BRPI0815049A2

BRPI0815049A2 - peptídeos relacionados a colágeno e usos dos mesmos

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Publication number: BRPI0815049A2
Application number: BRPI0815049-4A
Authority: BR
Inventors: William A. Kinney; Mabel Alamino Cejas; Bruce E. Maryanoff; Thomas Matalenas; Chunlin Yang
Original assignee: Ethicon, Inc
Priority date: 2007-08-01
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2020-09-24
Also published as: AU2008282500A1; ATE530576T1; JP5566885B2; US20090068246A1; EP2183280B1; US8076294B2; CA2695288A1; WO2009018126A3; EP2183280A2; JP2010535225A; WO2009018126A2; KR20100052499A

Abstract

PEPTÍDEOS RELACIONADOS A COLÁGENO E USOS DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a peptídeos relacionados a colágeno (CRP) tendo grupos de aminoácidos hidrofóbicos nas terminações N- e C- capazes de automontagem não-covalente em triplas hélices miméticas de colágeno e fibrilas das mesmas, e à síntese, aos métodos de uso e às composições dos mesmos.

Description

' Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEOS RELACIONADOS A COLÁGENO E USOS DOS MESMOS".

CAMPO DA INVENÇÃO - A presente invenção refere-se a peptídeos relacionados ao colá- . 5 geno(CRPs) que têm grupos de aminoácidos hidrofóbicos nas terminações D N- e C-, a trímeros e fibrilas miméticos dos mesmos, e à síntese, aos méto- dos de uso e às composições dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O colágeno, a proteina mais abundante em mamíferos, é am- plamente distribuído dentro do corpo e a rigidez de sua tripla hélice em for- ma de corda e fibrilas agregadas possibilita-o executar um papel estrutural ço essencial, ajudando a fornecer resistência mecânica aos tecidos. Os coláge- nos fibrilares mais abundantes, tipos |, 11 e Ill, ocorrem na pele, ossos, carti- 7 lagens, tendões, ligamentos, vasos sanguíneos e no humor vítreo dos olhos. Os colágenos fibrilares mais complexos, como os tipos IV e VI, formam re- des bi- e tridimensionais, suportando os tecidos intersticiais do corpo e sen- do o componente fundamental das membranas basais às quais as camadas de células epiteliais e endoteliais podem ligar-se. Em geral, os colágenos fibrilares contêm três cadeias de peptí- deos separadas entrelaçadas uma em torno da outra para formar uma tripla hélice (Rich A e Crick FHC, J. Mol. Biol., 1961, 3, 483-506). Restrições geo- métricas e a estabilidade da tripla hélice de colágeno exigem que cada ter- ceiro aminoácido seja a glicina (Gly or G), resultando em uma sequência - GXY- repetitiva, sendo que X e Y cada uma representam frequentemente a prolina(Pro or P) e hidróxi prolina (Hyp or O). A tripla hélice de colágeno tem tipicamente mais de 300 nm de comprimento e acima de 1000 aminoácidos. As fibrilas resultantes do conjunto de tais triplas hélices de colágeno exce- dem a 1 um de comprimento. Em tecidos saudáveis e não danificados, o colágeno suporta a parede de vasos sanguíneos e seus tecidos circundantes e está escondido pelas camadas de células endoteliais, e não pode entrar em contato com as plaquetas que circulam dentro da corrente sanguínea, as quais regulam o f processo de coagulação.

Entretando, o dano à parede do vaso, que ocorre em consequência de trauma mecânico ou ruptura da placa aterosclerótica em paredes de vasos sanguíneos lesados, pode remover a camada de célu- la endotelial e permitir que o colágeno interaja com as plaquetas e outras proteinas do plasma sanguíneo, ativando assim as plaquetas para agrega- , ção e adesão.

Esses processos são essenciais à reação da coagulação, e são bem entendidos no campo.

Configuração Triplo-Helicoidal O colágeno tem fascinado os cientistas a longo tempo por causa de suas características estruturais extraordinárias e pela importância biológi- ca dessas proteínas.

O estudo da estrutura, estabilidade e função das triplas . hélices de colágeno têm sido facilitado pelo uso de peptídeos relacionados ao colágeno sintético. (Feng Y, Melacini G, Taulane JP e Goodman M, J. 1 Am.

Chem.

Soc., 1996, 118, 10351-10358; Fields GB E Prockop DJ, Bio- polymers 1996, 40, 345-357 e referências citadas nesses; Holmgren SK, Ta- ylor KM, Bretscher LE e Raines RT, Nature 1998, 392, 666-667; Jenkins CL e Raines RT, Nat.

Prod.

Rep. 2002, 19, 49-59; e Shah NK, Ramshaw JAM, Kirkpatrick A, Shah C e Brodsky, B.

Biochemistry 1996, 35, 10262-10268). Por exemplo, o uso de peptídeos triplo-helicoidais sintéticos que compreen- dem motivos de reconhecimento específicos permitiram que as propriedades de ligação ao receptor dos colágenos fossem investigadas em detalhes.

Adi- cionalmente, a conformação triplo-helicoidal dos colágenos pode ser um pré- requisito para seu reconhecimento pelas plaquetas e outros receptores de colágeno.

Certas sequências triplo-helicoidais, além disso, podem interagir diretamente com os receptores de plaquetas como o GpVI, incluindo a se- quência de repetição de tripletos glicina-prolina-hidróxi prolina (GPO). Para peptídeos simples relacionados ao colágeno, a sequência (GPO).o forma triplas hélices termicamente estáveis, com uma temperatura de fusão de 58- 70ºC.

Os aminoácidos hidróxi prolina estabilizam a estrutura triplo-helicoidal facilitando a formação de pontes de hidrogênio mediadas por água e forne- cendo efeitos estereoeletrônicos.

Além disso, a Publicação Internacional Número WO07/052067

' descreve uma série de peptídeos de colágeno triplo-helicoidais incluindo o domínio de colágeno tipo Ill e tendo uma atividade de adesão plaquetária baseada na afinidade pelo domínio A3 do fator plaquetário de von Wille- brand. A Publicação Internacional WO07/017671 descreve peptídeos de tri- . 5 meros contendo repetições GPO que, sem reticulação entre os peptídeos, - são capazes de ativar plaquetas. A Publicação Internacional WO06/098326 descreve um filme de colágeno sintético preparado a partir de um polipepti- deo POG e um composto de fosfato de cálcio. A Publicação de Patente Ja- ponesa 2005206542 descreve estruturas de tecido de colágeno contendo sequências de polipeptídeo Pro-X-Gly e Y-Z-Gly (sendo que X e Z represen- tam prolina (Pro) e hidróxi prolina (Hyp) e Y representa um resíduo de ami- DP noácido que tem um grupo carboxila). A Publicação de Patente Japonesa 2005126360 descreve composições cosméticas e alimentares contendo a í sequência de polipeptídeos Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly (sendo que Y representa Gln, Asn, Leu, lle, Val ou Ala; e Z representa Ile ou Leu) preparados pela síntese de fase sólida para inibição da colagenase. A Publicação de Patente US nº 2003/162941 (equivalente à PJ 2003321500) descreve polipeptídeos de colágeno com uma sequência Pro-Y-Gly (sendo que Y representa Pro ou Hyp), que tem uma estrutura triplo-helicoidal. A Patente US nº 5.973.112 (equivalente à WOS99/10381) descreve mímicos de colágeno tripeptídeo da sequência de Xaa-Xbb-Gly (sendo que Xaa representa um resíduo de ami- noácido; e Xbb representa 4(R)-fluoro-L-prolina (FIlp), 4(S)-fluoro-L-prolina, 4 4-difluoroprolina, ou uma hidróxi prolina modificada de acetila, mesil ou trifluorometil. O colágeno mímico (Pro-Flp-Gly).o mostrou estabilidade au- —mentada em relação às triplas hélices do colágeno Pro-Pro-Gly e Pro-Hyp- Gly.

Automontagem Várias estratégias têm sido empregadas para induzir a formação da estrutura triplo-helicoidal em sequências ligando o colágeno isolado (con- forme discutido na Patente US nº 6.096.863, equivalente à Publicação Inter- nacional WOS98/007752, e referências nessas). A formação da estrutura em tripla hélice em sequências de colágeno isoladas pode ser induzida pela adi-

á ção de inúmeras repetições de Gly-Pro-Hyp em ambas as extremidades de uma sequências de colágeno. Entretanto, mesmo com mais de 50% da se- quência de polipeptido consistindo em repetições de Gly-Pro-Hyp, as triplas hélices resultantes podem não ter estabilidade térmica suficiente para sobre- á 5 vivera condições fisiológicas. Embora possa ser alcançada uma estabiliza- . ção substancial na estrutura triplo-helicoidal com a introdução de ligações covalentes entre as regiões C-terminal das três cadeias de peptídeos, o grande tamanho (90-125 resíduos e aminoácidos) dos compostos de peptí- deos triplo-helicoidais "ramificados" resultantes torna-os difíceis de sintetizar e purificar (conforme discutido na Patente US nº 6.096.863 e referências nessa). Apesar dos CRPs oligomerizados, via conjunto de dendrímero ou - reticulação covalente, poderem induzir efetivamente a agregação plaquetária sem serem imobilizados, nos CRPs menos organizados como aqueles que têm uma sequência de (PGO);,, falta essa propriedade (Rao GHR, Fields CG, White JG e Fields GB, J. Biol. Chem. 1994, 269, 13899-13903; Morton LF, Hargreaves PG, Farndale RW, Young RD and Barnes MJ, Biochem. J. 1995, 306, 337-344; Knight CG, Morton LF, Onley DJ, Peachey AR, Ichinohe T, Okuma M, Farndale RW and Barnes MJ. Cardiovasc. Res. 1999, 471, 450- 457). A disponibilidade e utilidade dos CRPs capazes de automontagem têm dependido da facilidade de sua preparação, da simplicidade e estabilidade da estrutura da CRP e do potencial da atividade de agregação. Embora a síntese possa ser desafiadora e relativamente complexa, materiais baseados em CRP e em escala de micrômeros foram obtidos a partir da automonta- gem de entidades triplas torcidas, anexadas covalentemente pelo emprego deum nó de cisteina (Koide T, Homma DL, Asada S and Kitagawa K, Bio- org. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5230-5233; e Kotch F e Raines RT, Proc.

