro órdenes de magnitud) superior a la de un activador incompleto, por ejemplo, factor Xa humano, o trocarina, solo.

Esta comparación se hace entre una proteasa de veneno de serpiente y un activador incompleto medidos en condiciones similares o iguales, por ejemplo, en ausencia de Ca y fosfolípidos. El % de actividad (es decir, la actividad del activador parcialmente completo o completo en ausencia de Ca y fosfolípido como un % del observado con el mismo activador en presencia de Ca y fosfolípidos) de uno parcialmente completo o completo es al menos 1,5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000 ó 4000 veces superior al mismo % mostrado por un activador incompleto, por ejemplo, factor X humano o trocarina. Los activadores parcialmente completos o completos dados a conocer en el presente documento pueden coagular el plasma citratado a una concentración de aproximadamente 10-10 a 10-06 M, por ejemplo, a 10-8 ó 10-7 M, dando tiempos de coagulación de aproximadamente 50 a 15 segundos, demostrando independencia de Ca2+ y fosfolípido. Por consiguiente, el activador de protrombina muestra propiedades cinéticas de independencia de cofactor (iones calcio y/o fosfolípido) en el intervalo de concentración de aproximadamente 10-10 a 10-16 M, siendo el intervalo de concentración un intervalo de trabajo adecuado para reducir la pérdida de sangre.

Las SVP de la invención no incluyen trocarina, mostrada por ejemplo en la figura 21. La cadena ligera procesada de una SVP completa dada a conocer en el presente documento puede diferir de la cadena ligera procesada de trocarina en al menos 1, 3, 5, 10, 15 ó 20 residuos. La cadena pesada procesada de una SVP completa dada a conocer en el presente documento puede diferir de la cadena pesada procesada de trocarina en al menos 5, 10, 15, 20 ó 30 residuos (diferir significa diferir en identidad o por inserción o deleción, a menos que se indique lo contrario).

La secuencia de una SVP completa tal como se da a conocer en el presente documento puede tener una o más de las siguientes propiedades, será distinta de serina en el residuo 41 (todas las referencias son con respecto a la numeración consenso de la figura 21), isoleucina en el residuo 48, prolina en el residuo 50, asparginina en el residuo 74, prolina en el residuo 104, asparginina en el residuo 105, lisina en el residuo 123, glutamina en el residuo 127, arginina en el residuo 142, serina, ácido glutámico, treonina en los residuos 145-7, serina en el residuo 154, arginina en el residuo 156, valina en el residuo 159, ácido glutámico en el residuo 167, ácido aspártico en el residuo 169, alanina en el residuo 178; incluirá al menos un residuo de la secuencia 181-208 de cualquiera de las secuencias de la serpiente marrón, taipán, negra de vientre rojo, tigre, de escamas rugosas de la figura 21 (o un residuo correspondiente de la serpiente taipán del interior); será distinta de isoleucina en el residuo 228, asparginina en el residuo 229, glicina en el residuo 233, ácido glutámico en el residuo 232, histidina en el residuo 245, serina, valina en los residuos 258-9; incluirá al menos un residuo de la secuencia 260-270 de cualquiera de las secuencias de la serpiente marrón, taipán, negra de vientre rojo, tigre, de escamas rugosas de la figura 21 (o un residuo correspondiente de la serpiente taipán del interior); será distinta de arginina en el residuo 274, treonina en el residuo 286, asparganina-tirosina-tirosina-tirosina-valina-histidina-glutamina-asparganina en los residuos 292-300, arginina en el residuo 303, alanina en el residuo 305, arginina en el residuo 314, ácido glutámico en el residuo 338, serina en el residuo 345, RIQFKQPT en los residuos 353-360, isoleucina en el residuo 367, treonina en el residuo 368, ácido aspártico en los residuos 382, arginina en el residuo 384, glutamina en el residuo 387, asparginina en los residuos 389, isoleucina en el residuo 424, arginina en el residuo 342, lisina en los residuos 451, serina, leucina en el residuo 454-455; o incluirá al menos un residuo de la secuencia 457-467 de cualquiera de las secuencias de la serpiente marrón, taipán, negra de vientre rojo, tigre, de escamas rugosas de la figura 21 (o un residuo correspondiente de la serpiente taipán del interior);

La cadena ligera procesada de una SVP parcialmente completa dada a conocer en el presente documento puede diferir de la cadena ligera procesada de trocarina en al menos 1, 3, 5, 10 ó 15 residuos. La cadena pesada procesada de una SVP completa dada a conocer en el presente documento puede diferir de la cadena pesada procesada de trocarina en al menos 5, 10, 15, 20 ó 30 residuos.

La secuencia de una SVP parcialmente completa tal como se da a conocer en el presente documento puede incluir al menos un residuo de la secuencia 181-208 de cualquiera de las secuencias de la serpiente marrón, taipán, negra de vientre rojo, tigre, de escamas rugosas de la figura 21 (o un residuo correspondiente de la serpiente taipán del interior); o incluirá al menos un residuo de la secuencia 260-270 de cualquiera de las secuencias de la serpiente marrón, taipán, negra de vientre rojo, tigre, de escamas rugosas de la figura 21 (o un residuo correspondiente de la serpiente taipán del interior).

La SVP dada a conocer en el presente documento es un activador de protrombina completo e incluye una o ambas de una cadena ligera que tiene una identidad de secuencia de al menos el 87, 89 o el 90% con, o difiere en no más de 16, 14 ó 13 residuos de: la secuencia consenso de la figura 24 o una cadena pesada que tiene al menos el 82, 85 y una identidad del 84% o difiere en no más de 45, 39 ó 40 residuos de la secuencia consenso de la figura 24.

La SVP completa dada a conocer en el presente documento incluye una o ambas de cadena pesada y ligera que es idéntica con o tiene una identidad de secuencia de al menos el 84, 86 o el 86% con, o difiere en no más de 61 ó 53 residuos de, la secuencia de SVP de serpiente marrón, taipán de la costa o taipán del interior mostrada en la figura

24.

La SVP dada a conocer en el presente documento es un activador de protrombina parcialmente completo e incluye una o ambas de una cadena pesada y ligera que tiene una identidad de secuencia de al menos el 84% con, o difiere en no más de 61 ó 53 residuos de: la secuencia de la figura 24.

La SVP parcialmente completa dada a conocer en el presente documento incluye una o ambas de una cadena pesada y ligera que es idéntica con o tiene una identidad de secuencia de al menos el 84, 80 o el 82% con, o difiere en no más de 61, 76, 68 residuos de, la secuencia de SVP de serpiente negra de vientre rojo, tigre o de escamas rugosas mostrada en la figura 24.

En el presente documento se dan a conocer polipéptidos de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, un polipéptido: que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, o la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18; una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, o la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18; o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85, 90, 95, 98 o el 99% con, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10, 15 ó 20 residuos de, una de las secuencias de aminoácidos mencionadas.

También se dan a conocer polipéptidos de cadena ligera de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, un polipéptido: que tiene los residuos de aminoácido 41 a 179 (la numeración se refiere a la numeración consenso en la figura 23) de cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, o los residuos de aminoácido 41 a 179 de la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18; una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a los residuos de aminoácido 41 a 179 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, o la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18; o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85, 90, 95, 98 o el 99% con, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10, 15 ó 20 residuos de, una de las secuencias de aminoácidos mencionadas.

Se dan a conocer adicionalmente polipéptidos de cadena pesada de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, un polipéptido: que tiene los residuos de aminoácido 235 a al menos 453 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, o los residuos de aminoácido 235 a al menos 453 de la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18; una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a los residuos de aminoácido 235 a al menos 453 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, o la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18; o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85, 90, 95, 98 o el 99% con, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10, 15 ó 20 residuos de, una de las secuencias de aminoácidos mencionadas.

También se dan a conocer constructos de ácido nucleico que incluyen una molécula de ácido nucleico de proteasa de veneno de serpiente descrita en el presente documento.

También se describen fragmentos o polipéptidos de proteasa de veneno de serpiente unidos operativamente a polipéptidos de proteasa no de veneno de serpiente para formar proteínas de fusión. La secuencia que codifica para uno o más de la cadena ligera de una proteasa de veneno de serpiente, un polipéptido activador, y una proteasa de veneno de cadena pesada puede unirse a una secuencia que codifica para un propéptido de un polipéptido activador de protrombina no de veneno de serpiente, por ejemplo, una secuencia que codifica para el propéptido de factor Xa humano. También se dan a conocer la secuencia que codifica para la cadena ligera de una proteasa de veneno de serpiente y la secuencia que codifica para la cadena pesada de una proteasa de veneno de serpiente que pueden unirse la una a la otra mediante una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido activador de un polipéptido activador de protrombina no de veneno de serpiente, por ejemplo, una secuencia que codifica para un péptido activador de factor Xa humano. Una secuencia de SVP puede fusionarse a una secuencia, preferiblemente fácilmente escindible, que permite el aislamiento, por ejemplo, fusionado a un resto de GST o a una etiqueta de epítopo.

Se da a conocer adicionalmente una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera o todas del grupo que consiste en:

KREASLPDFVQS [SEQ ID NO: 19];

LKKSDNPSPDIR [SEQ ID NO: 20]; y

SVX1VGEIX2X3SR [SEQ ID NO: 21]

X1, X2 y X3 pueden ser cualquier aminoácido.

Preferiblemente, X1 es o bien valina o bien isoleucina, X2 es o bien asparginina o bien ácido aspártico y X3 es o bien arginina, lisina o bien isoleucina.

La proteína aislada descrita anteriormente puede comprender adicionalmente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK [SEQ ID NO: 22] y

ANRFLQRTKR [SEQ ID NO: 23]

La proteína activadora de protrombina dada a conocer en el presente documento puede aislarse a partir del veneno de serpiente. Por ejemplo, dicha proteína activadora de protrombina puede obtenerse a partir del veneno de una serpiente australiana seleccionada del grupo no limitativo que consiste en: cualquier serpiente marrón (Pseudonaja sp.) incluyendo la serpiente marrón común (Pseudonaja textilis), taipán (Oxyuranus scutellatus), tigre continental (Notechis scutatus), de escamas rugosas (Tropidechis carinatus) y serpiente negra de vientre rojo (Pseudechis porphyriacus).

También se describe en el presente documento un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente o fragmento biológicamente activo del mismo. La molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente puede codificar para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17. Las moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen la secuencia de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, o un complemento completo de SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18 también se contemplan ya que son moléculas de ácido nucleico que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, variantes alélicas que se producen de manera natural) a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18. También se da a conocer una molécula de ácido nucleico que se hibrida en una condición de rigurosidad descrita en el presente documento con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, en la que el ácido nucleico que codifica para un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente de longitud completa o un fragmento activo del mismo.

Se dan a conocer adicionalmente constructos de ácido nucleico que incluyen una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteasa de veneno de serpiente o parte de la misma, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente pueden estar operativamente unidas a secuencias reguladoras heterólogas o nativas. La molécula de ácido nucleico puede incluir un ácido nucleico que codifica para un propéptido, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera de una proteasa de veneno de serpiente, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido activador, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de una proteasa de veneno de serpiente, en la que una o más de la secuencia que codifica para el propéptido y la secuencia que codifica para el péptido activador no son de una proteasa de veneno de serpiente. Por ejemplo, una o más de la secuencia que codifica para el propéptido y el péptido activador pueden ser de un activador de protrombina mamífero, por ejemplo, un activador de protrombina humano, por ejemplo, factor Xa humano. También se dan a conocer vectores y células huésped que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención por ejemplo, vectores y células huésped adecuados para producir polipéptidos y moléculas de ácido nucleico de proteasa de veneno de serpiente.

Se describen fragmentos de ácido nucleico adecuados como cebadores o sondas de hibridación para la detección o amplificación de ácidos nucleicos que codifican para proteasa de veneno de serpiente. Por ejemplo, cebadores separados entre sí para amplificar: una proteasa de veneno de serpiente de longitud completa, por ejemplo, una proteasa de veneno de serpiente descrita en el presente documento, o cualquier dominio o región de una proteasa de veneno de serpiente descrita en el presente documento.

En aún otro aspecto relacionado, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido con respecto a una proteasa de veneno de serpiente que codifica para moléculas de ácido nucleico.

También se contemplan fragmentos, variantes, derivados y homólogos biológicamente activos de los ácidos nucleicos y las proteínas aisladas mencionados anteriormente.

Otro aspecto dado a conocer en el presente documento es un anticuerpo que se une a un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente aislado, por ejemplo, un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente descrito en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a: el propéptido de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente o fragmentos del mismo descritos en el presente documento, una cadena ligera de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente o fragmento de la misma descritos en el presente documento, un polipéptido activador de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente o fragmentos del mismo descritos en el presente documento, o una cadena pesada de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente o fragmento de la misma descritos en el presente documento. Alternativamente el anticuerpo puede unirse a una parte de una proteasa de veneno de serpiente que incluye las cadenas tanto ligera como pesada de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente descrito en el presente documento. Pueden usarse anticuerpos, por ejemplo, para aislar proteasas de veneno de serpiente de una muestra.

Otro aspecto descrito es una composición farmacéutica que incluye un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente aislado o fragmento biológicamente activo del mismo, por ejemplo, un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente aislado descrito en el presente documento, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición, por ejemplo, la composición farmacéutica, tiene un pH de aproximadamente 5 a 9, de manera preferible de aproximadamente 6,5 a 7. La composición, por ejemplo, la composición farmacéutica, puede incluir adicionalmente, por ejemplo, un estabilizador, tal como un poliol. En tales realizaciones, la composición, por ejemplo, la composición farmacéutica puede incluir aproximadamente el 5%, 10%, 20% o más de un poliol (o polioles). Un ejemplo de un poliol que puede usarse en la composición es glicerol. La composición, por ejemplo, la composición farmacéutica, puede no incluir un cofactor o la composición, por ejemplo, la composición farmacéutica puede incluir uno o más cofactores, por ejemplo, uno o más de calcio, fosfolípido y factor Va.

También se describen métodos de selección de agentes, por ejemplo, compuestos tales como cofactores, que modulan la actividad de los polipéptidos de veneno de serpiente, por ejemplo, compuestos que modulan la respuesta de coagulación de la sangre y/o el procesamiento de la protrombina para dar trombina, pudiendo incluir un método de este tipo proporcionar una mezcla de reacción de protrombina y una proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, una proteasa de veneno de serpiente descrita en el presente documento, y poner en contacto la mezcla de reacción con uno o más cofactores (por ejemplo, uno o más de calcio, un fosfolípido, factor Va y una vitamina, por ejemplo, vitamina K). La mezcla de reacción puede incluir adicionalmente, por ejemplo, fibrinógeno. El método puede incluir adicionalmente comparar la actividad de la proteasa de veneno de serpiente sobre el procesamiento de protrombina en ausencia y presencia del agente, por ejemplo, el cofactor. El método puede incluir proporcionar una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre) y poner en contacto la muestra con una proteasa de veneno de serpiente en ausencia y presencia de un agente, por ejemplo, un cofactor, y comparar el efecto del cofactor sobre la coagulación mediante la proteasa de veneno de serpiente. El método también puede incluir poner en contacto plaquetas con una proteasa de veneno de serpiente en ausencia y presencia de un agente, por ejemplo, un cofactor, para determinar el efecto del agente sobre la activación de plaquetas.

Un método para medir el nivel de actividad en la sangre completa anticoagulada con citrato o su fracción de plasma puede usarse para medir la actividad del polipéptido de veneno de serpiente (proteasa) determinando el tiempo para que se forme un coagulo sólido. La medición puede llevarse a cabo manualmente o mediante cualquiera de los dispositivos de medición de coagulación automatizados. Además, la actividad de la proteasa también puede medirse usando tetrapéptidos con una p-nitroanilida unida (sustratos cromogénicos) que se asemejan a dominios específicos de su sustrato (protrombina). Este ensayo es una medición colorimétrica simple de la tasa de formación de p-nitroanilina en disolución en una mezcla independiente de sustrato.

Otro aspecto descrito es un método para tratar un sujeto, por ejemplo, induciendo hemostasia. El método incluye administrar una proteasa de veneno de serpiente tal como se describe en el presente documento a un sujeto, tratando de ese modo al sujeto, por ejemplo, induciendo hemostasia.

Por ejemplo, se trata al sujeto para inhibir la hemorragia de un sitio en o dentro del cuerpo de un sujeto. El tratamiento puede usarse para inhibir la hemorragia que puede producirse en relación con un tratamiento médico, por ejemplo, cirugía. Opcionalmente se trata una herida, traumatismo u otro evento.

El sujeto puede tener una deficiencia en la capacidad para formar o mantener un coágulo de sangre. Esta deficiencia puede deberse a un defecto genético o puede ser el resultado de tratamiento médico, por ejemplo, la administración de un fármaco que reduce la capacidad del sujeto para formar o mantener un coágulo de sangre, por ejemplo, Coumadin o warfarina.

La proteasa de veneno de serpiente puede administrarse por otra persona que no sea el sujeto, o la proteasa de veneno de serpiente puede autoadministrarse. La otra persona que no es el sujeto puede ser un profesional sanitario pero en algunos casos no será un profesional sanitario. Por ejemplo, el producto puede usarse para tratar traumatismo de campo de batalla y será administrado por otra persona que no es un profesional sanitario.

La proteasa de veneno de serpiente puede proporcionarse al sujeto por adelantado a una necesidad de usarla, por ejemplo, en el caso de que el sujeto tenga una deficiencia en la capacidad para formar o mantener un coágulo de sangre o en el caso de un individuo del que se cree que corre el riesgo de una herida traumática, por ejemplo, personal militar, personas que trabajan con maquinaria peligrosa, o generalmente aquéllos que trabajan en ocupaciones arriesgadas, tales como agricultura o minería. La proteasa de veneno de serpiente puede suministrarse con instrucciones orales, grabadas en audio o vídeo o escritas, sobre su uso.

La proteasa de veneno de serpiente puede proporcionarse en una forma que permita al usuario (el sujeto o el que lo administre al sujeto) administrar una dosis medida. Por tanto, la proteasa de veneno de serpiente puede disponerse en un dispositivo dispensador, por ejemplo, un dispositivo que dispense líquido, gotas, aerosoles, polvo seco y similares, preferiblemente en una dosificación dosificada.

También se describe un método para activar la protrombina. El método incluye poner en contacto la protrombina con una proteasa de veneno de serpiente tal como se describe en el presente documento, para de ese modo activar dicha protrombina. La protrombina puede activarse in vitro o in vivo. La protrombina puede incluir descarboxiprotrombina.

Las composiciones farmacéuticas y métodos para inducir hemostasia y/o activación de protrombina pueden usarse para prevenir la pérdida de sangre de una herida. Por ejemplo, la composición puede ser la de un sellante de tejido y/o un adhesivo de fibrina. También se contempla que agentes antifibrinolíticos pueden formar parte de tal composición. Los agentes antifibrinolíticos pueden seleccionarse de un grupo no limitativo que incluye textilinina (publicación internacional WO 99/58569), aprotinina y EACA, cualquiera de los cuales puede añadirse para prevenir la lisis del coágulo de sangre a través de la inhibición de la acción de la plasmina o activadores de la plasmina.

Otro aspecto dado a conocer es un método para obtener una proteína, ácido nucleico o biblioteca, o información de secuencia de proteína o ácido nucleico, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo obtener una proteína de serpiente, por ejemplo, una SVP, por ejemplo, una SVP descrita en el presente documento,

o ácido nucleico que codifica para una proteína de serpiente, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para una SVP, por ejemplo, una SVP descrita en el presente documento o cualquiera de las bibliotecas descritas en el presente documento. Éstos se denominan en el presente documento “métodos basados en recogida”. El método incluye: recoger una serpiente australiana seleccionada del grupo no limitativo que consiste en una Pseudonaja textilis, Pseudonaja nuchalis, Pseudonaja affinis, Pseudonaja inframacula, Oxyuranus scutellatus, Oxyuranus microlepidotus, Notechis sctitatus, Notechis ater niger, Notechis ater serventyi, Hoplocephalus etapahansii, Pseudechis porphiracus, Australaps surperba, Tropedechis carinatus (o recoger tejido de o producido por tal serpiente, por ejemplo, huevos o tejido desechado tal como piel de muda) y obtener una proteína, ácido nucleico o biblioteca de la serpiente o de la progenie de la serpiente, u obtener datos de secuencia de una proteína o ácido nucleico de la serpiente o de la progenie de la serpiente.

El método puede incluir recoger una serpiente australiana muerta o capturar una serpiente australiana viva o una serpiente australiana dañada viva. El método puede incluir adicionalmente obtener una muestra de la serpiente, por ejemplo, obtener una muestra de veneno de la serpiente, y obtener la proteína, o biblioteca de proteínas, de la muestra, por ejemplo, de la muestra de veneno. El método también puede incluir obtener una muestra de la serpiente y obtener un ácido nucleico, o biblioteca de ácidos nucleicos, de la muestra, por ejemplo, de una glándula de veneno.

El método puede incluir adicionalmente determinar un ácido nucleico o secuencia de proteína de material tomado de la serpiente o progenie de la misma.

El método puede incluir adicionalmente preparar una proteína o biblioteca de ácido nucleico de la serpiente recogida

o de la progenie de la misma.

El método puede incluir adicionalmente obtener un polipéptido para su uso, por ejemplo, en fitosanidad, salud humana o animal, procesamiento o diagnóstico.

El método también puede incluir recoger la serpiente o muestra y enviar la serpiente o muestra a segundos, por ejemplo, una parte en otro país para realizar una etapa posterior del método.

También se da a conocer una proteína, ácido nucleico o biblioteca, o información de secuencia de proteína o ácido nucleico, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, que se prepara o produce mediante un método descrito en el presente documento, por ejemplo, uno de los métodos de recogida descritos en el presente documento. Por ejemplo, una proteína de serpiente, por ejemplo, una SVP, por ejemplo, una SVP descrita en el presente documento, o ácido nucleico que codifica para una proteína de serpiente, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para una SVP, por ejemplo, una SVP descrita en el presente documento o cualquiera de las bibliotecas descritas en el presente documento o la información de secuencia de cualquier ácido nucleico o proteína descrita en el presente documento preparado o producido mediante un método descrito en el presente documento, por ejemplo, los métodos de recogida descritos en el presente documento.

También se dan a conocer polipéptidos aislados que comprenden la secuencia: en la que X1, X10, X12-13, X15-16, X19-23 X25, X27-30, X33-34, X37, X39, X42-47, X50, X53-56, X58-62, X64, X79, X81-83, X85-94, X96, X99-105, X108-109, X113-115 y X117-119 se seleccionan cada uno independientemente de cualquier residuo de aminoácido;

imagen1

cada uno de X2, X6, X11, X14, X26, X31, X48 X57 y X63 es un residuo de aminoácido pequeño;

cada uno de X3, X4, X8, X17, X18, X35-36, X38, X51-52, X78, X80, X84, X95, X98, X106-107, X111-112 y X116 es un residuo de aminoácido hidrófobo; cada uno de X5, X7 y X110 es un residuo de aminoácido básico; cada uno de X9, X40-41 y X49 es un residuo de aminoácido cargado; X24 es un residuo de aminoácido ácido;

X32 es un residuo de aminoácido neutro/polar; X65-67, X70-72 y X75 están cada uno independientemente ausentes o se seleccionan de cualquier residuo de aminoácido;

X68 y X74 están cada uno independientemente ausentes o se seleccionan de cualquiera de los residuos de

aminoácido ácido; X69, X73 y X76 están cada uno independientemente ausentes o se seleccionan de cualquiera de los residuos de aminoácido hidrófobo;

X77 está ausente o es un residuo de aminoácido pequeño; y Z está ausente o es un péptido de 1-20 aminoácidos. A modo de ejemplo en algunas realizaciones, X1 se selecciona de un residuo de aminoácido ácido o hidrófobo, por

ejemplo, Val o una forma modificada de la misma, o Glu o una forma modificada de la misma. En algunas realizaciones, X2 se selecciona de Ala o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X3 se selecciona de Tyr o Phe o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X4 se selecciona de Phe

o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X5 se selecciona de Lys o Arg o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X6 se selecciona de Pro o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X7 se selecciona de Arg o Lys o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X8 se selecciona de Val o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X9 se selecciona de Glu o Lys o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X es un residuo de aminoácido ácido o neutro/polar, por ejemplo, X10 se selecciona de Asp o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X11 se selecciona de Thr o Ala o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X12 es residuo de aminoácido básico o pequeño o una forma modificada del mismo, por ejemplo, X12 se selecciona de Gly o Arg o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X13 es un residuo de aminoácido pequeño o hidrófobo o una forma modificada del mismo, por ejemplo, X13 se selecciona de Ile o Thr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X14 se selecciona de Pro o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X15 es un residuo de aminoácido neutro/polar o pequeño, por ejemplo, X15 se selecciona de Gly o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X16 es un residuo de aminoácido neutro/polar o básico, por ejemplo, X16 se selecciona de Arg, His o Lys o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X17 se selecciona de Val o Leu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X18 se selecciona de Tyr o Phe o Leu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X19 es un residuo de aminoácido neutro/polar o básico, por ejemplo, X19 se selecciona de Lys o Gln o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X es un residuo de aminoácido pequeño o hidrófobo, por ejemplo, X20 se selecciona de Val, Phe o Ala o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X21 es un residuo de aminoácido hidrófobo o ácido, por ejemplo, X21 se selecciona de Asp o Phe o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X22 es un residuo de aminoácido básico o pequeño, por ejemplo, X22 se selecciona de Pro, Asp o Phe

o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X23 es un residuo de aminoácido pequeño o neutro/polar, por ejemplo, X23 se selecciona de Asn o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X24 se selecciona de Asp o Glu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X25 es un residuo de aminoácido pequeño o hidrófobo, por ejemplo, X25 se selecciona de Ile o Thr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X26 se selecciona de Gly o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X27 es un residuo de aminoácido básico o hidrófobo, por ejemplo, X27 se selecciona de Leu o Arg o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X28 es un residuo de aminoácido hidrófobo o ácido, por ejemplo, X28 se selecciona de Glu, Asp o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X29 es un residuo de aminoácido ácido o pequeño, por ejemplo, X29 se selecciona de Gly o Glu o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X es un residuo de aminoácido ácido o neutro/polar, por ejemplo, X30 se selecciona de Asn o Asp o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X31 se selecciona de Thr o Ala o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X32 se selecciona de His o Gln o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X33 es un residuo de aminoácido básico o neutro/polar, por ejemplo, X33 se selecciona de Asn o Lys o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X34 es un residuo de aminoácido hidrófobo o pequeño, por ejemplo, X34 se selecciona de Thr o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X35 se selecciona de Leu o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X36 se selecciona de Val o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X37 es un residuo de aminoácido hidrófobo o pequeño, por ejemplo, X37 se selecciona de Ala o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X38 se selecciona de Val, Leu o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X39 es un residuo de aminoácido neutro/polar o ácido, por ejemplo, X39 se selecciona de Asp o Asn o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X se selecciona de Asp, Glu o Lys o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X41 se selecciona de Lys o Glu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X42 es un residuo de aminoácido pequeño o cargado, por ejemplo, X42 se selecciona de Lys, Glu o Gly o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X43 es un residuo de aminoácido ácido o pequeño, por ejemplo, X43 se selecciona de Gly, Asp o Glu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X44 es un residuo de aminoácido hidrófobo o pequeño, por ejemplo, X44 se selecciona de Ala o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X45 es un residuo de aminoácido neutro/polar o hidrófobo, por ejemplo, X45 se selecciona de Tyr o His o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X46 es un residuo de aminoácido neutro/polar o pequeño, por ejemplo, X46 se selecciona de Thr o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X47 es un residuo de aminoácido neutro/polar o ácido, por ejemplo, X47 se selecciona de Glu o Gln o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X48 se selecciona de Thr

o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X49 se selecciona de Glu o Lys o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X es un residuo de aminoácido neutro/polar, hidrófobo o pequeño, por ejemplo, X50 se selecciona de Thr, Met, His o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X51 se selecciona de Ile o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X52 se selecciona de Val o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X53 es un residuo de aminoácido neutro/polar o ácido, por ejemplo, X53 se selecciona de Asp o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X54 es un residuo de aminoácido hidrófobo o básico, por ejemplo, X54 se selecciona de Arg o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X55 es un residuo de aminoácido básico o pequeño, por ejemplo, X55 se selecciona de Ala o Lys o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X56 es un residuo de aminoácido neutro/polar o ácido, por ejemplo, X56 se selecciona de Glu o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X57 se selecciona de Pro o Thr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X58 es un residuo de aminoácido básico o pequeño, por ejemplo, X58 se selecciona de Gly o Arg o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X59 es un residuo de aminoácido neutro/polar, básico o pequeño, por ejemplo, X59 se selecciona de Pro, Arg o His o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X60 es un residuo de aminoácido pequeño o hidrófobo, por ejemplo, X60 se selecciona de Val, Ile o Ala o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X61 es un residuo de aminoácido pequeño, neutro/polar o básico, por ejemplo, X61 se selecciona de Lys, Gln o Thr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X62 es un residuo de aminoácido hidrófobo o pequeño por ejemplo, X62 se selecciona de Pro o Leu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X63 se selecciona de Pro

