CN105899242A - 包含聚合抑制剂的一组分纤维蛋白胶 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含纤维蛋白单体和可逆纤维蛋白聚合阻断剂的稳定液体封闭剂制剂、制剂的制备和使用方法。

Description

包含聚合抑制剂的一组分纤维蛋白胶
序列表
本申请含有以ASCII格式通过EFS-Web与本申请同时提交并且据此全文以引用方式并入的序列表。2013年12月22日创建的所述ASCII副本命名为“序列表”并且大小为8千字节。
技术领域
本文提供一种单一组分液体封闭剂制剂、它的制备方法和它用于尤其是止血、封闭、愈合和/或外科的使用方法。具体地，本文公开一种包含纤维蛋白原单体和GPRP肽的液体封闭剂制剂。制剂表现出稳定性和延长的储存寿命并且在阻断、中和、稀释和/或除去肽之后为可用的。
背景技术
纤维蛋白封闭剂也称为纤维蛋白胶，已在临床中使用了数十年(参见例如，Tabélé等人，J Pharm Pharmaceut Sci 2012，15:124–140；Dickneite G等人，Thrombosis Res 2003，112:73–82)。通常，纤维蛋白封闭剂由两种液体组分组成，包含纤维蛋白原的组分和包含凝血酶的组分，此类组分由于它们固有的不稳定性被冷冻储存。有时纤维蛋白封闭剂产品由两种冷冻干燥的组分组成，所以需要就在使用之前重构以及通过连接的注射器或其它双筒递送装置进行递送。冷冻干燥的制剂通常是稳定的，但是纤维蛋白原组分难以重构。在将两种组分溶液混合之后，凝血酶裂解纤维蛋白原，因此使纤维蛋白原生成纤维蛋白聚合物。
纤维蛋白封闭剂凝块通过涉及纤维蛋白原、凝血酶和因子XIII的酶促反应形成。纤维蛋白原是血凝块基质的前体蛋白质。它具有约340,000Da的分子量，并由通过二硫键连接的3对不同多肽链Aα、Bβ和γ组成。纤维蛋白原具有三结节结构：两个相同的D末端球状域和一个中心E球状域，它们通过超螺旋的α螺旋连接。凝血酶通过酶促作用将纤维蛋白原转化成纤维蛋白单体，速率由凝血酶的浓度决定。
因子XIII为血液凝固系统的酶，通常存在于胶制剂中，当通过凝血酶活化并且存在钙时使纤维蛋白凝块交联并稳定。此过程绕过了正常凝固的大多数步骤，并且模拟其最终阶段。一些制造商将抗蛋白溶解剂添加到纤维蛋白胶制剂中(例如，如WO93/05822中所述)或特异性除去纤溶酶原以使纤维蛋白溶解停止或延迟(例如，如美国专利5,792,835和7,125,569中所述)。
背景技术包括Laudano和Doolittle(PNAS 75(7):3085-9)以及美国专利5,219,328；5,318,524；8,367,802；5,750,657；6,262,236；6,268,483；6,500,427；5,723,579；5,478,810；5,607,858；6,908,899和8,513,380。
发明内容
纤维蛋白封闭剂在使用之前的制备是耗时的并且是繁琐的。市售的封闭剂由两种组分组成，包含纤维蛋白原的组分和包含凝血酶的组分，此类组分通常呈干粉或独立的冷冻液体的形式供应。用于重构粉末的过程由于纤维蛋白原组分的受限的溶解度而为耗时的，并且常常需要加热。一旦重构或融化，就要将组分转移到两个独立的注射器中从而立即使用。存在已知的单一组分封闭剂，此类封闭剂需要繁琐的处理和/或具有短的储存寿命。
本文提供包含纤维蛋白单体和GPRP肽或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂的单一组分稳定的封闭剂制剂、制造方法和使用方法，从而克服了已知封闭剂产品制剂、制造方法和/或使用方法的缺点。
可逆纤维蛋白聚合阻断剂可为大小小于约一(1)kD的试剂。在一些实施方案中，试剂为小分子和/或分离的肽、它们的衍生物或盐，此类试剂能够可逆地结合纤维蛋白单体并且防止或延迟纤维蛋白聚合。在一些实施方案中，可逆纤维蛋白聚合阻断剂包含小化学分子或分离的肽。可逆纤维蛋白聚合阻断剂可为对纤维蛋白单体的亲和力低并且对纤维蛋白聚合不具有永久性作用的结合试剂。因此，通常稀释和/或小分子交换将引发聚合。本文中的阻断剂通过将pH降低至酸性pH不起作用。
在一个方面，提供一种液体封闭剂制剂，其包含浓度为1％至13％(w/v)的纤维蛋白单体；和GPRP肽和/或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂；其中阻断剂和/或GPRP肽以相对于纤维蛋白单体摩尔过量超过约100或超过约340的量存在；并且其中液体制剂在选自由以下项组成的组的环境温度下稳定至少14天：约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃。
在一个实施方案中，液体制剂在选自由以下项组成的组的环境温度下稳定多至90天：约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃。
在一个实施方案中，液体制剂在选自由以下项组成的组的环境温度下稳定在14天和多至90天的范围内的时间段：约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃。