Natl. Acad. Sci USA 2006, 103, 3028-3033). Portanto, ainda são necessárias abordagens simplificadas para construir um motivo estrutural semelhante ao colágeno para facilitar o ali- —nhamento de peptídeos e iniciação e propagação de fibrilas. Especificamen- te, são necessários CRPs relativamente curtos única hélice que sejam facil- mente sintetizados e capazes de automontagem não covalente em trímeros

; que têm propriedades de mimetizar o colágeno.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se amplamente a um polipeptídeo relacionado ao colágeno (CRP) capaz de automontagem não covalente em . 5 umtrimero que tem propriedades de mimetizar o colágeno.

. O CRP tem um aminoácido hidrofóbico natural ou sintético na região N-terminal e C-terminal em cada extremidade, sendo que os aminoá- cidos mencionados são capazes de iniciar a propagação de fibrilas para for- mar fibrilas semelhantes ao colágeno.

A presente invenção também refere-se a um CRP de Fórmula (1): " B-(Z)m-X em que ' Z é um tripleto selecionado do grupo consistindo em Gly-Pro-J, Pro-J-Glye J-Gly-Pro; J é independentemente selecionado do grupo que consiste em Hp, fPro, mPro e Pro para cada tripleto Z; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15; por exemplo, se Z é Gly-Pro-J e m é 8, então cada um dos oito substituintes de J é, independentemente, selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro; e B e X são independentemente selecionados do grupo que con- siste em F5-Phe, Phe (opcionalmente mono ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, lle e Val. Os CRPs aqui descritos são úteis na construção de colágenos sintéticos que podem ser usados para iniciar a agregação plaquetária e para o tratamento de diagnóstico de transtornos hemorrágicos. Os CRPs da presente invenção são adicionalmente úteis em composições como um hemostático.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO A Figura 1 é uma curva de resposta à dosagem ilustrando a ati-

á vidade dos CRPs que têm SEQ ID 25, SEQ ID 26, SEQ ID 27, SEQ ID 28, SEQ ID 34 e SEQ ID 35 comparadas ao colágeno para estimulação da a- gregação plaquetária.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO f 5 A presente invenção refere-se amplamente a um CRP capaz de - automontagem não covalente em um trímero que tem propriedades de mi- metizar o colágeno. O CRP tem um aminoácido hidrofóbico natural ou sintético na região N-terminal e C-terminal em cada extremidade, sendo que os aminoá- cidosmencionados são capazes de iniciar a propagação de fibrilas para for- mar fibrilas semelhantes ao colágeno. - A presente invenção também refere-se a um CRP de Fórmula (O): : B-(Z)M-X emque Z é um tripleto selecionado do grupo consistindo em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro; J é independentemente selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro para cada tripleto Z; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15; por exemplo, se Z é Gly-Pro-J e m é 8, então cada um dos oito substituintes de J é, independentemente, selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro; e B e X são independentemente selecionados do grupo que con- siste em Fs-Phe, Phe (optionalmente mono ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, fe- nila-Gly, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, lle e Val. Os CRPs da presente invenção são capazes de automontagem —não-covalente em um trímero. O trímero de CRP resultante é adicionalmente capaz de automontagem de ordem mais alta por interações hidrofóbicas or- denadas e de empilhamento aromático não-covalente, em fibrilas semelhan-

: tes ao colágeno.

Uma modalidade da presente invenção inclui uma substância fibrilar semelhante ao colágeno que compreende uma pluralidade de CRPs da presente invenção.

Modalidades da presente invenção incluem uma substância fibri- E lar semelhante ao colágeno que compreende uma pluralidade de CRPs da presente invenção, sendo que os CRPs estão presentes na substância fibri- lar semelhante ao colágeno na forma de uma pluralidade de trímeros de CRP. Em uma modalidade da invenção, o trímero de CRP é um homo- trímero, sendo que os três CRPs são homólogos. - Em uma modalidade da invenção, o trímero de CRP é um hete- rotrímero, sendo que os três CRPs são heterólogos. : Uma modalidade da invenção é um CRP Fórmula (1), sendo que Zé um tripleto selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro, sendo que J é Hyp em pelo menos quatro tripletos Z consecuti- VOS.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo que J é, independentemente, selecionado do grupo que consiste em Hyp, fProePro para cada tripleto Z.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo que J é, independentemente, selecionado do grupo que consiste em Hyp e Pro para cada tripleto Z.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo quemé1o.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo que B e X são independentemente selecionados do grupo que consiste em Fs5-Phe, Phe (opcionalmente mono- ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, fenilglici- na, 2-nafti-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Val.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo que B e X são independentemente selecionados do grupo que consiste em

Fs-Phe, Phe e Leu.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo que B é selecionado do grupo que consiste em Fs-Phe, Phe (opcionalmente mono ou dissubstituída em fenila com fluoro, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4- (OH)-Phe, MeO-Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg e - Leu.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo que B é selecionado do grupo que consiste em F5-Phe, Phe ((opcionalmente mono- ou dissubstituída em fenila com fluoro, hidróxi, metila ou CF 3) e Leu.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo que B é selecionado do grupo que consiste em F5-Phe, Phe e Leu. e Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo que X é selecionado de um grupo que consiste em Phe (opcionalmente mo- " no ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou

15. CF3), Tyr, 3,4-(OH);-Phe, MeO-Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, lle e Val.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (1), sendo que X é Phe.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I) selecio- nadoapartirde: SEQ ID 1: B-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)nN-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; SEQ ID 2: B-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)p-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; SEQ ID 3: B-(Gly-Pro-Hyp)12-(Gly-Pro-J)g-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 20u 3; SEQ ID 4: B-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)N-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; SEQ ID 5: B-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)p-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de O, 1, 2, 3,4,5,6 ou 7; SEQ ID 6: B-(Pro-Hyp-Gly)12-(Pro-J-Gly)g-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3;

: SEQ ID 7: B-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)n-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; SEQ ID 8: B-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)p-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3,4, 5,6 ou 7; ou Ê 5 SEQ ID 9: B-(Hyp-Gly-Pro) 12-(J-Gly-Pro)qg-X, sendo que q é um " número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 20u3. Em modalidades alternativas, o CRP de Fórmula (1) é seleciona- do a partir de: SEQ ID 10: B-(Gly-Pro-J)n-(Gly-Pro-Hyp)4-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; SEQ ID 11: B-(Gly-Pro-J)p-(Gly-Pro-Hyp)8-X, sendo que q é um - número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3,4, 5,6 ou 7; SEQ ID 12: B-(Gly-Pro-J)g-(Gly-Pro-Hyp)12-X, sendo que q sen- à do que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 20u 3; SEQ ID 13: B-(Pro-J-Gly)n-(Pro-Hyp-Gly)4-X, sendo que n sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; SEQ ID 14: B-(Pro-J-Gly)p-(Pro-Hyp-Gly)8-X, sendo que p sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5,6 ou 7; SEQ ID 15: B-(Pro-J-Gly)a-(Pro-Hyp-Gly)12-X, sendo que q sen- doqueqé um número inteiro selecionado a partir de O, 1, 20u3; SEQ ID 16: B-(J-Gly-Pro)n-(Hyp-Gly-Pro)4-X, sendo que n sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6,7, 8, 9, 10 ou 11; SEQ ID 17: B-(J-Gly-Pro)p-(Hyp-Gly-Pro)8-X, sendo que p sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3,4, 5,6 ou 7; ou SEQ ID 18: B-(J-Gly-Pro)g-(Hyp-Gly-Pro)12-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 20u3. Ainda em outras modalidades, o CRP de Fórmula (1) é selecio- nado a partir de: SEQ ID 19: B-(Gly-Pro-J)r-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)s-X, sendo queres são cada um número inteiro selecionado a partir de 1,2,3,4, 5,6, 7, 8, 9 ou 10 e sendo que a combinação de (Gly-Pro-J)r, (Gly-Pro-J)s e (Gly- Pro-Hyp)4 não excede a (2)15;