o Ala o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X64 es un residuo de aminoácido neutro/polar, pequeño o básico por ejemplo, X64 se selecciona de Lys, Thr o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X65 cuando está presente es un residuo de aminoácido hidrófobo, pequeño o básico por ejemplo, X65 se selecciona de Lys, Ser o Tyr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X66 cuando está presente es un residuo de aminoácido hidrófobo o pequeño, por ejemplo, X66 se selecciona de Ser, Gly o Tyr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X67 cuando está presente es un residuo de aminoácido hidrófobo o neutro/polar, por ejemplo, X67 se selecciona de Gln o Tyr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X68 cuando está presente es Glu o una forma modificada de la misma. En algunas realizaciones, X69 cuando está presente se selecciona de Phe o Val o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X70 cuando está presente es un residuo de aminoácido neutro/polar o hidrófobo, por ejemplo, X70 se selecciona de Tyr o His o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X71 cuando está presente es un residuo de aminoácido neutro/polar o ácido, por ejemplo, X71 se selecciona de Glu o Gln

o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X72 cuando está presente es un residuo de aminoácido neutro/polar o básico, por ejemplo, X72 se selecciona de Lys o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X73 cuando está presente se selecciona de Phe o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X74 cuando está presente es Asp o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X75 cuando está presente es un residuo de aminoácido básico o hidrófobo, por ejemplo, X75 se selecciona de Leu o Arg o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X76 cuando está presente se selecciona de Val o Phe o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X77 cuando está presente se selecciona de Ser o Ala o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X78 se selecciona de Ile o Leu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X79 es un residuo de aminoácido básico o neutro/polar, por ejemplo, X79 se selecciona de Gln o Arg o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X80 se selecciona de Met o Leu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X81 es un residuo de aminoácido básico o neutro/polar, por ejemplo, X81 se selecciona de Asn o Lys o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X82 es un residuo de aminoácido ácido o neutro/polar, por ejemplo, X82 se selecciona de Gln o Glu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X83 es un residuo de aminoácido pequeño o hidrófobo, por ejemplo, X83 se selecciona de Phe o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X84 se selecciona de Val o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X85 es un residuo de aminoácido neutro/polar, básico o pequeño, por ejemplo, X85 se selecciona de Gly, Arg o His o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X86 es un residuo de aminoácido pequeño o hidrófobo por ejemplo, X86 se selecciona de Ile o Thr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X87 es un residuo de aminoácido neutro/polar, básico o hidrófobo, por ejemplo, X87 se selecciona de Phe, Arg o Gln o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X88 es un residuo de aminoácido hidrófobo, pequeño o ácido, por ejemplo, X88 se selecciona de Glu, Ser o Phe o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, en las que X89 es un residuo de aminoácido hidrófobo, pequeño o básico, por ejemplo, X89 se selecciona de Arg, Lys, Gly o Ile o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X90 es un residuo de aminoácido neutro/polar o pequeño, por ejemplo, X90 se selecciona de Gly o Gln o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X91 es un residuo de aminoácido hidrófobo, neutro/polar o pequeño, por ejemplo, X91 se selecciona de Pro, Gln o Tyr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X92 es un residuo de aminoácido pequeño o neutro/polar, por ejemplo, X92 se selecciona de Asn, Gln o Thr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X93 es un residuo de aminoácido neutro/polar o básico, por ejemplo, X93 se selecciona de Lys o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X94 es un residuo de aminoácido hidrófobo o pequeño por ejemplo, X94 se selecciona de Thr o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X95 se selecciona de Leu, Val o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X96 es un residuo de aminoácido pequeño

o básico, por ejemplo, X96 se selecciona de Lys o Thr o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X97 se selecciona de Val o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X98 se selecciona de Leu o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X99 es un residuo de aminoácido ácido o neutro/polar, por ejemplo, X99 se selecciona de Asn, Glu o Asp o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X100 es un residuo de aminoácido pequeño o hidrófobo, por ejemplo, X100 se selecciona de Phe o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X101 es un residuo de aminoácido básico o pequeño, por ejemplo, X101 se selecciona de Pro o Arg o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X102 es un residuo de aminoácido neutro/polar o pequeño, por ejemplo, X102 se selecciona de Pro o Gln o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X103 es un residuo de aminoácido neutro/polar

o pequeño, por ejemplo, X103 se selecciona de Thr o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X104 es un residuo de aminoácido básico o neutro/polar, por ejemplo, X104 se selecciona de Gln o Arg

o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X105 es un residuo de aminoácido pequeño o básico, por ejemplo, X105 se selecciona de Arg o Gly o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X106 se selecciona de Ile o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X107 se selecciona de Val o Ile o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X108 es un residuo de aminoácido neutro/polar o básico, por ejemplo, X108 se selecciona de Arg, Gln o Lys o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X109 es un residuo de aminoácido pequeño o básico, por ejemplo, X109 se selecciona de Lys o Thr o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X110 se selecciona de Arg o Lys o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X111 se selecciona de Ile o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X112 se selecciona de Leu o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X113 es un residuo de aminoácido neutro/polar o básico, por ejemplo, X113 se selecciona de Lys o Asn o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X114 es un residuo de aminoácido hidrófobo o pequeño, por ejemplo, X114 se selecciona de Pro o Leu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X115 es un residuo de aminoácido pequeño o básico, por ejemplo, X115 se selecciona de Arg, Lys o Ala o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X116 se selecciona de Ile o Val o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X117 es un residuo de aminoácido pequeño o básico, por ejemplo, X117 se selecciona de Arg o Ser o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X118 es un residuo hidrófobo, básico o neutro/polar, por ejemplo, X118 se selecciona de Gln, Lys o Leu o una forma modificada de las mismas. En algunas realizaciones, X119 es un residuo de aminoácido neutro/polar o básico, por ejemplo, X119 se selecciona de Lys o His o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, Z está presente y comprende la secuencia X118PSTESSTGRL, en la que X118 es cualquier residuo de aminoácido. En algunas realizaciones, X118 es un residuo neutro/polar o hidrófobo, por ejemplo, X118 se selecciona de Leu o Gln o una forma modificada de las mismas.

En algunas realizaciones, X65-77 representa una secuencia de n aminoácidos en la que n es desde 0 hasta 13 residuos de aminoácido, por ejemplo, la secuencia se selecciona de KX119X120EFYEKFDLVS, SYYQNIDRFA o YYYVHQNFDRVA, en la que X119 es un residuo de aminoácido pequeño, por ejemplo, X119 se selecciona de Ser o Gly o una forma modificada de las mismas; y X120 es cualquier residuo de aminoácido, por ejemplo, X120 se selecciona de Gln o Tyr o una forma modificada de las mismas.

Otras características y ventajas de la invención tal como se definen mediante las reivindicaciones adjuntas resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las tablas y figuras

Tabla 1: Caracterización de muestras durante la purificación de la proteasa de veneno de serpiente marrón usando Sephacryl S-300.

Tabla 2: Caracterización de muestras durante la purificación de la proteasa de veneno de serpiente marrón usando Superdex 200.

Tabla 3: Caracterización de muestras durante la purificación de la proteasa de veneno de serpiente marrón, protocolo 1.

Tabla 4: Caracterización de muestras durante la purificación de la proteasa de veneno de serpiente marrón, protocolo 2.

Tabla 5: Caracterización de muestras durante la purificación de la proteasa de veneno de serpiente marrón, protocolo 3.

Tabla 6: Caracterización de muestras durante la purificación de proteasa de veneno de serpiente marrón, protocolo

4.

Tabla 7: Hidrólisis de S-2222 mediante el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con y sin componentes auxiliares (complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón solo, complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 10 mM y complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 10 mM y fosfolípido).

Tabla 8: Tiempo de coagulación de plasma citratado mediante el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón solo, complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 10 mM y complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 10 mM y fosfolípido.

Tabla 9: Tiempo de coagulación de ensayos de coagulación de plasma citratado  Ca2+, con proteasa de veneno de serpiente aislada añadida derivada de P. textilis (serpiente marrón).

Tabla 10: Coagulación de plasma citratado mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón.

Tabla 11: Tasas iniciales de hidrólisis de S-2222 mediante proteasa de veneno de serpiente aislada derivada de P. textilis, con o sin Ca2+ 10 mM añadido.

Tabla 12: Tiempos de coagulación aproximados de coágulos producidos en plasma citratado humano usando proteasa de veneno de serpiente marrón con y sin CaCl2 40 mM y con CaCl2 40 mM solo.

Tabla 13: Determinación de la masa molecular de la proteasa de veneno de serpiente marrón mediante diversos métodos.

Tabla 14: Pérdida de sangre en un modelo de hemorragia de la vena de cola de ratón tratado con proteasa de veneno de serpiente marrón.

Tabla 15: Pérdida de sangre de ratones tratados con proteasa de veneno de serpiente marrón (prueba) y solución salina (control). Pueden observarse los datos para cada ratón de prueba individual y también la pérdida de sangre promedio  desviación estándar (DE).

Tabla 16: Coagulación de plasma humano citratado mediante diversos venenos de serpiente exóticas y australianas.

Figura 1: Perfil de elución tras cromatografía de veneno de P. textilis (10 ml; 233 mg) en una columna (2,5 x 16 cm) de ConA-Sepharose 4B en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4. A. Trazado del patrón de cromatografía. Se aplicó el tampón de elución (metil--D-manopiranósido 0,02 M en Tris-HCl 0,05 M) a la columna en la flecha B. Las fracciones con actividad hidrolítica de S-2222 se reunieron y se concentraron (designado por la línea en A).

Figura 2: SDS-PAGE del pico reunido y concentrado de cromatografía en ConA-Sepharose 4B. Carril 1. Marcadores de peso molecular (los tamaños se muestran en kDa). Carril 2. Complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón sin -mercaptoetanol. Carril 3. Complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con -mercaptoetanol.

Figura 3: El efecto sobre el tiempo de coagulación del plasma citratado e hidrólisis de S-2222 mediante complejo de proteasa de veneno de serpiente derivado de P. textilis tratado con NaSCN 0,8 M.

Figura 4: Datos de HPLC de serina proteasa de veneno de serpiente marrón.

Figura 5: SDS-PAGE -Me. Carril 1 - 10 l de marcador BIO-RAD, carril 2 - 20 l de veneno de P. textilis, carril 3 - 20 l de Pt-PA intacto, carril 4 - 20 l de Sephacryl S-300 (1) fracciones reunidas 30-43, carril 5 - 20 l de Sephacryl S-300 (2) fracciones reunidas 25-29, carriles 6, 7 y 8 - 10 l de Sephacryl S-300 (3) fracciones reunidas 25-29, carril 9 - 20 l de Sephacryl S-300 (3) fracciones reunidas 25-29 + -Me y carril 10 - 20 l de complejo de proteasa de veneno del suero intacto +-Me.

Figura 6: SDS-PAGE de serina proteasa de veneno de serpiente marrón, con o sin -Me. Carril 1 - marcador BIORAD, carril 2 – veneno de P. textilis entero, carril 3 - Sephacryl S-300 (3) fracciones reunidas 30-43, carril 4 -Sephacryl S-300 (#3), carril 5 - S-300 (#3) + -Me, carril 6 - S300 (#3), carril 7 - Sephacryl S-300 (#3) + -Me, carril 8

-

Sephacryl S-300 (3) fracciones reunidas 30-43 + -Me, carril 9 - complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón intacto + -Me y carril 10 - marcador BIO-RAD. # representa el pico activo reunido y concentrado de las cromatografías en Sephacryl S-300 de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón como anteriormente. Todas las muestras consisten en alícuotas de 10 l.

M.

Las fracciones con actividad de S-2222 se reunieron y concentraron, designado por la línea A.

Figura 7A: Perfil de elución tras la etapa de cromatografía 1 del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón (18 ml; 50,4 mg) en una columna (2,5 x 90 cm) de Superdex 200 en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4 con NaSCN 0,8 Figura 7B: Cromatografía de la etapa 2 según condiciones de la figura 7A.

Figura 7C: SDS-PAGE de muestras de la purificación de la proteasa de veneno de serpiente marrón con Superdex

200. Carriles 1 y 2. Concentrado reunido de la etapa de cromatografía 1 con (2) y sin (1) -mercaptoetanol. Carriles 3 y 4. Concentrado reunido de la etapa de cromatografía 2 con (5) y sin (4) -mercaptoetanol. Carril 5. Marcadores de peso molecular (los tamaños se muestran en kDa). Las flechas A, B y C indican impurezas en el carril 4.

Figura 8A: Coagulación de plasma citratado mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón (denominada proteasa de Pt-PA) sin componentes auxiliares (los puntos de datos son medias de mediciones por duplicado).

Figura 8B: Coagulación de plasma citratado mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón (“Pt-PA”) con CaCl2 10 mM.

Figura 8C: Coagulación de plasma citratado mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón (“Pt-PA”) con CaCl2 10 mM y fosfolípido.

Figura 9A: Hidrólisis de S-2222 mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón (denominada proteasa de Pt-PA) sin componentes auxiliares (los puntos de datos son medias de mediciones por duplicado).

Figura 9B: Hidrólisis de S-2222 mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón sin componentes auxiliares (los puntos de datos son medias de mediciones por duplicado) con CaCl2 10 mM.

Figura 9C: Hidrólisis de S-2222 mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón sin componentes auxiliares (los puntos de datos son medias de mediciones por duplicado) con CaCl2 10 mM.

Figura 9D: Pendiente y valor de R2 de las respectivas representaciones gráficas en las figuras 9A, 9B y 9C. El valor de R2 es el coeficiente de correlación para una línea recta.

Figura 10: Activación de protrombina mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón. Se convirtió la protrombina (100 l, de una preparación 1,3 mg/ml) en trombina mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón (20 l de una preparación 1,3 mg/ml) en un volumen total de 500 l durante los períodos de tiempo indicados en el eje X. Entonces se añadió una alícuota de cada reacción a un ensayo de coagulación de plasma citratado y se midieron los tiempos de coagulación (eje Y).

Figura 11A: SDS-PAGE sin reducción de protrombina tras la incubación con proteasa de veneno de serpiente marrón. Se añadió proteasa de veneno de serpiente marrón a la protrombina a los 0 min. (tiempo, t = 0); carril 1, marcadores de peso molecular (los tamaños se muestran en kDa); carril 2, t = 0; carril 3, t = 6 min.; carril 4, t = 24 h; carril 5, t = 48 h. PT, protrombina; PT1, pretrombina 1; T, trombina; F1,2, fragmento 1,2; PT2, pretrombina 2; F1, fragmento 1.

Figura 11B: Hidrólisis de S-2238 mediante la trombina generada por la proteasa de veneno de serpiente marrón.

Figura 12: Modelo propuesto de activación de protrombina mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón. Las flechas indican los enlaces que se escinden por la trombina y proteasa de veneno de serpiente marrón.

Figura 13: SDS-PAGE de coágulos de fibrina en presencia de -mercaptoetanol. Carril 1. Marcadores de peso molecular (los tamaños se muestran en kDa). Carril 2. Coágulo de fibrina obtenido por la acción de 22 g de proteasa de veneno de serpiente marrón solo sobre plasma citratado. Carril 3. Coágulo de fibrina obtenido por la acción de 22 g de proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 40 mM sobre plasma citratado. Carril 4. Coágulo de fibrina producido con CaCl2 40 mM. Carril 5. Fibrinógeno humano. Los símbolos griegos en el lado derecho del gel son indicativos de las cadenas de fibrinógeno humano que incluyen cadenas A (monómero  y fibrinopéptido A), cadenas B (monómero  con fibrinopéptido B) y cadenas .

Figura 14: Mapeo del sitio activo de proteasa. SDS-PAGE de la proteasa de veneno de serpiente marrón purificada con y sin tratamiento con DNS-GGACK. Carriles 1 y 2. Complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón inhibido con DNS-GGACK con (2) y sin -mercaptoetanol (1). Carriles 3 y 4. Proteasa de veneno de serpiente marrón inhibida con DNS-GGACK con (4) y sin -mercaptoetanol (3). Los carriles 5-8 son una repetición de los carriles 1-4 sin DNS-GGACK y teñidos con azul de Coomassie. Carril 9. Marcadores de peso molecular (los tamaños se muestran en kDa).

Figura 15: Alineación de secuencias de aminoácidos de un fragmento de proteína de la proteasa de veneno de serpiente marrón, trocarina y factor Xa humano que comprende un supuesto sitio activo que tiene las histidinas de interacción propuestas mostradas en negrita.

Figura 16: Alineación de secuencias de aminoácidos de la parte de la cadena pesada de la proteasa de veneno de serpiente marrón prevista y trocarina. Un valor esperado (E) es un parámetro que muestra el número de resultados positivos que se esperan al azar cuando se realiza una búsqueda en la base de datos del NCBI. Cuanto más cerca esté el valor de E de cero, más significativo será el apareamiento de secuencia. El valor de E disminuye exponencialmente con la puntuación dada a un apareamiento entre dos secuencias y también depende de la longitud de las secuencias comparadas. Un valor esperado de 1 significa que dentro de la base de datos se espera que un apareamiento tenga una puntuación similar al azar. Puntuación = 39,7, Esperado = 0,004; Identidades = 11/11 (100%), Positivas= 11/11 (100%)

Figura 17: Alineación de secuencias de aminoácidos de una parte de la cadena pesada de la proteasa de veneno de serpiente marrón prevista y factor Xa humano.

Figura 18: Alineación de secuencias de aminoácidos de una parte de la cadena ligera de la proteasa de veneno de serpiente marrón prevista y trocarina.

Figura 19: Alineación de secuencias de una parte de la cadena ligera de la proteasa de veneno de serpiente marrón prevista y factor X de ratón. Puntuación = 24,8, Esperado = 116; Identidades =9/12 (75%), Positivas =9/12 (76%).

Figura 20A: Secuencia de ácido nucleótido [SEQ ID NO: 1 que codifica para proteasa de veneno de serpiente de P. textilis (serpiente marrón común).

Figura 20B: Secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 2] de proteasa de veneno de serpiente de P. textilis (serpiente marrón común).

Figura 21: Alineación de secuencias de aminoácidos entre proteasas de veneno de serpiente aisladas a partir de glándulas de veneno de las siguientes serpientes australianas: P. textilis (marrón) [SEQ ID NO: 2], O. scutellatus (taipán de la costa) [SEQ ID NO: 5], P. potphyriacus (negra de vientre rojo) [SEQ ID NO: 11], N. scutatus (tigre del continente) [SEQ ID NO: 14], T. carinatus (de escamas rugosas) [SEQ ID NO: 17] y trocarina [SEQ ID NO: 31].

Figura 22. Alineación de secuencias de aminoácidos de proteasas de veneno de serpiente aisladas con Xa humano [SEQ ID NO: 27]. Se muestran secuencias de aminoácidos de la proteasas de veneno de serpiente derivadas de las siguientes serpientes: marrón [SEQ ID NO: 2], taipán de la costa [SEQ ID NO: 5], de vientre rojo [SEQ ID NO: 11], de escamas rugosas “Roughie” [SEQ ID NO: 14] y tigre del continente [SEQ ID NO: 17].

Figura 23. Alineación de secuencias de aminoácidos entre proteasas de veneno de serpiente aisladas a partir de glándulas de veneno de las serpientes australianas P. textilis (marrón) [SEQ ID NO: 2], O. scutellatus (taipán de la costa) [SEQ ID NO: 5], O. microepidotus (taipán del interior) [SEQ ID NO:8], P. porphyriacus (negra de vientre rojo) [SEQ ID NO: 11], N. scutatus (tigre del continente) [SEQ ID NO: 14], y T. carinatus (de escamas rugosas) [SEQ ID NO: 17].

Figura 24 Alineación de secuencias de aminoácidos entre proteasas de veneno de serpiente aisladas a partir de glándulas de veneno de las serpientes australianas P. textilis (marrón) [SEQ ID NO: 2], O. scutellatus (taipán de la costa) [SEQ ID NO: 5], O. microepidotus (taipán del interior) [SEQ ID NO:8], P. porphyriacus (negra de vientre rojo) [SEQ ID NO: 11], N. scutatus (tigre del continente) [SEQ ID NO: 14], T. carinatus (de escamas rugosas) [SEQ ID NO: 17] y una secuencia consenso [SEQ ID NO:].

Figura 25. Alineación de secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos que codifican para proteasas de veneno de serpiente derivadas de las siguientes serpientes australianas: P. textilis (marrón) [SEQ ID NO: 1], O. scutellatus (taipán de la costa) [SEQ ID NO: 4], P. porphyriacus (negra de vientre rojo) [SEQ ID NO: 10], N. scutatus (tigre del continente) [SEQ ID NO: 13], T. carinatus (de escamas rugosas) [SEQ ID NO: 16] y factor Xa humano [SEQ ID NO: 26].

Figura 26. Alineación de secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos que codifican para proteasas de veneno de serpiente derivadas de las siguientes serpientes australianas: P. textilis (marrón) [SEQ ID NO: 1], O. scutellatus (taipán de la costa) [SEQ ID NO: 4], O. microlepidotus (taipán del interior) [SEQ ID NO:7], P. porphyriacus (negra de vientre rojo) [SEQ ID NO: 10], N. scutatus (tigre del continente) [SEQ ID NO: 13] y T. carinatus (de escamas rugosas) [SEQ ID NO: 16].

Figura 27: Muestra colas de ratón con y sin tratamiento con proteasa de veneno de serpiente marrón (observe el coágulo grande formado con el tratamiento de proteasa).

Figura 28: Diagrama de cajas de resultados de la hemorragia de los ratones. Cada caja representa un intervalo que comprende el 50% de los valores. Los bigotes son líneas que se extienden desde la caja hasta los valores más altos y más bajos. La línea que cruza la caja indica la mediana.

Descripción detallada de la invención

Los venenos de serpiente son una fuente abundante de proteínas y otros constituyentes que afectan al mecanismo hemostático de los mamíferos mediante la inhibición y/o activación de factores dentro de las rutas de agregación plaquetaria, fibrinólisis y la cascada de coagulación. De particular interés son las proteasas de veneno de serpiente únicas para las especies de serpientes elápidas australianas. Normalmente, la escisión proteolítica de la protrombina para dar su forma activa, trombina, se cataliza mediante el complejo de protrombinasa en sistemas de mamíferos. La proteasa funcional dentro de la protrombinasa es el factor Xa. Sin embargo, para una actividad óptima, la enzima Xa requiere el factor Va como cofactor en presencia de iones calcio y fosfolípidos.

La invención se basa, en parte, en el aislamiento de proteasas de veneno de serpiente a partir del veneno de serpientes australianas. Los ejemplos de serpientes australianas incluyen la serpiente marrón común australiana Pseudonaja textilis, taipán de la costa (Oxyaranus scutellatus), taipán del interior (Oxyuranus microlepidotus), tigre del continente (Notechis scutatus), de escamas rugosas (Tropidechis carinatus) y negra de vientre rojo (Pseudechis porphyriacus) y otras serpientes del género Elapidae. Las proteasas de veneno de serpiente descritas en el presente documento imitan el efecto del factor Xa in vivo, escindiendo la protrombina para dar trombina, sin embargo lo hacen en ausencia de cofactores, tales como factor Va, fosfolípido e iones calcio. Por tanto, las proteasas de veneno de serpiente descritas en el presente documento actúan como activadores de protrombina o bien completos o bien parcialmente completos. La expresión “activador de protrombina completo” tal como se usa en el presente documento se refiere a una proteasa de veneno de serpiente que procesa la protrombina para dar trombina en ausencia de calcio, fosfolípidos y factor Va. Los ejemplos de proteasas de veneno de serpiente que actúan como activadores de protrombina completos incluyen proteasas de veneno de serpiente de la serpiente marrón y las serpientes de taipán. La expresión “activadores de protrombina parcialmente completos” tal como se usa en el presente documento se refiere a proteasas de veneno de serpiente que procesan la protrombina para dar trombina en ausencia de calcio y fosfolípidos, pero sí requieren la presencia de factor Va.

Las proteasas de veneno de serpiente aisladas pueden aislarse a partir del veneno de la serpiente marrón australiana común (P. textilis), taipán (Oxyuranus scutellatus) de la costa o del interior, tigre del continente (Notechis scutatus), de escamas rugosas (Tropidechis carinatus) y serpiente negra de vientre rojo (Pseudechis porphyriacus).

Una proteasa de veneno de serpiente puede aislarse a partir de un complejo de protrombinasa denominado en el presente documento “complejo de proteasa de veneno de serpiente”. El complejo de proteasa de veneno de serpiente puede comprender varias proteínas y/o cofactores. Las proteasas de veneno de serpiente incluyen, por ejemplo, aquellas proteínas mostradas en la figura 23 y subfragmentos digeridos proteolíticamente de las mismas. La figura 23 representa la secuencia de aminoácidos de una proteasa de veneno de serpiente de serpiente marrón (SEQ ID NO:2); la secuencia de aminoácidos de una proteasa de veneno de serpiente de serpiente taipán de la costa (SEQ ID NO:5); la secuencia de aminoácidos de una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente taipán del interior (SEQ ID NO:8); la secuencia de aminoácidos de una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente negra de vientre rojo (SEQ ID NO: 11); la secuencia de aminoácidos de una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente tigre (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de aminoácidos de una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente de escamas rugosas (SEQ ID NO: 17).

Las proteasas de veneno de serpiente descritas en el presente documento contienen un número significativo de características estructurales en común entre sí. El término “familia” cuando se refiere a las moléculas de ácido nucleico y proteína descritas significa dos o más moléculas de ácido nucleico o proteínas que tienen un motivo o dominio estructural común y que tienen homología de secuencia de nucleótido o aminoácido suficiente tal como se define en el presente documento. Tales miembros de familia pueden producirse de manera natural o no natural y pueden ser o bien de la misma o bien de diferentes especies. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes.

Tal como se usa en el presente documento, una “actividad de proteasa de veneno de serpiente”, “actividad biológica de una proteasa de veneno de serpiente” o “actividad funcional de una proteasa de veneno de serpiente”, se refiere a una actividad que se ejerce mediante una molécula de ácido nucleico, polipéptido o proteína de la proteasa de veneno de serpiente. Por ejemplo, una actividad de proteasa de veneno de serpiente puede ser uno o más de: la capacidad para procesar la protrombina para dar trombina (por ejemplo, la capacidad para escindir la protrombina entre el residuo de arginina 274 y el residuo de treonina 275 de la protrombina y entre el residuo de arginina 323 y el residuo de isoleucina 324 de la protrombina, por ejemplo, la capacidad para escindir la protrombina entre el residuo de arginina 274 y el residuo de treonina 275 de la protrombina y entre el residuo de arginina 323 y el residuo de isoleucina 324 de la protrombina pero para no escindir la protrombina entre el residuo de arginina 155 y el residuo de serina 156 y/o entre el residuo de arginina 286 y el residuo de treonina 287); la capacidad para producir coagulación en plasma tratado con citrato; la capacidad para procesar la protrombina y/o producir coagulación en ausencia de calcio y fosfolípido. Las proteasas de veneno de serpiente aisladas descritas en el presente documento se caracterizan por tener una actividad protrombinasa en gran parte independiente del calcio tal como se muestra, por ejemplo, en las tablas 8-12.

La invención presenta el uso de polipéptidos de veneno de serpiente y fragmentos biológicamente activos del mismo, que son activadores de protrombina parcialmente completos o completos. Un activador parcial o completo muestra una actividad significativamente mayor en ausencia de cofactores que un activador incompleto, por ejemplo, factor X humano o trocarina. Las realizaciones de los activadores parcialmente completos o completos de la invención tienen un nivel de actividad que es aproximadamente el 0,4% de la actividad del activador de protrombina completo en combinación con Ca2+ y fosfolípidos. La actividad del activador de protrombina parcialmente completo o completo solo es preferiblemente al menos 1,5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000 ó 4000 veces (de dos a cuatro órdenes de magnitud) superior a la de un activador incompleto, por ejemplo, el factor Xa humano o trocarina, solo. Esta comparación se hace entre una proteasa de veneno de serpiente y un activador incompleto medidos en condiciones similares o iguales, por ejemplo, en ausencia de Ca y fosfolípidos. El % de actividad (es decir, la actividad del activador parcialmente completo o completo en ausencia de Ca y fosfolípido como un % de la observada con el mismo activador en presencia de Ca y fosfolípidos) de uno parcialmente completo o completo es preferiblemente al menos 1,5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000 ó 4000 veces superior al mismo % mostrado por un activador incompleto, por ejemplo, el factor X humano o trocarina. Los activadores parcialmente completos o completos preferidos coagularán el plasma citratado a una concentración de aproximadamente 10-10 a 10-06 M, por ejemplo, a 10-8 ó 10-7 M, dando tiempos de coagulación de aproximadamente 50 a 15 segundos, demostrando independencia de Ca2+ y fosfolípido. Por consiguiente, el activador de protrombina muestra propiedades cinéticas de independencia de cofactor (iones calcio y/o fosfolípido) en el intervalo de concentración de aproximadamente 10-10 a 10-06 M, siendo el intervalo de concentración un intervalo de trabajo adecuado para reducir la pérdida de sangre.