在一个实施方案中，GPRP肽以相对于纤维蛋白单体摩尔过量约超过100至约460或超过100至约340、或约340至约460倍的量存在。
如本文所用的术语“纤维蛋白单体”包括纤维蛋白单体、二聚体和具有多个纤维蛋白单元的低聚体，使得纤维蛋白在选自由以下项组成的组的环境温度下在水性液体溶液中呈可溶形式保持：约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃。
在一个实施方案中，低聚体含有多至10个纤维蛋白单元。
如本文所用的术语“纤维聚合物”包括多个具有多个纤维蛋白单元的纤维蛋白单元，从而限制了纤维蛋白在选自由以下项组成的组的环境温度下在水性液体溶液中的溶解度：约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃。
在一个实施方案中，聚合物含有超过10个纤维蛋白单元。
“环境温度”为纤维蛋白制剂的周围环境的温度。
在一个实施方案中，制剂当在较低温度例如2-8℃下保存或被冷冻时稳定较长时间段。在融化之后，制剂可被转移到具有约20-25℃环境温度的位置并在那个温度下保持稳定至少14天。制剂还可在除上文所具体描述的温度之外的温度下为稳定的。
在各种实施方案中，纤维蛋白单体以1％至4％(w/v)或3.5％至13％(w/v)的浓度存在。
在一些实施方案中，制剂还包含药学上可接受的载体。
术语“药学上可接受的载体”是指适于人或其它动物使用的任何稀释剂或媒介物。
在一些实施方案中，制剂基本上不含添加的凝血酶。“基本上不含”是指小于约一(1)IU的凝血酶每毫升(U/ml)的制剂。
在一些实施方案中，GPRP肽包括包含Gly-Pro-Arg-Pro四肽氨基酸序列的肽、它们的衍生物或盐。
在一些实施方案中，GPRP肽为具有SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列的四肽或它们的衍生物或盐。
在一些实施方案中，GPRP肽为由SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列组成的四肽或它们的衍生物或盐。
在各种实施方案中，“GPRP肽”包括选自由具有选自以下的氨基酸序列的肽或它们的衍生物或盐的肽：SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:42(SEQID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ IDNO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ IDNO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27；SEQ IDNO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ IDNO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；和SEQ ID NO:42)。
在各种实施方案中，GPRP肽选自具有选自SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:42的氨基酸序列的肽或它们的衍生物或盐。
在各种实施方案中，GPRP肽选自由由选自SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:42的氨基酸序列组成的肽或它们的衍生物或盐。
在一些实施方案中，GPRP肽为GPRP肽酰胺。
在一些实施方案中，制剂还包含凝血酶活化的因子XIII。制剂可还包括钙螯合剂。钙螯合剂可为柠檬酸根离子、草酸根离子、EDTA、EGTA、或此类钙螯合剂的组合。在各种实施方案中，钙螯合剂为例如柠檬酸钠所提供的柠檬酸根离子。柠檬酸钠可以约1mM至约50mM浓度存在于制剂中。制剂可包括EDTA和/或EGTA，例如约0.1mM至约2.5mM的EDTA和/或EGTA。
在一些实施方案中，制剂具有中性pH，例如约6-8的pH或约6.5-7.5的pH或约6.7-7.2的pH。
在一些实施方案中，制剂含有缓冲液。通常，缓冲液为防止pH的极端偏移的成分。在一个实施方案中，缓冲液选自由以下项组成的组：柠檬酸钠、草酸钠、乙酸钠、甘氨酸、精氨酸、以及它们的组合。
制剂可用于止血、愈合、封闭和/或外科，例如组织封闭、创伤愈合、硬脑膜愈合、缝合线替换或吻合。
在另一个方面，本文提供一种容纳如本文所公开的液体封闭剂制剂的容器。在一些实施方案中，容器为安瓿、小瓶或包含制剂的预填充的注射器。在一些实施方案中，制剂或制剂的各个组分是冻干的。本文提供一种容纳冻干制剂的容器，冻干制剂在重构之后提供如本文所公开的液体封闭剂制剂。
在另一个方面，本文提供一种试剂盒，该试剂盒包括包含如本文所公开的液体封闭剂制剂的容器和任选地小分子交换装置或G除去装置(以及任选地使用说明)。
小分子交换装置可为含有用容许纤维蛋白聚合的小分子预平衡的树脂的任何模块。制剂内的小分子被交换为所述容许聚合的小分子。
通常，小分子交换为将至少一种小分子用至少另一种小分子置换。柱中的树脂用一种或多种最终制剂中所需的小分子和/或容许纤维蛋白聚合的分子预平衡。树脂珠粒通常为多孔的，孔在待置换的那些分子的分子量的范围内。