SEQ ID 20: B-(Gly-Pro-J)t-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)uU-X, sendo que t e u são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3,4, 5 ou 6 e sendo que a combinação de (Gly-Pro-J)t, (Gly-Pro-J)u e (Gly-Pro-Hyp)8 não exceda a (Z)15; ' 5 SEQ ID 21: B-(Pro-J-Gly)r-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)s-X, sendo - que r e s são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9 ou 10 e sendo que a combinação de (Pro-J-Gly)r, (Pro-J-Gly)s e (Gly- Pro-Hyp)4 não exceda a (2)15; SEQ ID 22: B-(Pro-J-Gly)t-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)U-X, sendo 10 queteusão cada um número inteiro selecionado a partir de 1,2, 3,4,5 ou 6 e sendo que a combinação de (Pro-J-Gly)t, (Pro-J-Gly)u e (Gly-Pro-Hyp)8 - não exceda a (2)15; SEQ ID 23: B-(J-Gly-Pro)r-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)s-X, sendo É que r e s são cada um número inteiro selecionado a partir de 1,2, 3,4,5,6, 7,8 ,90u10e sendo que a combinação de (J-Gly-Pro)r, (J-Gly-Pro)s e (Gly- Pro-Hyp)4 não exceda a (Z) 15; ou SEQ ID 24: B-(J-Gly-Pro)t-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)U-X, sendo que t e u são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 e sendo que a combinação de (J-Gly-Pro)t, (J-Gly-Pro)u e (Gly-Pro-Hyp)8 nãoexcedaa(Z)15. Em certas modalidades, o CRP de Fórmula (1) é selecionado a partir de: SEQ ID 25: Fs5Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe; SEQ ID 26: Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe; SEQ ID 27: Leu-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe; SEQ ID 31: FsPhe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe; SEQ ID 32: Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe; and SEQ ID 33: Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe.

Na discussão da presente invenção, outras sequências de poli- peptídeos incluem: Comparador SEQ ID 28: Gly-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly; Comparador SEQ ID 29: Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly;

NA Á Referência SEQ ID 30: (Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-Hyp-Ala)-(Pro-Hyp- GSy)S; Referência SEQ ID 34: (Pro-Hyp-Gly)10; and Comparador SEQ ID 35: F;Phe-(Gly-Pro-Hyp)5-Ph. Á 5 A título de exemplo, um CRP de Fórmula (1) tendo uma SEQ ID - 25 tem a seguinte SPtrutura; F F NH? oH O, F 2 NL 3) OH O Sd NH ' " A presente invenção refere-se adicionalmente a um método de " formação de uma substância fibrilar semelhante ao colágeno, compreenden- do as etapas de seleção de uma pluralidade de CRPs de Fórmula (1) e mis- 10 turada pluralidade de CRPs sob condições aquosas favoráveis para iniciar e propagar a formação de uma pluralidade de trimeros, compósitos supramo- leculares e fibrilas semelhantes ao colágeno.

Em uma modalidade do método, a pluralidade de trímeros de CRP é selecionada a partir de uma pluralidade de homotrímeros, heterotri- merose misturas dos mesmos.

Em uma modalidade do método, a substância fibrilar semelhante ao colágeno é selecionada a partir de uma pluralidade de compósitos su- pramoleculares ou fibrilas semelhantes ao colágeno.

Em uma modalidade do método, as condições aquosas favorá- veis compreendem adicionalmente a mistura da pluralidade de peptídeos relacionados ao colágeno em água ou em uma solução salina aquosa a uma temperatura menor que cerca de 50ºC.

Em uma modalidade do método, a solução salina aquosa é sele- cionada a partir de salina tamponada, solução tampão de fosfato, solução salina balanceada de Hank, salina tamponada com fosfato, salina tampona- da com Tris, salina tamponada com Hepes e misturas das mesmas.

Em uma modalidade do método, a solução salina aquosa é PBS.

Á Definições A respeito das modalidades da presente invenção, as seguintes definições e outras fornecidas por todo este relatório não devem ser interpre- tadas, dentro conhecimento pelo elemento versado na técnica, como limita- ' 5 dorasdo escopo da presente invenção. - O termo "tripleto" refere-se a um conjunto de três aminoácidos conforme definido pelo conjunto Gly-Pro-J tendo os três aminoácidos Gly, Pro e J, o conjunto Pro-J-Gly tendo os três aminoácidos Pro, J e Gly e o con- junto J-Gly-Pro tendo os três aminoácidos J, Gly e Pro.

O termo "homotrímero" refere-se a uma tripla hélice formada por três CRPs idênticas de Fórmula (1). . O termo "heterotrímero" refere-se a uma tripla hélice formada pelos CRPs Fórmula (1). : O termo "trímero" refere-se a uma tripla hélice formada por três CRPsde Fórmula (1). E O termo "compósitos supramoleculares" refere-se a trímeros de CRP montados de várias formas, incluindo fibrilas semelhantes ao colágeno e estruturas fibrilares.

Os termos "Ala" ou "A" referem-se ao aminoácido alanina; "Cha" refere-se ao aminoácido mimético ciclo-hexil-alanina; "Chg" refere-se ao a- minoácido mimético ciclo-hexil-glicina; "Fs-Phe" refere-se ao aminoácido mimético 1,2,3,4,5-Fs-fenilalanina; "fPro" refere-se ao aminoácido mimético (4R)-fluoroprolina; "Gly" ou "G" refere-se ao aminoácido glicina; "Hyp" ou "O" refere-se ao aminoácido mimético (4R)-hidróxi-prolina; "Met" refere-se ao aminoácido metionina; "mPro" refere-se ao aminoácido mimético (4S)- metilprolina; "Phe" ou "F" refere-se ao aminoácido fenilalanina; "Pro" ou "P" refere-se ao aminoácido prolina; e "Tyr" refere-se ao aminoácido tirosina.

Discussão da Invenção Certos monômeros de automontagem têm sido descritos, nos quais monômeros de dietil éster ácido dioxâmico fenileno meta-substituído foram mostrados por raio X em estado sólido são capazes de automontagem em uma cadeia helicoidal por meio de ligação de hidrogênio (ponta a ponta),

: com as hélices adjacentes alinhadas lado a lado por tr-empilhamento (Blay G, Fernandez |, Pedro JR, Ruiz-Garcia R, Munoz MC, Cano J e Carrasco R, Eur. J. Org. Chem. 2003, 1627-1630). O design inicial pelos inventores da presente invenção para um trímero de CRP de automontagem envolveu a ' 5 anexaçãode um grupo amida de éster fenil oxâmico nos N- e C-terminais de b uma sequência (GPO)1,º para facilitar a montagem ponta a ponta por meio de ligação de hidrogênio. Entretanto, devido a forte interação de empilhamento aromático não-covalente entre o benzeno e o hexafluorobenzeno (Hunter CA and San- dersJKM,J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 5525-5534; Gdaniec M, Jankowski W, Milewska MJ and Polofski T, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 3903-3906

1. (também, Referências 9 e 10 citadas nesses); e Lozman OR, Bushby RJ e Vinter JG, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 2001, 1446-1453), os inventores É da presente invenção levantaram a hipótese de que o empilhamento aromá- tico (ponta a ponta e lado a lado) e interações hidrofóbicas ordenadas torna- riam os trímeros de CRP da presente invenção adicionalmente capazes de automontagem de alta ordem em fibrilas e fibras semelhantes ao colágeno. Consequentemente, o design de automontagem por ligação de hidrogênio evoluiu para o design da presente invenção na qual as interações entreos grupos hidrofóbicos e aromáticos foram utilizadas para a montagem ponta a ponta por tr-empilhamento e interações hidrofóbicas ordenadas. As sequências dos CRPs lineares da presente invenção são capazes de auto- montar-se em trimeros e subsequentemente, em compósitos e fibrilas su- pramoleculares através de meios não-covalentes. Outros pesquisadores ob- servaram que a sequência de colágeno inclui regiões de telopeptídeo con- tendo especificamente resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e aromáticos como Tyr, Phe e Leu. A importância de tais resíduos de aminoácidos hidro- fóbicos e aromáticos para a automontagem triplo-helicoidal tem sido indicada (Helseth DL, Jr. e Veis A, J. Biol. Chem., 1981, 256, 7118-7128; Prockop DJ eFertala A,J. Biol. Chem. 1998, 273, 15598-15604; e Traub W, FEBS Let- ters 1978, 92, 114-120). Como consequência, investigou-se o potencial para iniciar a i propagação de fibrila por um trimero de CRP da presente invenção, por e- xemplo, por um trímero de CRP tendo uma sequência SEQ ID 25: Fs;Phe- (Gly-Pro-Hyp)10-Phe. Conforme mostrado abaixo no Exemplo 3, a modela- gem molecular computacional foi usada para avaliar a interface cabeça- Á 5 cauda entre dois trimeros de CRP tendo SEQ ID 25. Um campo de força : XED (distribuição estendida de elétron) foi usado para atrair as duas triplas hélices uma em direção à outra. À medida que as triplas hélices se aproxi- mavam uma a outra, os pares fenil/pentafluorofenila adotaram uma orienta- ção face a face, resultando em uma energia de ligação de interface total de - 55,2 kcal/ímol. Quando os anéis aromáticos foram colocados em uma orien- tação borda-a-face, a montagem reminimizada reverteu à orientação face a - face. As interfaces dos trimeros de CRP análogos que têm sequên- Ô cias SEQ ID 26: Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe e SEQ ID 27: Leu-(Gly-Pro- Hyp)10-Phe, também foram examinados. Comparativamente, no caso da sequência SEQ ID 26, foi observada uma energia de interface mais baixa (energia total de -49,2 kcal/mol) sem interações face a face observadas. Um aumento adicional na energia de ligação ocorreu para a SEQ ID 27 (energi- a/total de -32,5 kcal/mol). As fortes interações entre as extremidades opos- tasdostrimeros de CRP tendo SEQ ID 25 e as interações entre as extremi- dades opostas dos trímeros de CRP tendo SEQ ID 26 e SEQ ID 27 apoiam a hipótese do inventor de que o potencial dos trímeros de CRP da presente invenção inicia a propagação de fibrila devido ao empilhamento aromático e interações hidrofóbicas entre os trimeros de CRP.