Las proteínas de la proteasa de veneno de serpiente, fragmentos de las mismas y derivados y otras variantes de la secuencia en SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 y 17, se denominan colectivamente “proteínas o polipéptidos de proteasa de veneno de serpiente”. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para tales polipéptidos o proteínas se denominan colectivamente “ácidos nucleicos que codifican para la proteasa de veneno de serpiente”. Las moléculas de proteasa de veneno de serpiente se refieren a anticuerpos, polipéptidos y ácidos nucleicos de proteasa de veneno de serpiente.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “moléculas de ácido nucleico” incluye moléculas de ADN (por ejemplo, un ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, un ARNm) y análogos del ADN o ARN. Un análogo de ADN o ARN puede sintetizarse a partir de análogos de nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero es preferiblemente ADN bicatenario. La figura 26 representa una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente marrón (SEQ ID NO: 1, región codificante SEQ ID NO:3); una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente taipán de la costa (SEQ ID NO:4, región codificante SEQ ID NO:6); una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente taipán del interior (SEQ ID NO:7), región codificante SEQ ID NO:9); una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente negra de vientre rojo (SEQ ID NO:10, región codificante SEQ ID NO:12); una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente tigre (SEQ ID NO: 13, región codificante SEQ ID NO:15); y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteasa de veneno de serpiente de la serpiente de escamas rugosas (SEQ ID NO:16, región codificante SEQ ID NO:18).

La expresión “moléculas aisladas de ácido nucleico” o “moléculas purificadas de ácido nucleico” incluye moléculas de ácido nucleico que se separan de otras moléculas de ácido nucleico presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término “aislado” incluye moléculas de ácido nucleico que se separan del cromosoma con el que el ADN genómico se asocia de manera natural. Preferiblemente, un ácido nucleico “aislado” está libre de secuencias que flanquean de manera natural el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5’ y/o 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos 5’ y/o 3’ que flanquean de manera natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico “aislada”, tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular,

o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “se hibrida en condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad media, rigurosidad alta o rigurosidad muy alta” describe condiciones para hibridación y lavado. Puede encontrarse orientación para realizar las reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,

N.Y. (1989), 6,3.1-6,3.6. Se describen métodos no acuosos y acuosos en esa referencia y cualquiera puede usarse. Las condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en el presente documento son tal como sigue: 1) condiciones de hibridación de rigurosidad baja en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1%, al menos a 50ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55ºC para condiciones de rigurosidad baja); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 60ºC; 3) condiciones de hibridación de rigurosidad alta en SSC 6X a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 65ºC; y preferiblemente 4) condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC, seguido por uno o más lavados a SSC 0,2X, SDS al 1% a 65ºC. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas y las que deben usarse a menos que se especifique lo contrario.

Una molécula de ácido nucleico aislada tal como se describe en el presente documento puede hibridarse en una condición de rigurosidad descrita en el presente documento con la secuencia de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18 que preferiblemente corresponde a una molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural.

Tal como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico “que se produce de manera natural” se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se produce en la naturaleza. Por ejemplo una molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural puede codificar para una proteína natural.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “gen” y “gen recombinante” se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen al menos un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de la proteasa de veneno de serpiente. El gen además puede incluir opcionalmente secuencias no codificantes, por ejemplo, secuencias reguladoras e intrones.

Una proteína o polipéptido “purificado” o “aislado” está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula u fuente de tejido de la que se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. “Sustancialmente libre” significa que una preparación de una proteína de la proteasa de veneno de serpiente tiene al menos una pureza del 10%. Por ejemplo, la preparación de la proteína de la proteasa de veneno de serpiente tiene menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10% y más preferiblemente el 5% (en peso seco), de proteína de la proteasa no de veneno de serpiente (también denominada en el presente documento como “proteína contaminante”), o de precursores químicos o productos químicos de proteasa no de veneno de serpiente. Cuando la proteína de la proteasa de veneno de serpiente o parte biológicamente activa de la misma se produce de manera recombinante, está también de manera preferible sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparación de proteína. Se contemplan preparaciones purificadas o aisladas de al menos 0,01, 0,1, 1,0 y 10 miligramos en peso seco.

Un residuo de aminoácido “no esencial” es un residuo que puede alterarse de la secuencia de tipo natural de una proteasa de veneno de serpiente sin suprimir o alterar sustancialmente una actividad de proteasa de veneno de serpiente. Preferiblemente la alteración no altera sustancialmente la actividad de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, la actividad es al menos el 20%, 40%, 60%, 70% u 80% del tipo natural. Una residuo de aminoácido “esencial” es un residuo que, cuando se altera de la secuencia de tipo natural de una proteasa de veneno de serpiente, da como resultado la supresión de una actividad de proteasa de veneno de serpiente de modo que menos del 20% de la actividad del tipo natural esté presente. Por ejemplo, se prevé que los residuos de aminoácido conservados entre las proteasas de veneno de serpiente, por ejemplo, las proteasas de veneno de serpiente mostradas en la figura 24 sean particularmente no susceptibles de alteración.

Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un residuo de aminoácido no esencial previsto en una proteína de la proteasa de veneno de serpiente se reemplaza preferiblemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de proteasa de veneno de serpiente, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden seleccionarse por la actividad biológica de la proteasa de veneno de serpiente para identificar mutantes que conservan actividad. Tras la mutagénesis de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, la proteína codificada puede expresarse de manera recombinante y puede determinarse la actividad de la proteína.

Los residuos de aminoácido pueden subclasificarse generalmente en subclases principales tal como sigue:

Ácido: El residuo tiene una carga negativa debido a la pérdida de iones H a pH fisiológico y se atrae al residuo mediante disolución acuosa para buscar las posiciones de superficie en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena

lateral ácida incluyen ácido glutámico y ácido aspártico.

Básico: El residuo tiene una carga positiva debido a la asociación con el ion H a pH fisiológico o dentro de una o dos unidades de pH del mismo (por ejemplo, histidina) y se atrae al residuo mediante disolución acuosa para buscar las 5 posiciones de superficie en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral básica incluyen arginina, lisina e histidina.

Cargado: Los residuos están cargados a pH fisiológico y, por tanto, incluyen los aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas o ácidas (es decir, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina e histidina).

10 Hidrófobo: Los residuos no están cargados a pH fisiológico y se repele el residuo mediante disolución acuosa para buscar las posiciones internas en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrófoba incluyen tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y triptófano.

15 Neutro/polar: Los residuos no están cargados a pH fisiológico, pero no se repele suficientemente el residuo mediante disoluciones acuosas de modo que buscaría posiciones internas en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral neutra/polar incluyen asparagina, glutamina, cisteína, histidina, serina y treonina.

20 Esta descripción también caracteriza ciertos aminoácidos como “pequeños” puesto que sus cadenas laterales no son lo suficientemente largas, incluso si carecen de grupos polares, para conferir hidrofobicidad. Con la excepción de prolina, los aminoácidos “pequeños” son aquéllos con cuatro carbonos o menos cuando al menos un grupo polar está en la cadena lateral y tres carbonos o menos cuando no. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral

25 pequeña incluyen glicina, serina, alanina y treonina. La prolina, el aminoácido secundario codificado por genes es un caso especial debido a sus efectos conocidos sobre la conformación secundaria de cadenas de péptidos. La estructura de prolina difiere de todos los demás aminoácidos que se producen de manera natural porque su cadena lateral está unida al nitrógeno del grupo -amino, así como el -carbono. Varias matrices de similitud de aminoácidos (por ejemplo, matriz PAM120 y matriz PAM250 tal como se dan a conocer por ejemplo por Dayhoff et

30 al. (1978) A model of evolutionary change in proteins. Matrices for determining distance relationships en M. O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, vol. 5, págs. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC; y por Gonnet et al., 1992, Science 256(5062): 144301445), sin embargo, incluyen prolina en el mismo grupo como glicina, serina, alanina y treonina. Por consiguiente, para los fines de la presente invención, se clasifica la prolina como un aminoácido “pequeño”.

35 El grado de atracción o repulsión requerido para la clasificación como polar o no polar es arbitrario y, por tanto, los aminoácidos contemplados específicamente por la invención se han clasificado como uno u otro. La mayoría de aminoácidos sin nombrar específicamente pueden clasificarse basándose en su comportamiento conocido.

40 Los residuos de aminoácido pueden además subclasificarse como cíclicos o no cíclicos, y aromáticos o no aromáticos, clasificaciones explicativas por sí mismas con respecto a los grupos sustituyentes de cadena lateral de los residuos, y como pequeño o grande. El residuo se considera pequeño si contiene un total de cuatro átomos de carbono o menos, inclusive el carbono de carboxilo, siempre que esté presente un sustituyente polar adicional; tres o menos si no. Los residuos pequeños son, por supuesto, siempre no aromáticos.

45 Para los aminoácidos de la proteína que se producen de manera natural, la subclasificación según el esquema anterior se presenta en la siguiente tabla.

Subclasificación de aminoácidos

Subclases

Aminoácidos

Ácido

ácido aspártico, ácido glutámico

Básico

no cíclicos: arginina, lisina; cíclicos: histidina

Cargado

ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina, histidina

Pequeño

glicina, serina, alanina, treonina

Polar/neutro

asparagina, histidina, glutamina, cisteína, serina, treonina

Polar/grande

asparagina, glutamina

Hidrófobo

tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano

50 La prolina, el aminoácido secundario codificado por genes es un caso especial debido a sus efectos conocidos sobre la conformación secundaria de cadenas de péptidos, y por tanto, no se incluye en un grupo.

Los aminoácidos “modificados” que pueden incluirse en las SVP son aminoácidos codificados por genes que se han

procesado tras la traducción del gen, por ejemplo, mediante la adición de grupos metilo o derivatización a través de 55 enlace covalente a otros sustituyentes u oxidación o reducción u otra modificación covalente. La clasificación en la

que se encuentra el aminoácido modificado resultante se determinará mediante las características de la forma modificada. Por ejemplo, si se modificara lisina acilando el grupo -amino, la forma modificada no se clasificaría como básica sino como polar/grande.

Determinados aminoácidos encontrados comúnmente, que no se codifican por el código genético, incluyen, por ejemplo, -alanina (-Ala) u otros aminoácidos omega, tales como 3-aminopropiónico, 2,3-diaminopropiónico (2,3diaP), 4-aminobutírico, etcétera, ácido -aminoisobutírico (Aib), sarcosina (Sar), ornitina (Orn), citrulina (Cit), t-butilalanina (t-BuA), t-butilglicina (t-BuG), N-metilisoleucina (N-Melle), fenilglicina (Phg) y ciclohexilalanina (Cha), norleucina (Nle), 2-naftilalanina (2-Nal); ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico (Tic); beta-2-tienilalanina(Thi); sulfóxido de metionina (MSO); y homoarginina (Har). Éstos también se encuentran convenientemente en categorías particulares.

Basándose en las definiciones anteriores, Sar, beta-Ala y Aib son pequeños; t-BuA, t-BuG, N-MeIle, Nle, Mvl, Cha, Phg, Nal, Thi y Tic son hidrófobos; 2,3-diaP, Orn y Har son básicos; Cit, acetilo, Lys y MSO son neutros/polares/grandes. Los diversos aminoácidos omega se clasifican según el tamaño como pequeños (-ala y 3aminopropiónico) o como grandes e hidrófobos (todos los demás).

También pueden incluirse otras sustituciones de aminoácido para aquéllos codificados en el gen y pueden clasificarse dentro de este esquema general según su estructura.

En todas las SVP uno o más enlaces amida (--CO--NH--) pueden reemplazarse opcionalmente por otro enlace que sea un isóstero tal como –CH2NH--, --CH2S--, --CH2CH2, --CH=CH-- (cis y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2--y --CH2SO--. Este reemplazo puede hacerse mediante métodos conocidos en la técnica. Las siguientes referencias describen la preparación de análogos de péptido que incluyen estos restos de unión alternativa: Spatola, A. F., Vega Data (marzo de 1983), vol. 1, número 3, “Peptide Backbone Modifications” (revisión general); Spatola, A. F., en “Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins”, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, pág. 267 (1983) (revisión general); Morley, J. S., Trends Pharm Sci (1980) págs. 463-468 (revisión general); Hudson, D., et al., Int J Pept Prot Res (1979) 14:177-185 (--CH2NH--, --CH2CH2--); Spatola, A. F., et al., Life Sci (1986) 38:1243-1249 (--CH2--S); Hann, M. M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314 (--CH--CH--, cis y trans); Almiquist, R. G., et al., J Med Chem (1980) 23:1392-1398 (--COCH2-); Jennings-White, C., et al., Tetrahedron Lett (1982) 23:2533 (--COCH2--); Szelke, M., et al., solicitud europea EP 45665 (1982) CA:97:39405 (1982) (--CH(OH)CH2--); Holladay, M. W., et al., Tetrahedron Lett (1983) 24:4401-4404 (--C(OH)CH2--); y Hruby, V. J., Life Sci (1982) 31: 189-199 (--CH2--S--).

Tal como se usa en el presente documento, una “parte biológicamente activa” de una proteína de la proteasa de veneno de serpiente incluye un fragmento de una proteína de la proteasa de veneno de serpiente que participa en una interacción, por ejemplo, una interacción intermolecular o una intramolecular. Una interacción intermolecular puede ser una interacción de unión específica o una interacción enzimática (por ejemplo, la interacción puede ser transitoria y se forma o se rompe un enlace covalente). Una interacción intermolecular puede ser entre una molécula de proteasa de veneno de serpiente y una molécula de proteasa no de veneno de serpiente, por ejemplo protrombina, o entre una primera molécula de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, una cadena ligera de una proteasa de veneno de serpiente y una segunda molécula de proteasa de veneno de serpiente (por ejemplo, una interacción de dimerización). Las partes biológicamente activas de una proteína proteasas de veneno de serpiente incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína proteasas de veneno de serpiente, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, que incluyen menos aminoácidos que las proteínas de la proteasa de veneno de serpiente de longitud completa, y muestran al menos una actividad de una proteína de la proteasa de veneno de serpiente. Normalmente, las partes biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de proteína de la proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, la capacidad para procesar la protrombina para dar trombina, por ejemplo, en ausencia de calcio y/o fosfolípido. Una parte biológicamente activa de una proteína de la proteasa de veneno de serpiente puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, 200 o más aminoácidos de longitud. Preferiblemente, dicho fragmento es una “parte biológicamente activa” que tiene no menos del 1%, preferiblemente no menos del 10%, más preferiblemente no menos del 25% e incluso más preferiblemente no menos del 50% de la actividad del procesamiento de protrombina de las proteasas de veneno de serpiente descritas en el presente documento.

También se contempla un “fragmento” de una proteasa de veneno de serpiente tal como se da a conocer en el presente documento. El término “fragmento” incluye dentro de su alcance fragmentos de cadena ligera y pesada de una proteasa de veneno de serpiente. Por ejemplo, el fragmento es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra a continuación (números de residuo tal como se muestran en la figura 27):

KREASLPDFVQS (residuos 181-192) [SEQ ID NO: 19]

LKKSDNPSPDIR (residuos 198-209) [SEQ ID NO: 20]

SVXVGEIXXSR (residuos 260-270) [SEQ ID NO: 21] MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK (residuos 1-29) [SEQ ID NO: 22]

ANRFLQRTKR (residuos 31-40) [SEQ ID NO: 23]

KREASLPDFVQSXXAXXLKKSDNPSPDIR (residuos 181-209) [SEQ ID NO: 24]

MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKXANRFLQRTKR (residuos 1-40) [SEQ ID NO: 25]

X puede ser cualquier aminoácido.

Se apreciará que también se contemplan los subfragmentos de péptidos de los fragmentos de péptido anteriores, por ejemplo los péptidos tal como se exponen por SEQ ID NOS: 19 y 20 son subfragmentos respectivos del péptido expuesto por SEQ ID NO: 24. Un experto en la técnica puede seleccionar otros fragmentos y subfragmentos. Por ejemplo, un “fragmento” es un péptido pequeño, por ejemplo de al menos 6, preferiblemente al menos 10 y más preferiblemente al menos 20 aminoácidos de longitud. También se contemplan fragmentos más grandes que comprenden más de un péptido, y pueden obtenerse a través de la aplicación de técnicas de ácido nucleico recombinantes convencionales o sintetizarse usando técnicas de síntesis en fase sólida o líquida convencionales. Alternativamente, los péptidos pueden producirse por la digestión de un polipéptido de la invención con proteinasas tales como endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C y Staphylococcus V8-proteasa. Los fragmentos digeridos pueden purificarse mediante, por ejemplo, técnicas de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).

Se realizan los cálculos de homología o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan de manera intercambiable en el presente documento) tal como sigue.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico o aminoácidos para alineación óptima y las secuencias no homólogas pueden ignorarse para fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es de al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, el 60%, e incluso más preferiblemente al menos el 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces, se comparan los residuos de aminoácido o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido. Cuando se ocupa una posición en la primera secuencia por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como en la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se usa en el presente documento la “identidad” de ácido nucleico o aminoácido es equivalente a “homología” de ácido nucleico o aminoácido).

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de las secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando o bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En aún otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un conjunto de parámetros particularmente preferido (y el que debe usarse a menos que se especifique lo contrario) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización extendida de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento del marco de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

Las secuencias de proteína y ácido nucleico descritas en el presente documento pueden usarse como una “secuencia de consulta” para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otras secuencias relacionadas o miembros de familia. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos en BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogos a moléculas de 53010 ácidos nucleicos de la invención. Las búsquedas de proteína en BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogos a moléculas de 53010 proteínas de la invención. Para obtener alineaciones con huecos para fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Los polipéptidos de proteasa de veneno de serpiente tal como se describen en el presente documento pueden tener una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17. En el contexto de una secuencia de aminoácidos, la expresión “sustancialmente idéntica” se usa en el presente documento para referirse a un primer aminoácido que contiene un número mínimo o suficiente de residuos de aminoácido que son i) idénticos a, o ii) sustituciones conservativas de residuos de aminoácido alineados en una segunda secuencia de aminoácidos de modo que la primera y segunda secuencias de aminoácidos pueden tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 60% o el 65%, probablemente una identidad del 75%, más probablemente una identidad del 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17 se califican como sustancialmente idénticas.

En el contexto de secuencia de nucleótidos, la expresión “sustancialmente idéntica” se usa en el presente documento para referirse a una primera secuencia de ácido nucleico que contiene un número mínimo o suficiente de nucleótidos que son idénticos a nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que la primera y segunda secuencias de nucleótidos codifican para un polipéptido que tiene una actividad funcional común,

o codifica para un dominio de polipéptido estructural común o una actividad de polipéptido funcional común. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que tienen una identidad de al menos aproximadamente el 60% o el 65%, probablemente una identidad del 75%, más probablemente una identidad del 85%, 90%. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con SEQ ID NOs:1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18 se califican como sustancialmente idénticas.

“Sujeto,” tal como se usa en el presente documento, se refiere a animales no humanos y seres humanos. La expresión “animales no humanos” de la invención incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos, tales como primates no humanos (particularmente primates superiores), ovejas, perros, roedores (por ejemplo, ratón o rata), cobayas, cabras, cerdos, gatos, conejos, vacas, y no mamíferos, tales como pollos, anfibios, reptiles, etc. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un animal experimental o animal adecuado como un modelo de enfermedad.

Una “preparación purificada de células”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación de células in vitro. En el caso células de organismos multicelulares (por ejemplo, plantas y animales), una preparación purificada de células es un subconjunto de células obtenidas del organismo, no el organismo intacto entero. En el caso de microorganismos unicelulares (por ejemplo, células cultivadas y células microbianas), consiste en una preparación de al menos el 10% y más preferiblemente el 50% de las células del sujeto.

Las variantes pueden encontrarse dentro del alcance del término “homólogos” de las proteínas proteasas de veneno de serpiente.

Tal como se usa generalmente en el presente documento, un “homólogo” comparte una relación de secuencia de aminoácidos o nucleótidos definible con una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de la invención según sea el caso. Las proteínas de la proteasa de veneno de serpiente de la invención derivadas de diferentes serpientes son homólogas de entre sí.

Se incluyen dentro del alcance de los homólogos los “ortólogos”, que son proteínas de la proteasa de veneno de serpiente y sus ácidos nucleicos que los codifican, aislados a partir de organismos distintos de Pseudonaja textilis, Oxyuranus scutellatus, Notechis scutatus, Tropidechis carinatus y Pseudechis porphyriacus. Además, una proteína de la proteasa de veneno de serpiente de una de las especies anteriores es un ortólogo de cualquiera de las demás especies mencionadas. Por ejemplo, una proteína de la proteasa de veneno de serpiente de P. textilis es un ortólogo de una proteína de la proteasa de veneno de serpiente de O. scutellatus.

Otros derivados contemplados por la invención incluyen, pero no se limitan a, modificación a las cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante la síntesis de proteínas, polipéptidos o péptidos y el uso de agentes de reticulación y otros métodos que imponen restricciones conformacionales a los polipéptidos, fragmentos y variantes dados a conocer en el presente documento. Los ejemplos de modificaciones de cadena lateral contempladas por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tales como mediante acilación con anhídrido acético; acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; amidinación con acetimidato de metilo; carbamoilación de grupos amino con cianato; piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguido por reducción con NaBH4; alquilación reductiva mediante reacción con un aldehído seguido por reducción con NaBH4; y trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6trinitrobencenosulfónico (TNBS).

El grupo carboxilo puede modificarse mediante activación de carbodiimida por medio de la formación de O-acilisourea seguido por derivatización posterior, a manera de ejemplo, para dar una correspondiente amida.

El grupo guanidina de residuos de arginina puede modificarse mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.

Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse mediante métodos tales como oxidación de ácido perfórmico para dar ácido cisteico; formación de derivados mercuriales usando ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, 4-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4-nitrofenol, cloruro de fenilmercurio y otros compuestos mercuriales; formación de disulfuros mezclados con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; y carbamoilación con cianato a pH alcalino.

Los residuos de triptófano pueden modificarse, por ejemplo, mediante alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfonilo o mediante oxidación con N-bromosuccinimida.

Los residuos de tirosina pueden modificarse mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.

El anillo de imidazol de un residuo de histidina puede modificarse mediante N-carbetoxilación con pirocarbonato de dietilo o mediante alquilación con derivados de ácido yodoacético.

Los ejemplos de incorporación de derivados y aminoácidos no naturales durante la síntesis de péptidos incluyen pero no se limitan a, el uso de ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5fenilpentanoico, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, t-butilglicina, norleucina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, 2-tienilalanina y/o isómeros D de aminoácidos.

Las proteínas activadoras de protrombina aisladas dadas a conocer en el presente documento (inclusive fragmentos, variantes, derivados y homólogos) pueden prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido para los expertos en la técnica.

Diversos aspectos de la invención se describen adicionalmente en detalle a continuación.

Moléculas de ácido nucleico aisladas

También se da a conocer una molécula de ácido nucleico, purificada o aislada que codifica para un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente descrito en el presente documento, por ejemplo, una proteína de la proteasa de veneno de serpiente de longitud completa o un fragmento de la misma, por ejemplo, una parte biológicamente activa de la proteína proteasas de veneno de serpiente. También se da a conocer un fragmento de ácido nucleico adecuado para su uso como una sonda de hibridación, que puede usarse, por ejemplo, para identificar una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención, ARNm de la proteasa de veneno de serpiente y fragmentos adecuados para su uso como cebadores, por ejemplo, cebadores para PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.

Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye secuencias que codifican para la proteína de la proteasa de veneno de serpiente (es decir, “la región codificante” de SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 ó 16, tal como se muestra en SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15 ó 18, respectivamente), así como secuencias no traducidas 5’. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede incluir sólo la región codificante de SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 ó 16 (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15 ó 18, respectivamente) y, por ejemplo, secuencias no flanqueantes que normalmente acompañan a la secuencia objeto. La molécula de ácido nucleico puede codificar para una secuencia correspondiente a un fragmento de la proteína. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico codifica para uno o más de una cadena pesada, péptido de activación, cadena ligera y propéptido de una proteasa de veneno de serpiente. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede codificar para uno o más de los dominios o regiones descritos en el presente documento.

Una molécula de ácido nucleico aislada descrita en el presente documento incluye una molécula de ácido nucleico que es un complemento, por ejemplo, un complemento completo, de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos, por ejemplo, cualquier parte que codifica para un dominio o región descrita en el presente documento. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, de modo que puede hibridarse (por ejemplo, en una condición de rigurosidad descrita en el presente documento) con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, formando de ese modo un dúplex estable.

Una molécula de ácido nucleico aislada tal como se describe en el presente documento incluye una secuencia de nucleótidos que es homóloga en al menos aproximadamente: el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la longitud entera de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, o una parte, preferiblemente de la misma longitud, de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos.

Fragmentos de ácido nucleico de la proteasa de veneno de serpiente

Una molécula de ácido nucleico dada a conocer en el presente documento puede incluir sólo una parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de este tipo puede incluir un fragmento que puede usarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica para una parte de una proteína proteasas de veneno de serpiente, por ejemplo, una parte biológicamente activa o inmunogénica de una proteína de la proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, una parte biológicamente activa o inmunogénica de una proteína de la proteasa de veneno de serpiente descrita en el presente documento. Un fragmento puede comprender aquellos nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, que codifican para, por ejemplo, un propéptido, una cadena ligera, un péptido activador, una cadena pesada, un dominio GLA, un dominio EGF-1, un dominio EGF-2 o cualquier otro dominio o región descrito en el presente documento, de proteasa de veneno de serpiente. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen de la proteasa de veneno de serpiente permite la generación de sondas y cebadores diseñados para su uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de la proteasa de veneno de serpiente,

o fragmentos de los mismos, así como homólogos de la proteasa de veneno de serpiente, o fragmentos de los mismos, de otras especies.

Opcionalmente, un ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que incluye parte, o todo, de la región codificante y se extiende en cualquier región no codificante 5’ o 3’ (o ambas). Otras alternativas incluyen un fragmento que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de aminoácidos descrito en el presente documento. Los fragmentos de ácido nucleico pueden codificar para un sitio o dominio específico descrito en el presente documento o fragmentos del mismo, particularmente fragmentos del mismo que tienen al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ó 550 aminoácidos de longitud. Los fragmentos también incluyen secuencias de ácido nucleico correspondientes a secuencias de aminoácidos específicas descritas anteriormente o fragmentos de las mismas. Los fragmentos de ácido nucleico que se dan a conocer en el presente documento no deben interpretarse como que abarcan aquellos fragmentos que pueden haberse dado a conocer antes de la invención.

Un fragmento de ácido nucleico puede incluir una secuencia correspondiente a un dominio, región o sitio funcional descrito en el presente documento. Un fragmento de ácido nucleico también puede incluir uno o más del dominio, región o sitio funcional descrito en el presente documento. Por tanto, por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico de proteasa de veneno de serpiente puede incluir una secuencia correspondiente a un dominio GLA, un dominio EGF o un dominio similar al factor Va.

Se proporcionan sondas y cebadores de proteasa de veneno de serpiente. Normalmente una sonda/cebador es un oligonucleótido purificado o aislado. El oligonucleótido normalmente incluye una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en una condición de rigurosidad descrita en el presente documento con al menos aproximadamente 7, 12 ó 15, de manera preferible aproximadamente 20 ó 25, de manera más preferible aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia antisentido o sentido de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 y/o 18, o de un mutante o variante alélica que se produce de manera natural de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18. Preferiblemente, un oligonucleótido tiene menos de aproximadamente 200, 150, 120 ó 100 nucleótidos de longitud. Las sondas o cebadores de proteasa de veneno de serpiente descritos en el presente documento se hibridan con una región de una proteasa de veneno de serpiente que codifica para el ácido nucleico pero no se hibrida con una región de factor Xa humano y/o trocarina.

La sonda o cebador puede estar unido a un soporte sólido, por ejemplo, un soporte sólido descrito en el presente documento.

Un kit de cebadores a modo de ejemplo incluye un cebador directo que se hibrida con la hebra codificante y un cebador inverso que se hibrida con la hebra no codificante. El cebador directo puede hibridarse con el codón de iniciación, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el residuo de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17. El cebador inverso puede hibridarse con el codón final, por ejemplo, el codón inmediatamente antes del codón de terminación, por ejemplo, el codón que codifica para el residuo de aminoácido 581 de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17. Opcionalmente, las temperaturas de hibridación de los cebadores directo e inverso difieren en no más de 5, 4, 3 ó 2ºC.

Opcionalmente el ácido nucleico dado a conocer en el presente documento es una sonda que tiene al menos 10, 12, 15, 18, 20 y menos de 200, más preferiblemente menos de 100, o menos de 50, nucleótidos de longitud. Debe ser idéntico o diferir en 1 ó 2, o menos de 5 ó 10 nucleótidos, de una secuencia dada a conocer en el presente documento. Si es necesaria la alineación para esta comparación, deben alinearse las secuencias para una máxima homología. Se consideran diferencias las secuencias “que sobresalen en bucle” por deleciones o inserciones o apareamientos erróneos.

Puede derivarse una sonda o un cebador de la cadena homosentido o antisentido de un ácido nucleico que codifica para: un propéptido, una cadena ligera, un péptido activador, una cadena pesada o partes de los mismos (o dominios dentro de tales regiones).