在一个实施方案中，使包含纤维蛋白单体和GPRP肽的液体制剂通过装填有多孔树脂的柱。制剂中的纤维蛋白单体将太大以至于不能进入树脂的孔并且将快速地通过柱。不受机制的束缚，溶液中的小分子例如GPRP肽，将沿一条更曲折的路径行进，因为它们能够进入并再离开树脂的孔，因此大大减缓了它们通过树脂的迁移速率。不受理论的束缚，那些使树脂预平衡的小分子具有显著领先的优点，并由此与蛋白质(例如纤维蛋白单体)一起离开树脂。因此，缓冲液、盐和其它小分子在这个步骤中得以交换。
在一个实施方案中，在施用制剂之前和/或期间，将GPRP相对于纤维蛋白单体进行稀释并且比率为等于或小于100，诸如比率为1-60，例如3、4、11、11.3、17、22.7、23、34、45、56.7或57。
在另一个实施方案中，试剂盒中的制剂或制剂的各个组分为冻干的。因此，试剂盒包括了包含呈粉末或液体的纤维蛋白单体的容器、包含呈粉末或液体的GPRP肽的容器和任选地包含重构液体的容器，重构液体诸如水、乙酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液或以中性pH的精氨酸缓冲液或以中性pH的柠檬酸盐缓冲液。在一个实施方案中，干燥纤维蛋白单体和GPRP肽粉末提供于相同的容器中。
容器或试剂盒中的制剂可还包含药学上可接受的载体。
在又一个方面，提供一种用于在表面处制备封闭剂的方法，该方法包括：
a)提供如本文所公开的液体封闭剂制剂；以及
b)在促进纤维蛋白在表面处聚合的条件下将制剂施用至表面。
在一些实施方案中，表面为受治疗者的出血或未出血器官/组织。受治疗者包括哺乳动物，包括人，并且可为人患者。在一些实施方案中，人患者为外科患者。
“表面”为人们期望形成封闭剂或胶的位置或方位。表面取决于封闭剂的使用。封闭剂可用于例如止血、组织固定、移植物固定、创伤愈合和吻合。本文所公开的制剂、方法和试剂盒可在内部或在外部用于组织和器官移植物固定、封闭外科创伤、包括提供止血的血管外科和吻合，诸如动脉、胃肠和气管吻合。
表面可以是可裸眼视力可见的皮肤的外表面以及为生物体内部解剖结构一部分的体内部分的表面。外表面包括但不限于面部、咽喉、头皮、胸部、背部、耳朵、颈、手、肘、臀、膝盖的皮肤以及其它皮肤部位。体内部分的示例包括但不限于暴露于外部环境和内部器官的体腔或解剖学开口，诸如鼻孔；唇；生殖器区域，包括子宫、阴道和卵巢；肺；肛门；脾；肝；和心肌。表面可为出血或未出血的部位。表面还可为工作表面。
在一些实施方案中，条件包括除去、阻断、中和和/或稀释GPRP肽。GPRP肽可通过将制剂直接施用到表面来除去或稀释。另选地，GPRP肽可通过使制剂通过小分子交换装置来除去或稀释。另外，GPRP肽可通过使制剂在施用到表面之前或期间通过基于尺寸排阻和/或亲合力的装置来除去或稀释。其它除去或稀释选项包括将GPRP-互补部分添加到装置。装置中的互补部分可基本上为亲合力方法。
另选地或除此之外，制剂中的GPRP可通过添加肽例如GPRP肽的互补部分或能够置换与纤维蛋白结合的GPRP的抗体来中和和/或阻断。
在又一方面，提供一种在有需要的受治疗者中愈合、封闭和/或减少失血的方法，该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的本文所公开的液体封闭剂制剂。制剂在促进纤维蛋白聚合的条件下施用到受治疗者。在一些实施方案中，条件包括除去、阻断、中和和/或稀释GPRP肽。
术语“治疗有效量”是指预防、改善和/或治疗疾病、病症或病状所需的剂量。有效剂量可根据受治疗者的年龄和体重、疾病或病状和它的严重性以及本领域技术人员可认识到的其它因素而变化。
在另一个方面，提供一种如本文所公开的液体封闭剂制剂，其用于愈合、封闭、减少失血和/或外科。
在又一个方面，本文提供一种制造如本文所公开的液体封闭剂制剂的方法，该方法包括：
a)提供包含纤维蛋白单体的组分；
b)提供GPRP肽或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂、它们的衍生物或盐；
c)掺和a)和b)以便获得液体封闭剂制剂，所述液体封闭剂制剂包含相对于纤维蛋白单体摩尔过量超过100或超过至少340倍的量的GPRP和浓度为1％至13％(w/v)的纤维蛋白单体。
在某一实施方案中，比率为相对于纤维蛋白单体摩尔过量约超过100至约460或超过100至约340、或约340至约460倍。
术语“掺和”意指以任何次序、任何组合和/或亚组合的形式混合组分。
另外提供一种可通过该方法获得的液体封闭剂制剂。
纤维蛋白单体可通过在允许纤维蛋白原裂解成纤维蛋白的条件下使包含水性纤维蛋白原的溶液与凝血酶接触来获得。在此类实施方案中，纤维蛋白单体的制备是在纤维蛋白聚合受到抑制的条件下进行，例如在存在GPRP或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂时。在一个实施方案中，纤维蛋白在抑制聚合(例如通过降低温度)的条件下从纤维蛋白原获得，并且稍后添加GPRP肽。
凝血酶可在溶液中是游离的或被固定在珠粒上。