Embora o trabalho de modelagem tenha examinado a interface ponta a ponta dos trimeros de CRP para iniciar a propagação de fibrila, o escopo da presente invenção pretende incluir outras interfaces possíveis como as interfaces desalinhadas nas quais ocorrem interações hidrofóbicas em uma orientação ponta a ponta entre CRPs em diferentes locais dentro de um trimerode CRP e interações lado a lado com trímeros de CRP adjacen- tes onde for permitido pelas interações hidrofóbicas, como no casos do telo- peptídeos de colágeno.

Configurações CRP Em adição ao anteriormente mencionado, modalidades não- limitadoras, a presente invenção abrange também os CRPs e homotrímeros e heterotrímeros do mesmo que consistem em sequências em qualquer á 5 combinação representativa de Fórmula (1). - O comprimento total de um CRP conforme descrito na presente invenção pode estar em uma faixa de 26 a minoácidos a 47 aminoácidos. Em uma modalidade da presente invenção, o comprimento geral de um CRP pode ser de até 32 aminoácidos. Um CRP como descrito aqui pode ser polimerizado ou ligado a um parceiro de acoplamento de peptiídila ou não peptidila, tal como mas não , limitado a uma molécula efetora, um rótulo, um marcador, um fármaco, uma toxina, um veículo ou molécula transportadora ou molécula de alvejamento " tal como um anticorpo ou fragmento do mesmo ou outro ligante. Técnicas para acoplar um polipetídeo de CRP aos parceiros de acoplamento peptí- deos e não peptídeos são bem conhecidas na técnica.

Em algumas modalidades, um CRP conforme descrito na pre- sente invenção pode ser aplicado como revestimento sobre uma superfície sólida ou um suporte insolúvel. O suporte pode estar na forma particulada ou sólida, incluindo por exemplo uma placa, tubo de ensaio, cápsulas, esfera, um filtro, tecido, polimero ou uma membrana. Métodos para fixar um polipep- tídeo de CRP a superfícies sólidas ou suportes insolúveis são conhecidos pelos versados na técnica.

Em algumas modalidades, o suporte pode ser uma proteína, por exemplo uma proteina do plasma ou uma proteína de tecido, como uma i- munoglobulina ou fibronectina. Em outras modalidades, o suporte pode ser sintético e pode ser, por exemplo, um polímero biocompatível e biodegradá- vel. Polímeros adequados incluem polietileno glicóis, poliglicolídeos, polilac- tídeos, polioésteres, polianidridos, polifosfazenos, e poliuretanos. Um outro aspecto da invenção fornece um conjugado incluindo um polipeptídeo, con- forme descrito na presente invenção, anexado a um polímero inerte.

A inclusão de grupos reativos em uma das extremidades do

CRP permite o acoplamento químico a veículos inertes de modo que o pro- duto resultante pode ser entregue a lesões patológicas como ferimentos crô- nicos ou lugares de ferimentos traumáticos agudos sem entrar dentro da cor- rente sanguínea.

É 5 Os CRPs da presente invenção podem ser gerado total ou par- - cialmente por síntese química, por exemplo, de acordo com métodos de sín- tese de peptídeos bem estabelecidos, como líquido padrão ou, de preferên- cia, em fase sólida, cujas descrições gerais são amplamente disponíveis (consultar, por exemplo, em J.M.

Stewart e J.D.

Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2º edição, Pierce Chemical Company, Rockford, Iilinois (1984), em M.

Bodanzsky e A.

Eodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Sprin- - ger Verlag, New York (1984); em J.

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Jones, The Chemical Synthesis of Peptides.

Oxford University Press, Oxford 1991; em Applied Biosystems i 430A Users Manual, ABI! Inc., Foster City, Califórnia, em G. a.

Grant, (Ed.) Synthetic Peptides, A User's Guide.

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Freeman & Co., New York 1992, E.

Atherton e R.C.

Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach.

IRL Press 1989 e em G.E.

Fields, (Ed.) Solid-Phase Peptide Syn- thesis (Métodos em Enzimologia Vol. 289) Academic Press, New York, EUA, e Londres 1997), ou podem ser preparados em solução, pelo método de fa- selíquida ou por qualquer combinação de fase sólida, fase líquida e química de solução.

Modificações Estruturais da CRP O CRP conforme descrito na presente invenção pode ser quimi- camente modificado, por exemplo, pela adição de uma ou mais moléculas de polietileno glicol, açúcares, fosfatos, e/ou outras moléculas, sendo que a mo- lécula ou moléculas não são naturalmente anexadas a proteínas de coláge- no de ocorrência natural.

Modificações químicas adequadas de CRPs e mé- todos de preparo de CRPs por síntese química são bem conhecidos pelos versados na técnica e também são abrangidos pela presente invenção.

O mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ou em graus variados em vários locais do CRP.

Além disso, as modificações po- dem ocorrer em qualquer lugar na sequência de CRP, incluindo na cadeia á principal do CRP, em quaisquer cadeias laterais de aminoácidos e no termi- nal amino ou carboxila.

Consequentemente, um dado CRP pode conter mui- tos tipos de modificações.

Como indicado acima, o CRP conforme descrito na presente in- á 5 venção pode ser estruturalmente modificado.

Um CRP estruturalmente modi- - ficado é substancialmente similar na forma tridimensional e na atividade bio- lógica ao CRP aqui descrito e compreende, de preferência, uma disposição espacial de porções químicas reativas que assemelha-se muito à disposição tridimensional dos grupos ativos na sequência do CRP.

Modificações adicio- nais também podem ser feitas pela substituição de grupos químicos dos a- minoácidos com outros grupos de estrutura similar. - Adicionalmente, os CRPs conforme descritos na presente inven- ção podem ser estruturalmente modificados para compreender um ou mais K D-aminoácidos.

Por exemplo, um CRP pode ser um enantiômero no qual um ou mais resíduos de L-aminoácido na sequência de aminoácidos do CRP são substituídos pelo resíduo de D-aminoácido correspondente ou um poli- peptídeo inverso-D, que é um polipeptídeo que consiste em D-aminoácidos dispostos em orderm inversa quando comparados à sequência de L- aminoácidos descrita acima (Smith CS, et al., Drug Development Res., 1988, 15, páginas 371-379). Métodos de preparação de polipeptídeos estrutural- mente modificados adequados são bem conhecidos na técnica.

Composições de CRP Os CRPs da presente invenção podem ser isolados e/ou purifi- cados e subsequentemente usados conforme desejado.

Em uma modalida- deda presente invenção, os CRPs podem ser usados em uma composição, como uma composição farmacêutica ou uma composição adequada ao uso como um dispositivo médico, que pode incluir um ou mais componentes op- cionais incluindo, mas não se limitando a, um ou mais excipientes conheci- dos na técnica.

Em adição a essas modalidades não-limitadoras, a presente invenção também abrange CRPs, assim como homotrímeros e heterotrime- ros dos mesmos, que consistem em sequências em qualquer combinação representativa de Fórmula (|) nessas composições.