También se da a conocer un conjunto de cebadores, por ejemplo, cebadores adecuados para su uso en una PCR, que pueden usarse para amplificar una región seleccionada de una secuencia de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, un dominio, región, sitio u otra secuencia descrita en el presente documento. Los cebadores deben tener al menos 5, 10 ó 50 pares de bases de longitud y menos de 100, o menos de 200, pares de bases de longitud. Los cebadores deben ser idénticos, o diferir en una base de una secuencia dada a conocer en el presente documento o de una variante que se produce de manera natural. Por ejemplo, se proporcionan cebadores adecuados para amplificar la totalidad o una parte de cualquiera de las siguientes regiones: un propéptido, una cadena ligera, un péptido activador, una cadena pesada (o dominios y sitios dentro de esas regiones).

Un fragmento de ácido nucleico puede codificar para una región que porta un epítopo de un polipéptido descrito en el presente documento.

Puede prepararse un fragmento de ácido nucleico que codifica para una “parte biológicamente activa de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente” aislando una parte de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, que codifica para un polipéptido que tiene una actividad biológica de proteasa de veneno de serpiente (por ejemplo, las actividades biológicas de las proteínas proteasas de veneno de serpiente se describen en el presente documento), que expresa la parte codificada de la proteína proteasa de veneno de serpiente (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y que evalúa la actividad de la parte codificada de la proteína proteasa de veneno de serpiente. Un fragmento de ácido nucleico que codifica para una parte biológicamente activa de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente, puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene más de 300 o más nucleótidos de longitud.

Opcionalmente, un ácido nucleico puede incluir una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o más nucleótidos de longitud y se hibrida en una condición de rigurosidad descrita en el presente documento con una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18.

Variantes de ácido nucleico de proteasa de veneno de serpiente

Se dan a conocer adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18. Tales diferencias pueden deberse a la degeneración del código genético (y dar como resultado un ácido nucleico que codifica para las mismas proteínas proteasas de veneno de serpiente que las codificadas por la secuencia de nucleótidos dada a conocer en el presente documento). Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere, en al menos 1, pero menos de 5, 10, 20, 50 ó 100 residuos de aminoácido de la mostrada en SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17. Si es necesaria la alineación para esta comparación, deben alinearse las secuencias para una máxima homología. La proteína codificada puede diferir en no más de 5, 4, 3, 2 ó 1 aminoácidos. Se consideran diferencias las secuencias “que sobresalen en bucle” por deleciones o inserciones o apareamientos erróneos.

Pueden elegirse los ácidos nucleicos para que tengan codones, que son preferidos, o no preferidos, para un sistema de expresión particular. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser uno en el que se ha alterado al menos un codón, en preferiblemente al menos el 10% o el 20% de los codones de manera que se optimiza la secuencia para la expresión en células de E. coli, levadura, ser humano, insecto o CHO.

Pueden producirse de manera natural variantes de ácido nucleico, tales como variantes alélicas (mismo locus), homólogos (diferente locus) y ortólogos (diferente organismo) o pueden producirse de manera no natural. Pueden prepararse variantes que se producen de manera no natural mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos. Puede producirse variación en cualquiera o en ambas de las regiones codificante y no codificante. Las variaciones pueden producir sustituciones de aminoácidos tanto conservativas como no conservativas (en comparación con el producto codificado). Por ejemplo, los homólogos de ácido nucleico son ácidos nucleicos ortólogos aislados a partir de serpientes distintas de Pseudonaja textilis, Oxyuranus scutellatus, Notechis scutatus, Tropidechis carinatus y Pseudechis porphyriacus.

El ácido nucleico dado a conocer anteriormente puede diferir del de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18, por ejemplo, tal como sigue: en al menos uno pero menos de 10, 20, 30 ó 40 nucleótidos; al menos uno pero menos del 1%, 5%, 10% o el 20% de los nucleótidos en el ácido nucleico objeto. El ácido nucleico puede diferir en no más de 5, 4, 3, 2 ó 1 nucleótido. Si es necesario para este análisis, deben alinearse las secuencias para una máxima homología. Se consideran diferencias las secuencias “que sobresalen en bucle” por deleciones o inserciones o apareamientos erróneos.

Pueden identificarse ortólogos, homólogos y variantes alélicas usando métodos conocidos en la técnica. Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que es idéntica normalmente en al menos aproximadamente el 70-75%, más normalmente al menos aproximadamente el 80-85% y lo más normalmente al menos aproximadamente el 90-95% o más a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17 o un fragmento de esta secuencia y preferiblemente tiene una actividad de proteasa de veneno de serpiente. Tales moléculas de ácido nucleico pueden identificarse fácilmente ya que pueden hibridarse en una condición de rigurosidad descrita en el presente documento con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO 2, 5, 8, 11, 14, 17 ó un fragmento de las mismas. También pueden aislarse adicionalmente moléculas de ácido nucleico correspondientes a ortólogos, homólogos y variantes alélicas de los ADNc de proteasa de veneno de serpiente descritos anteriormente mediante mapeo en el mismo cromosoma o locus que el gen de proteasa de veneno de serpiente.

Las variantes preferidas incluyen las que tienen una actividad de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, una capacidad para inducir coagulación en ausencia de uno o más de calcio, fosfolípido y factor Va.

Las variantes alélicas de proteasa de veneno de serpiente incluyen proteínas tanto funcionales como no funcionales. Las variantes alélicas funcionales son variantes de secuencias de aminoácidos que se producen de manera natural de la proteína proteasa de veneno de serpiente dentro de una población que mantienen la capacidad para procesar protrombina. Las variantes alélicas funcionales sólo contendrán normalmente la sustitución conservativa de uno o más aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, o la sustitución, deleción o inserción de residuos no críticos en regiones no críticas de la proteína. Las variantes alélicas no funcionales son variantes de secuencias de aminoácidos que se producen de manera natural de la proteína proteasa de veneno de serpiente dentro de una población que no tienen la capacidad para procesar protrombina. Las variantes alélicas no funcionales contendrán normalmente una sustitución, una deleción o inserción no conservativa, o un truncamiento prematuro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, o una sustitución, inserción o deleción en residuos críticos o regiones críticas de la proteína.

Además, también se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican para otros miembros de la familia de proteasa de veneno de serpiente y, por tanto, que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de proteasa de veneno de serpiente de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 ó 18.

También pueden prepararse homólogos de ácido nucleico aislados mediante métodos que utilizan técnicas de amplificación de secuencias de ácido nucleico.

Opcionalmente, el método incluye las etapas de:

(i)

obtener un extracto de ácido nucleico a partir de una célula huésped o animal;

(ii)

crear uno o más cebadores que, opcionalmente, son degenerados en el que cada uno de dichos cebadores corresponde a una parte de un ácido nucleico aislado de la invención; y

(iii) usar dichos cebadores para amplificar, mediante una técnica de amplificación de ácido nucleico, uno o más productos de amplificación de dicho extracto de ácido nucleico.

De manera adecuada, dicho uno o más cebadores se diseñan para poder hibridarse con una o la otra cadena de un ácido nucleico bicatenario en condiciones de hibridación y extensión con cebadores usadas normalmente para la amplificación. En el caso de cebadores degenerados, se introducen de forma intencionada diferencias de secuencia entre el cebador y la secuencia de ácido nucleico aislada para tener en cuenta la posible variación de secuencia, tal como debido a degeneración en secuencias codificantes homólogas.

Se conocen bien técnicas de amplificación de ácidos nucleicos adecuadas por el destinatario experto, e incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) tal como se describe por ejemplo en el Capítulo 15 de Ausubel et al. citado anteriormente; amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) tal como se describe por ejemplo en la patente estadounidense n.º 5.422.252; replicación por círculo rodante (RCR) tal como se describe por ejemplo en la solicitud internacional WO 92/01813 y la solicitud internacional WO 97/19193; amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) tal como se describe por ejemplo por Sooknanan et al., 1994, Biotechniques 17 1077; y amplificación por replicasa Q- tal como se describe por ejemplo por Tyagi et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395, aunque sin limitación a las mismas.

Una técnica de amplificación de secuencias de ácido nucleico preferida es la PCR.

Tal como se usa en el presente documento, un “producto de amplificación” se refiere a un producto de ácido nucleico generado mediante una técnica de amplificación de ácidos nucleicos tal como se define ampliamente en el presente documento.

Un homólogo de ácido nucleico puede codificar para un homólogo de proteína. Por consiguiente, pueden usarse los métodos descritos anteriormente para aislar un homólogo de ácido nucleico para aislar un homólogo de proteína.

Polipéptidos de proteasa de veneno de serpiente aislados

Se da a conocer aún adicionalmente una proteína proteasa de veneno de serpiente aislada, o fragmento, por ejemplo, una parte biológicamente activa, para su uso como inmunógenos o antígenos para producir o someter a prueba (o más generalmente para unirse a) anticuerpos anti-proteasa de veneno de serpiente. Puede aislarse la proteína proteasa de veneno de serpiente a partir de fuentes de tejidos o células usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. Opcionalmente, la proteasa de veneno de serpiente se aísla a partir de una serpiente seleccionada del grupo de: Pseudonaja textilis, Oxyranus scutellatus, Notechis scutatus, Tropidechis carinatus y Pseudechis porphyriacus. Preferiblemente, la proteasa de veneno de serpiente se aísla a partir de la glándula de veneno de una serpiente australiana, por ejemplo, una serpiente australiana descrita en el presente documento. Puede producirse una proteína proteasa de veneno de serpiente o fragmentos de la misma mediante técnicas de ADN recombinante o sintetizarse químicamente.

Los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen los que surgen como resultado de la existencia de acontecimientos traduccionales y postraduccionales alternativos. El polipéptido puede expresarse en sistemas, por ejemplo, células cultivadas, que dan como resultado sustancialmente las mismas modificaciones postraduccionales presentes cuando se expresa el polipéptido en una célula nativa, o en sistemas que dan como resultado la alteración u omisión de modificaciones postraduccionales, por ejemplo, glicosilación o escisión, presentes cuando se expresa en una célula nativa.

Por ejemplo, un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente tiene una o más de las siguientes características:

(i)

tiene la capacidad para procesar protrombina;

(ii)

tiene un peso molecular, por ejemplo, un peso molecular deducido, preferiblemente ignorando cualquier contribución de modificaciones postraduccionales, composición de aminoácidos u otra característica física de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, un polipéptido de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17;

(iii) tiene una similitud de secuencia global de al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 70, 80, 90 o el 95%, con un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, un polipéptido de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17;

(iv) tiene una identidad de secuencia sustancial con uno o más de los dominios o regiones descritos en el presente documento, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento.

La proteína proteasa de veneno de serpiente descrita anteriormente, o fragmento de la misma, puede diferir de la correspondiente secuencia en SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17. Por ejemplo, difiere en al menos uno pero en menos de 15, 10 ó 5 residuos de aminoácido. En otro caso, difiere de la correspondiente secuencia en SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17 en al menos un residuo pero menos del 20%, 15%, 10% o el 5% de los residuos en los que difiere de la correspondiente secuencia en SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17. (Si esta comparación requiere alineación, deben alinearse las secuencias para una máxima homología. Se consideran diferencias las secuencias “que sobresalen en bucle” por deleciones o inserciones o apareamientos erróneos). Las diferencias son, preferiblemente, diferencias o cambios en un residuo no esencial o una sustitución conservativa.

Otras opciones incluyen una proteína que contiene uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, un cambio en un residuo de aminoácido que no es esencial para la actividad. Tales proteínas proteasas de veneno de serpiente difieren en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, aunque conservan la actividad biológica.

La proteína puede incluir una secuencia de aminoácidos homóloga en al menos aproximadamente el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más a la SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, y tiene una actividad biológica de proteasa de veneno de serpiente.

Por ejemplo, una parte biológicamente activa de una proteína proteasa de veneno de serpiente incluye uno o más de: un dominio GLA, un dominio EGF-1, un dominio EGF-2 y un dominio similar al factor Va. Además, pueden prepararse otras partes biológicamente activas, en las que se delecionan otras regiones de la proteína, mediante técnicas recombinantes y evaluarse para determinar una o más de las actividades funcionales de una proteína proteasa de veneno de serpiente nativa.

La proteína proteasa de veneno de serpiente descrita anteriormente puede tener una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17. Alternativamente, la proteína proteasa de veneno de serpiente es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, y conserva la actividad funcional de la proteína de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17, tal como se describió en detalle en las subsecciones anteriores. Por ejemplo, la proteína proteasa de veneno de serpiente conserva la capacidad para procesar protrombina en ausencia de uno o más de calcio, fosfolípidos y factor Va, preferiblemente conserva la capacidad para procesar protrombina en ausencia tanto de calcio como de fosfolípido.

Proteínas de fusión o quiméricas de proteasa de veneno de serpiente

También se describen proteínas de fusión o quiméricas de proteasa de veneno de serpiente. Tal como se usa en el presente documento, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” de proteasa de veneno de serpiente incluye un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente unido a un polipéptido que no es de proteasa de veneno de serpiente. Un “polipéptido que no es de proteasa de veneno de serpiente” se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que es diferente de la proteína proteasa de veneno de serpiente y que se deriva del mismo organismo o de uno diferente. El polipéptido de proteasa de veneno de serpiente de la proteína de fusión puede corresponder a la totalidad o una parte, por ejemplo, un fragmento descrito en el presente documento de una secuencia de aminoácidos de proteasa de veneno de serpiente. En un ejemplo, una proteína de fusión de proteasa de veneno de serpiente incluye al menos una (o dos) parte biológicamente activa de una proteína proteasa de veneno de serpiente. El polipéptido que no es de proteasa de veneno de serpiente puede fusionarse al extremo N-terminal o el extremo C-terminal del polipéptido de proteasa de veneno de serpiente. En otro ejemplo, el “polipéptido que no es de proteasa de veneno de serpiente” es un pro-péptido de una proteína de activación protrombótica distinta a una proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, es un propéptido del factor Xa de mamífero, por ejemplo, factor Xa humano. En un ejemplo adicional, el “polipéptido que no es de proteasa de veneno de serpiente” puede incluir un péptido activador de una proteína de activación protrombótica distinta de una proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, un péptido activador de factor Xa de mamífero, por ejemplo, factor Xa humano. Aún en otro ejemplo, el polipéptido quimérico o de fusión puede incluir un propéptido y un péptido activador de un “polipéptido que no es de proteasa de veneno de serpiente”, por ejemplo, de un polipéptido de factor Xa de mamífero, por ejemplo, un polipéptido de factor Xa humano.

La proteína de fusión puede incluir un resto que tiene una alta afinidad por un ligando. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión GST-proteasa de veneno de serpiente en la que las secuencias de proteasa de veneno de serpiente se fusionan al extremo C-terminal de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de proteasa de veneno de serpiente recombinante. Alternativamente, la proteína de fusión puede ser una proteína proteasa de veneno de serpiente que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N-terminal. En determinadas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o secreción de proteasa de veneno de serpiente puede aumentarse mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.

Las proteínas de fusión pueden incluir la totalidad o una parte de una proteína sérica, por ejemplo, una región constante de IgG o albúmina sérica humana.

Las proteínas de fusión de proteasa de veneno de serpiente descritas anteriormente pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto in vivo. Pueden usarse las proteínas de fusión de proteasa de veneno de serpiente para afectar a la biodisponibilidad de un sustrato de proteasa de veneno de serpiente.

Además, pueden usarse las proteínas de fusión de proteasa de veneno de serpiente como inmunógenos para producir anticuerpos anti-proteasa de veneno de serpiente en un sujeto, para purificar ligandos de proteasa de veneno de serpiente y en ensayos de selección para identificar moléculas que inhiben la interacción de proteasa de veneno de serpiente con un sustrato de proteasa de veneno de serpiente.

Están disponibles comercialmente vectores de expresión que ya codifican para un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica para una proteasa de veneno de serpiente puede clonarse en un vector de expresión de este tipo de manera que el resto de fusión se una en marco a la proteína proteasa de veneno de serpiente.

Variantes de proteínas proteasas de veneno de serpiente

Otro aspecto dado a conocer también caracteriza una variante de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, que funciona como agonista (mimético) o como antagonista. Pueden generarse variantes de las proteínas proteasas de veneno de serpiente mediante mutagénesis, por ejemplo, mutación puntual discreta, la inserción o deleción de secuencias o el truncamiento de una proteína proteasa de veneno de serpiente. Un agonista de las proteínas proteasas de veneno de serpiente puede conservar sustancialmente las mismas, o un subconjunto, de las actividades biológicas de la forma que se produce de manera natural de una proteína proteasa de veneno de serpiente. Un antagonista de una proteína proteasa de veneno de serpiente puede inhibir una o más de las actividades de la forma que se produce de manera natural de la proteína proteasa de veneno de serpiente mediante, por ejemplo, la modulación de forma competitiva de una actividad mediada por proteasa de veneno de serpiente de una proteína proteasa de veneno de serpiente. Por tanto, pueden provocarse efectos biológicos específicos mediante tratamiento con una variante de función limitada.

Pueden identificarse variantes de una proteína proteasa de veneno de serpiente mediante el examen de bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de una proteína proteasa de veneno de serpiente para determinar la actividad agonista o antagonista.

Pueden usarse bibliotecas de fragmentos, por ejemplo, fragmentos N-terminales, C-terminales o internos, de una secuencia que codifica para una proteína proteasa de veneno de serpiente, para generar una población variada de fragmentos para el examen y la posterior selección de variantes de una proteína proteasa de veneno de serpiente. Se prefieren particularmente variantes en las que se añade o deleciona un residuo de cisteína, en las que se añade

o deleciona un residuo de unión a calcio, por ejemplo, un residuo de ácido carboxiglutámico o asparganina, o en las que se añade o deleciona un residuo que está glicosilado.

Se conocen en la técnica métodos para el examen de productos génicos de bibliotecas combinatorias preparadas mediante mutaciones puntuales o truncamiento, y para el examen de bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales métodos pueden adaptarse para el examen rápido de las bibliotecas génicas generadas mediante mutagénesis combinatoria de proteínas proteasas de veneno de serpiente. Puede usarse la mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una nueva técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, en combinación con los ensayos de selección para identificar variantes de proteasa de veneno de serpiente (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327-331).

También se describe un método de preparación de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, un péptido que tiene una actividad de tipo no natural, por ejemplo, un antagonista, agonista o superagonista de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente que se produce de manera natural, por ejemplo, un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente que se produce de manera natural. El método incluye: alterar la secuencia de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, alterar la secuencia, por ejemplo, mediante sustitución

o deleción de uno o más residuos de una región no conservada, un dominio o residuo dado a conocer en el presente documento, y someter a prueba el polipéptido alterado para determinar la actividad deseada.

Se da a conocer adicionalmente un método de preparación de un fragmento o análogo de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente que tiene una actividad biológica de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente que se produce de manera natural. El método incluye: alterar la secuencia, por ejemplo, mediante sustitución o deleción de uno o más residuos, de un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, alterar la secuencia de una región no conservada, o un dominio o residuo descrito en el presente documento, y someter a prueba el polipéptido alterado para determinar la actividad deseada.

Anticuerpos anti-proteasa de veneno de serpiente

Puede generarse un anticuerpo anti-proteasa de veneno de serpiente, o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno del mismo). El término “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de inmunoglobulina o parte inmunológicamente activa de la misma, es decir, una parte de unión a antígeno. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una proteína que comprende al menos una, y preferiblemente dos, regiones variables de cadena pesada (H) (abreviadas en el presente documento como VH), y al menos una y preferiblemente dos regiones variables de cadena ligera (L) (abreviadas en el presente documento como VL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de complementariedad” (“CDR”), intercaladas con regiones están más conservadas, denominadas “regiones de entramado” (FR). La extensión de la región de entramado y las CDR se ha definido con precisión (véanse, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos, publicación NIH n.º 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, que se incorporan al presente documento como referencia). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

El anticuerpo anti-proteasa de veneno de serpiente puede incluir además una región constante de cadena pesada y ligera, para formar de ese modo una cadena de inmunoglobulina pesada y ligera, respectivamente. El anticuerpo puede ser un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras, mediante lo cual se interconectan las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. La región constante de cadena ligera se compone de un dominio, CL. La región variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos normalmente median la unión del anticuerpo a factores o tejidos del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inmunoglobulina” se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humanos reconocidos incluyen los genes de regiones constantes kappa, lambda, alfa (IgA1 y IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, así como la pluralidad de genes de regiones variables de inmunoglobulina. Las “cadenas ligeras” de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 KDa o 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de región variable en el extremo NH2-terminal (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el extremo COOH-terminal. Las “cadenas pesadas” de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KDa o 446 aminoácidos) están codificadas de manera similar por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de regiones constantes mencionados anteriormente, por ejemplo, gamma (que codifica para aproximadamente 330 aminoácidos).

La expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “parte de anticuerpo” o “fragmento”), tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que conservan la capacidad para unirse específicamente al antígeno, por ejemplo, polipéptido de proteasa de veneno de serpiente o fragmento del mismo. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo antiproteasa de veneno de serpiente incluyen, pero no se limitan a: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo,

(v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que les permite prepararse como una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véanse por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla también están englobados dentro de la expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y se examinan los fragmentos para determinar su utilidad de la misma manera que lo son los anticuerpos intactos.

El anticuerpo anti-proteasa de veneno de serpiente puede ser un anticuerpo policlonal o uno monoclonal. El anticuerpo puede producirse de manera recombinante, por ejemplo, producirse mediante presentación en fago o mediante métodos combinatorios.

Se conocen en la técnica métodos combinatorios y de presentación en fago para generar anticuerpos anti-proteasa de veneno de serpiente (tal como se describe, por ejemplo, en Ladner et al. patente estadounidense n.º 5,223,409; Kang et al. publicación internacional n.º WO 92/18619; Dower et al. publicación internacional n.º WO 91/17271; Winter et al. publicación internacional WO 92/20791; Markland et al. publicación internacional n.º WO 92/15679; Breitling et al. publicación internacional WO 93/01288; McCafferty et al. publicación internacional n.º WO 92/01047; Garrard et al. publicación internacional n.º WO 92/09690; Ladner et al. publicación internacional n.º WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982).

Puede prepararse un anticuerpo mediante inmunización con antígeno purificado de proteasa de veneno de serpiente, o un fragmento del mismo, por ejemplo, un fragmento descrito en el presente documento, tejido, por ejemplo, preparaciones tisulares en bruto, células completas, preferiblemente células vivas, células lisadas o fracciones celulares.

Puede usarse una proteína proteasa de veneno de serpiente de longitud completa o fragmento de péptido antigénico de una proteasa de veneno de serpiente como inmunógeno o puede usarse para identificar anticuerpos antiproteasa de veneno de serpiente preparados con otros inmunógenos, por ejemplo, células, preparaciones de membrana y similares. El péptido antigénico de proteasa de veneno de serpiente debe incluir al menos 8 residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ó 17 y engloba un epítopo de una proteasa de veneno de serpiente. Preferiblemente, el péptido antigénico incluye al menos 10 residuos de aminoácido, más preferiblemente al menos 15 residuos de aminoácido, incluso más preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácido, y lo más preferiblemente al menos 30 residuos de aminoácido. El anticuerpo anti-proteasa de veneno de serpiente puede unirse a una región, dominio o sitio de una proteasa de veneno de serpiente descrito en el presente documento. Se dan a conocer anticuerpos reactivos con, o específicos para, cualquiera de estas regiones, u otras regiones o dominios descritos en el presente documento.

Los anticuerpos pueden unirse sólo a una proteína proteasa de veneno de serpiente nativa, sólo a una proteína proteasa de veneno de serpiente desnaturalizada o de otro modo no nativa, o pueden unirse a ambas. Los anticuerpos pueden tener epítopos lineales o conformacionales. Pueden identificarse epítopos conformacionales a veces mediante la identificación de anticuerpos que se unen a proteína proteasa de veneno de serpiente nativa pero no desnaturalizada.

Ejemplos de epítopos englobados por el péptido antigénico son regiones de proteasas de veneno de serpiente que se ubican en la cadena ligera o pesada, regiones hidrófilas, así como regiones con alta antigenicidad.

Los anticuerpos pueden unirse a uno o más de antígeno purificado, tejido, por ejemplo, secciones de tejido, células completas, preferiblemente células vivas, células lisadas o fracciones celulares.

El anticuerpo anti-proteasa de veneno de serpiente puede ser un anticuerpo de cadena sencilla. Puede modificarse mediante ingeniería genética un anticuerpo de cadena sencilla (scFV) (véanse, por ejemplo, Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80; y Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52). El anticuerpo de cadena sencilla puede dimerizarse o multimerizarse para generar anticuerpos multivalentes que tienen especificidades por diferentes epítopos de la misma proteína proteasa de veneno de serpiente diana.

El anticuerpo puede acoplarse a un compuesto, por ejemplo, un marcador tal como un núcleo radiactivo, o agente de formación de imágenes, por ejemplo un agente de formación de imágenes radiactivo, enzimático u otro, por ejemplo, un agente de contraste para RMN. Se prefieren marcadores que producen emisiones radiactivas detectables o fluorescencia.

Puede usarse un anticuerpo anti-proteasa de veneno de serpiente (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) para aislar una proteasa de veneno de serpiente mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, puede usarse un anticuerpo anti-proteasa de veneno de serpiente para detectar proteína proteasa de veneno de serpiente (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína. Pueden usarse anticuerpos anti-proteasa de veneno de serpiente de forma diagnóstica para monitorizar los niveles de proteasa de veneno de serpiente en tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas. Puede facilitarse la detección mediante acoplamiento (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable (es decir, marcaje de anticuerpos). Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina, -galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos protéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. El marcador puede seleccionarse de un grupo que incluye un cromógeno, un catalizador, una enzima, un fluoróforo, una molécula quimioluminiscente, un ion lantánido tal como europio (Eu34), a radioisótopo y un marcador visual directo. En el caso de un marcador visual directo, puede hacerse uso de una partícula coloidal metálica o no metálica, una partícula de colorante, una enzima o un sustrato, un polímero orgánico, una partícula de látex, un liposoma u otra vesícula que contenga una sustancia productora de señales y similares.

Se da a conocer un gran número de enzimas útiles como marcadores en las memorias descriptivas de patente estadounidense U.S. 4.366.241, U.S. 4.843.000 y U.S. 4.849.338. Los marcadores enzimáticos útiles en la presente invención incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano picante, luciferasa, -galactosidasa, glucosa oxidasa, lisozima, malato deshidrogenasa y similares. Puede usarse el marcador enzimático solo o en combinación con una segunda enzima en disolución.

Vectores de expresión recombinantes, células huésped y células modificadas mediante ingeniería genética

Se dan a conocer adicionalmente vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido y puede incluir un plásmido, cósmido o vector viral. El vector puede dar replicación autónoma o puede integrarse en el ADN de un huésped. Los vectores virales incluyen, por ejemplo, virus adenoasociados, adenovirus y retrovirus de replicación defectuosa.

Un vector puede incluir un ácido nucleico de proteasa de veneno de serpiente en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Preferiblemente, el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras operativamente unidas a la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse. La expresión “secuencia reguladora” incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, así como secuencias inducibles y/o reguladoras específicas de tejido. El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado y similares. Los vectores de expresión dados a conocer en el presente documento pueden introducirse en células huésped para producir de ese modo proteínas o polipéptidos, incluyendo polipéptidos o proteínas de fusión, codificados por ácidos nucleicos tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, proteínas proteasas de veneno de serpiente, proteínas de fusión y similares).

Los vectores de expresión recombinantes descritos anteriormente pueden diseñarse para la expresión de proteínas proteasas de veneno de serpiente en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, pueden expresarse polipéptidos de la invención en células de E. coli, de insecto (por ejemplo, usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Se tratan adicionalmente las células huésped adecuadas en Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. Alternativamente, puede transcribirse el vector de expresión recombinante y traducirse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y polimerasa de T7.

De la manera más frecuente, se lleva a cabo la expresión de proteínas en procariotas en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas o bien de fusión o bien que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, habitualmente al extremo amino-terminal de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión sirven normalmente para tres fines: 1) aumentar la expresión de proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en purificación por afinidad. A menudo, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión de forma posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Maximizar la expresión de proteína recombinante en E. coli es expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad dañada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que va a insertarse en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido son los utilizados preferentemente en E. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteración de secuencias de ácidos nucleicos de la invención puede llevarse a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales.

El vector de expresión de proteasa de veneno de serpiente puede ser un vector de expresión de levadura, un vector para la expresión en células de insecto, por ejemplo, un vector de expresión de baculovirus o un vector adecuado para la expresión en células de mamífero.

Cuando se usa en células de mamífero, pueden proporcionarse funciones de control del vector de expresión mediante elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores usados comúnmente se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus del simio 40.

El promotor puede ser un promotor inducible, por ejemplo, un promotor regulado por una hormona esteroidea, por una hormona polipeptídica (por ejemplo, por medio de una ruta de transducción de señales), o por un polipéptido heterólogo (por ejemplo, los sistemas inducibles por tetraciclina, “Tet-On” y “Tet-Off’; véanse, por ejemplo, Clontech Inc., CA, Gossen y Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547, y Paillard (1989) Human Gene Therapy 9:983).