如果凝血酶被固定在珠粒上，例如以分批的形式或在柱中的珠粒，并且纤维蛋白原组分穿过/接触珠粒，那么所得的制剂/组分可包含残余量的凝血酶。在一些实施方案中，制剂基本上不含凝血酶，例如具有小于约一(1)IU/ml的凝血酶。
在一些实施方案中，制剂/组分包括凝血酶活化的因子XIII。
另选地，制剂中的纤维蛋白单体可通过在允许纤维蛋白原裂解成纤维蛋白的条件下使包含水性纤维蛋白原的溶液与凝血酶样酶接触来获得。此类酶的示例为裂解纤维蛋白肽A(FpA)的蛇毒酶，如巴曲酶(Batroxobin)。在此类实施方案中，纤维蛋白单体的制备是在纤维蛋白聚合受到抑制的条件下进行，例如在存在GPRP或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂时。
在一些实施方案中，纤维蛋白单体组分/制剂还包括钙螯合剂。
在一些实施方案中，制造方法包括干燥步骤以提供干燥制剂。
GPRP肽和/或包含纤维蛋白单体的组分可呈粉末和/或液体形式。
还提供一种使用本文所提供的方法所制造的封闭剂制剂。
纤维蛋白原可由初始血液组合物制备。血液组合物可为全血或血液级分，即全血制品，诸如血浆。纤维蛋白原可为自体的、人来源(包括汇集血浆)或非人来源。还可能的是，纤维蛋白原通过重组方法来制备或可被化学改性。
在本发明的一个实施方案中，纤维蛋白原溶液包含作为来源于血浆的蛋白质溶液的生物活性组分(BAC)，纤维蛋白原溶液可还包含纤维蛋白溶解剂诸如氨甲环酸和/或稳定剂，诸如精氨酸、赖氨酸、它们药学上可接受的盐、或它们的混合物。BAC可来源于冷析出物，尤其是浓缩的冷析出物。
术语“冷析出物”是指得自由全血制备的冷冻血浆的血液组分。当将冷冻血浆在寒冷条件下(通常在0-4℃的温度下)解冻，导致形成含有纤维蛋白原和因子XIII的析出物时，可获得冷析出物。析出物可例如通过离心来收集并溶解于合适的缓冲液中，诸如含有120mM的氯化钠、1mM的氯化钙、10mM的柠檬酸三钠、120mM的甘氨酸、95mM的盐酸精氨酸的缓冲液。BAC的溶液可包含附加因子，诸如像因子VIII、纤粘蛋白、血管性血友病因子(vWF)、玻连蛋白等，例如US 6,121,232和WO9833533中所述。BAC的组合物可包含稳定剂，诸如氨甲环酸和盐酸精氨酸。BAC的溶液中氨甲环酸的量可为约80mg/ml至约110mg/ml。
在另一个实施方案中，例如5μg/ml或更低的纤溶酶原，例如使用如US 7,125,569、EP 1,390,485和WO02095019中所述的方法，将BAC组合物中纤溶酶原和纤溶酶的浓度降低至等于或低于15μg/ml。在另一个实施方案中，当将BAC组合物中纤溶酶原和纤溶酶的浓度降低时，组合物不含有氨甲环酸或抑肽酶。
纤维蛋白原溶液可为含有BAC2组分(来自)或任何其它纤维蛋白原的溶液，诸如经纯化的重组纤维蛋白原或从人血浆产生的冷析出物。
在另一个实施方案中，制剂为充分溶解的溶液，例如溶质和溶剂成分仅构成一个相例如液相的溶液。
在参阅以下详细的具体实施方式和附图后，本发明的这些和其它方面和实施方案将变得显而易见。
附图说明
图1为示出在固定的纤维蛋白浓度下GPRP肽浓度对纤维蛋白聚合时间的影响的图。
图2A示出包含GPRP肽和纤维蛋白的液体制剂。
图2B示出在除去GPRP肽之后发生纤维蛋白聚合。在该实施方案中，GPRP通过使制剂经受小分子交换装置来除去。
具体实施方式
本公开部分基于在一定浓度下包括纤维蛋白单体和GPRP肽的稳定封闭剂制剂的发现。
本文提供以某一摩尔比包含纤维蛋白单体和GPRP肽的液体封闭剂制剂，从而克服了当前可用的封闭剂制剂的不足。本文另外提供封闭剂的制造方法和使用方法。
本文提供一种液体封闭剂制剂，其包含a)纤维蛋白单体；和b)GPRP肽或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂。纤维蛋白单体以约1％至约13％(重量每体积(w/v))的浓度存在。在一个实施方案中，GPRP肽具有氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Pro(GPRP；SEQ ID NO:1)、它们的衍生物或盐，并且以相对于纤维蛋白单体摩尔过量超过100倍、相对于纤维蛋白单体摩尔过量超过或等于约340倍或摩尔过量约340至约460倍的量存在。
在另一个实施方案中，GPRP肽包含氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:1)或Gly-Pro-Arg-Val(SEQ ID NO:23)。
在各种实施方案中，GPRP肽选自具有选自SEQ ID NO:2-SEQ IDNO:42的氨基酸序列的肽。
稳定性可通过在制剂中观察到最小限度的或不存在自发聚合或凝结来确定，例如制剂在存在GPRP肽多至14天时不示出或具有自发聚合或凝结，并且在除去、稀释、阻断和/或中和GPRP至等于或小于100的摩尔过量时保持它的凝结活性水平。制剂的凝结活性水平或形成封闭剂的能力可使用本领域中已知的凝结技术体外和/或体内确定。稳定性还可通过在即可上架(shelf-ready)的液体制剂中测量并观察到存在最小限度的或不存在纤维蛋白聚合物或凝块来确定。
在使用时，GPRP作用可例如通过根据预期用途稀释至一定浓度来减小。对于止血，将为有利的是获得小于一分钟的凝结时间。在一个实施方案中，制剂中的GPRP浓度被稀释至等于或小于100倍的摩尔过量或等于或小于34倍的摩尔过量。