] Certos polipeptídeos têm sido descritos para uso em várias composições farmacêuticas, dispositivos médicos, e produtos combinados. Por exemplo, a Publicação Internacional WO07/044026 descreve um peptí- deo mimético do colágeno com arcabouço de polietileno glicol hidrogel dia- ' 5 crilato para reparo de cartilagem danificada. A Publicação de Patente US nº " US2006/073207 descreve uma composição de coacervato amorfo de hepa- rinato de colágeno/elastina/sódio bovino para várias aplicações médicas. A Publicação de Patente US US2005/147690 descreve composições de um filme de poliuretano modificado que tem uma superfície incrustada de colá- geno/elastina/heparina para uso em um enxerto vascular. A Publicação de Patente Japonesa 2005060550 descreve composições para adesão a subs- - tratos contendo uma sequência de polipeptídeos Pro-Y-Gly (sendo que Y representa Pro ou Hyp), tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso mo- lecular de 100.000 a 600.000. A Publicação de Patente Japonesa 2005060315 descreve composições farmacêuticas contendo uma sequência de polipeptídeos Pro-Y-Gly (sendo que Y representa Pro ou Hyp) tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso molecular de 100.000 a 600.000 e vita- mina C. A Publicação de Patente Japonesa 2005060314 descreve composi- ções cosméticas contendo uma sequência de polipeptídeos Pro-Y-Gly (sen- do que Y representa Pro ou Hyp) tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso molecular de 100.000 a 600.000. A Publicação de Patente Japonesa 2005058499 descreve uma composição de tecido não-trançado impregnado com um polipetídeo de sequência Pro-Y-Gly (sendo que Y representa Pro ou Hyp), tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso molecular de 100.000 a

600.000, que pode ser degradada pela colagenase. A Publicação de Patente Japonesa 2005058106 descreve composições comestíveis contendo uma sequência de polipeptídeos Pro-Y-Gly (sendo que Y representa Pro ou Hyp), tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso molecular de 100.000 a

600.000, que pode ser degradada pela colagenase. A Publicação de Patente Japonesa 2005053878 descreve polipeptídeos tendo as sequências Pro-X- Gly e Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly (sendo que X representa Pro ou Hyp; Y represen- ta Gln, Asn, Leu, lle, Val ou Ala; e Z representa Ile ou Leu), tendo uma estru-

tura triplo-helicoidal com peso molecular de 70.000 a 600.000, que pode ser degradada pela colagenase. A Publicação Internacional WO98/52620 des- creve compostos de biopolímeros com uma sequência Gly-Pro-Nleu cova- lentemente ligada a uma superfície ou superfícies de um material a granel á 5 — biocompatível para uso como uma prótese de implante. A Patente US nº - 6.096.863 descreve complexos peptídeo-amfíifilo tendo uma porção lipofílica e uma porção de peptídeo tendo uma sequência semelhante ao colágeno R202C(CH2).CH(CO2R)NHCO(CH2)2CO(GlIy-Pro-Hyp)o4-[peptídeo]-(Gly- Pro-Hyp)o-4, sendo que R; e R> são, cada um, independentemente, um a vin- te grupos hidrocarbila preparados via síntese de fase sólida. As Patentes US nº 6.096.710 e nº 6.329.506 descrevem derivados de colágeno sintético tri- - plo-helicoidais tendo tripletos de aminoácidos de repetição Gly-Xp-Pro, Gly- Pro-Yp, Gly-Pro-Hyp e Gly-Pro-Pro, sendo que Xp e Yp são resíduos de É peptoides selecionados a partir de aminoácidos N-substituídos.

A presente invenção estende-se a vários aspectos, não apenas aos CRPs conforme descritos na presente invenção, opcionalmente acopla- dos a outras moléculas, peptídeos, polipeptídeos e membros de ligação es- pecíficos, mas inclui, também, uma composição farmacêutica, medicamento, fármaco, dispositivo médico ou componentes dos mesmos, ou outras com- posições que compreendem tais CRPs. Tal composição farmacêutica, medi- camento, fármaco, dispositivo médico ou componentes dos mesmos, ou ou- tra composição pode ser usada para vários propósitos, incluindo, mas não se limitando a fins de diagnóstico, terapêutica e prevenção.

A presente invenção também estende-se ao uso de tais CRPs no preparo dessas composições e um método para fazer tais composições compreendendo a mistura de CRPs com os excipientes opcionais desejados e outros ingredientes opcionais. Exemplos de excipientes adequados inclu- em, mas não se limitam a veículos, veículos, tampões, estabilizadores, e similares que são bem conhecidos na técnica.

Nas modalidades em que a composição é uma composição far- macêutica, a composição pode conter, em adição a tais CRPs, um agente ativo farmaceuticamente secundário, sendo que o produto da combinação í resultante pode ser adicionamente misturado com um excipiente como aque- les bem conhecidos como farmaceuticamente aceitáveis na técnica. Exem- plos de tais excipientes adequados são apresentados em, por exemplo, Handbook of Pharmaceutical Excipients, (Quinta Edição, Outubro de 2005, Pharmaceutical Press, Eds. Rowe RC, Sheskey PJ e Weller P). Tais materi- E ais não devem ser tóxicos e não devem interferir com a eficácia de tais CRPs ou de agentes ativos farmaceuticamente secundários. Tais composi- ções da presente invenção podem ser administradas de maneira localizada no local desejado ou podem ser entregues de modo que o CRP ou agentes ativos farmaceuticamente secundários tenham como alvo tecidos ou células particulares. Agentes ativos farmaceuticamente secundários adequados in- - cluem, mas não se limitam a, hemostáticos (como trombina, fibrinogênio, ADP, ATP, cálcio, magnésio, TXA,, serotonina, epinefrina, fator plaquetário É 4, fator V, fator XI, PAI-1, trombospondina e similares e combinações dos mesmos), anti-infecciosos (como anticorpos, antígenos, antibióticos, agentes antivirais e similares e combinações dos mesmos), analgésicos e combina- ções de analgésicos ou, agentes anti-inflamatórios (como anti-histamínicos e similares).

No amplo uso de tais composições, a composição pode ser apli- cada topicamente no local do ferimento como um hemostato, como por e- xemplo, uma formulação farmacêutica, ou como um componente de um cu- rativo de ferimento. A composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, de maneira substancialmente simultã- nea ou sequencial dependendo do problema de saúde a ser tratado. Tais CRPs, sozinhos ou em um artigo ou dispositivo que compreenda esses CRP, incluindo um curativo para ferimentos, podem ser fornecidos em um kit, por exemplo, lacrado em um recipiente adequado que proteja o conteúdo do ambiente externo. Esse kit pode incluir instruções de uso. Em uma modalidade, o CRP conforme descrito na presente in- venção pode ser útil na simulação da hemostase em trauma agudo, por e- xemplo, após um acidente de tráfego ou lesões de guerra, por meio da apli- cação tópica aos ferimentos que de outro modo causariam perda sanguínea

' fatal.

Um método de estimulação da hemostase nesses locais de lesões po- de compreender o contato do local com uma composição que compreende o CRP conforme descrito na presente invenção, sendo que a composição compreende um substrato de modo que o CRP esteja presente na superfície : 5 do substrato em uma quantidade suficiente para induzir e manter a hemos- E tase.

Em outra modalidade, o CRP descrito na presente invenção po- de ser útil na estimulação da hemostase em lesões crônicas como úlceras.

Sem se ater à teoria, em relação ao mecanismo proposto, acreditamos que o CRP pode agir primeiramente para aumentar a fixação celular, e então a liberação dos conteúdos ativados de grânulos de plaquetas pode estimular a r migração de células da corrente sanguínea e dos tecidos próximos danifica- dos que contribuem para o processo de cura.

Um método de estimulação da ' hemostase nesses locais de lesões crônicas em um indivíduo pode compre- endero contato do local com uma composição que compreende o CRP con- forme descrito na presente invenção, sendo que a composição compreende um substrato de modo que o CRP esteja presente na superfície do substrato em uma quantidade suficiente para induzir a hemostase.

Esses CRPs da presente invenção conforme descrito aqui po- dem ser amplamente úteis como reagentes preciosos em inúmeros testes de laboratório e clínicos, incluindo aqueles para diagnóstico de transtornos he- morrágicos.

Por exemplo, tais CRPs conforme descrito na presente invenção podem ser úteis na construção de colágenos sintéticos que podem então ser usados para iniciar a agregação plaquetária.

Em outro exemplo, tais CRPs podem ser úteis na investigação ou triagem de compostos de teste que ini- bem a agregação e ativação plaquetária e/ou coagulação sanguínea.

Em um exemplo adicional, tais CRPs podem ser úteis como reagente para pesquisa sobre a ativação e/ou agregação de plaquetas.

Um método de ativação e/ou agregração plaquetária pode compreender o tratamento de plaquetas com tais CRPs conforme descrito na presente invenção.

Em uma modalidade, as plaquetas podem ser tratadas in vitro na presença de plasma sanguíneo.

A atividade das plaquetas tratadas, isto é,

plaquetas após o contato com tais CRPs conforme descrito na presente in- venção, pode ser medida ou determinada, por exemplo, na presença ou au- sência de um fator ou agente, composição de teste ou substância de inte- resse, empregando experimentos de controle adequados conforme esperado É 5 natécnica.

O efeito de um fator sobre a ativação plaquetária e/ou agregação - pode ser determinado por um método que compreende tratar as plaquetas com tais CRPs descritos na presente invenção e determinar o efeito do fator sobre e ativação e/ou agregação plaquetária.

A ativação e/ou agregação plaquetária podem ser determinadas na presença ou ausência do fator ou comofatorem diferentes concentrações.

Em outra modalidade da presente invenção, tais CRPs também - podem ser úteis no diagnóstico de transtornos plaquetários, como no diag- nóstico que usa rotineiramente filbrilas de colágeno extraídas de tecidos a- : nimais como reagente em agregometria plaquetária, ou preparações de co- lágeno imobilizado como no Analisador de Função Plaquetária e outros ins- trumentos.

Por exemplo, tais CRPs podem ser usados para investigar a ati- vidade ou função plaquetária ou para diagnosticar uma disfunção na ativida- de plaquetária pela determinação da ativação e/ou agregação plaquetária em uma amostra tratada com CRPs, conforme descrito na presente inven- ção.