En otro ejemplo, el vector de expresión de mamífero recombinante puede dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los ejemplos no limitativos de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor del neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916) y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotor del suero de la leche; patente estadounidense n.º 4.873.316 y publicación de solicitud europea n.º 264.166). También se contemplan promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de la -fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

Cuando se usa en una célula de mamífero, el vector de expresión puede proporcionar la expresión de la cadena ligera y la cadena pesada de la proteasa de veneno de serpiente y la expresión de un dominio de propéptido y/o péptido de activación de un polipéptido que no es de proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, una proteína proteasa que no es de veneno de serpiente activadora de protrombina, por ejemplo, un propéptido y/o péptido de activación de un factor X de mamífero, por ejemplo, factor X humano.

También se da a conocer un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN descrita en el presente documento clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Pueden elegirse secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores y/o potenciadores virales) operativamente unidas a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejido o específica del tipo de célula de un ARN antisentido en una variedad de tipos de células. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado.

Otro aspecto dado a conocer proporciona una célula huésped que incluye una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de proteasa de veneno de serpiente dentro de un vector de expresión recombinante o una molécula de ácido nucleico de proteasa de veneno de serpiente que contiene secuencias que le permiten recombinarse de manera homóloga en un sitio específico del genoma de la célula huésped. “Células huésped” y “célula huésped recombinante” se usan de manera intercambiable en el presente documento. Tales expresiones no se refieren sólo a la célula objeto particular sino a la progenie o posible progenie de tal célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en posteriores generaciones debido o bien a mutación o bien a influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula original, pero todavía está incluida dentro del alcance de la expresión tal como se usa en el presente documento.

Una célula huésped puede ser cualquier célula eucariota o procariota. Por ejemplo, una proteína proteasa de veneno de serpiente puede expresarse en células bacterianas (tales como E. coli), células de insecto, levadura o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS (células de riñón de mono verde africano, células CV-1 de origen SV40; Gluzman (1981) CellI23:175-182)). Otras células huésped adecuadas las conocen los expertos en la técnica.

Puede introducirse ADN de vector en células huésped mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se usa en el presente documento, los términos “transformación” y “transfección” pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación.

Puede usarse una célula huésped para producir (es decir, expresar) una proteína proteasa de veneno de serpiente. Por consiguiente, también se describen métodos para producir una proteína proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, una proteína proteasa de veneno de serpiente descrita en el presente documento, usando las células huésped. Por ejemplo, el método incluye cultivar la célula huésped (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica para una proteína proteasa de veneno de serpiente) en un medio adecuado de manera que se produce una proteína proteasa de veneno de serpiente. El método puede incluir además aislar una proteína proteasa de veneno de serpiente del medio o la célula huésped.

También se contempla una célula humana, por ejemplo, una célula madre hematopoyética, transformada con ácido nucleico que codifica para un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente objeto.

Informática

Se proporciona la secuencia de una proteasa de veneno de serpiente en una variedad de medios para facilitar el uso de la misma. Puede proporcionarse una secuencia grabada, en contraposición a una proteína o ácido nucleico, como un producto fabricado. Tal producto fabricado puede proporcionar una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, por ejemplo, un marco de lectura abierto, en una forma que permite el examen, por ejemplo, mediante programas de análisis de secuencias o mediante inspección directa, del producto fabricado usando medios no aplicables directamente al examen de secuencias de nucleótidos o aminoácidos, o un subconjunto de las mismas, tal como existen en la naturaleza o en forma purificada. La información de secuencia puede incluir, pero no se limita a, secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de longitud completa de SVP, secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos parciales, secuencias polimórficas incluyendo polimorfismos de un único nucleótido (SNP), secuencia de epítopo o dominio, y similares. En un ejemplo, el producto fabricado es un medio legible por ordenador, por ejemplo, un dispositivo de almacenamiento de información magnético, óptico, químico o mecánico.

Tal como se usa en el presente documento, “medios legibles por ordenador” se refiere a cualquier medio que puede leer y acceder al mismo directamente un ordenador, por ejemplo, un ordenador digital u ordenador analógico. Los ejemplos no limitativos de un ordenador incluyen un PC de sobremesa, ordenador portátil, ordenador central, servidor (por ejemplo, un servidor web, servidor de red o conjunto de servidores), asistente digital portátil, buscapersonas, teléfono móvil y similares. El ordenador puede ser autónomo o estar conectado a una red de comunicaciones, por ejemplo, una red de área local (tal como una VPN o intranet), una red de área amplia (por ejemplo, una Extranet o Internet), o una red telefónica (por ejemplo, una red inalámbrica, DSL o ISDN). Los medios legibles por ordenador incluyen, pero no se limitan a: medios de almacenamiento magnéticos, tales como disquetes, medio de almacenamiento de disco duro y cinta magnética; medios de almacenamiento ópticos tales como CDROM; medios de almacenamiento eléctricos tales como RAM, ROM, EPROM, EEPROM, memoria flash y similares; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos.

Está disponible una variedad de estructuras de almacenamiento de datos para un experto para crear un medio legible por ordenador que tiene grabado en el mismo una secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la presente invención. La elección de la estructura de almacenamiento de datos se basará generalmente en los medios elegidos para acceder a la información almacenada. Además, puede usarse una variedad de programas y formatos de procesador de datos para almacenar la información de secuencia de nucleótidos de la presente invención en un medio legible por ordenador. La información de secuencia puede representarse en un archivo de texto de tratamiento de textos, formateado en software disponible comercialmente tal como WordPerfect y Microsoft Word, o representarse en forma de un archivo ASCII, almacenado en una aplicación de bases de datos, tal como DB2, Sybase, Oracle o similares. El experto puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos de estructuración de procesador de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) para obtener un medio legible por ordenador que tiene grabado en el mismo la información de secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento.

La información de secuencia puede almacenarse en una base de datos relacional (tal como Sybase u Oracle). La base de datos puede tener una primera tabla para almacenar información de secuencia (secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos). La información de secuencia puede almacenarse en un campo (por ejemplo, una primera columna) de una fila de la tabla y puede almacenarse un identificador para la secuencia en otro campo (por ejemplo, una segunda columna) de la fila de la tabla. La base de datos puede tener una segunda tabla, por ejemplo, que almacena anotaciones. La segunda tabla puede tener un campo para el identificador de secuencia, un campo para un descriptor o texto de anotación (por ejemplo, el descriptor puede referirse a una funcionalidad de la secuencia, un campo para la posición inicial en la secuencia a la que se refiere la anotación y un campo para la última posición en la secuencia a la que se refiere la anotación. Los ejemplos no limitativos de anotaciones a la secuencia de aminoácidos incluyen dominios de polipéptido, por ejemplo, un dominio descrito en el presente documento; sitios activos y otros aminoácidos funcionales; y sitios de modificación.

Mediante la provisión de las secuencias de nucleótidos o aminoácidos dadas a conocer en el presente documento en forma legible por ordenador, el experto puede acceder de manera rutinaria a la información de secuencia para una variedad de fines. Por ejemplo, un experto en la técnica puede usar las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de la invención en forma legible por ordenador para comparar una secuencia diana o motivo estructural diana con la información de secuencia almacenada dentro de los medios de almacenamiento de datos. Se usa una búsqueda para identificar fragmentos o regiones de las secuencias de la invención que coinciden con una secuencia diana o motivo diana particular. La búsqueda puede ser una búsqueda BLAST u otra comparación de secuencias de rutina, por ejemplo, una búsqueda descrita en el presente documento.

Por tanto, también se describe un método de análisis de una secuencia de SVP, por ejemplo, el análisis de la estructura, función o relación con una o más secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos. El método incluye: proporcionar una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de SVP; comparar la secuencia de SVP con una segunda secuencia, por ejemplo, una o más, preferiblemente una pluralidad, de secuencias de una colección de secuencias, por ejemplo, una base de datos de secuencias de ácido nucleico o de proteína para analizar de ese modo SVP. El método puede realizarse en una máquina, por ejemplo, un ordenador, o manualmente por parte de un experto.

El método puede incluir evaluar la identidad de secuencia entre una secuencia de SVP y una segunda secuencia, por ejemplo, una secuencia de una base de datos. El método puede realizarse accediendo a la base de datos en un segundo sitio, por ejemplo, en Internet.

Tal como se usa en el presente documento, una “secuencia diana” puede ser cualquier secuencia de ADN o de aminoácidos de seis o más nucleótidos o dos o más aminoácidos. Un experto puede reconocer que cuanto más larga es una secuencia diana, es menos probable que una secuencia diana esté presente como aparición al azar en la base de datos. Longitudes de secuencia típicas de una secuencia diana son de desde aproximadamente 10 hasta 100 aminoácidos o desde aproximadamente 30 hasta 300 residuos de nucleótido. Sin embargo, está bien reconocido que los fragmentos importantes desde un punto de vista comercial, tales como fragmentos de secuencias implicados en la expresión génica y el procesamiento de proteínas, pueden ser de longitud más corta.

Está disponible para el público software informático que permite que un experto acceda a la información de secuencia proporcionada en un medio legible por ordenador para el análisis y la comparación con otras secuencias. Se da a conocer para el público una variedad de algoritmos conocidos y una variedad de software disponible comercialmente para realizar medios de búsqueda y pueden usarse en los sistemas basados en ordenador de la presente invención. Los ejemplos de tal software incluyen, pero no se limitan a, MacPattern (EMBL), BLASTN y BLASTX (NCBI).

Por tanto, también se da a conocer un método de realización de una grabación legible por ordenador de una secuencia de una secuencia de SVP que incluye grabar la secuencia en un alineamiento legible por ordenador. La grabación puede incluir una o más de las siguientes: identificación de un ORF; identificación de un dominio, región o sitio; identificación del inicio de la transcripción; identificación del terminador de la transcripción; la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína, o una forma madura de la misma; el extremo 5’ de la región traducida.

Se describe un método de análisis de una secuencia. El método incluye: proporcionar una secuencia de SVP, o grabación, en forma legible por ordenador; comparar una segunda secuencia con la secuencia de SVP, por ejemplo, analizar la secuencia de SVP para determinar la presencia o ausencia de un motivo o dominio particular; analizando de ese modo una secuencia. La comparación puede incluir comparar con secuencias para determinar la identidad de secuencia o determinar si una secuencia está incluida dentro de las otras, por ejemplo, determinar si la secuencia de SVP incluye una secuencia con la que está comparándose. La segunda secuencia o de SVP puede almacenarse en un primer ordenador, por ejemplo, en un primer sitio y se realiza la comparación, se lee o se graba en un segundo ordenador, por ejemplo, en un segundo sitio. Por ejemplo, la segunda secuencia o de SVP puede almacenarse en una base de datos pública o privada en un ordenador, y los resultados de la comparación realizarse, leerse o grabarse en un segundo ordenador. La grabación puede incluir una o más de las siguientes: identificación de un ORF; identificación de un dominio, región o sitio; identificación del inicio de la transcripción; identificación del terminador de la transcripción; la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína, o una forma madura de la misma; el extremo 5’ de la región traducida.

Bibliotecas

Se dan a conocer adicionalmente bibliotecas de ácidos nucleicos o proteínas derivadas de una de las serpientes dadas a conocer en el presente documento, por ejemplo, una serpiente marrón, taipán del interior, taipán de la costa, de vientre rojo, tigre o escamas rugosas. Las bibliotecas de ácidos nucleicos pueden ser bibliotecas de ADNc

o genómico. Las bibliotecas de ADNc pueden derivarse de tejidos particulares, por ejemplo, tejidos de la glándula de veneno. Una biblioteca incluirá normalmente al menos 102, 103, 104, 105 o más elementos diversos. Los elementos de la biblioteca de ácidos nucleicos pueden insertarse en vectores, por ejemplo, vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión inducibles.

Pueden presentarse los elementos de bibliotecas de proteínas de varias maneras, por ejemplo, en sistemas de presentación en fago o presentación en célula.

Alineamientos y usos de los mismos

También caracterizado en el presente documento es un alineamiento que incluye un sustrato que tiene una pluralidad de direcciones. El alineamiento puede ser un alineamiento de ácidos nucleicos o un alineamiento de proteínas. Un alineamiento de ácidos nucleicos puede presentar una biblioteca de ácidos nucleicos de una o más de las serpientes a las que se hace referencia en el presente documento. Un alineamiento de proteínas puede presentar un miembro de una biblioteca de proteínas, polipéptidos o péptidos de una o más de las serpientes a las que se hace referencia en el presente documento. Se colocan miembros de proteínas o ácidos nucleicos en direcciones identificables en el alineamiento. El alineamiento puede tener una densidad de al menos de 10, 50, 100, 200, 500, 1.000, 2.000 ó 10.000 o más direcciones/cm2, e intervalos entremedias. La pluralidad de direcciones puede incluir al menos 10, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, 50.000 direcciones o la pluralidad de direcciones incluye igual a o menos de 10, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000 ó 50.000 direcciones. El sustrato puede ser un sustrato bidimensional tal como un portaobjetos de vidrio, una oblea (por ejemplo, de sílice o plástico), una placa para espectroscopía de masas, o un sustrato tridimensional tal como una almohadilla de gel. Pueden disponerse en el alineamiento direcciones además de la dirección de la pluralidad.

Al menos una dirección de la pluralidad puede incluir una sonda de captura de ácido nucleico que se hibrida específicamente con un miembro de una biblioteca de ácidos nucleicos, por ejemplo, la cadena homosentido o antisentido. Por ejemplo, un subconjunto de direcciones de la pluralidad de direcciones tiene una sonda de captura de ácido nucleico para un miembro de una biblioteca de ácidos nucleicos. Cada dirección del subconjunto puede incluir una sonda de captura que se hibrida con una región diferente de un miembro de la biblioteca.

Puede generarse un alineamiento mediante diversos métodos, por ejemplo, mediante métodos fotolitográficos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.143.854; 5.510.270; y 5.527.681), métodos mecánicos (por ejemplo, métodos de flujo dirigido tal como se describe en la patente estadounidense n.º 5.384.261), métodos basados en agujas (por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.º 5.288.514) y técnicas basadas en perlas (por ejemplo, tal como se describe en el documento PCT US/93/04145).

Al menos una dirección de la pluralidad puede incluir una sonda de captura de polipéptido que se une específicamente a un polipéptido de SVP o fragmento del mismo. El polipéptido puede ser una pareja de interacción que se produce de manera natural de un polipéptido de SVP. Preferiblemente, el polipéptido es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo descrito en el presente documento (véase “Anticuerpos anti-SVP,” anteriormente), tal como un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo de cadena sencilla.

Composiciones farmacéuticas

Se describen además composiciones farmacéuticas que incluyen un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” incluye disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retardo de la absorción e isotónicos, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Estos portadores pueden seleccionarse de un grupo no limitativo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, disoluciones tamponadas con fosfato, emulsionantes, polietilenglicol y diferentes pesos moleculares del mismo, solución salina isotónica y sales tales como sales de ácidos minerales incluyendo clorhidratos, bromuros y sulfatos, ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos y malonatos y agua libre de pirógenos.

Una referencia útil que describe portadores, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables es Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991). También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden usarse para promover o facilitar de otro modo la coagulación de la sangre. Los ejemplos de uso incluyen administración a heridas sangrantes tales como durante cirugía o tras una lesión o traumatismo.

En un aspecto, un polipéptido de proteasa de veneno de serpiente es el único componente de coagulación de la sangre presente en la composición farmacéutica. Una ventaja de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente es que la coagulación de la sangre se produce rápidamente sin necesidad de una acción secuencial o combinatoria de una pluralidad de componentes tales como cofactores. Por ejemplo, no se requieren componentes adicionales tales como iones calcio, factor Va y fosfolípidos. Por tanto, opcionalmente, la composición farmacéutica no incluye ningún cofactor, por ejemplo, ninguno de calcio, un fosfolípido, factor Va o vitamina K. Alternativamente, la composición farmacéutica puede incluir uno o más, pero no todos, de calcio, un fosfolípido y factor Va.

La composición farmacéutica puede incluir un adyuvante o componente adicional. Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de: un antimicrobiano, por ejemplo, un antibiótico, un antiviral, un antifúngico, un agente antiparasitario, un agente antiinflamatorio, un antihistamínico, un agente antifibrolítico y un factor de crecimiento. Los ejemplos de antibióticos incluyen tetraciclina, ciprofloxacino, gentamicina, ciclosporina, cefotaxima y similares. Los ejemplos de antivirales incluyen ganciclovir, zidovudina, amantidina, vidarabina, ribaravina, trifluridina, aciclovir, didesoxiuridina y similares. Los antifúngicos incluyen, pero no se limitan a, Diflucan, ketoconazol, nistatina y similares. Pueden incluirse agentes antiparasitarios tales como pentamidina. La composición puede incluir además un agente antiinflamatorio tal como I-1-anti-tripsina, I-1-antiquimiotripsina y similares. Ejemplos de factores de crecimiento que pueden incluirse en la composición son factores de crecimiento que promueven la cicatrización de heridas, incluyendo, pero sin limitarse a, angiogeninas; endotelinas; factor de crecimiento de hepatocitos y factor de crecimiento de queratinocitos; factores de crecimiento de fibroblastos, incluyendo factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2) y factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4); factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF); factores de crecimiento de unión a insulina (IGF), incluyendo factor de crecimiento de unión a insulina 1 y factor de crecimiento de unión a insulina 2; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factores de crecimiento transformantes (TGF), incluyendo factor de crecimiento imagen1

transformante I y factor de crecimiento transformante ; factores inductores de cartílago (CIF), incluyendo CIP-A y CIP-B; factor inductor de osteoide (OIF); osteogenina y otros factores de crecimiento óseo; factores de crecimiento morfogenéticos óseos (BMP), incluyendo BMP-1 y BMP-2; factor de crecimiento de colágeno; factores de crecimiento de unión a heparina, incluyendo factor de crecimiento de unión a heparina 1 y factor de crecimiento de unión a heparina 2; citocinas; interferones; hormonas. Otros compuestos que pueden incluirse en la composición incluyen: agentes vasoconstrictores tales como adrenalina, o anestésicos, por ejemplo, anestésicos locales.

La composición farmacéutica puede formularse para promover la estabilidad de la proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, para reducir la digestión, por ejemplo, autodigestión, de la proteasa de veneno de serpiente. Puede promoverse la estabilidad de la proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, preparando la provisión de la proteasa de veneno de serpiente en una composición farmacéutica que tiene un pH de aproximadamente 5 a 9, preferiblemente de aproximadamente 6,5 a 7. También puede estabilizarse la estabilidad de la proteasa de veneno de serpiente mediante la provisión de la proteasa de veneno de serpiente en una composición farmacéutica que incluye además, por ejemplo, un estabilizador, tal como un poliol. En tales realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir aproximadamente el 5%, 10%, 20% o más de un poliol (o polioles). Un ejemplo de un poliol que puede usarse en la composición farmacéutica es glicerol. En otros aspectos, puede aumentarse la estabilidad de la proteasa de veneno de serpiente mediante la provisión de la proteasa de veneno de serpiente en una forma cristalizada, secada por congelación o liofilizada. Si se congela la composición, la composición debe descongelarse antes del momento de uso. También se da a conocer una composición que incluye una proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, una proteasa de veneno de serpiente descrita en el presente documento, y que tiene un pH de aproximadamente 5 a 9, preferiblemente de aproximadamente 6,5 a 7 y una composición que incluye una proteasa de veneno de serpiente, por ejemplo, una proteasa de veneno de serpiente descrita en el presente documento, y un agente estabilizante, por ejemplo, un poliol, por ejemplo, glicerol. El poliol puede estar presente a aproximadamente el 5%, 10% o el 20%.

La dosificación de la composición que comprende la proteasa de veneno de serpiente depende del uso particular de la proteasa de veneno de serpiente, pero la dosificación debe ser una cantidad eficaz para que la composición realice su uso pretendido. Pueden usarse datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios con animales en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. Generalmente, para una composición que comprende una proteasa de veneno de serpiente que es una disolución acuosa, se cree que desde aproximadamente 1 ml hasta aproximadamente 50 ml de tal composición es suficiente para aumentar la formación de coágulos de fibrina. Sin embargo, dependiendo del uso de la composición, la dosificación puede oscilar entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 200 ml.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de forma tópica a una herida, incisión quirúrgica u otra ubicación en la que va a prevenirse la pérdida de sangre. Para este fin, vendajes, parches, gasa, esparadrapo quirúrgico, bastoncillos de algodón u otros materiales absorbentes o matrices de soporte pueden recubrirse, impregnarse o unirse químicamente con una composición que incluye una proteasa de veneno de serpiente de la invención para administración tópica. También se contemplan composiciones farmacéuticas en forma de un adhesivo de fibrina o sellante quirúrgico. Las composiciones pueden estar en forma de cremas, lociones, geles, pulverizaciones o aerosoles para el cierre de heridas laparoscópicas o quirúrgicas abiertas o traumáticas. Es deseable la administración tópica en estas aplicaciones. Además, pueden usarse suturas o grapas recubiertas o unidas químicamente con una composición que incluye una proteasa de veneno de serpiente.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar incluidas en un envase, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración.

También se contempla que pueden añadirse agentes antifibrinolíticos para prevenir la lisis del coágulo de sangre a través de la acción de un activador de plasminógeno tisular tal como textilinina tal como se describe en la publicación internacional WO 99/58569, aprotinina y EACA.

También se describen kits que comprenden una proteasa de veneno de serpiente o parte de la misma descrita en el presente documento. El kit puede incluir uno o más de otros elementos incluyendo: instrucciones para su uso; otros reactivos, por ejemplo, uno o más cofactores (por ejemplo, uno o más de calcio, un fosfolípido y factor Va), y/u otros agentes terapéuticos (por ejemplo, uno o más de: un antimicrobiano, por ejemplo, un antibiótico, un antiviral, un antifúngico, un agente antiparasitario, un agente antiinflamatorio, un antihistamínico, un agente antifibrolítico, un analgésico y un factor de crecimiento); un diluyente; dispositivos, por ejemplo, envases, por ejemplo, envases estériles, u otros materiales para preparar la proteasa de veneno de serpiente para su administración; portadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, un estabilizador); y dispositivos u otros materiales para su administración a un sujeto (por ejemplo, jeringas, aplicadores, vendajes, dispositivos de pulverización o aerosol). Las instrucciones pueden incluir instrucciones para la aplicación terapéutica incluyendo dosificaciones y/o modos de administración sugeridos, por ejemplo, en un paciente con hemorragia externa y/o interna. En algunas aplicaciones, la proteasa de veneno de serpiente reaccionará con otros componentes, por ejemplo, uno o más cofactores, antes de la administración. En otras aplicaciones, la proteasa de veneno de serpiente puede administrase en combinación con otros componentes, por ejemplo, uno o más cofactores, y el kit puede incluir instrucciones sobre la cantidad, dosificación y momento de administración de la proteasa de veneno de serpiente y los demás componentes.

La proteasa de veneno de serpiente puede suministrarse en forma liofilizada o forma secada por congelación. Por ejemplo, el kit puede incluir uno o más de: instrucciones para descongelar y/o hidrolizar, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. El kit puede incluir instrucciones para un diluyente o una cantidad medida previamente de un diluyente.

Usos

Se ha encontrado que las proteasas de veneno de serpiente descritas anteriormente activan eficazmente la protrombina mediante el procesamiento de protrombina a trombina. La trombina es una serina proteasa que escinde fibrinógeno para generar fibrina, y puede actuar sobre varios factores sanguíneos incluyendo los factores V, VIII y XIII para estabilizar la interacción entre monómeros de fibrina, potenciando de ese modo la formación de coágulos. Por consiguiente, se describen métodos de activación de protrombina y aumento de la hemostasia mediante la administración de las proteasas de veneno de serpiente descritas en el presente documento. El método puede incluir: administrar una proteasa de veneno de serpiente en un sitio deseado en un sujeto en una cantidad eficaz para promover o aumentar la formación de coágulos de fibrina, para aumentar de ese modo la coagulación y/o disminuir la pérdida de sangre o fluido. La expresión “sitio deseado” se refiere a una ubicación en la que se desea la formación de un coágulo de fibrina. Las composiciones pueden aplicarse directamente a la herida, otro tejido u otro sitio deseado. Normalmente para heridas externas, puede aplicarse directamente mediante cualquier medio, incluyendo pulverización de la herida. También puede aplicarse internamente, tal como durante una intervención quirúrgica.

En realizaciones preferidas, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano. Puesto que las proteasas de veneno de serpiente descritas en el presente documento no proceden de sangre, se mitigan las preocupaciones referentes al riesgo de patógenos transmitidos por la sangre u otros agentes infecciosos que pueden encontrarse en sellantes, adhesivos y hemostáticos obtenidos a partir de componentes sanguíneos.

Las proteasas de veneno de serpiente y composiciones que comprenden las proteasas de veneno de serpiente descritas en el presente documento pueden usarse en diversas aplicaciones incluyendo como sellante quirúrgico, adhesivo (por ejemplo, un adhesivo tópico o quirúrgico) o como hemostático.

Los métodos, kits o composiciones farmacéuticas descritos en el presente documento pueden usarse, por ejemplo, para conectar tejidos u órganos, detener o reducir la hemorragia, prevenir o inhibir la hemorragia, cicatrizar heridas, y/o sellar una herida. Los métodos, kits y las composiciones farmacéuticas pueden usarse en diversas prácticas quirúrgicas incluyendo: cirugía del sistema nervioso; cirugía de la nariz, boca o faringe; cirugía del sistema respiratorio; cirugía del sistema cardiovascular; cirugía de los sistemas hematológico o linfático; cirugía del sistema digestivo; cirugía del sistema urinario; cirugía del sistema reproductor; cirugía del sistema musculoesquelético; cirugía del sistema tegumentario; cirugía plástica; cirugía ortopédica y cirugía de trasplantes. Por ejemplo, las proteasas de veneno de serpiente pueden usarse en cirugía vascular incluyendo proporcionar hemostasis para la hemorragia por los huecos de los puntos de anastomosis de arterias coronarias distales; líneas de sutura de ventrículo izquierdo; sitios de canulación y aortotomía; hemorragia epimiocárdica difusa observada en nuevas operaciones; y supuración de sitios de hemorragia venosa, por ejemplo a los niveles auricular, de la cava o ventricular derecho. La invención objeto también es útil para el sellado de injertos arteriales con Dacron antes del injerto, el sellado de tejidos fuera del organismo, la detención de la hemorragia de bazos (salvando de ese modo el órgano), hígados y otros órganos parenquimatosos dañados; el sellado de anastomosis traqueales y bronquiales y fugas de aire o laceraciones del pulmón, el sellado de muñones bronquiales, fístulas bronquiales y fístulas esofágicas; y para la cicatrización sin costuras y sin suturas (técnica “Zipper”). La invención objeto es útil además para proporcionar hemostasis en trasplantes corneales, hemorragias nasales, hemorragias posamigdalectomía, extracciones dentales y otras aplicaciones. Véase G. F. Gestring y R. Lermer, Vascular Surgery, 294-304, septiembre/octubre de 1983. Además, las composiciones farmacéuticas de la invención son especialmente adecuadas para individuos con defectos de la coagulación tales como hemofilia (por ejemplo, hemofilia A y hemofilia B).

También se ha descubierto que a diferencia del factor Xa y la trocarina, las proteasas de veneno de serpiente descritas en el presente documento pueden activar descarboxiprotrombina. La descarboxiprotrombina se encuentra, por ejemplo, en sujetos que están tratándose con anticoagulantes tales como cumadina. Por tanto, los métodos, kits y las composiciones farmacéuticas descritos anteriormente pueden usarse para activar la protrombina y aumentar la hemostasia en sujetos que están tratándose con un anticoagulante tal como cumadina. Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento pueden usarse en estos sujetos durante cirugía o traumatismo sin necesidad de inhibir o disminuir el tratamiento con cumadina.

Tal como se comentó anteriormente, la proteasa de veneno de serpiente puede formularse como parte de un apósito, vendaje, parche, gasa, esparadrapo quirúrgico, bastoncillos de algodón u otros materiales absorbentes o matrices de soporte. El apósito y vendaje están listos para usar, no requiriendo ninguna habilidad o conocimiento técnico avanzado para su manejo. Incluso pueden autoadministrarse como una medida de primeros auxilios de emergencia. Tales apósitos y vendajes pueden usarse en diversas aplicaciones de campo, tales como en paquetes para traumatismos para soldados, trabajadores de rescate, equipos paramédicos/de ambulancia, bomberos y en el tratamiento de primeros auxilios y traumatismo temprano por personal de urgencias en hospitales y clínicas, particularmente en situaciones de catástrofes. Tales apósitos también pueden tener utilidad en kits de primeros auxilios para su uso por el público general o por profesionales médicos. El apósito o vendaje que contiene proteasa de veneno de serpiente puede incluir además uno o más de calcio, un fosfolípido, un agente estabilizante u otro compuesto o agente tal como los descritos en el presente documento. Por ejemplo, el apósito o vendaje puede incluir adicionalmente: un analgésico, un antiviral, un antifúngico, un agente antiparasitario, un agente antiinflamatorio, un antihistamínico, un agente antifibrinolítico y un factor de crecimiento.