对于移植物固定，将为有利的是获得大约15分钟的凝结时间。在一个实施方案中，制剂中的GPRP浓度被稀释至等于或小于100倍的摩尔过量或等于或小于56倍的摩尔过量。
术语“稳定的”和“稳定性”当指代液体封闭剂制剂时意指在被施用到表面之前制剂中不存在纤维蛋白聚合/纤维蛋白凝块。本文所公开的制剂在如上文所定义的环境温度下稳定至少14(十四)天。
纤维蛋白聚合或凝结可例如通过在倾斜表面上测量迁移长度(或下落试验模型)或通过本领域中已知的任何其它方法来测量。充分聚合可通过液体制剂例如在倒置时的流动停止来评价。迅速聚合可使用Stat4凝结分析仪Stago Diagnostics或类似的测凝计测量。
对于在2-8℃下长期储存例如一年或更长时间，包含纤维蛋白单体和GPRP肽的制剂可被等分到无菌小瓶、安瓿或其它容器中，然后将这些容器封闭。在一个实施方案中，使用允许利用注射器穿过封闭件移除制剂的封闭件。可根据药学或医疗装置领域的标准操作标记容器。
在使用时，液体封闭剂制剂可从容器中被直接施用，可穿过小分子交换装置，或通过GPRP除去装置(例如具有GPRP-互补部分的亲和力装置)；虽然使用方法将由使用者(例如医疗工作者诸如医师、护士、医生)决定，即根据各个患者的需要并且基于出血或病状的严重性。
除非上下文中明确地指出，否则本文所用的不定冠词“一个(a)”和“一个(an)”意为“至少一个”或“一个或多个”。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、以及它们的语法变体应被视为指定所述特征、步骤或组分，但不排除添加一种或多种另外特征、步骤、组分或它们的组。
当数值前面为术语“约”时，术语“约”旨在指示+/-10％。
如本文所用，术语“肽”广泛地用于指约4至约50个连续氨基酸的分离化合物或氨基酸类似物。在肽的定义内包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如合成氨基酸、类肽等)的肽，具有取代的键合、肽盐以及本领域中已知的其它修饰的肽，这两种肽为天然存在的或非天然存在的(例如，合成的)。因此，合成肽、环化肽、支链肽等都包括在定义内。
术语“肽”还包括本发明氨基酸序列的具有一个或多个取代、添加和/或缺失的衍生物，包括一种或多种非天然存在的氨基酸。优选地，衍生物表现出与参考序列至少约50％同一性，优选地至少约70％同一性，更优选地与本文所述的参考序列至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。肽衍生物可包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(一般来讲在性质上是保守的)，只要肽保持所需的活性即可，例如可逆地抑制纤维蛋白聚合。
这些修饰可为故意的，如通过定点突变诱发，或可为偶然的，诸如通过产生蛋白质的宿主的合成或突变或归因于PCR扩增的错误。本文另外涵盖的是肽的药学上可接受的盐和此类盐的衍生物。
可逆抑制剂涉及对纤维蛋白单体的亲和力低并且对纤维蛋白聚合或纤维蛋白凝块不具有永久性作用的抑制剂(例如GPRP肽)。因此，通常稀释、除去和/或小分子交换将除去抑制作用。
术语“可逆聚合抑制剂”可在本文与术语“可逆纤维蛋白聚合阻断剂”互换使用。
“GPRP肽”意指SEQ ID NO:1中所列出的四个或更多个连续氨基酸序列的肽，明确地说，序列Gly-Pro-Arg-Pro。GPRP肽可包含四聚体(GPRP，SEQ ID NO:1)、它们的衍生物或类似物。GPRP肽可为长度为4至12个氨基酸的残基或长度为4至8，优选地4、5、6、7或8个氨基酸。
不受理论束缚，GPRP肽能够与纤维蛋白单体结合，从而阻断了纤维蛋白单体的缔合和聚合。GPRP肽可包括例如以引用方式并入的美国专利5,478,810和5,607,858中所公开的GPRP肽酰胺(酰胺在C末端)，具有式GPRP-X-N(R1R2)，其中G为氨基酸甘氨酸，P为氨基酸L-脯氨酸，R为氨基酸L-精氨酸，X为除脯氨酸之外的生蛋白氨基酸或为包括脯氨酸的二肽，N为氮并且R1和R2相同或不同或为氢或具有至多4个碳原子的低级烷基链。其它GPRP肽包括美国专利8,513,380中所公开的称为“纤维蛋白钮肽(fibrin knob peptide)”的肽，诸如具有氨基酸序列GPRP(SEQ IDNO:1)、GPRV(SEQ ID NO:2)或GHRP(SEQ ID NO:3)的肽。GPRP肽可具有氨基酸序列GPRPX(SEQ ID NO:32)、GPRVX(SEQ IDNO:33)、GPRPXX(SEQ ID NO:34)、GPRVXX(SEQ ID NO:35)、GPRPXXX(SEQ ID NO:36)、GPRVXXX(SEQ ID NO:37)、GPRPXXXX(SEQ ID NO:38)或GPRVXXXX(SEQ ID NO:39)或GPRXXX(SEQ ID NO:40)，其中X为任何氨基酸。