Por exemplo, tais CRPs conforme descrito na presente invenção podem ser colocados em contato com uma amostra sanguínea obtida de um indiví- duo, então a agregação das plaquetas pode ser determinada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Em outra modalidade da presente invenção, tais CRPs podem serúteis como um revestimento de superfície bioativa que age para assegu- rar a adesão celular diretamente, bem como agregar e ativar as plaquetas localmente, como pela da contribuição para a produção e liberação de outras moléculas bioativas.

Um método pode, por exemplo, compreender o contato das plaquetas com tais CRPs conforme descrito na presente invenção, as quais podem ser imobilizadas sobre um suporte sólido ou semissólido, na presença de plasma sanguíneo, para agregar ou ativar as plaquetas no su- porte ou próximo ao dito suporte.

E Os CRPs da presente invenção também podem ser amplamente usados no tratamento de transtornos hemorrágicos.

Em uma modalidade, como os CRPs conforme descritos na pre- sente invenção são adsorvidos ou de outro modo contidos no ou sobre um suporte sólido ou semissólido, como em um suporte de polímero inerte, o ' suporte resultante pode ser útil para servir como um composto auxiliar ou alternativo para a transfusão de plaquetas em casos de insuficiência plaque- tária, o que pode resultar em trombocitopenia autoimune ou ablação tera- pêutica da medula óssea como na terapia de câncer, bem como em trans- tornos hemorrágicos a partir de outras causas, como a doença de Glanz- mann. Nessa modalidade, os CRPs que são adsorvidos sobre ou de outro - modo contidos dentro ou sobre um suporte sólido ou semissólido, podem ser administrados a um indivíduo que precise do mesmo, como, por exemplo, É indivíduos que podem ter insuficiência plaquetária e/ou podem ter uma con- diçãomédica conforme especificado acima.

Tais CRPs conforme descritos na presente invenção, que são adsorvidos ou de outro modo contidos dentro ou sobre um suporte sólido ou semissólido, podem ser úteis na indução de formação de trombo no aneu- rismo aórtico. Por exemplo, tais CRPs podem ser revestidos sobre o lado externode uma espiral embólica para segurar o tecido e/ou evitar a dilatação de uma artéria distendida. Nessa modalidade, a formação de trombo no teci- do vascular danificado de um indivíduo pode ser induzido por meio do conta- to do tecido vascular com tais CRPs conforme descrito na presente inven- ção, que são adsorvidos ou de outro modo contidos no ou sobre um suporte sólido ou semissólido, como em um suporte de polímero inerte. Exemplos de suportes de polímeros inertes aceitáveis incluem, mas não se limitam a stents, espirais embólicas, e similares. Tal indivíduo pode sofrer de proble- mas médicos como, por exemplo, artéria ou outros vasos sanguíneos dis- tendidos e/ou aneurisma aórtico. Em uma modalidade, o suporte pode ser um suporte polimérico inerte que compreende proteínas, polietileno glicol, ou lipossomas, que é revestido como um CRP instantâneo que adsorve ao su- porte.

É Tais CRPs da presente invenção, conforme descrito aqui, podem ser adicionalmente úteis em uma composição quo compreendo uma matriz de polímero tridimensional quimicamente definido suplementado com os di- tos peptídeos relacionados ao colágeno para a diferenciação direcionada de É 5 células-tronco embrionárias.

A Publicação Internacional WO07/075807, aqui - incorporada inteiramente por referência para todos os propósitos, descreve uma composição que compreende uma matriz de polímero tridimensional quimicamente definido suplementado com um polipeptídeo IV de colágeno que suporta a diferenciação direcionada de células-tronco embrionárias.

Ainda outra modalidade da presente invenção é direcionada a um método de tratamento de uma condição hemostática em um indivíduo - que necessite do mesmo, compreendendo a administração de uma compo- sição que compreende um CRP da presente invenção, sendo que a compo- É sição pode incluir, mas não se limitar a tais CRPs conforme descrito pela presente invenção.

Uma composição de polipeptídeo pode, opcionalmente, incluir um substrato durante a administração.

Tal composição pode, tipica- mente, ser administrada de acordo com um regime suficiente para mostrar benefício ao indivíduo.

A quantidade real administrada e a taxa e curso do tempo da administração, dependerão de vários fatores como por exemplo, a natureza e severidade da doença ou problema de saúde sendo tratado.

À composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com terapias adjuntivas de outros tratamentos, de modo simultâneo ou sequencial, de- pendendo da doença ou problema de saúde tratado.

De acordo com esse método para tratamento de um problema —hemostático, a composição de CRP conforme descrito pela presente inven- ção pode ser usada sozinha ou em combinação com um excipiente e outros ingredientes opcionais para fornecer hemostase.

Em outra modalidade, tais - CRPs podem ser combinados com um substrato adequado para uso como um hemostato.

O hemostato da composição de CRP pode estar em variadas formas, que incluem mas não se limitam a, um pó, uma fibra, um filme ou uma espuma.

As espumas contendo CRP podem ser preparadas por proces-

sos como, por exemplo, liofiização ou espumejamento com solvente super- crílico. Detalhes desses processos são bem conneciaos na técnica & apre- sentados em, por exemplo, S. Matsuda, Polymer J., 1991, 23(5), 435-444 (liofilização) e Pedido de Patente Europeia EP 464.163 B1 (espumejamento à 5 com solvente supercrítico). Em geral, uma espuma liofilizada contendo CRP - da presente invenção pode ser preparada primeiramente pela dissolução do CRP, e qualquer ingrediente opcional conhecido na técnica como, por e- xemplo, plastificantes, em um solvente adequado sob temperaturas suficien- tes para essa dissolução, e então derramando a solução contendo CRP den- trodeum molde. O CRP pode estar presente na solução que o contém em uma quantidade, baseada no peso total da solução contendo CRP, em uma " faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de10 mg/mL, ou em uma faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 1 mg/mL, ou cerca de 0,3 mg/mL. Plastificantes É adequados incluem, mas não se limitam a glicerol; polietileno glicol; gliceri- na; propileno glicol; monoacetato de glicerol; diacetato de glicerol; triacetato de glicerol e misturas dos mesmos, e podem ser usados em uma quantida- de, baseada no peso seco final da espuma contendo CRP, em uma faixa de cerca de 0,5 por cento a cerca de 15 por cento, ou em uma faixa de 1 por cento a cerca de 5 por cento. Para minimizar possíveis efeitos deletérios ao CRP, atemperatura de dissolução não deve exceder a cerca de 50ºC. A dis- solução pode ser realizada sob condições aquosas favoráveis que incluem, mas não se limitam a, em água ou em soluções salinas aquosas, como a salina tamponada, solução tampão de fosfato, solução salina balanceada de Hank, salina tamponada com fosfato (PBS), salina tamponada com Tris, sa- linatamponada com Hepes, e misturas das mesmas.

Em uma modalidade, os solventes podem ser tamponados em uma faixa de pH de cerca de 6 a cerca de 8. Depois do molde ser preenchi- do com a quantidade desejada de solução, o molde é então transferido para um liofilizador, que o congelará, e então secará a vácuo a solução para re- mover o solvente da espuma resultante. Embora a espessura da espuma resultante possa variar dependendo de, por exemplo, a quantidade de solu- ção dentro do molde, a concentração de CRP na solução, e similares, a es-

puma resultante tipicamente pode ter uma espessura em uma faixa de cerca de 0,5 mm a cerca de 10 mm, ou em uma faixa de cerca de 1 mm a cerca do mm, e um tamanho de poro em uma faixa de cerca de 1 mícron a cerca de 500 mícrons. As espumas podem ser feitas em uma variedade de tamanhos 5 que podem ser adequados ao uso para enfrentar desafios hemostáticos em - locais hemorrágicos.

Filmes contendo CRP podem ser preparados por processos co- mo, por exemplo, fundição do filme a partir de um solvente adequado. Deta- lhes deste processo são bem conhecidos na técnica e foram apresentados em, por exemplo, Bagrodia S e Wilkes GL, "Effects of Solvent Casting Co- polymer Materials As Related to Mechanical Properties," J Biomed Mater '" Res., 1976 (Jan), 10(1), 101-11. De acordo com esta modalidade, o CRP da presente invenção, juntamente como qualquer ingrediente opcional conheci- E do na técnica como por exemplo, plastificantes, pode ser dissolvido em uma quantidade suficiente de solvente aquoso. O CRP pode estar presente na solução em uma quantidade, baseada no peso total da solução, em uma faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 10 mg/mL, ou em uma faixa de 0,1 mg/mL a cerca de 1 mg/mL, ou cerca de 0,3 mg/mL. Plastificantes adequa- dos incluem, mas não se limitam a glicerol, polietileno glicol, glicerina, propi- lenoglicol, monoacetato de glicerol, diacetato de glicerol, triacetato de glice- rol e misturas dos mesmos, e podem ser usados em uma quantidade, com base no peso seco final do filme contendo CRP, em uma faixa de cerca de 0,5 por cento a cerca de 15 por cento, ou em uma faixa de cerca de 1 por cento a cerca de 5 por cento.