Puede añadirse a la composición más de un compuesto distinto de la proteasa de veneno de serpiente, para liberarse simultáneamente, o cada uno puede liberarse de una manera de liberación en el tiempo predetermina. El compuesto (o compuestos) adicional(es) añadido(s) a la composición puede(n) añadirse a una concentración tal que sea eficaz para su fin pretendido, por ejemplo, un antibiótico inhibirá el crecimiento de microbios, un analgésico aliviará el dolor, etc. En algunas realizaciones, el apósito o vendaje puede incluir una cada adhesiva y/o una capa de refuerzo. El refuerzo del apósito o vendaje puede ser de materiales convencionales, no absorbibles, por ejemplo, un parche de silicona o material plástico; o puede ser de materiales biocompatibles, reabsorbibles, por ejemplo, quitina

o sus derivados.

Para otras aplicaciones tales como para su uso como sellante quirúrgico o adhesivo quirúrgico, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de un adhesivo de fibrina o sellante quirúrgico que puede estar en forma de cremas, lociones, geles, pulverizaciones, espuma o aerosoles. Para espumas, pulverizaciones y aerosoles, la composición puede almacenarse en un depósito o tanque con un propelente a presión, de modo que los componentes se suministran al sitio de la herida como una pulverización o espuma expansible. En una realización preferida, la pulverización, espuma o aerosol se proporciona en una dosis medida. En tales realizaciones, los métodos pueden incluir proporcionar a un sujeto la pulverización, aerosol o espuma en una dosis medida y proporcionar al sujeto instrucciones para administrar la pulverización, aerosol o espuma, por ejemplo, a una herida. Las instrucciones pueden ser para autoadministración o administración a otras personas.

Aunque la velocidad con la que la composición forma coágulos puede estar dictada en cierto grado por la aplicación, por ejemplo, un entorno rápido para heridas arteriales y daño tisular hemorrágico, un entorno más lento para el tratamiento de heridas en tejido óseo, preferiblemente, la coagulación es evidente en el plazo de diez minutos tras la aplicación. Lo más preferiblemente, la coagulación será evidente en el plazo de dos a ocho minutos tras la aplicación.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos.

EJEMPLOS

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Se preparó un complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón mediante un método tal como se describe en Masci et al., 1988, Biochem. Int. 17 825, incorporado al presente documento como referencia. Se almacenaron 4 mg/ml de activador de protrombina en glicerol al 50% a -20ºC. Se obtuvo Sephacryl S-300 de Amersham Pharmacia Biotech., Uppsala, Suecia, y se obtuvo el sustrato cromogénico sintético S-2222 de Chromogenex, Estocolmo, Suecia. Se obtuvo plasma citratado caducado de voluntarios examinados con respecto al virus normales puesto a disposición por el banco de sangre del Princess Alexandra Hospital. Se obtuvieron kits de examen Hampton 1 y 2 de Hampton Research, Estados Unidos de América. Se obtuvieron kits de examen Wizard 1 y 2 de Emerald Biostructures, Reino Unido.

Purificación de proteasa de veneno de serpiente marrón

ConA-Sepharose 4B

La primera etapa en la purificación de proteasa de veneno de la serpiente P. textilis era aislar el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón a partir de veneno en bruto, tal como se describe en Masci et al., 1988, citado anteriormente. Se rellenó Con A-Sepharose 4B en una columna de 2,5 x 16 cm, se lavó tal como recomendaba el fabricante y se equilibró con tampón inicial (Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4). Se reconstituyó veneno de P. textilis (233 mg en peso seco) en 10 ml de tampón inicial y se colocó en un baño de agua a 37ºC hasta que se disolvió. Se cargó la muestra en la columna y se lavó con tampones de columna hasta que la línea base volvió a cero. Se aplicó tampón de elución (metil--D-manopiranósido 0,02 M en Tris-HCl 0,05 M) a la columna para eluir la proteína unida (complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón) de la Con A-Sepharose 4B. La velocidad de flujo de la columna era de 52 ml/hora. El detector UV de doble longitud de onda se fijó a 280 mm con atenuaciones de 0,32 y 0,64 unidades de absorbancia a escala completa (AUFS). Se reunieron las fracciones con actividad hidrolítica de S-2222 y se concentraron en un concentrador Amicon, modelo 405, con una membrana YM3, que tenía una velocidad de flujo de 48 ml/hora. Se almacenó el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón purificado en glicerol al 50% a -20ºC.

Purificación de proteasa de veneno de serpiente marrón a partir de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón

Cromatografía en Sephacryl S-300

Se lavó el gel para cromatografía en Sephacryl S-300 tal como recomendaba el fabricante. Se rellenó una columna de 87 cm x 2,5 cm de Sephacryl S-300 a 6ºC, y se equilibró con tampón inicial (tampón Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4), seguido por la equilibración con dos volúmenes de columna del mismo tampón con NaSCN 0,8 M añadido, antes de la aplicación de la muestra. Se incubaron 10 ml de activador de protrombina 4 mg/ml y 10 ml de NaSCN 1,6 M durante 10 min. y se cargaron en la columna. Se estableció una bomba peristáltica Gilson con una cámara púrpura/negra, con el fin de proporcionar una velocidad de flujo de 40 ml/h. Se usaron un detector UV de doble longitud de onda de Altex, fijado a A280 con una atenuación de 0,32 AUFS, con un registrador gráfico de pluma Cole Palmer 2, fijado a 1 cm/h. Se recogieron las fracciones usando una base de tiempo a intervalos de tiempo de 10 min/tubo inicialmente, seguido de un cambio hasta 12 min/tubo proporcionando fracciones de 6,5 y 8 ml respectivamente, usando un aparato de recogida de fracciones LKB 7000. Se realizaron ensayos cromogénicos, tal como se describió anteriormente, para evaluar las fracciones con actividad hidrolítica, que se reunieron y concentraron en un concentrador Amicon, modelo 42, con una membrana YM3. Se repitió este procedimiento tres veces.

Cromatografía en gel Superdex 200

Se usó también cromatografía en gel de alta resolución en Superdex 200 para purificar la proteasa del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón. Se lavó el Superdex 200 tal como recomendaba el fabricante, se rellenó en una columna de 2,5 x 90 cm y se equilibró con tampón de columna (Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, NaSCN 0,8 M). Se incubó una disolución que comprendía 9 ml de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón 5,6 mg/ml y 9 ml de NaSCN 1,6 M durante 30 min., entonces se cargó en la columna. La velocidad de flujo era de 48 ml/hora. La atenuación del detector de longitud de onda a 280 mn era de 0,32 ó 0,64 AUFS. Se reunieron las fracciones con actividad de S-2222 y se concentraron en un concentrador Amicon, modelo 52, con una membrana YM3. Entonces volvió a cromatografiarse la muestra concentrada reunida (5 ml) en la misma columna. Se dializó la preparación de proteasa final durante la noche en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, para retirar el NaSCN de la disolución. Se usó esta preparación (almacenada en glicerol al 10%/tampón Tris a -20ºC) para todos los estudios de caracterización estructural y funcional.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

Se realizó una HPLC de fase inversa a 25ºC, usando un sistema Waters (TM) que consistía en una bomba de doble pistón 6000A y una bomba M45A, un detector de longitud de onda 490 fijado a A280 nm, y un inyector de muestra Wisp y una columna C18 Jupiter de Phemonenex (KHO-4154) (1,4 mm x 250 mm). Se llevó a cabo la cromatografía usando un modo de gradiente lineal a lo largo de 60 min. con una disolución inicial, (A) TFA al 0,1% en agua destilada y eluido con (B) acetonitrilo al 80% en (A). Se usó el software Waters Millenium versión 1.01 para gestionar el sistema e integrar los datos.

Electroforesis 20 en gel de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato de sodio (SDS)

Se realizó la SDS-PAGE esencialmente tal como se describe por Laemlli, 1970, Nature 227 680. Se llevaron a ebullición las muestras de SDS-PAGE durante 10 min. en tampón de muestra de SDS en presencia o ausencia de mercaptoetanol (-Me). Se tiñeron los geles con azul de Coomassie y se destiñeron con metanol, ácido acético y agua (45:10:45).

Secuenciación de aminoácidos por el extremo N-terminal

Se realizó la secuenciación usando el método de degradación de Edman. Se usó un sistema de secuenciación de proteínas Procine 492cLC de Applied Biosytems para secuenciar la serina proteasa de veneno de serpiente marrón. Véase Applied Biosystems Manual, parte n.º 904 244, revisión D para los detalles del equipo. Entonces se realizaron búsquedas usando BLAST ExPAsy/NCBI para identificar la homología de secuencia entre la serina proteasa de reptil y el factor Xa, y la serina proteasa similar al factor Xa de T. carinatus.

Síntesis de ADNc de primera cadena y amplificación de los extremos de ADNc

Se usó 1 g de ARN total aislado a partir de una glándula de serpiente para la síntesis de ADNc. Para la preparación de ADNc 5’RACE-Ready se usaron los cebadores 5’-CDS [5’-(T)25 N-1 N-3’; N=A, C, G o T; N-1= A, G o C] [SEQ ID NO: 32] y SMART II A oligo [5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’] [SEQ ID NO: 33] del kit de amplificación de ADNc SMART RACE, y para la preparación de ADNc 3’RACE ready el cebador 3’-CDS A [5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1 N-3’; N=A, C, G o T; N-1 = A, G o C] [SEQ ID NO: 34] y la transcriptasa inversa PowerScript del mismo kit. Se diluyeron ambos ADNc añadiendo 100 l de agua y se usaron para la amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) según el protocolo descrito en el manual de usuario (kit de amplificación de ADNc SMART RACE, Clontech).

Para la PCR 3’RACE: ADNc 3’RACE, UPM [mezcla de cebadores universales A 5’CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (largo) [SEQ ID NO: 35] y 5’CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (corto) [SEQ ID NO: 36] y cebador GSP-2 (directo) degenerado [AAYGGWATGGAYTGYAA; Y=C+T,W=A+T] [SEQ ID NO: 37] basándose en la secuencia de aminoácidos N-terminal IVNGMD. Se usó la mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) para cebar la reacción. Ciclo térmico: 1 ciclo: 95ºC 1 min.; ciclos: 95ºC 30 s, 65ºC 1 min., 68ºC 3 min.; 1 ciclo: 68ºC 3 min. Se aisló el producto de PCR principal (1,5 kpb) a partir de gel usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) y se clonó en el vector pGEM-T Easy. Tras examinar las colonias, se aislaron 25 minipreparaciones de 35 colonias usando el kit de minipreparaciones QIAprep Spin (Qiagen).

Secuenciación de ADN

Se realizó la secuenciación de ADN usando el terminador BigDye y un cebador directo para el vector pGEM-T (GTTTTCCCAGTCACGAC) [SEQ ID NO: 38]. Sólo se descubrieron 2 clones que no contenían codón de terminación dentro de aproximadamente 500 pb. Se secuenciaron estos clones con el cebador For2 (ATCGTTAGTGGATTTGG) [SEQ ID NO: 39]. Se descubrió el codón de terminación. La secuencia completa de estos dos clones era similar y la longitud del ADN 3’ desde GSP-2 hasta el primer codón de terminación era de 776 pb.

Usando una secuencia de ADNc 3’, se diseñó el cebador inverso GSP-1: GAAATCGTCTCGGTCTCATTA [SEQ ID NO: 40]. Para la PCR 5’RACE se usaron ADNc 5’, UPM (véase anteriormente), GSP-1 y mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech). Las condiciones de PCR eran las mismas que para la PCR 3’RACE. Se aisló el producto de PCR principal (1 kpb) y se clonó en el vector pGEM-T Easy. De los 15 clones seleccionados para la secuenciación 6 eran los mismos, y no contenían codones de terminación. Se usaron dos cebadores de secuenciación: directo para el vector pGEM-T Easy (véase anteriormente) y el cebador inverso GSP-1. Los seis clones contenían ATG y estaban a 628 pb del inicio con respecto a la posición correspondiente a la secuencia del cebador GSP-2. Se usaron secuencias de ADNc 3’ y 5’ para diseñar los cebadores directo e inverso para el ADNc de cadena completa: SE(directo) ATGGCTCCTCAACTACTCCTCTG [SEQ ID NO: 41] y SE(inverso) TTAGAGCCGACCAGTGCTTGACTC [SEQ ID NO: 42]. Se clonó el producto de PCR (1.407 pb) en el vector pGEM-T Easy para su secuenciación.

Ensayos de activación de protrombina cromogénicos para el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón

Se realizaron una serie de ensayos para obtener curvas patrón para una tasa de hidrólisis de S-2222 frente a una cantidad de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón o proteasa de veneno de serpiente marrón. Se prepararon respectivas diluciones de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón (4 mg/ml) y proteasa (1 mg/ml) que variaban desde 1/10 hasta 1/10.000 en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4 y se almacenaron en hielo.

Se determinó la actividad hidrolítica del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón o la serina proteasa de

P. textilis sobre S-2222 mediante la equilibración de 0,93 ml de tampón Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, con o sin CaCl2 10 mM y 50 l de S-2222 3,0 mM en la célula de 1 ml de un espectrofotómetro Hitachi 557 a 25ºC. Se inició la reacción mediante la adición de concentraciones variables de 20 l de proteasa (0,4 mg/ml). Se monitorizó la liberación de pnitroanilina a 405 nm. Se realizaron ensayos con 0,91 ml de tampón Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, que contenía NaSCN 0,8 M, 50 l de S-2222 y 40 l de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón 0,4 mg/ml a intervalos de tiempo de 0, 1, 2, 5 y 10 minutos. Una unidad de actividad es equivalente a la hidrólisis de 1 mol de sustrato/min.

Ensayos de activación de protrombina para la proteasa de veneno de serpiente marrón

Se añadió proteasa de veneno de serpiente marrón (5 g) a 2 ml de protrombina 0,25 mg/ml (en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4). Se tomaron alícuotas (20 l) de esta disolución a diversos intervalos de tiempo y se realizaron ensayos cromogénicos con el sustrato selectivo de trombina S-2238. Estos ensayos consistían en 930 l de Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, 50 l de S-2238 y la muestra de 20 l. Se midió la tasa de hidrólisis de sustrato a 405 nm. También se tomaron dos alícuotas de 20 l en cada intervalo de tiempo para el análisis de SDS-PAGE -mercaptoetanol.

Ensayo de coagulación

Se realizaron ensayos de coagulación de plasma citratado usando una máquina Hyland-Clotek tal como se describe por Austen y Rhymes en: A laboratory manual of blood coagulation. Blackwell Scientific Publishers, Oxford R.U. 1975. Los ensayos consistían en 100 l de tampón Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, 100 l de plasma humano citratado y 20 l de una concentración variada de proteasa. También se realizaron ensayos idénticos con o sin CaCl2 0,04 M, y con NaSCN 0,8 M tomando alícuotas en intervalos de tiempo.

Formación de fibrina en plasma citratado mediante proteasa de veneno de serpiente marrón

Se mezcló plasma citratado humano (970 l) con:

(1)

20 l de proteasa 1,16 mg/ml;

(2)

20 l de proteasa 1,16 mg/ml y 10 l de CaCl2 4 M para dar una concentración de Ca2+ final de 40 mM (concentración de Ca2+ libre~10 mM);

(3)

10 l de CaCl2 4 M.

Se enrasó cada disolución hasta 1 ml mediante la adición de Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4. Se dejaron las tres disoluciones durante 4 horas y se prensaron los coágulos resultantes y se lavaron varias veces con dH2O para eliminar las otras proteínas plasmáticas de los coágulos de fibrina. Entonces se añadieron los coágulos a tubos Eppendorf que contenían 500 l de tampón de muestra de SDS 4x con -mercaptoetanol y urea 4 M. Se añadió una gota adicional de -mercaptoetanol a cada tubo Eppendorf y se dejó durante la noche. Se llevaron a ebullición las muestras durante 5 min. y 10 l de cada serie en un gel de acrilamida de SDS-PAGE tal como se describe en el presente documento.

Marcaje de sitios activos del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón y la proteasa de veneno de serpiente marrón

Se hicieron reaccionar muestras (120 l) de disoluciones de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón (4 mg/ml) y proteasa de veneno de serpiente marrón (2 mg/ml) con 15 l de DNS-GGACK 40 mM (concentración final de 4 mM en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4) durante 1 hora. Entonces se dializaron las muestras durante la noche con un agitador magnético a 4ºC en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, para eliminar el inhibidor en exceso. Entonces se realizó la SDS-PAGE con y sin -mercaptoetanol en complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón y proteasa tanto marcados como sin marcar. Se visualizó el gel con proteínas marcadas en los sitios activos bajo luz ultravioleta, mientras que el otro gel se tiñó con azul de Coomassie.

Estudios con adhesivo de fibrina

Se dispensó plasma citratado caducado (3,5 ml) en viales de plástico cónicos de 20 ml en un baño de agua a 37ºC. Se añadieron 20 l de serina proteasa de veneno de serpiente marrón 2 mg/ml a ambos viales. Se añadió CaCl2 0,025 M a un vial y se añadió solución salina al otro. Se monitorizó el tiempo de coagulación visualmente y cuando se formaron coágulos firmes, se colocaron sobre papel de filtro n.º 54 y se prensaron. Se lavaron exhaustivamente los coágulos prensados resultantes con agua destilada y se almacenaron durante la noche a 4ºC. Se fotografiaron los coágulos para revisar la textura.

RESULTADOS

Tal como se muestra en el presente documento, y se muestra a modo de ejemplo mediante P. textilis, el complejo de proteasa de veneno de serpiente comprende una proteasa característica de una serina proteasa similar al factor Xa y otras varias proteínas con función desconocida. Las proteasas de veneno de serpiente aisladas de P. textilis, O. scutellatus, N. scutatus, T. carinatus y P. porphyriacus pueden ser útiles para la preparación de una composición farmacéutica en forma de un “sellante” o “adhesivo” de fibrina tópico.

Algunos de los experimentos en el presente documento se han realizado usando proteínas y muestras derivadas de

P. textilis. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que estos experimentos son ejemplos que caracterizan un complejo de proteasa de veneno de serpiente y una proteasa de veneno de serpiente que pueden ser aplicables a las otras proteasas de veneno de serpiente de la invención.

Purificación de proteasas de veneno de serpiente

Purificación de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón (ConA-Sepharose 4B)

La primera etapa en la purificación de proteasa de veneno de la serpiente P. textilis fue aislar el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón a partir de veneno en bruto. Se usó un método basado en el descrito por Masci et al, 1988, citado anteriormente. En la figura 1 se muestra un perfil de elución a 280 nm que resulta de la cromatografía de 233 mg en peso seco de veneno de P. textilis en bruto en ConA-Sepharose 4B (un perfil del cromatograma original).

Se resolvió el veneno en dos picos de proteína principales, uno que se unía a ConA-Sepharose 4B y tenía actividad frente al sustrato S-2222 del factor Xa (indicado mediante la línea en A en la figura 1). Basándose en mediciones de A280, el pico de actividad representaba aproximadamente el 30% de proteína de veneno total.

En la figura 2, se muestran los resultados de SDS-PAGE del concentrado de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón reunido a partir de cromatografía en ConA-Sepharose 4B; carril 1: marcadores de peso molecular (los tamaños se muestran en kDa), carril 2: complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón sin mercaptoetanol, carril 3: complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con -mercaptoetanol.

La flecha A indica una banda de proteasa de veneno de serpiente marrón intacta en el carril 2, mientras que las flechas B y C designan las cadenas pesada y ligera respectivas de la proteasa de veneno de serpiente marrón en el carril 3 (véase más adelante).

El complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón, en ausencia de -mercaptoetanol (carril 2), comprende una única banda de proteína ancha predominante a ~150-200 kDa, y otras tres bandas principales con masas moleculares de ~60, 50 y 45 kDa. La suma de las masas aproximadas de las tres bandas principales en el carril 2 da como resultado una masa calculada predicha de 300-350 kDa para el complejo intacto.

El complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón en presencia de -mercaptoetanol (carril 3) se separa en varias bandas de proteína con respectivas masas moleculares aparentes de 110, 93, 80, 55, 46, 40 y una banda ancha (posiblemente un doblete) a ~32-34 kDa. Las diferencias entre los carriles 2 y 3 indican que enlaces disulfuro parecen ligar algunos de los polipéptidos en el complejo entre sí.

El componente de proteasa del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón existe como un doblete visible en el carril 2 a ~50-60 kDa, tal como se indica mediante la flecha A. La cadena pesada de la proteasa presenta una banda a aproximadamente 40 kDa (indicada mediante la flecha B), y la cadena ligera de la proteasa tiene una masa aproximada de 32 kDa (indicada mediante la flecha C). Se confirmó está designación de las bandas de SDS-PAGE A, B y C mediante los experimentos de caracterización y aislamiento descritos en el presente documento. Algunas de las bandas en la figura 2 pueden representar impurezas de veneno en el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón.

Purificación del componente de proteasa del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón

Cromatografía en Sephacryl S-300

Para aislar el componente de serina proteasa similar al factor Xa de veneno de serpiente marrón del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón, fue necesario disociar el complejo. Speijer et al (1986) mostraron que el NaSCN 0,8 M podía disociar eficazmente el activador de protrombina de O. scutellatus, pero nunca intentaron purificarlo con NaSCN 0,8 M en el procedimiento cromatográfico. Para ilustrar la capacidad para disociar el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con NaSCN 0,8 M, se realizaron los siguientes experimentos y se proporcionan los resultados en la figura 3. La adición de NaSCN 0,8 M al complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón provocó una rápida disminución en la actividad de coagulación del plasma citratado desde menos de 10 s hasta más de 60 s, sin embargo, esencialmente se conservó la mayor parte de la actividad de S-2222.

Se separó el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón tratado con NaSCN 0,8 M en los componentes individuales mediante cromatografía de filtración en gel en una columna Sephacryl S-300, equilibrada con un tampón que contenía NaSCN 0,8 M.

Las fracciones 30-43 mostraron actividad de hidrólisis de S-2222. Se aumentó el volumen de fracción para las etapas cromatográficas restantes desde 6,5 ml/tubo hasta 8 ml/tubo para reducir el número de fracciones. Se realizó una segunda cromatografía en Sephacryl S-300 con las fracciones 30-43 reunidas y concentradas. Se observó actividad hidrolítica de S-2222 en las fracciones 25-29. Se realizó una tercera cromatografía en Sephacryl S-300 con las fracciones 25-29 reunidas y concentradas. Esencialmente proporcionó un único pico de proteína que tenía actividad hidrolítica de S-2222 en las fracciones 25-29. Se confirmó un alto grado de homogeneidad mediante HPLC (figura 4). Basándose en la HPLC, la serina proteasa de veneno de serpiente marrón tiene una pureza superior al 95%.

Las tablas 1-6 resumen los resultados de purificación y la caracterización de las muestras de los conjuntos de experimentos.

SDS-PAGE -Me de productos de filtración en gel Sephacryl S-300

Se realizó la SDS-PAGE con fracciones reunidas de todas las etapas cromatográficas, mostrada en la figura 5. El carril 4 (que contiene Sephacryl S-300, etapa cromatográfica 1, fracciones reunidas 30-43) muestra que no se obtuvo una preparación homogénea de serina proteasa de veneno de serpiente marrón reunida puesto que existe un contaminante a un peso molecular de aproximadamente 107 kDa. El carril 5 (que contiene Sephacryl S-300, etapa cromatográfica 2, fracciones reunidas 25-29) muestra un mayor porcentaje de un componente de 55-56 kDa pero todavía contiene un contaminante que requiere una tercera cromatografía. Los carriles 6-8, con cantidades variables de las fracciones reunidas 25-29 en Sephacryl S-300 de la tercera etapa cromatográfica, muestran una preparación homogénea. El peso molecular de la serina proteasa de veneno de serpiente marrón intacta parece estar entre 55 y 56 kDa tal como se observa en los carriles 5-8.

Se ha comparado la serina proteasa de veneno de serpiente marrón tanto con veneno de P. textilis completo (carril 2) como con complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón intacto, con -Me (carril 10) y sin el mismo (carril 3). Esto mostró la posición de la serina proteasa de veneno de serpiente marrón dentro del complejo y en veneno completo.

El carril 9 de la figura 5 muestra una reducción de las fracciones reunidas 25-29 en Sephacryl S-300 de la etapa cromatográfica 3, con -Me. Puede observarse una única banda con un peso molecular de aproximadamente 31 kDa. Se realizó una segunda separación en gel para identificar las dos bandas esperadas que deberían haber resultado de la reducción de la serina proteasa de veneno de serpiente marrón. Se muestra este gel en la figura 6.

En la figura 6, puede observarse la SDS-PAGE de las fracciones 25-29 reunidas y concentradas en Sephacryl S300, con o sin -Me. Los carriles 3 (que contienen Sephacryl S-300, etapa cromatográfica 3, fracciones reunidas 2529), 4 y 6 (que contienen las fracciones 25-29 reunidas y concentradas en Sephacryl S-300 de la cromatografía 3) muestran que se logró una preparación homogénea de serina proteasa de veneno de serpiente marrón. Sin embargo, ambas bandas de los carriles 3 y 6 eran muy débiles. El peso molecular de la serina proteasa de veneno de serpiente marrón parece ser de entre 55 y 56 kDa, que corresponde al resultado en la figura 5.

El carril 5 (que contiene las fracciones 25-29 reunidas y concentradas en Sephacryl S-300 de la cromatografía 3 con -Me) muestra que la serina proteasa de veneno de serpiente marrón contiene 3 subunidades, sin embargo la última banda podría ser un frente de tinción, que se observa a menudo con el método de Laemlli, o podría ser un producto de autodigestión. El carril 7 (que comprende Sephacryl S-300, etapa cromatográfica 3, fracciones 25-29 reunidas y concentradas + -Me) no muestra ninguna banda y el carril 8 (que comprende las fracciones 25-29 reunidas y concentradas en Sephacryl S-300 de la cromatografía 3 + -Me) muestra que la serina proteasa de veneno de serpiente marrón está compuesta por cadenas ligera y pesada. Se supone que las serina proteasas de veneno de serpiente marrón comprenden cadenas ligera y pesada basándose en la estructura de la serina proteasa de O. scutellatus y el factor Xa correspondiente. El peso molecular de la cadena pesada de serina proteasa de veneno de serpiente marrón parece ser de aproximadamente 31 kDa, que corresponde al resultado en la figura 5, y la cadena ligera de aproximadamente 18 kDa. Se incluyó veneno completo de P. textilis (carril 2) y complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón intacto con -Me (carril 9) en el gel para poder realizar una comparación con las bandas que representan la serina proteasa de veneno de serpiente marrón.

Filtración en gel Superdex 200

En un intento por mejorar la purificación de la proteasa de veneno de serpiente marrón, se usó alternativamente un medio de filtración en gel de mayor resolución (Superdex 200) en lugar de Sephacryl S-300. En las figuras 7A y 7B, se muestran los perfiles de elución a 280 nm tras la cromatografía y una nueva cromatografía del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón en Superdex 200 en presencia de NaSCN. Las figuras 7A y 7B muestran un perfil de elución tras la cromatografía de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón (18 ml; 50,4 mg) en una columna (2,5 x 90 cm) de Superdex 200 en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4 con NaSCN 0,8 M. La figura 7A muestra la etapa cromatográfica 1 y la figura 7B muestra la etapa cromatográfica 2. En cada etapa, se reunieron y concentraron las fracciones con actividad de S-2222, designado mediante la línea en A.

Se separaron muestras de la purificación de proteasa de veneno de serpiente marrón con Superdex 200 mediante SDS-PAGE tras cada etapa de purificación tal como se muestra en la figura 7C. Los carriles 1 y 2: concentrado reunido de la etapa cromatográfica 1 con -mercaptoetanol (carril 2) y sin el mismo (carril 1); carriles 3 y 4: concentrado reunido de la etapa cromatográfica 2 con -mercaptoetanol (carril 5) y sin el mismo (carril 4); carril 5: marcadores de peso molecular (los tamaños se muestran en kDa); las flechas A, B y C indican impurezas en el carril

4.

La actividad específica del material de partida usado en la purificación en Superdex 200 era sustancialmente menor que la del material de partida usado en la cromatografía en Sephacryl S-300 (tabla 2). Esto puede reflejar diferentes actividades de diferentes muestras de veneno. El producto final de la purificación en Superdex 200 tenía una actividad específica de 1,1 U/ml/A280, menos de la mitad de las 2,4 U/ml/A280 del producto de Sephacryl S-300.

Se contemplan otros métodos de aislamiento, incluyendo la cromatografía de intercambio iónico, urea como agente de disociación alternativo, purificación de la proteasa de veneno de serpiente marrón a partir de veneno de P. textilis en bruto usando un procedimiento de purificación en ConASepharose 4B de una etapa, afinidad basada en la especificidad de sustrato de la proteasa y otros métodos conocidos en la técnica. Los siguientes son ejemplos de métodos adecuados para aislar una proteína activadora de protrombina de la invención, mostrados a modo de ejemplo con aislamiento de proteasa de veneno de serpiente marrón. Las tablas 3-6 muestran las propiedades de las muestras durante la purificación en diferentes etapas.