肽还可具有C末端氨基酸，诸如像半胱氨酸或赖氨酸，此类氨基酸允许与其它试剂进行后续的化学反应以产生C末端缀合物。因此，在一些实施方案中，肽的C末端氨基酸为半胱氨酸。因此，在一些实施方案中，肽的C末端氨基酸为赖氨酸。例如，GPRP可具有氨基酸序列GPRPAAC(SEQ ID NO:25)、GPRPFPAC(SEQ ID NO:26)、GPRPPERC(SEQ IDNO:27)、GPRVVERC(SEQ ID NO:28)、GPRVVAAC(SEQ IDNO:29)或GPSPAAC(SEQ ID NO:30)。
SEQ ID NOS:1-42中所列出的任何肽序列可为肽酰胺，例如上文所参考的专利中所公开的。
氨基酸和肽序列的常用缩写如下在表A中所示。
表A：常见氨基酸的缩写、系统命名和化学式
在一个实施方案中，使用氨基酸类似物序列，由此分离肽中的至少一个氨基酸被类似物或生物类似氨基酸取代(保守取代)，如本领域中已知的。氨基酸可以是L形式、D形式或它们的衍生物(如，伪氨基酸、官能化的氨基酸(例如氟化的氨基酸……等)、β氨基酸、γ氨基酸……等)。
本领域的技术人员将认识到，本文所公开的肽可合成为肽的衍生物，包括“模拟肽”。模拟肽或“拟肽”为在性质上不完全是肽，但是模拟在结构上所基于的肽的生物活性的分子。此类拟肽包括含有非天然存在的氨基酸的肽样分子。拟肽可包括一种或多种氨基酸类似物或可为肽样分子，含有例如酰胺键电子等排体诸如逆向-反转修饰；还原酰胺键；亚甲基硫醚或亚甲基亚砜键；亚甲基醚键；次乙基键；硫代酰胺键；反式烯烃或氟烯烃键；1,5-而取代四唑环；酰亚胺键；酮亚甲基或氟代酮亚甲基键或另一酰胺电子等排体。术语还包括包含一种或多种N取代的甘氨酸残基(“类肽”)和其它合成氨基酸或肽的分子。(对于肽的描述参见例如，美国专利5,831,005；5,877,278；和5,977,301；Nguyen等人(2000)Chem Biol.7(7):463-473；和Simon等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(20):9367-9371)。本领域的技术人员理解，这些和其它拟肽都涵盖在如本文所用的术语“拟肽”的含义内。
肽的氨基酸序列根据常规表示法书写，其中N末端的氨基基团(NH2)出现在序列的左边，并且C末端的羧基基团(COOH)出现在序列的右边。
本文所公开的肽可通过常规的盐形成反应形成生理上可接受的盐。此类盐可包括与无机酸诸如盐酸、硫酸和磷酸的盐；与有机酸诸如乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、油酸和棕榈酸的盐；与碱金属和碱土金属诸如钠、钾、钙和铝的氢氧化物和碳酸盐的盐；和与胺诸如三乙胺、苄胺、二乙醇胺、叔丁胺、二环己胺和精氨酸的盐。
链间和链内二硫键可形成，并且由此类二硫键的形成所得到的肽形式都由本发明所涵盖。
在一个实施方案中，本文所公开的肽为化学合成的。在其它实施方案中，本文所公开的肽通过原核或真核宿主细胞中重组DNA的表达来体内或体外产生。
在一些实施方案中，GPRP肽可逆地结合纤维蛋白和纤维蛋白原链的C末端区域。应当理解，优先的相互作用不必需要在特定氨基酸残基和/或各肽的基序之间的相互作用。
术语“基本上不含凝血酶”或“不含凝血酶的”涉及组分或制剂具有不超过约1(一)个单位的凝血酶每毫升(ml)制剂。
术语“有效量”是指本文所公开的组分或制剂形成封闭剂例如以覆盖受伤表面、减少出血、增加愈合、改善不期望的病状等所需的量。
“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”载体、溶剂、稀释剂、赋形剂和媒介物一般是指不与本文所公开的组分的活性成分反应的惰性、无毒的固体或液体填充剂、稀释剂或包封材料。可接受的赋形剂包括但不限于盐水；乙酸或乙酸盐；和氯化钠离子；甘露糖醇；白蛋白；或它们的组合。
本文所公开的肽根据本领域中已知的方法合成，包括但不限于合成(例如从各个氨基酸化学合成肽)和重组方法(例如合成编码肽的DNA并且使用该DNA产生重组肽)。
肽的化学合成：本文所公开的肽和编码肽的DNA可通过本领域中已知的方法化学合成。用于合成肽的合适方法由Stuart和Young(1984)，“Solid Phase Peptide Synthesis,”Solid Phase Peptide Synthesis，MethodsEnzymol.，第二版，Pierce Chemical Company，289，Academic Press，Inc.，NY(1997)描述。例如，可使用固相合成方法或液相合成方法。固相合成通常通过用适当的保护基保护氨基基团来进行。例如，可使用Boc(叔丁氧基羰基)或Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)或它们的组合。在一个实施例中，本文所公开的肽通过以下步骤合成：1)将对应于待产生的肽的C末端的氨基酸残基通过氨基酸的a-COOH基团与不溶于反应溶剂的固相材料结合，或此类固相材料为购买的；2)在朝向肽的N末端的方向上，在保护了除a-COOH基团之外的其它官能团诸如对应氨基酸或肽片段的a-氨基基团之后，将对应的氨基酸或肽片段通过缩合与步骤1)的氨基酸结合；3)将形成肽键的氨基基团的保护基诸如a-氨基基团从键合的氨基酸或肽片段除去；4)重复步骤2)和3)以伸长肽链以形成对应于所期望的肽的肽链；5)使所产生的肽链从固相材料脱离并将保护基从所保护的官能团除去；以及6)将肽纯化，从而获得所期望的肽。