Exemplos de solventes aquosos adequados incluem, mas não se limitam a, água, solventes orgânicos miscíveis, álcoois e misturas dos mesmos. Exemplos de solvente orgânicos miscíveis adequados e álcoois incluem, mas não se limitam a, acetona, etanol, isopropanol, propanol, me- tanol e similares e misturas dos mesmos. Para minimizar possíveis efeitos deletérios ao CRP, a temperatura de dissolução não deve exceder a cerca de 50ºC. A solução contendo CRP pode então ser adicionada, por exemplo, por gotejamento ou de outro modo, derramando uma quantidade adequada para cobrir uma área da superfície desejada em um substrato de fundição. Exeimpios de substratos de fundição adequados incluem aqueles que compreendem um material que liberará facilmente o filme contendo CRP, e podem incluir mas não serem limitados àqueles feitos de vidro, me- f 5 tal, recipientes revestidos por Teflon e similares. O tamanho e formato de - tais substratos podem variar de acordo com as necessidades da composi- ção. O solvente pode então ser removido da solução contendo CRP por e- vaporação ou por secagem a ar, então o filme resultante pode ser opcional- mente submetido a secagem por vários métodos, como através de secagem avácuo, para remover qualquer solvente residual. Se um filme mais espesso for desejado, o processo pode ser repetido pela fundição de uma ou mais - camadas da solução contendo CRP no topo da superfície superior do filme previamente fundido. Embora a espessura do filme resultante possa variar É dependendo de, por exemplo, a quantidade de solução derramada sobre o substrato de fundição, a concentração dos CRPs na solução e similares, tipi- camente a espessura de cada camada de filme pode estar numa faixa de cerca de 50 mícrons a cerca de 150 mícrons. Conforme especificado acima a respeito da espuma, os filmes podem também ser preparados em uma variedade de tamanhos.

Os pós contendo CRP podem ser obtidos por trituração, manu- almente ou mecanicamente, ou pulverização de fibras, filmes, ou espumas compreendidas pelo CRP da presente invenção usando processos bem co- nhecidos na técnica. Técnicas exemplificadoras para trituração ou pulveriza- ção de fibras, filmes ou espumas em pós incluem, mas não se limitam, àque- lasque usam pilão e almofariz, lâmina giratória, ou esmeril de impacto, como um moinho de esferas. Esses e outros meios para a trituração dos CRP em um pó podem ser realizados à temperatura ambiente ou por processos de trituração criogênica, em temperaturas abaixo do ponto de congelamente do CRP. O pó resultante contendo CRP pode ser opcionalmente peneirado para — obter um pó que tem tamanho de partícula na faixa de cerca de 1 mícron a cerca de 2000 mícrons, ou em uma faixa de cerca de 10 mícrons a cerca de 500 mícrons.

Os pós, filmes e/ou espumas contendo CRP podem ser aplica- dos diretamente no local da hemorragia como um hemostato para acentuar ou causar hemostase.

Alternativamente, o CRP descrito na presente inven- ção pode ser aplicado em combinação com um componente do substrato, e í 5 emtaismodalidades, o CRP é, deste ponto em diante no presente documen- " to, referido como componente CRP-hemostato.

O substrato pode ser um substrato adequado para a implantação em um indivíduo, ou pode ser um substrato não implantável.

Exemplos de substratos implantáveis adequados incluem, mas não se limitam a, dispositivos médicos, como âncoras de sutura, grampos, tachas cirúrgicas, clipes, parafusos, e filmes; estruturas para engenharia te- - cidual, como feltros não trançados, tecidos ou redes trançadas; espumas; e pós.

Esses substratos implantáveis podem compreender qualquer material adequado para a implantação no corpo e incluem, mas não se limitam a, polímeros biocompatíveis, bioabsorvíveis como poliésteres alifáticos, po- lil(aminoácidos) como a poli(L-lisina e polifácido glutâmico), copoli(éter- ésteres), oxalatos de polialquileno como aqueles que têm um comprimento do grupo alquila de um a dez átomos de carbono, polioxaamidas, policarbo- natos derivados de tirosina, polifiminocarbonatos), poliortoésteres, polioxa- ésteres, poliesteramidas, polioxaésteres contendo grupos amina, po- lif(anidridos), polifosfazenos, biomoléculas (incluindo biopolimeros como o colágeno, elastina, e gelatina, e polissacarídeos, como amidos, alginato, pectina, carbóxi metil celulose, sais de carbóxi metil celulose, celulose rege- nerada oxidada, e similares), e copolímeros e combinações dos mesmos, bem como materiais não absorvíveis incluindo, mas não se limitando a, al- godão, linho, seda, náilon, como náilon 6-6 e poliamidas aromáticas, como aquelas comercialmente disponíveis junto a E. |. du Pont de Nemours e Companhia sob os nomes comerciais "KEVLAR" ou NOMEX, poliésteres, como poli(etileno tereftalato), fluoropolimeros, como o politetrafluoroetileno, — polifetileno-propileno) fluorados (FEP) e polivinilideno fluorado (PFA), polio- lefinas, como polietileno e polipropileno, poliuretanos e combinações dos mesmos.

Para uso na presente invenção, "bioabsorvível" deverá referir-se a materiais que degradam-se prontamente via reações enzimáticas ou hidro- líticas após exposição a tecido corporal por um período de tempo relativa- mente curto. "Degradar" deverá significar que o material fragmenta-se em pequenos segmentos que podem ser substancialmente metabolizados ou : eliminados pelo corpo. A bioabsorção completa deve ocorrer dentro de cerca de vinte meses, embora a bioabsorção possa ser completada por exemplo, dentro de cerca de nove meses, dentro de cerca de seis meses, ou dentro de cerca de três meses ou menos. Entende-se que os poliliminocarbonatos), para o propósito desta invenção, incluem aqueles polímeros conforme descritos por Kemnitzer e - Kohn, no Handbook of Biodegradable Polymers, editado por Domb, et. al., Hardwood Academic Press, pp. 251-272 (1997). Entende-se que os copo- ] liféter-ésteres), para o propósito desta invenção, incluem aqueles copoliéste- res-éteres conforme descrito no Journal of Biomaterials Research, volume 22, páginas 993-1009, 1988 por Cohn e Younes, e em Polymer Preprints (ACS Division of Polymer Chemistry), Volume. 30(1), página 498, 1989 por Cohn (e.g. PEO/PLA). Os oxalatos de polialquileno, para o propósito desta invenção, incluem aqueles descritos nas Patentes US nºs: 4.208.511;

4.141.087; 4.130.639; 4.140.678; 4.105.034; e 4.205.399. Entende-se que policarbonatos derivados de tirosina, para o propósito desta invenção, inclu- em aqueles polímeros conforme descritos por Pulapura et al., Biopolymers, Volume 32, Número 4, páginas 411-417, e Ertel et al., J. Biomed. Mater. Res., 1994, 28, 919-930. Para o propósito desta invenção, entende-se que os polifosfazenos, polímeros à base de monômero misturado de co-, ter- e de ordem mais alta feitos a partir de L-lactídeo, D, L-lactídeo, ácido láctico, glicolídeo, ácido glicólico para-dioxanona, carbonato de trimetileno e épsilon- caprolactona incluem aqueles descritos por Allcock na the Encyclopedia of Polymer Science, Volume 13, páginas 31-41, Wiley Intersciences, John Wi- ley & Sons, 1988 e por Vandorpe, et al no Handbook of Biodegradable Polymers, editado por Domb, et al, Hardwood Academic Press, pp. 161-182 (1997). Entende-se que as poliesteramidas, para o propósito desta invenção,

incluem aqueles polímeros conforme descrito no pedido de Patente US nº 20060188547, e Patente US nº 5.919.893. Os polianidridos incluem aqueles derivados a partir de diácidos de forma HOOC-CgH4-O0-(CH2)Mm-O-CeHa- COOH, sendo que m é um número inteiro na faixa de 2 a 8, e copolímeros Í 5 — desses com diácidos alfa-ômega alifáticos de até 12 átomos de carbono. Os - polioxaésteres, polioxamidas e polioxaésteres contendo aminas e/ou grupos amido são descritos em uma ou mais das seguintes Patentes US nºs:

5.464.929; 5.595.751; 5.597.579; 5.607.687; 5.618.552; 5.620.698;

5.645.850; 5.648.088; 5.698.213; 5.700.583; e 5.859.150. Entende-se que poliortoésteres, para o propósito desta invenção, incluem aqueles polímeros conforme descritos por Heller em Handbook of Biodegradable Polymers, edi- - tado por Domb, et al, Hardwood Academic Press, páginas 99-118 (1997). Entende-se que os poliuretanos, para o propósito desta invenção, incluem É aqueles polímeros conforme descrito na Patente US nºs.: 6.326.410; 6019996;5571529; e 4.960.594.

Entende-se que os poliésteres alifáticos, para o propósito desta invenção, incluem, mas não se limitam a, homopolímeros e copolimeros de lactídeo (que inclui ácido láctico D-, L- e meso lactídeo), glicolídeo (incluindo ácido glicólico), épsilon-caprolactona, p-dioxanona (1,4-dioxan-2-ona), car- bonato de trimetileno (1,3-dioxan-2-ona), derivados alquila de carbonato de trimetileno, conforme descrito na Patente US nº 5.412.068, delta valerolactona, beta-butirolactona, gama-butirolactona, épsilon-decalactona, hidroxibutirato, hidroxivalerato, 1,4-dioxepan-2-ona (incluindo seu dímero 1,5,8,12-tetraoxaciclotetradecano-7,14-diona), — 1,5-dioxepan-2-ona, — 6,6- —dimetil-1,4-dioxan-2-ona e combinações dos mesmos.