Protocolo 1

ConA-Sepharose (07-01-03)

•

Tampón inicial, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4

•

Tampón de elución, Tris-HCl 0,05 M, metil--D-manopiranósido 0,02 M

•

Muestra de carga: se reconstituyó veneno seco (peso: 541 mg) de Venom Supplies en 10 ml de tampón inicial *A280 de 1 ml de disolución: 13,5 *Unidades de A280 totales cargadas: 135

*Actividad de la muestra: 38 U/ml *Unidades de actividad totales cargadas: 377

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas *La A280 del conjunto concentrado era de 6,8 y consistía en 10 ml. *Unidades de A280 totales reunidas: 68 *Actividad del conjunto: 2,6 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 26,0

Superdex 200 (13-01-03)

•

Tampón inicial, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, NaSCN 0,8 M

•

Muestra de carga: parte del pico reunido y concentrado de la cromatografía en ConA-Sepharose anterior con NaSCN 0,8 M añadido (A280 8,9, 10 ml, 3,25 U/ml)

*Unidades A280 totales cargadas: 89 *Unidades de actividad totales cargadas: 32,5

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas *La A280 del conjunto concentrado era de 0,350 y consistía en 20 ml *Unidades de A280 totales reunidas: 7 *Actividad del conjunto concentrado: 0,46 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 9,2

Superdex 200 (14-01-03)

•

Tampón inicial, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, NaSCN 0,8 M

•

Muestra de carga: fracciones reunidas y concentradas de la cromatografía en Superdex 200 previa (A280 0,350, 20 ml, 0,46 U/ml)

*Unidades A280 totales cargadas: 7 *Unidades de actividad totales cargadas: 9,2

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas

*La A280 del conjunto concentrado era de 0,076 y consistía en 40 ml *Unidades de A280 totales reunidas: 3,0 *Actividad del conjunto concentrado: 0,11 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 4,4

Protocolo 2

ConA-Sepharose (21-01-03)

•

Tampón inicial, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4

•

Tampón de elución, Tris-HCl 0,05 M, metil--D-manopiranósido 0,02 M, entonces Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, NaSCN 0,8 M

•

Muestra de carga: se reconstituyó veneno seco (peso: 432 mg) de John Weigel en 10 ml de tampón inicial *A280 de 1 ml de disolución: 25,6 *Unidades A280 totales cargadas: 256 *Actividad de la muestra: 102,9 U/ml *Unidades de actividad totales cargadas: 1028

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas *se prepararon 2 conjuntos

1.

fracciones concentradas eluidas con metil--D-manopiranósido (aplicadas a la columna de fenil-Sepharose) *La A280 del conjunto concentrado era de 0,95 y consistía en 22 ml *Unidades de A280 totales reunidas: 20,9 *Actividad del conjunto: 5,0 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 110

2.

fracciones concentradas eluidas con NaSCN (sólo la mitad de esto se aplicó a dos etapas cromatográficas en Superdex 200 idénticas a continuación). Columna 200 tal como se describe a continuación *La A280 del conjunto concentrado era de 1,85 y consistía en 27 ml. *Unidades de A280 totales reunidas: 68 *Actividad del conjunto: 2,6 U/ml

*Unidades de actividad totales reunidas: 26,0 Superdex 200 (29-01-03 y 30-01-03)

•

Tampón inicial, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, NaSCN 0,8 M

•

Muestra de carga: parte del pico reunido y concentrado de la cromatografía en ConA-Sepharose anterior. Se realizaron dos etapas cromatográficas idénticas. Una muestra de carga consistía en 16 ml del pico reunido y concentrado de la cromatografía en ConA-Sepharose anterior con NaSCN 0,8 M añadido:

*A280 de 1 ml de disolución: 1,2

*Unidades A280 totales cargadas: 19,2 *Actividad de la muestra: 15,7 U/ml *Unidades de actividad totales cargadas: 250,6

• Se reunieron y concentraron las fracciones con una actividad específica idéntica y alta de cada una de las etapas cromatográficas (otras fracciones también tenían actividad de S-2222 pero la actividad específica era menor, éstas se reunieron por separado):

*La A280 del conjunto concentrado era de 1,9 y consistía en 9 ml *Unidades de A280 totales reunidas: 17,1 *Actividad del conjunto concentrado: 25,7 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 231,3

Superdex 200 (04-02-03)

•

Tampón inicial, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4 (sin NaSCN)

•

Muestra de carga: fracciones reunidas y concentradas de la cromatografía en Superdex 200 previa (A280 1,9, 9 ml, 25,7 U/ml)

*Unidades A280 totales cargadas: 17,1 *Unidades de actividad totales cargadas: 231,3

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas (los resultados a continuación incluyen las fracciones con la mayor actividad de S-2222, otras fracciones también tenían actividad de S-2222 y éstas se reunieron por separado)

*La A280 del conjunto concentrado era de 1,7 y consistía en 9,5 ml *Unidades de A280 totales reunidas: 16,2 *Actividad del conjunto concentrado: 17,7 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 168,2

Protocolo 3

ConA-Sepharose (10-02-03)

•

Tampón inicial, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4

•

Tampón de elución, Tris-acetato 0,025 M, pH 6,5, urea 4 M

•

Muestra de carga: veneno seco (peso: 557 mg) reconstituido en 25 ml de tampón inicial *A280 de 1 ml de disolución: 28 *Unidades A280 totales cargadas: 700 *Actividad de la muestra: 83,4 U/ml *Unidades de actividad totales cargadas: 2087

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas *La A280 del conjunto era de 0,592 y consistía en 640 ml. *Unidades de A280 totales reunidas: 379

*Actividad del conjunto: 0,152 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 97,3 CM-Sepharose (12-02-03)

•

Tampón inicial, Tris-acetato 0,025 M, pH 6,5, urea 4 M

•

Muestra de carga: fracciones reunidas de la cromatografía en ConA-Sepharose (A280 0,592, 640 ml, 0,152 U/ml)

*Unidades A280 totales cargadas: 379 *Unidades de actividad totales cargadas: 97

•

Una vez cargada toda la muestra en la columna se aplicó un gradiente de NaCl 0-0,05 M

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas *La A280 del conjunto concentrado era de 4,5 y consistía en 17,5 ml. *Unidades de A280 totales reunidas: 79 *Actividad del conjunto concentrado: 1,44 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 25

Superdex 200 (13-02-03)

•

Tampón inicial, Tris-acetato 0,05 M, pH 6,5

•

Muestra de carga: fracciones reunidas y concentradas de la cromatografía en CM-Sepharose (A280 4,5, 17,5 ml, 1,44 U/ml)

*Unidades A280 totales cargadas: 79 *Unidades de actividad totales cargadas: 25

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas (los resultados a continuación se refieren a un pico simétrico reunido, otras fracciones también tenían actividad de S-2222) *La A280 del conjunto concentrado era de 0,330 y consistía en 7,5 ml *Unidades de A280 totales reunidas: 2,5

*Actividad del conjunto concentrado: 0,146 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 1

Protocolo 4

Fenil-Sepharose (15-02-03)

•

Tampón inicial, NaSCN-fosfato 0,8 M, pH 6,5

•

Muestra de carga: fracciones reunidas y concentradas de la cromatografía en ConA-Sepharose (A280 0,95, 22 ml, 5,03 U/ml)

*Unidades A280 totales cargadas: 20,9 *Unidades de actividad totales cargadas: 110

•

Una vez cargada toda la muestra en la columna se aplicó un gradiente de NaSCN 0,8-0 M

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas

*La A280 del conjunto concentrado era de 0,485 y consistía en 9,5 ml

*Unidades de A280 totales reunidas: 4,6

*Actividad del conjunto concentrado: 1,4 U/ml

*Unidades de actividad totales reunidas: 13 Superdex 200 (18-02-03)

•

Tampón inicial, Tris-acetato 0,05 M, pH 6,5

•

Muestra de carga: fracciones reunidas y concentradas de la cromatografía en fenil-Sepharose (A280 0,485, 10 ml, 1,4 U/ml)

*Unidades A280 totales cargadas: 4,85 *Unidades de actividad totales cargadas: 14

•

Fracciones con actividad de S-2222 reunidas (se hicieron dos conjuntos, el descrito a continuación comprende las fracciones con la mayor actividad) *La A280 del conjunto concentrado era de 0,327 y consistía en 3,5 ml *Unidades de A280 totales reunidas: 1,14

*Actividad del conjunto: 1,83 U/ml *Unidades de actividad totales reunidas: 6,4

Caracterización del complejo de proteasa de veneno de la serpiente P. textilis

Efecto del Ca2+ sobre la hidrólisis de sustrato cromogénico S-2222 mediante el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón

Para determinar la especificidad de escisión similar al factor Xa del complejo de proteasa de veneno de serpiente, se realizaron ensayos cromogénicos usando el sustrato cromogénico S-2222 específico del factor Xa. El complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón hidroliza S-2222, con o sin Ca2+ añadido. Las tasas iniciales de hidrólisis sin Ca2+ eran similares a aquéllas en presencia de Ca2+, pero sólo a concentraciones mayores que 2 g/ml de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón (datos no mostrados).

La tasa de hidrólisis de S-2222 mediante el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón era aproximadamente lineal con una cantidad de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón en el ensayo (tal como se indica mediante los valores de R2 en la tabla 7; gráficos no mostrados).

El Ca2+ añadido o Ca2+ con PL no afectaba sustancialmente a la hidrólisis de S-2222 mediante el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón, que es similar para la proteasa de veneno de serpiente marrón aislada. Una comparación de la hidrólisis de S-2222 mediante el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con proteasa de veneno de serpiente marrón muestra que las tasas en unidades de -1 son similares. Puesto que sólo aproximadamente el 10-15% del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón es proteasa (basado en la masa), la tasa de hidrólisis de S-2222 mediante la proteasa en el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón en términos molares es aproximadamente 10 veces mayor que para la proteasa aislada.

Coagulación de plasma citratado mediante el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón

Se realizaron ensayos de coagulación de plasma citratado con complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón para comparar las propiedades de coagulación con la proteasa de veneno de serpiente marrón aislada. Los resultados de estos experimentos se muestran en la tabla 8. Los valores mostrados en la tabla 8 se derivan de los datos en relación con la coagulación de plasma citratado mediante el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con y sin componentes auxiliares (es decir complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón solo, complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 40 mM y complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 40 mM y fosfolípido).

Los resultados muestran que Ca2+ y PL no afectan a la eficacia de coagulación del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón.

Efecto del Ca2+ sobre el tiempo de coagulación de plasma citratado de la serina proteasa de veneno de serpiente marrón

Para investigar las propiedades de coagulación de la proteasa de veneno de serpiente marrón, se compararon los tiempos de coagulación de plasma citratado sin Ca2+ con aquéllos cuando estaba presente Ca2+. Los resultados en las tablas 9 y 10 muestran que el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón no requiere Ca2+ para coagular la sangre. Por ejemplo, 39 g/ml de serina proteasa de veneno de serpiente marrón aislada coagularán plasma citratado en ausencia de Ca2+ en menos de 30 s. La adición de Ca2+ dio como resultado un aumento de 200 veces en la cantidad de proteasa de veneno de serpiente marrón requerida para dar un tiempo de coagulación de 70 s (tabla 10). Esto muestra que la proteasa de veneno de serpiente marrón puede convertir la protrombina en trombina en ausencia de Ca2+ y que el Ca2+ puede facilitar la escisión de la protrombina.

Las figuras 8A-8C muestran la coagulación de plasma citratado mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón con y sin componentes auxiliares (los puntos de datos son medias de mediciones por duplicado). Figura 8A: proteasa de veneno de serpiente marrón sola, figura 8B: proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 10 mM y figura 8C: proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 10 mM y fosfolípido (Platelin).

Ca2+ también potenciará la activación de fibrinógeno mediante la trombina producida por proteasa de veneno de serpiente marrón (Mankad y Codispoti, 2001, Am J Surg 182 21S) y por consiguiente la adición de Ca2+ que afecta a la coagulación puede ser secundaria a la activación de protrombina. PL también puede funcionar para facilitar la escisión de protrombina mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón, dando como resultado una disminución de 10 veces adicional en la cantidad de proteasa de veneno de serpiente marrón requerida para la coagulación, tal como se muestra en la tabla 14.

Efecto del Ca2+ sobre la escisión de sustrato cromogénico S-2222 mediante proteínas activadoras de protrombina

Para determinar la especificidad de escisión similar al factor Xa del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón, se realizaron ensayos cromogénicos usando el sustrato cromogénico S-2222 específico del factor Xa. S2222 es un sustrato cromogénico sintético desarrollado para el factor Xa (Aurell et al., 1977, Thrombin Res 11 595). La hidrólisis de S-2222 libera p-nitroanilina que puede detectarse por un aumento en la absorbancia a 405 nm. Las representaciones gráficas de la actividad enzimática frente a la cantidad de proteasa de veneno de serpiente marrón eran esencialmente lineales, tal como se muestra en las figuras 9A-9D. Los resultados indican que la tasa de hidrólisis de S-2222 no se veía afectada por la presencia de Ca2+, o Ca2+ y PL, y por tanto, que el sitio catalítico no se ve afectado por Ca2+ y PL. A partir de la pendiente de 0,002 U/g de proteasa, la actividad específica de la preparación purificada era de 2 U/mg.

Las figuras 9A-9D muestran la hidrólisis de S-2222 mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón con y sin componentes auxiliares (los puntos de datos son medias de mediciones por duplicado). Figura 9A: proteasa de veneno de serpiente marrón sola; figura 9B: proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 10 mM; figura 9C: proteasa de veneno de serpiente marrón con CaCl2 10 mM y PL, y figura 9D: pendiente y valor de R2 de cada representación gráfica mostrada en las respectivas figuras 9A-9C. El valor de R2 es el coeficiente de correlación para una línea recta.

La proteasa de veneno de serpiente marrón hidroliza S-2222, con o sin Ca2+ añadido tal como se muestra en la tabla 11 aunque a tasas de hidrólisis iniciales ligeramente menores sin Ca2+ en comparación con aquéllas en presencia de Ca2+

.

Por el contrario, la hidrólisis de un sustrato de factor Xa sintético mediante textarina se potenció por la presencia de Ca2+ y PL (Stocker et al., 1994, Toxicon 32 1227), al igual que por trocarina, la serina proteasa similar al factor Xa de veneno de serpiente de escamas rugosas (Joseph et al., 1999, Blood 94 621).

Activación de protrombina mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón aislada

Sin restringirse a la teoría, se cree que la coagulación se produce mediante una reacción de dos etapas: (1) conversión de protrombina en trombina mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón, seguido de (2) escisión del fibrinógeno para dar fibrina y la activación del factor XIII mediante la trombina.

Haciendo referencia a la figura 10 que demuestra la activación de la protrombina mediante la serina proteasa de veneno de serpiente marrón, en el plazo de 10 minutos de reacción, la proteasa de veneno de serpiente marrón actúa para convertir la protrombina en trombina suficientemente para reducir el tiempo de coagulación de plasma citratado desde 65 segundos hasta una referencia de 12 segundos.

Activación de protrombina mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón

Los resultados de los experimentos a continuación muestran que la proteasa de veneno de serpiente marrón puede convertir la protrombina en trombina sin Ca2+, PL o proteínas auxiliares tales como el factor Va.

Los resultados de los ensayos de S-2222 indican que la proteasa de veneno de serpiente marrón puede hidrolizar los mismos enlaces que el factor Xa en la protrombina. Se determinó el efecto de la proteasa de veneno de serpiente marrón sobre la protrombina usando protrombina humana (0,5 mg en 2 ml de tampón Tris-HCl 0,05 M) que se hizo reaccionar con 5 g de proteasa de veneno de serpiente marrón (enzima:sustrato 1:100). Se analizaron los productos de reacción mediante SDS-PAGE no reductora, tal como se muestra en la figura 11A. Adicionalmente, se monitorizó la tasa de formación de trombina mediante la hidrólisis de S-2238, tal como se muestra en la figura 11B. S-2238 se usa comúnmente para determinar la actividad enzimática de la trombina (Kornalik y Blomback, 1975, Nature 227 680), incorporado al presente documento como referencia.

La figura 11A muestra la SDS-PAGE del transcurso de tiempo de la escisión de protrombina mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón. Un banda de proteína a ~40 kDa (carril 5) indica que la trombina (masa molecular de 36,7 kDa) es un producto final principal. Esta banda de proteína aumenta de intensidad con el tiempo, mostrando que está convirtiéndose la protrombina (PT) mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón en trombina (T). La protrombina ha desaparecido sustancialmente en el punto de tiempo de 48 horas (carril 5). La figura 11B muestra que la actividad inicial frente a S-2238 era muy baja y aumentaba aproximadamente 20 veces. A partir del gel de SDS-PAGE, se hubiera esperado que la actividad de S-2238 hubiera alcanzado un máximo a las 48 horas.

La protrombina humana usada en estos experimentos no era totalmente pura, tal como se indica mediante las bandas mostradas en el carril 2 de la figura 11A. Sólo debería observarse una banda de protrombina (PT) a 72 kDa (Mann, 1976, Methods Enzymol 1976 132). Una banda de proteína más débil a ~55 kDa indica la presencia de algo de pretrombina 1 (PT1), que resulta posiblemente de la escisión de protrombina mediante la trombina, tal como se muestra en la figura 12. La pretrombina 1 no es una enzima activa, confirmada mediante el ensayo de S-2238 en la disolución de protrombina a t = 0.

Parece que una banda de pretrombina 1 ha aumentado con el tiempo, y entonces disminuido. Posiblemente la trombina estaba presente en la disolución de protrombina, pero no era detectable mediante el ensayo de S-2238. Más probablemente, la trombina generada durante la incubación puede haber sido responsable de la formación de pretrombina 1.

Para ayudar con la interpretación de los resultados, se ha propuesto un mecanismo de activación de protrombina mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón y se muestra un diagrama esquemático en la figura 12. La invención no está restringida por este diagrama.

Activación de protrombina mediante proteasa de veneno de serpiente marrón aislada y formación de fibrina reticulada

A partir de los resultados anteriores, la proteasa de veneno de serpiente marrón activa la protrombina para dar trombina. La trombina activada debería convertir secuencialmente el fibrinógeno en fibrina. Para investigar esto, se incubó plasma citratado con proteasa de veneno de serpiente marrón con o sin Ca2+. Esto dio como resultado la formación de coágulos que se lavaron y entonces se separaron mediante SDS-PAGE, junto con un coágulo de fibrina lavado formado por la adición de Ca2+ solo al plasma citratado (lo que representa la formación de un coágulo in vivo normal dado que el Ca2+ solo activa la cascada de coagulación. Los resultados de este experimento, mostrados en la figura 13, demuestran que la fibrina producida por la acción de la proteasa de veneno de serpiente marrón tiene una estructura similar a la fibrina normal, la formación de fibrina reticulada se produce en respuesta a la activación de trombina mediante la serina proteasa de veneno de serpiente marrón y la activación del factor XIII resultante. También se registraron los tiempos de coagulación aproximados de cada experimento (tabla 12).

Usando los patrones de peso molecular (carril 1) y las estructuras de cadena tanto del fibrinógeno (carril 5) como del coágulo de fibrina producido por Ca2+ (carril 4) de la figura 13, pueden identificarse las bandas. Una banda a aproximadamente 100 kDa en los carriles 2 y 3 (proteasa de veneno de serpiente marrón sin y con Ca2+ respectivamente) es indicativa del dímero de  (-). El dímero de  tiene una masa molecular de 105 kDa y resulta de reticulaciones covalentes realizadas entre dos monómeros  mediante el factor XIIIa (McKee et al., 1970, Proc Natl Acad Sci 66 738).

También pueden observarse bandas a aproximadamente 70 y 60 kDa en estos carriles, indicativas de cadenas de fibrina de monómero  () y monómero  () respectivamente. El monómero  tiene una masa molecular de 73 kDa, mientras que el monómero  tiene una masa molecular de 60 kDa (McKee et al., 1970, citado anteriormente). La banda con una masa molecular mayor que 400 kDa (parte superior del gel) es indicativa de polímero de  (p), que resulta de la reticulación covalente de lisina-ácido glutámico del monómero  mediante el factor XIIIa (Gaffney y Brasher, 1974, Nature 251 53). También puede observarse el producto de degradación de cadena  (1) a ~38 kDa en los carriles 2-4.

Parece que la trombina que resulta de la acción de la proteasa de veneno de serpiente marrón convierte el fibrinógeno en fibrina de una manera similar a la -trombina normal. Esto se muestra comparando los patrones de bandas del coágulo producido de la manera normal (mediante la adición de Ca2+ a plasma citratado) con coágulos producidos mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón, con y sin Ca2+ (carriles 3 y 2 respectivamente). Una mayor cantidad de monómero  no reticulado está presente en el coágulo producido con proteasa de veneno de serpiente marrón sola (carril 2) en comparación con en presencia de Ca2+ (carril 3). Esto sugiere que el factor XIIIa no estaba activo en la formación del coágulo anterior. Esto concuerda con la bibliografía puesto que el factor XIIIa activado en presencia de Ca2+ es más activo que la misma enzima activada en ausencia de Ca2+ (Turner y Maurer, 2002, Biochemistry 41 7947). La reticulación del monómero  mediante el factor XIIIa es un proceso más lento que la reticulación de la cadena , lo que explica por qué la cadena  parece estar completamente reticulada en los tres coágulos. Dejar el coágulo durante más de cuatro horas puede haber permitido que el monómero  se reticulara completamente.

Se observaron patrones de bandas muy similares en el coágulo producido usando proteasa de veneno de serpiente marrón con Ca2+ y el coágulo que representa la formación in vivo normal (Ca2+ solo). Sin embargo, había una diferencia en los tiempos de coagulación de estos dos coágulos (tabla 12). El coágulo con proteasa de veneno de serpiente marrón y Ca2+ se coaguló ~30 veces más rápido que el coágulo con Ca2+ solo. Esto indica que la coagulación se debía a la acción de la proteasa de veneno de serpiente marrón sobre el plasma citratado en vez de la del Ca2+. El calcio añadido redujo ligeramente el tiempo de coagulación de plasma citratado mediante la proteasa de veneno de serpiente marrón (de 120 a 60 s). Esto concuerda con los resultados de los ensayos de coagulación de plasma citratado con proteasa de veneno de serpiente marrón y Ca2+ añadido.

Caracterización estructural de la proteasa de veneno de la serpiente P. textilis

Marcaje de sitios activos de la proteasa de veneno de serpiente marrón

La dansil-L-glutamil-glicil-L-arginil clorometil cetona (DNS-GGACK) es un inhibidor que alquila específicamente el sitio activo histidina de serina proteasas, incluyendo el factor Xa, inactivándolas de este modo (Kettner y Shaw, 1981, Methods Enzymol 80 826). Para determinar qué banda o bandas de SDS-PAGE comprenden un sitio catalítico, se incubaron respectivamente proteasa de veneno de serpiente marrón y complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón intacto con DNS-GGACK y se separaron en una serie mediante SDS-PAGE. Las propiedades fluorescentes de DNS-GGACK permiten la visualización de bandas de proteasa de veneno de serpiente marrón que incorporan inhibidor unido de manera covalente usando luz ultravioleta. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 14.

Una banda fluorescente prominente es visible en el carril 3, que corresponde a la proteasa de veneno de serpiente marrón intacta (carril 7). En presencia de -mercaptoetanol (carril 4), el inhibidor fluorescente se incorporó exclusivamente en la cadena pesada de la proteasa de veneno (banda a aproximadamente 37 kDa en el carril 8). Esto muestra que el sitio activo de la proteasa de veneno de serpiente marrón está ubicado en la cadena pesada en vez de en la cadena ligera. Estos resultados y también la ubicación de la proteasa de veneno de serpiente marrón dentro del patrón de bandas del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón se confirman en los carriles 1 y 2, y 7 y8.

La cadena pesada del factor Xa de mamífero comprende un sitio activo de enzima (Bock et al., 1989, Arch Biochem Biophys 273 375). El análisis de digestos peptídicos de factor Xa inactivado mediante DNS-GGACK ha mostrado que la histidina 42 de la cadena pesada forma parte del sitio activo. Mediante la alineación de secuencias, se propone que los residuos de histidina del sitio activo tanto de la trocarina como de la proteasa de veneno de serpiente marrón están en una posición idéntica a la histidina del sitio activo del factor Xa, tal como se muestra en la figura 15. La histidina propuesta del sitio activo se muestra en texto en negrita.

Secuenciación de aminoácidos N-terminales de la serina proteasa de veneno de serpiente marrón, y homología de secuencia con el factor Xa y serina proteasa similar al factor Xa de T. carinatus.

Se realizó la secuenciación de aminoácidos N-terminales de las supuestas cadenas ligera y pesada de la proteasa de veneno de serpiente marrón. También se requerían secuencias cortas para facilitar la clonación del ADNc para la proteasa de veneno de serpiente marrón de una biblioteca de ADNc de glándula de veneno de P. textilis.

Se separaron el complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón y la proteasa de veneno de serpiente marrón mediante SDS-PAGE en presencia de -mercaptoetanol y se transfirieron a una membrana de PVDF. A partir de esta membrana, se realizó la secuenciación de bandas de proteína.

Inicialmente, se obtuvo una secuencia de aminoácidos parcial de la cadena pesada de proteasa de veneno de serpiente marrón: IVNGMD(C)KLGE [SEQ ID NO: 43]. Obsérvese que la (C) significa que este ciclo era en blanco e indica que una cisteína estaba presente pero no es seguro. La presencia de este residuo de cisteína se confirmó posteriormente tras la secuenciación de un ADNc correspondiente.

La cadena pesada de la proteasa de veneno de serpiente marrón era una primera banda de proteína transferida a una membrana de PVDF y secuenciada. El extremo N-terminal del fragmento de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos: IVNGMDCKLGE [SEQ ID NO: 43]. Una búsqueda de homología mostró que esta secuencia es idéntica al 100% con la secuencia N-terminal de la cadena pesada de trocarina (véase la figura 16). Se usó esta secuencia para diseñar un cebador de ácido nucleico que se usó satisfactoriamente para amplificar el ADNc de proteasa de veneno de serpiente marrón. También se halló similitud entre la secuencia N-terminal de la proteasa de veneno de serpiente marrón y la cadena pesada del factor Xa humano, mostrada en la figura 17.

También se secuenciaron los aminoácidos a la cadena ligera de proteasa de veneno de serpiente marrón. La secuencia N-terminal de la banda correspondiente a la cadena ligera era ANSLVXXFKSGNI [SEQ ID NO: 44]. La “X” indica que había espacios en blanco en los ciclos de secuenciación 6º y 7º. Esto indicaba que los aminoácidos eran

o bien cisteínas, que se degradan durante la secuenciación, o bien que los residuos contenían modificaciones postraduccionales. La secuencia de aminoácidos de proteasa de veneno de serpiente marrón deducida a partir de una secuencia de nucleótidos del ADNc correspondiente reveló que los residuos de aminoácido “X” eran ambos ácido glutámico. Se sustituyó la “X” en la secuencia de aminoácidos por estos residuos. Se alineó la homología del extremo N-terminal secuenciado de la cadena ligera de la invención con trocarina tal como se muestra en la figura

18. También se halló similitud alineando la secuencia de la cadena ligera de veneno de serpiente marrón parcial con la secuencia N-terminal de la cadena ligera del factor Xa de ratón tal como se muestra en la figura 19. Las alineaciones mostradas en las figuras 15-19 muestran que la proteasa de veneno de serpiente marrón comparte homología con la trocarina y el factor Xa.

También se halló homología de secuencia con otra segunda secuencia para la serina proteasa de veneno de serpiente marrón y el factor Xa. La homología es superior al 55%.

Una comparación entre la secuencia de aminoácidos de trocarina y la secuencia N-terminal obtenida de serina proteasa de veneno de serpiente marrón.

Se obtuvieron el ADN de cadena completa y la secuencia de proteína codificada de la serina proteasa de veneno de serpiente marrón tal como se describió anteriormente y ambas secuencias se muestran en las figuras 20-26.

En la figura 21 se muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos completa de la serina proteasa de veneno de serpiente marrón y la trocarina. El nivel global de identidad de secuencia era del 81%, sin embargo hay varias características únicas en la proteasa de veneno de serpiente marrón que empieza en la secuencia de propéptido N-terminal (40 aminoácidos) que no está presente en la trocarina. Se predijo que el sitio de escisión de propéptido estaría entre R y A en el extremo del propéptido tal como se muestra en la figura 23. Esto está respaldado por una búsqueda en BLAST que revela que una serie de factores hemostáticos que incluyen los factores X, IX, VII y otros y sus precursores están relacionados con la serina proteasa de veneno de serpiente marrón. Esta secuencia en el extremo del propéptido KRANS-----EE-----EREC y residuos de ácido glutámico adicionales importantes para la función en la unión a Ca2+ están bien conservados. De hecho, hay varios bloques de secuencia conservada que incluyen el sitio de escisión o partes del mismo entre las cadenas ligera y pesada RIVNGMD [SEQ ID NO:45] sólo distal con respecto al residuo de aminoácido 200.