固相材料以及溶剂和缩合剂均为本领域中熟知的。
DNA的化学合成和表达：编码本文所公开的肽的DNA当在广泛多种克隆和表达载体中插入到广泛多种宿主细胞中之后可被复制并用于表达重组肽。宿主可为原核的或真核的。DNA可为化学合成的。用于合成DNA和克隆载体(例如用于哺乳动物、昆虫、织物细胞、细菌、噬菌体和酵母)的合适方法为可用的。可以融合蛋白的形式表达的重组肽通过本领域中已知的方法进行纯化。
虽然下列实施例说明了本发明的某些实施方案，但它们不应被理解为限制本发明的范围，而应理解为有助于完善本发明的描述。
实施例
实施例1：GPRP肽浓度对纤维蛋白聚合时间的影响。
为了评估肽的存在和它的浓度对纤维蛋白单体聚合速率的影响，培养GPRP肽:纤维蛋白单体的混合物并且测量凝块形成的时间。
如下制备GPRP肽:纤维蛋白单体的混合物：
将GPRP肽(Gly-Pro-Arg-Pro；由Sigma定制；肽呈冻干形式供应(250mg)并且溶解于100mM的二水合柠檬酸三钠中；pH＝7产生1M的GPRP)添加到纤维蛋白原溶液(如纤维蛋白封闭剂中的BAC2溶液)中。溶液中肽最终浓度在以下表1中列出。所使用的纤维蛋白原最终浓度为1％、1.5％、3％、3.5％。将含有7％可凝结纤维蛋白原的BAC2溶液[的纤维蛋白原组分]溶解于20mM pH 7.0的乙酸钠(NaAcetate)缓冲液中以获得最终所列出的浓度。
为了形成纤维蛋白，将凝血酶(如纤维蛋白封闭剂中)在10IU/ml或100IU/ml的最终浓度下添加到纤维蛋白原溶液中，然后记录凝结时间。通过评价当将管倒置时的流动估计凝结。
表1提供每个纤维蛋白和肽最终浓度的凝结时间的概要。
将纤维蛋白单体浓度估计为等于纤维蛋白原浓度。
表1：凝结时间随纤维蛋白和肽浓度的变化。
短期实验的结果：
一般来讲，当GPRP肽的浓度降低时，纤维蛋白单体以较快速率自发聚合。例如，在1％的纤维蛋白和0.1mM的GPRP(约3.4:1摩尔比的GPRP:纤维蛋白)下，纤维蛋白凝块即刻形成，在1％的纤维蛋白和1mM的GPRP(约34:1摩尔比)下，凝块在小于5分钟内形成。在1％的纤维蛋白和5mM的GPRP(约170:1)下，溶液呈液体形式稳定4小时，并且在1％的纤维蛋白和10mM的GPRP(约340:1)下，溶液呈液体形式稳定大约7-8天，但之后不聚合以形成固体。
长期实验的结果：
在1.5％的纤维蛋白浓度和20mM的GPRP(约453:1)下，或在3.5％的纤维蛋白和40mM的GPRP(约389:1)下，溶液是稳定的但即使在室温下2周之后仍不形成凝块。
这些实验示出，340:1的摩尔比(GPRP:纤维蛋白)有利地导致液体溶液稳定约7-8天。
利用所使用的两种凝血酶浓度观察到了类似的结果。
不受理论的束缚，此结果指出大部分或所有纤维蛋白原由凝血酶裂解，并且凝结时间的差异与GPRP相对于纤维蛋白的浓度有关。
聚合时间和GPRP:纤维蛋白摩尔比之间的关系还示出于图1中。
在此实验中，使用固定的(3％)纤维蛋白浓度和递增量的GPRP(0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM和5mM)来延迟聚合。所有这些(具有至多57:1的比率)都低于纤维蛋白单体的长期稳定所需的最小比率。如上文(通过将GPRP肽添加到纤维蛋白原溶液中并且将凝血酶添加到GPRP:纤维蛋白原混合物中)制备GPRP:纤维蛋白溶液。接着，如上记录凝结时间。
图1示出在纤维蛋白聚合速率和GPRP肽与纤维蛋白的摩尔比之间存在对数相关性。
这指出，纤维蛋白凝块形成速率可通过调整GPRP肽在溶液内的浓度来控制，以及将GPRP肽稀释至甚至很少量都将影响纤维蛋白聚合速率。
此外，在一些实施方案中，所定义的相关性允许通过控制施用之后(例如通过小分子交换装置)最终GPRP肽浓度来控制聚合速率。
实施例2：使用小分子交换装置从包含纤维蛋白和GPRP的溶液的纤 维蛋白凝块形成。
以下实施例旨在示出，引发和/或加速纤维蛋白凝块形成可通过使用小分子交换装置稀释或除去溶液中的GPRP肽来实现。
如上所述(通过将GPRP肽添加到3.8％的纤维蛋白原溶液中并且添加凝血酶以将纤维蛋白原裂解成纤维蛋白)制备含有浓度为大约3.8％的纤维蛋白、浓度为41mM的GPRP肽的GPRP肽的混合物(摩尔比为约366:1)。发现此摩尔比足以维持制剂稳定。
根据与装置一起提供的标准旋转协议使用小分子交换装置(GE PD-10旋转柱；产品代码：17-0851-01，GE Healthcare)以除去/稀释GPRP:纤维蛋白单体制剂中的GPRP肽。将交换装置用包括20mM的乙酸钠pH 7.0；25mM的氯化钙的缓冲液预平衡。使2.5ml的溶液经受缓冲液交换程序，并且通过将含有缓冲液交换的混合物的管倒置来评价纤维蛋白凝块形成。
小分子交换的制剂快速凝结(图2B)，然而未经受缓冲液交换程序的溶液保持液体形式(图2A)。
虽然本文已描述了各种实施方案，但是可以对那些实施方案实施多种修改和变型。另外，凡是公开了用于某些组分的材料的，均可使用其它材料。上述具体实施方式和下述权利要求旨在涵盖所有这样的修改和变型。
以引用方式全文或部分地并入本文的任何专利、公布或其它公开材料均仅在所并入的材料不与本公开所述的现有定义、陈述或其它公开材料相冲突的范围内并入本文。因此，并且在必要的程度下，本文明确阐述的公开内容取代以引用方式并入本文的任何冲突材料。
本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。
节段标题在本文用于易于理解说明书并且不应理解为必要限制性的。

Claims (22)

1.一种液体封闭剂制剂，所述液体封闭剂制剂包含浓度为1%至13%（w/v）的纤维蛋白单体和GPRP肽或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂；其中所述阻断剂或GPRP以相对于所述纤维蛋白单体摩尔过量超过100倍的量存在于所述制剂中；并且其中所述液体制剂在选自由以下项组成的组的环境温度下稳定至少14天：约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述GPRP肽以相对于所述纤维蛋白单体摩尔过量超过约340倍的量存在。
3.根据权利要求1所述的制剂，其中所述GPRP肽以相对于所述纤维蛋白单体摩尔过量约340至460倍的量存在。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制剂，其中所述制剂基本上不含添加的凝血酶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制剂，所述制剂还包含凝血酶活化的因子XIII。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的制剂，所述制剂还包含钙螯合剂。
7.根据权利要求6所述的制剂，其中所述钙螯合剂为柠檬酸根离子。
8.根据权利要求7所述的制剂，其中所述柠檬酸根离子由柠檬酸钠提供。
9.根据权利要求8所述的制剂，所述制剂包含约1mM至约50mM的柠檬酸钠。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的制剂，其中所述制剂具有中性pH。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的制剂，所述制剂用于止血、封闭、愈合和/或外科。
12.一种容器，所述容器包含权利要求1至10中任一项所述的制剂。
13.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求12所述的容器和任选地使用说明。
14.一种用于在表面制备封闭剂的方法，所述方法包括：提供权利要求1至10中任一项所述的制剂；以及在促进纤维蛋白在所述表面聚合的条件下将所述制剂施用到所述表面。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述条件包括除去、阻断、中和和/或稀释所述GPRP肽。
16.一种制造液体封闭剂制剂的方法，所述液体封闭剂制剂包含浓度为1%至13%（w/v）的纤维蛋白单体和GPRP肽或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂；其中所述阻断剂以相对于所述纤维蛋白单体摩尔过量超过约100倍的量存在于所述制剂中；并且其中所述液体制剂在选自由以下项组成的组的环境温度下稳定至少14天：约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃，所述方法包括以下步骤：
a) 提供包含纤维蛋白单体的组分；
b) 提供GPRP肽或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂、它们的衍生物或盐；以及
c) 掺和a）和b）以便获得所述液体封闭剂制剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所提供的纤维蛋白单体通过在允许纤维蛋白原裂解的条件下使水性纤维蛋白原溶液与凝血酶或凝血酶样酶接触来获得。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述纤维蛋白单体组分包含凝血酶活化的因子XIII。
19.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述纤维蛋白单体组分包含钙螯合剂。
20.一种制剂，所述制剂能够根据权利要求16至19中任一项所述的方法获得。
21.一种在有需要的受治疗者中愈合、封闭和/或减少失血的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的根据权利要求1至10或权利要求20中任一项所述的制剂。
22.一种液体封闭剂制剂，所述液体封闭剂制剂包含浓度为1%至13%（w/v）的纤维蛋白单体和GPRP肽；其中GPRP以相对于所述纤维蛋白单体摩尔过量超过340倍的量存在于所述制剂中；并且其中所述液体制剂在选自由以下项组成的组的环境温度下稳定至少14天：约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃。
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