Otra diferencia con la trocarina evidente en la alineación es la presencia de 28 aminoácidos en la proteasa de veneno de serpiente marrón (residuos 182-209) que están ausentes en la trocarina. Esta secuencia precede al sitio de escisión predicho entre las cadenas ligera y pesada tal como se muestra en las figuras 21A y 23. La cadena ligera de la trocarina consiste en 141 residuos y termina con la secuencia de aminoácidos KARNK [SEQ ID NO: 46] (Joseph et al., 1999, Blood 94 621). La secuencia de aminoácidos predicha de cadena ligera de la proteasa de veneno de serpiente marrón comprende una secuencia similar (KTRNK) [SEQ ID NO: 47] que empieza en el aminoácido 177 de la figura 23. La cadena ligera de la proteasa de veneno de serpiente marrón puede escindirse en este punto eliminando de este modo los 28 aminoácidos finales antes del inicio de la cadena pesada. Se calculó que la masa molecular de la proteasa de veneno de serpiente marrón era de 43.587 Da, suponiendo la escisión en el punto indicado anteriormente, y se predice que las cadenas ligera y pesada respectivas tienen una masa molecular de 27.952 y 15.652 Da (véase la tabla 13).

También se usó la distancia migrada de las proteínas separadas mediante SDS-PAGE para estimar la masa molecular de la proteasa de veneno de serpiente marrón y sus cadenas componentes (datos no mostrados). Se determinó que las masas moleculares aproximadas de la proteasa de veneno de serpiente marrón intacta y sus cadenas ligera y pesada eran de 53 kDa, 35 kDa y 29 kDa, respectivamente, basándose en datos de SDS-PAGE (véase la tabla 13).

La secuencia de nucleótidos de ADNc no indica si una proteína está escindida o si tiene modificaciones postraduccionales. Por este motivo, se usó trocarina como modelo puesto que la secuencia de aminoácidos de la trocarina nativa (determinada mediante secuenciación de proteínas) y la secuencia de nucleótidos de ADNc traducida de la proteasa de veneno de serpiente marrón son muy similares. Se estimó que la masa molecular de la trocarina nativa era de 46.515 Da (Joseph et al., 1999, citado anteriormente). La masa molecular calculada a partir de la secuencia de aminoácidos de la trocarina sin ninguna modificación postraduccional es de aproximadamente

42.455 Da. Por consiguiente, hay aproximadamente 4.060 Da de modificaciones postraduccionales que incluyen residuos de Glu, N-glicosilación y O-glicosilación. La trocarina y la proteasa de veneno de serpiente marrón son muy similares y por tanto puede predecirse que la proteasa de veneno de serpiente marrón tendrá una modificación postraduccional similar a la trocarina. Basándose en esta suposición, la masa molecular de la proteasa de veneno de serpiente marrón con modificaciones postraduccionales y una cadena ligera escindida es de 47.647 Da, lo que concuerda con el valor determinado experimentalmente de 53 y 48 kDa. El factor Xa tiene una masa molecular de 46 kDa (Di Scipio et al., 1977, Biochemistry 67 99). Se usó esta masa calculada de 47.647 Da para determinar la concentración de proteasa de veneno de serpiente marrón en disolución.

Comparación de las proteínas proteasas de veneno derivadas de serpiente

Se extirparon las glándulas de veneno de una serpiente taipán de la costa, taipán del interior, marrón, tigre, negra de vientre rojo y de escamas rugosas de especímenes dañados en la carretera vivos, y se extrajo el ARN total por medio del método TRI Reagent© para la extracción de ARN (Sigma, Castle Hill, Australia). Entonces se sintetizó ADNc de primera cadena a partir del ARN. Entonces se examinó el ADNc para determinar la proteasa de veneno de serpiente similar al factor Xa por medio de PCR usando cebadores degenerados diseñados a partir de la secuencia de aminoácidos preliminar deducida de la proteasa de serpiente marrón. Obsérvese que se amplificaron diferentes regiones de la proteasa, usando diferentes conjuntos de cebadores, con atención en la cadena pesada del componente similar al factor Xa. Todos los productos de PCR se hicieron pasar por un gen de TAE-agarosa al 1,5%, se extrajeron usando un kit de extracción en gel QIAEX II (Qiagen, Hilden, Alemania), se clonaron en el sistema de vector pGEM-T (Promega, Annandale, Australia) y posteriormente se secuenciaron usando un kit de reacción listo para la secuenciación por ciclos ABI Prism Big Dye Terminator (Perkin-Elmer, Boston, EE.UU.). Entonces se realizaron alineaciones de secuencias entre las proteasas aisladas a partir de las cinco especies. La figura 21 muestra una alineación de aminoácidos de las proteasas de serpiente marrón, taipán de la costa, negra de vientre rojo, tigre y de escamas rugosas de la invención con trocarina. La figura 22 muestra una alineación de aminoácidos de estas proteasas de la invención con factor Xa humano. La figura 23 muestra una alineación de todas las proteasas de serpiente marrón, taipán de la costa, taipán del interior, negra de vientre rojo, tigre y de escamas rugosas de la invención con propéptido, con los dominios de cadena ligera y cadena pesada indicados.

Clonación y secuenciación de ácidos nucleicos que codifican para proteínas proteasas de veneno de serpiente taipán, tigre, de escamas rugosas y negra de vientre rojo

Se clonaron los respectivos ácidos nucleicos de longitud completa que codifican para proteínas proteasas de veneno de serpiente y se secuenciaron de serpientes taipán, tigre, de escamas rugosas y negra de vientre rojo. Una alineación de las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos derivados de serpiente anteriores con la proteasa de veneno de serpiente de la serpiente marrón común reveló varios puntos de interés. Esto incluye casi una homología del 100% dentro de una secuencia de aminoácidos de propéptido de 40 aminoácidos (residuos 1-40 mostrados en las figuras 23 y 24), a pesar de un cambio de un solo aminoácido en la serpiente negra de vientre rojo. También se observa este alto grado de conservación en las regiones del sitio de escisión entre el propéptido y la cadena ligera, y la cadena ligera y la cadena pesada (véase la figura 23). En global, hay un grado de homología del 72% entre las cinco serpientes. La proteasa de taipán es la más estrechamente relacionada con la de la serpiente marrón común, siendo homólogas en un 92%, tal como se habría esperado, ya que ambos son activadores de protrombina de grupo C. Igualmente, hay un alto grado de similitud entre los activadores de protrombina del grupo D de las serpientes tigre del interior y de escamas rugosas con una homología del 95%, siendo la serpiente negra de vientre rojo la más diferente de las cinco. Un punto final de interés es el área de baja homología en la cadena pesada, en la que se observan deleciones en las serpientes tigre, negra de vientre rojo y de escamas rugosas, más la terminación prematura de la proteasa a once aminoácidos del extremo en las serpientes tigre y de escamas rugosas.

Hay regiones novedosas conservadas de las proteasas de veneno de serpiente que son distintas de tanto la trocarina como el factor Xa humano y todas las demás proteínas conocidas. Estas regiones incluyen lo siguiente, que se muestra también en las figuras 21-23 como secuencias consenso.

KREASLPDFVQS (residuos 181-192) [SEQ ID NO: 19];

LKKSDNPSPDIR (residuos 198-209) [SEQ ID NO: 20]; y

SVX1VGEIX2X3SR (residuos 260-270) [SEQ ID NO: 21]

X1, X2 y X3 pueden ser cualquier aminoácido, pero preferiblemente X1 es o bien V o bien I, X2 es o bien D o bien N y X3 es o bien R o bien I.

MAPQLLLCLILTFL WSLPEAESNVFLKSK (residuos 1-29) [SEQ ID NO:22] y

ANRFLQRTKR (residuos 31-40) [SEQ ID NO: 23]

KREASLPDFVQSXXAXXLKKSDNPSPDIR (residuos 181-209) [SEQ ID NO: 24], en la que X puede ser cualquier aminoácido

MAPQLLLCLIL TFL WSLPEAESNVFLKSKXANRFLQRTKR (residuos 1-40) [SEQ ID NO: 25], en la que X puede ser cualquier aminoácido

Se apreciará que las SEQ ID NOS: 23, 24 y 25 corresponden a un propéptido predicho que comprende los aminoácidos 1-40 tal como se muestra en la figura 23 y por consiguiente puede no formar parte en una realización de una proteína madura digerida proteolíticamente.

Un experto en la técnica podrá identificar otras regiones conservadas novedosas de proteínas activadoras de protrombina de la invención basándose en los datos de alineación proporcionados en las figuras 21-23.

De manera similar, pueden determinarse ácidos nucleicos conservados novedosos que codifican para las proteínas activadoras de protrombina de la invención a partir de los datos de alineación proporcionados en la figura 25. Tales ácidos nucleicos novedosos pueden ser útiles, por ejemplo, para diseñar sondas y/o cebadores de ácidos nucleicos específicos para amplificar, secuenciar y/o identificar un ácido nucleico de la invención.

Adhesivo de fibrina

El plasma citratado con serina proteasa de veneno de serpiente marrón añadida coaguló muy rápidamente tanto en presencia como en ausencia de Ca2+ 10 mM. La textura macroscópica de los dos coágulos parece diferir para las dos preparaciones.

Modelo de hemorragia de la vena de cola de ratón

Se sometió a prueba la eficacia de la proteasa de veneno de serpiente marrón purificada en su función como agente antihemorrágico en ratones usando un modelo de hemorragia de la vena de cola. Los resultados de estos experimentos se muestran en las tablas 14 y 15 y la figura 27.

Se realizaron estudios de hemorragia de la vena de cola de ratón tal como se describe esencialmente por Masci et al (2000) con alteración de poca importancia. Los resultados se muestran en las figuras 27 y 28 y las tablas 14 y 15. Se aplicó proteasa de P. textilis (250 l; proteasa de P. textilis 65 g/ml en Tris-HCl 0,02 M, pH 7,4, CaCl2 10 mM) por vía tópica a la herida abierta de la cola cortada, durante 3 minutos. Se midió la pérdida de sangre usando tubos Eppendorf pesados previamente. La precisión dictó que la pérdida de sangre se midiera en peso en vez de en volumen. Se observa que todos los ratones tratados por vía tópica con la proteasa mostraron un gran coágulo en el sitio de la lesión tal como se muestra en la figura 27. Se sacrificaron los ratones por medio de dislocación cervical.

Los datos para la tabla 15 y la figura 28 se obtuvieron de experimentos en los que se sumergió una herida abierta de una cola de ratón cortada en 250 l de cloruro de sodio al 0,9% (solución salina control) con o sin 65 g de proteasa de veneno de serpiente marrón durante tres minutos. Se midió la pérdida de sangre en peso. Tal como muestran la tabla 15 y la figura 28, no se requieren cofactores para coagular la sangre.

Tal como se muestra en las tablas 14 y 15 y la figura 28, la proteasa de veneno de serpiente marrón redujo significativamente la pérdida de sangre en ratones (0,169 g  0,086) en comparación con los animales control (0,542  0,160) (prueba de la U de Mann Whitney, p=0,021) cuando se corrigieron los errores técnicos.

Ejemplo

Generación de una biblioteca de ADNc de la glándula de veneno de P. textilis para establecer un chip de microalineamientos para la comparación entre especies y su uso para el descubrimiento de fármacos.

Se amplificó ARN mensajero extraído de la glándula de veneno de la serpiente diana como ADNc y se clonaron fragmentos de más de 600 pb de tamaño en un vector TriplEx2 usando un kit de síntesis de bibliotecas de ADNc SMART (Clontech, Palo Alto, EE.UU.). Se produjo una biblioteca de ADNc de este tipo tanto de la serpiente taipán como de la marrón, y se realizaron análisis de secuencia preliminares en aproximadamente 30 transcritos de cada biblioteca. Este proceso implicaba la amplificación por PCR para detectar la presencia y el tamaño del inserto, seguido de conversión del TriplEx2 en un plásmido pTriplEx2 y la posterior secuenciación:

Debido a su variación y tamaño de inserto aumentado promedio, se decidió seleccionar la biblioteca de ADNc de taipán para el establecimiento de un chip de microalineamiento. Posteriormente, se aislaron aleatoriamente 4800 clones de ADNc para la purificación y amplificación por PCR a gran escala, que se imprimieron entonces por duplicado sobre portaobjetos de vidrio recubiertos usando un dispositivo de impresión de alineamientos GMS 417 disponible del Queensland Institute of Medical Research. Entonces se amplificó el ARN de las glándulas de veneno de las serpientes mencionadas anteriormente de un modo lineal usando un protocolo de amplificación de ARN antisentido de Eberwine modificado (dando un aumento de hasta setenta veces en la concentración de ARN) esperando la hibridación con el chip.

COMENTARIOS

Las proteasas de veneno de serpiente de la invención tienen una estructura y propiedades funcionales únicas. También comparten cierta similitud con el factor Xa y el activador de protrombina de O. scutellatus. Las proteasas de veneno de serpiente de la invención coagularon el plasma citratado sin la presencia de Ca2+. In vivo, el factor Xa también requiere la presencia de Ca2+ para una coagulación normal. Por consiguiente, es una observación novedosa y sorprendente que las proteasas de veneno de serpiente de la invención pueden coagular la sangre sin la presencia de factores tales como fosfolípido, factor Va o Ca2+.

El sustrato cromogénico específico del factor Xa, S-2222, se escinde mediante las proteasas de veneno de serpiente de la invención. Esto muestra que las proteasas de veneno de serpiente tienen una especificidad de escisión muy similar al factor Xa. Además, es interesante que el Ca2+ sólo potencie la tasa de hidrólisis de S-2222 a concentraciones inferiores a 2 g/ml de complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón. Además, cuando se añade NaSCN al complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón, no se mantiene toda la actividad de S-2222. Estas observaciones son distintas del trabajo de Speijer et al (1986) en relación con el activador de protrombina de

O. scutellatus.

El simple método de filtración en gel usando Sephacryl S-300 demostró ser relativamente malo para el aislamiento del componente de serina proteasa a partir del complejo de proteasa de veneno de serpiente marrón, evidente por el número de cromatografías requeridas para la purificación. A pesar de la extensa purificación, finalmente se logró una preparación homogénea, determinada mediante HPLC y SDS-PAGE en ausencia de -Me.

Los resultados de SDS-PAGE sugieren que la proteasa de veneno de serpiente marrón tiene un peso molecular nativo de entre 55 y 56 kDa. La proteasa de veneno de serpiente marrón comparte una mayor similitud de tamaño con el factor Xa de mamífero de 54 kDa (Mann et al, 1987) que con la proteasa similar al factor Xa de O. scutellatus de 60 kDa (Speijer et al, 1987, J. Biol. Chem. 261 13258). Además, la estructura de cadenas de la proteasa de veneno de serpiente marrón muestra una mayor semejanza con el factor Xa que con la serina proteasa similar al factor Xa de O. scutellatus.

La SDS-PAGE +-Me) mostró que la proteasa de veneno de serpiente marrón comprende dos cadenas peptídicas, probablemente unidas entre sí mediante un puente disulfuro. Esto está respaldado adicionalmente por el hallazgo de dos aminoácidos de extremo N-terminal a partir de la secuenciación de la proteasa de veneno de serpiente marrón. A partir de los resultados, los tamaños de las cadenas pesada y ligera son de aproximadamente 31 y 18 kDa respectivamente, sin embargo esto no se corresponde con un peso molecular de la proteasa total de 55 - 56 kDa. A diferencia de la proteasa de veneno de serpiente marrón de la invención, se encontró que la serina proteasa similar al factor Xa de O. scutellatus consistía en dos cadenas compuestas por 30 kDa cada una (Speijer et al, 1986, citado anteriormente).

Era una observación interesante que existiera una homología de secuencia del 100% entre los primeros 11 aminoácidos de la serina proteasa similar al factor Xa de T. carinatus y las proteasas de veneno de serpiente marrón de la invención. Esto muestra que se ha producido un grado de conservación de secuencia de aminoácidos (revelado con la secuencia de aminoácidos completa de la proteasa de veneno de serpiente marrón) a lo largo de la evolución de estos dos activadores de protrombina de veneno de serpiente australiana. También existe homología de secuencia entre el factor Xa y la proteasa de veneno de serpiente marrón, lo que muestra que se han conservado algunos aminoácidos en la evolución de las serpientes y los mamíferos. Sin embargo, tal como se muestra también en las figuras 21 y 22, las proteasas de veneno de serpiente de la invención tienen regiones conservadas novedosas que son distintas del factor Xa y la trocarina y todas las demás proteínas conocidas por el solicitante.

El factor Xa tiene todas las características típicas de una serina proteasa, teniendo dos dominios estructurados de manera similar, enlaces disulfuro dentro de los dominios y otros (Stubbs y Bode, 1994, citado anteriormente). Sin embargo, las diferencias de las serina proteasas le confieren su función específica. Por ejemplo, la hendidura de sitio activo del factor Xa está mucho más abierta que la hendidura de trombina (Stubbs y Bode, 1994, citado anteriormente), lo que puede contribuir a la especificidad de escisión del factor Xa por Arg274 - Thr275 y Arg323 Ile324.

Un uso terapéutico novedoso para las proteasas de veneno de serpiente de la invención es como reactivos para preparar adhesivo de fibrina tópico. Las proteasas de veneno de serpiente de la invención pueden proporcionar un agente terapéutico más eficaz para preparar adhesivo de fibrina que los métodos actuales. El adhesivo de fibrina tópico preparado con las proteasas de veneno de serpiente de la invención puede reducir enormemente la hemorragia experimentada en un traumatismo y por tanto puede posiblemente salvar muchas vidas humanas y de animales no humanos. Por ejemplo, las unidades médicas de emergencia pueden estar equipadas con vendajes y similares impregnadas con un adhesivo de fibrina que comprende proteasas de veneno de serpiente de la invención para evitar la hemorragia en un accidente.

ABREVIATURAS

A405 - absorbancia a 405 nm

Arg – arginina

AUFS - unidades de absorbancia a escala completa a 280 nm

C – cisteína

Ca2+- iones calcio

CaCl2 - cloruro de calcio

cm – centímetros

D - ácido aspártico

E - ácido glutámico

F – fenilalanina

G – glicina

HPLC - cromatografía de líquidos de alta resolución

h – hora

I – isoleucina

Ile – isoleucina

K – lisina

kDa - kiloDalton

L – leucina

M – metionina

M – molar

mg – miligramos

min. – minutos

ml - mililitros

mM - milimolar

N – asparaginas

NaSCN - tiocianato de sodio

nm - nanómetros

O. scutellatus -Oxyurarius scutellatus

P. textilis -Pseudonaja textilis

PAGE - electroforesis en gel de poliacrilamida

5

PEG - polietilenglicol

Q – glutamina

10

S – serina SDS - dodecilsulfato de sodio

s – segundos

15

T – treonina

T. carinatus -Tropidechis carinatus

20

TFA - ácido trifluoroacético Thr – treonina

TOF - tiempo de vuelo

25

V – valina

Y – tirosina

30

-me --mercaptoetanol l - microlitros

mol - micromolar

35

Tabla 1

Etapa

Volumen de muestra (ml) A280 total Actividad total (unidades) Actividad específica (unidades/ml/A280) Rendimiento (%) Purificación

Complejo de SVP marrón con NaSCN

20,0 80,0 106,5 1,3 100 -

Etapa 1

15,0 25,7 51,2 2,0 48,1 1,5

Etapa 2

8,0 13,0 27,3 2,1 25,6 1,6

Etapa 3

5,5 7,3 17,2 2,4 16,1 1,8

Tabla 2 Tabla 3

ETAPA

VOLUMEN DE MUESTRA (ml) A280 TOTAL ACTIVIDAD TOTAL (UNIDADES) ACTIVIDAD ESPECÍFICA (UNIDADES/ML/A280) RENDIMIENTO (%) PURIFICACIÓN

Complejo de SVP marrón con NaSCN

18,0 50,4 40,1 0,8 100 -

Etapa 1

5,0 13,0 13,1 1,0 32,6 1,2

Etapa 2

3,5 10,4 10,9 1,1 27,2 1,3

ETAPA

VOLUMEN DE MUESTRA (ml) A280 TOTAL ACTIVIDAD TOTAL (unidades) ACTIVIDAD ESPECÍFICA (unidades/ml/A280) RENDIMIENTO (%) PURIFICACIÓN

Complejo de SVP marrón + NaSCN

10,0 89,0 32,5 0,4 100 -

Superdex 200 (etapa 1)

20,0 7,0 9,2 1,3 28,3 3,25

Superdex 200 (etapa 2)

40 3,0 4,4 1,5 13,5 3,75

Tabla 4

ETAPA

VOLUMEN DE MUESTRA (ml) A280 TOTAL ACTIVIDAD TOTAL (unidades) ACTIVIDAD ESPECÍFICA (unidades/ml/A280) RENDIMIENTO (%) PURIFICACIÓN

Complejo de SVP marrón

32,0 38,4 501,2 13,1 100 -

Superdex 200 (etapa 1)

9,0 17,1 231,3 13,5 46,1 1,0

Superdex 200 (etapa 2)

9,5 16,2 168,2 10,4 33,6 0,8

Tabla 5

ETAPA

VOLUMEN DE MUESTRA (ml) A280 TOTAL ACTIVIDAD TOTAL (unidades) ACTIVIDAD ESPECÍFICA (unidades/ml/A280) RENDIMIENTO (%) PURIFICACIÓN

Veneno

25,0 700 2087 2,97 100 -

ConA 4B

640,0 379,0 97,3 0,257 4,6 0,09

CM-Sepharose

17,5 79,0 25,0 0,32 1,2 0,12

Superdex 200

7,5 2,5 1 0,442 0,05 0,15

Tabla 6

ETAPA

VOLUMEN DE MUESTRA (ml) A280 TOTAL ACTIVIDAD TOTAL (unidades) ACTIVIDAD ESPECÍFICA (unidades/ml/A280) RENDIMIENTO (%) PURIFICACIÓN

Complejo de SVP marrón

22,0 20,9 110 5,3 100

Fenil-Sepharose

10 4,85 14 2,9 12,7 0,55

Superdex 200

3,5 1,14 6,4 5,6 5,8 1,1

10 Tabla 7 Tabla 8

CONDICIÓN

PENDIENTE R2

A Complejo de SVP marrón solo

0,0022 0,9965

B Complejo de SVP marrón con CaCl2 10 mM

0,0025 0,9884

C Complejo de SVP marrón con CaCl2 10 mM+fosfolípido

0,0041 0,9852

TIEMPO DE COAGULACIÓN (s)

B COMPLEJO DE SVP (g)  COMPONENTES AUXILIARES

Solo

Ca2+ Ca2+ y PL

20

0,5 0,5 0,6

10

2,5 3 3

Tabla 9

SVP marrón (g/ml)

Tiempo de coagulación (s) – Ca2+ Tiempo de coagulación (s) +Ca2+

39,000

27,3 14,9

26,000

35,1 18,7

13,000

38,4 23,4

6,500

51,6 24,0

2,600

> 100 27,6

1,300

>100 34,5

0,650

>100 34,7

Tabla 10

TIEMPO DE COAGULACIÓN (s)

SVP MARRÓN (g)  COMPONENTES AUXILIARES

Sola

Ca2+ Ca2+ y PL

70

4 0,02 0,002

50

11 0,05 0,004

Tabla 11

SVP marrón (g/ml)

ΔA405/min. -Ca2+ ΔA405/min. +Ca2+

39

0,70 1,11

19,5

0,33 0,90

13

0,26 0,36

6,5

0,15 0,24

2,6

0,12 0,11

1,3

0,06 0,09

0,65

0,03 0,05

0,33

0,01 0,01

10 Tabla 12

TIPO DE COÁGULO

TIEMPO (S)

SVP marrón

120

SVP marrón con CaCl2 40 mM

60

CaCl2 solo

1800

Tabla 13

MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LA MASA

MASA MOLECULAR (DA)

Cadena pesada

Cadena ligera Proteína intacta

SDS-PAGE

35000 29000 53000

Espectrometría de masas

- - 48000

Calculada a partir de la secuencia de ADNc sin propéptido (residuos 1-40)

27952 18789 46723

Calculada a partir de la secuencia de ADNc sin propéptido y suponiendo que la cadena ligera tiene 141 residuos como la de trocarina

27952 15652 43587

Calculada a partir de la secuencia de ADNc sin propéptido, cadena ligera de 141 residuos, residuos de Gla y glicosilación al mismo nivel que trocarina

- - 47647

Tabla 14 Tabla 15

Tratamiento

Pérdida de sangre (gramos) (n=2) Sangre relativa conservada (%)

Solución salina

0,4335 -

Proteasa/Ca2+ 10 mM

0,0166 96,17

PRUEBA

PÉRDIDA DE SANGRE (g) CONTROL PÉRDIDA DE SANGRE (g)

1

0,12 1 0,64

2

0,16 2 0,71

3

0,29 3 0,42

4

0,10 5 0,39

Pérdida de sangre promedio (g)  DE

0,169 g  0,086 Pérdida de sangre promedio (g)  DE 0,542  0,160

Tabla 16

Venenos de serpiente

Concentración de veneno (mg/ml) Tiempos de coagulación (s  0,5 s)

A

Pseudonaja textilis- Qld

2,0 3,9

Pseudonaja textilis- SA

2,0 5,4

Pseudonaja textilis- Goyder

2,0 8,4

lagoon

Pseudonaja nuchalis

2,0 8,7

Pseudonaja affinis

2,0 5,5

Pseudonaja inframacula

2,0 7,9

Oxyziranus scutellatus

200,0 24,1

Oxyuranus microlepidotus

500,0 19,7

Notechis scutatus

500,0 34,9

Notechis ater niger

500,0 27,7

Notechis ater serventyi

1.000,0 31,1

Hoplocephalus stephansii

1.000,0 36,2

Pseudechis porphiracus

500,0 48,6

Australaps surperba

1.000,0 38,7

Tropedechis carinatus

500,0 34,9

B

Australaps ramsayii

1.000,0 250>coágulo<600

Pseudechis guttatus

1.000,0 250>coágulo<600

Pseudechis australis

1.000,0 > 100; sin coágulo

Pseudechis colletti

1.000,0 > 100; sin coágulo

Acanthopis antarcticus

1.000,0 >100; sin coágulo

Cryptophis nigrescens

1.000,0 >100; sin coágulo

C

Bothrops jararaca

100,0 11,7

Agkistradorn rhodasroma

100,0 6,3

Vipera russelli

500,0 >200

Naja naja

500,0 >200

Naja naja miolepis

500 >200

Echis carinatus

200,0 10,4

Bothrops atrox

100,0 5,3

Bungarus fasciatus

50,0 12,6

Ophiophagus hannah

100,0 >200; coágulo débil

5 A lo largo de la memoria descriptiva, el objetivo ha sido describir las realizaciones preferidas de la invención sin limitar la invención a una realización o colección de características específica cualquiera. Por tanto los expertos en la técnica apreciarán que, a la luz de la presente descripción, pueden hacerse diversas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares mostradas a modo de ejemplo sin apartarse del alcance de la presente invención tal

10 como se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Uso de una proteasa de veneno de serpiente (SVP) aislada que está codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comparte una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia de la figura 20A, en la fabricación de un medicamento para aumentar la coagulación y/o disminuir la pérdida de sangre en un sujeto.

2. 2.

   Proteasa de veneno de serpiente aislada que está codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comparte una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia de la figura 20A, para su uso en el aumento de la coagulación y/o la disminución de la pérdida de sangre de manera terapéutica en un sujeto.

3. 3.

   Uso según la reivindicación 1 o SVP aislada según la reivindicación 2, en el que la SVP aislada está codificada por una secuencia que comparte una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de la figura 20A.

4. 4.

   Uso según la reivindicación 1 o SVP aislada según la reivindicación 2, en el que la SVP aislada comparte una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de la figura 20B.

5. 5.

   Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4 o SVP aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la SVP se produce de manera recombinante usando un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos tal como se define en la reivindicación 1 ó 2, en el que la molécula de ácido nucleico comprende además secuencias de ácido nucleico de vector.

6. 6.

   Uso o SVP aislada según la reivindicación 5, en el que la molécula de ácido nucleico comprende además secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido heterólogo.

7. 7.

   Uso o SVP aislada según la reivindicación 5 ó 6, en el que la molécula de ácido nucleico está en forma de un vector.

8. 8.

   Uso o SVP aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la molécula de ácido nucleico está contenida en una célula huésped.

9. 9.

   Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4 o SVP aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la SVP se produce mediante un método que comprende cultivar la célula huésped tal como se define en la reivindicación 8 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico.

10. 10.

    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4 o SVP aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el medicamento comprende un poliol.

11. 11.

    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4 o SVP aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la SVP se formula con un portador farmacéuticamente aceptable.

12. 12.

    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 11 o SVP aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que dicho medicamento inhibe la hemorragia de un sitio en o dentro del cuerpo de un sujeto.

13. 13.

    Uso o SVP aislada según la reivindicación 12, en el que dicho sitio es el sitio de una intervención quirúrgica

    o médica, o es el sitio de traumatismo no deseado.

14. 14.

    Uso o SVP aislada según la reivindicación 12, en el que dicha SVP es para su administración por otra persona que no sea el sujeto.

15. 15.

    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 14 o SVP aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en el que la SVP se dispone en un dispositivo en una cantidad suficiente para inhibir la hemorragia cuando el dispositivo se pone en contacto con un sujeto.

16. 16.

    Uso o SVP aislada según la reivindicación 15, en el que dicho dispositivo es cualquier vendaje, compresa, apósito, sutura o prenda de vestir.