Em uma modalidade, o poliéster alifático é um compolímero e- lastomérico. "Copolimeros elastoméricos" são definidos com um material que à temperatura ambiente pode ser estendido repetidamente a pelo me- nos cerca de duas vezes seu comprimento original e na liberação imediata do estresse, retornará aproximadamente ao seu tamanho original. Os elas- tômeros bioabsobíveis e biocompatíveis adequados incluem, mas não se limitam àqueles selecionados do grupo consistindo em copolimeros elasto-

méricos de épsilon-caprolactona e glicólico (como aqueles que têm uma ra- zão molar épsilon-caprolactone para glicólico na faixa de de cerca de 30:70 a cerca de 70:30, ou na faixa de cerca de 35:65 a cerca de 65:35, ou na fai- xa de cerca de 45:55 a 35:65); copolímeros elastoméricos de épsilon- caprolactona e lactídeo, incluindo blendas de L-lactídeo, D-lactídeo ou copo- - límeros de ácido láctico (como aqueles que tem uma razão molar de épsilon- caprolactona para lactídeo na faixa de cerca de 35:65 a cerca de 65:35, ou na faixa de cerca de 45:55 a 30:70) copolímeros elastoméricos de p- dioxanona (1,4-dioxano-2-ona) e lactídeo incluindo L-lactídeo, D-lactídeo e ácido láctico (como aqueles que tem uma razão molar de p-dioxanona para lactídeo na faixa de cerca de 40:60 a cerca de 60:40); copolímeros elasto- ki méricos de épsilon-caprolactona e p-dioxanona (como aqueles que têm uma razão molar de épsilon-caprolactona para p-dioxanona na faixa de cerca de : 30:70 a cerca de 70:30); copolímeros elastoméricos de p-dioxanona e car- bonato de trimetileno (como aqueles que têm uma razão molar de p- dioxanona para carbonato de trimetileno na faixa de cerca de 30:70 a cerca de 70:30); copolímeros elastoméricos de carbonato de trimetileno e glicólico (como aqueles que têm uma razão molar de carbonato de trimetileno para glicólico na faixa de cerca de 30:70 a cerca de 70:30); copolímero elastomé- rico de carbonato de trimetileno e lactídeo incluindo L-lactídeo, D-lactídeo, blendas dos mesmos ou copolimeros de ácido láctico (como aqueles que têm uma razão molar de carbonato de trimetileno para lactídeo na faixa de cerca de 30:70 a cerca de 70:30) e blendas dos mesmos.

Em outra modali- dade, o copolímero elastomérico é épsilon-caprolactona e glicolideo que tem uma razão molar de épsilon-caprolactona para glicolíideo em uma faixa de cerca de 35:65 a cerca de 65:35. Em ainda outra modalidade, o copolímero elastomérico é épsilon-caprolactona e glicolídeo que tem uma razão molar de cerca de 35:65. Exemplos de substratos não-implantáveis adequados incluem, mas não se limitam a, bandagens e curativos para ferimentos.

Para uso na presente invenção, uma "bandagem" deverá significar um pedaço de pano ou outro material usado para atar ou envolver uma parte do corpo doente ou í ferida. Bandagens são colocadas diretamente sobre o ferimento ou usadas para atar um curativo ao ferimento. Para uso na presente invenção, um "cu- rativo para ferimento" deverá significar um pedaço de pano ou outro material que é colocado diretamente sobre o ferimento e serve ao propósito de prote- É 5 gero ferimento; promover a cura; e/ou fornecer, reter, ou remover a umida- UG de, e é opcionalmente mantido no lugar pelo uso de uma bandagem. Substratos não-implantáveis podem ser de várias formas inclu- indo, mas não se limitando a, tecidos, espumas, gazes, filmes, bandagens adesiva, hidrocoloides, géis e combinações dos mesmos. Esses substratos não-implantáveis podem compreender qualquer material adequado para a- plicação (sem implantação) ao corpo e incluem, mas não se limitam a, polí- " meros biocompatíveis e bioabsorvíveis como poliésteres alifáticos, po- lil(aminoácidos), como poli(L-lisina) e poliflácido glutâmico), copoli(éter- Ê ésteres), oxalatos de polialquileno como aqueles com grupos alquila tendo uma dez átomos de carbono, polioxaamidas, policarbonatos derivados de tirosina, poliliminocarbonatos), poliortoésteres, polioxaésteres, poliesterami- das, polioxaésteres contendo grupos amina, poli(anidridos), polifosfazenos, biomoléculas (incluindo biopolimeros como colágeno, elastina, e gelatina, e polissacarídeos, como amidos, alginato, pectina, carbóxi metil celulose, sais de carbóximetil celulose, celulose regenerada oxidada e similares) e copo- límeros e combinações dos mesmos, bem como materiais não- bioabsorvíveis incluindo algodão, linho, seda, náilon, como náilon 6-6 e poli- amidas aromáticas, como aquelas comercialmente disponíveis junto a E. |. du Pont de Nemours e Compahia sob os nomes comerciais "KEVLAR" ou "NOMEX," poliésteres, como poli(etileno tereftalato), fluoropolimeros como politerafluoroetileno, poli(etileno-propileno fluorado (FEP) e fluoreto de poli- vinilidino (PFA), poliolefinas como polietileno e polipropileno, poliuretanos e combinações dos mesmos Esses materiais são definidos conforme descrito acima.

O componente CRP-hemostato pode ser aplicado na superfície de tais substratos por meio de técnicas de revestimento convencionais, como revestimento por imersão, revestimento por aspersão, revestimento por liofili-

À zação, e técnicas de revestimento eletrostático. Detalhes desses métodos de revestimento são bem conhecidos da técnica e apresentados, por exemplo, na Patente US nº 6.669.980; Yun JH, et al., 40(3) ASAIO J.M, 401-5 (Julho- Setembro 1994); e Krogars K, et al, Eur J Pharm Sci., 2002 (Outubro), 17 (1- Í 5 2) 23-30. Em geral, uma solução contendo a quantidade desejada do compo- . nente CRP-hemostato pode ser preparada e aplicada à superfície do substra- to desejado por meio da técnica de revestimento selecionada. O substrato pode então ser submetido à secagem por meio de processos de secagem convencionais incluindo, mas não se limitando a, secagem a ar, secagem a vácuoe em forno a vácuo, ou secagem a liofilização. O CRP deve ser usado em uma quantidade necessária para alcançar as propriedade hemostáticas - desejadas, como coagulação sanguína, agregação plaquetária, e similares, mas geralmente o CRP está presente com o propósito de substrato de reves- À timento em uma quantidade em uma faixa de cerca de 0,01 mg/cm? a cerca deilmg/cm? de substrato, ou em uma faixa de cerca de 0,1 mg/cm? a cerca de 0,5 mg/cm?, ou em uma faixa de cerca de 0,4 mg/cm?.

Em outra modalidade na qual o substrato é um gel injetável ou aspersível ou líquido formador de gel, o componente CRP-hemostato, que pode estar na forma de um pó ou substância fibrilar semelhante ao coláge- no, pode ser combinado com um gel ou líquido injetável ou aspersível por meio de técnicas de mistura convencionais conhecidos na técnica. O gel in- jetável ou aspersível ou líquido formador de gel pode compreender uma so- lução salina aquosa e um material gelificante.

Exemplos desolução salina aquosa adequados incluem, mas nãoselimitam a, solução tampão fisiológica, salina, água, salina tamponada, solução tampão de fosfato, solução salina balanceada de Hank, PBS, salina tamponada com Tris, salina tamponada com Hepes, e misturas das mes- mas. Em uma modalidade, a solução salina aquosa por ser uma solução tampão de fosfato ou PBS.

Exemplos de materiais gelificantes adequados incluem, mas não se limitam a proteinas como, colágeno, elastina, trombina, fibronectina, gelati- na, fibrina, tropoelastina, polipeptídeos, laminina, proteoglicanos, cola de fibri-

h na, trombo de fibrina, trombo de plasma rico em plaquetas (PRP), trombo de plasma pobre em plaquetas (PPP), hidrogéis de peptídeos, e atelocolágeno; polissacarídeos como amido, pectina, celulose, alquil celulose (por exemplo, metil celulose), celulose de alquil hidróxi alquila (por exemplo, celulose de etil É 5 hidróxi etila), celulose de hidróxi alquila (por exemplo, hidroxiletil cellulose), h sulfato de celulose, sais de carbóxi metil celulose, carbóxi metil celulose, car- boxietil celulose, quitina, carboximetil quitina, ácido hilaurônico, sais de ácido hilaurônico, alginato, alginato reticulado, alginato de propileno glicol, glicogê- nio, dextrano, sulfato de dextrano sulfate, curdlano, pectina, pululano, xanta- na, chondroitina, sulfatos de condroitina, carbóxi metil dextrano, carbóxi metil quitosano, quitosano, heparina, sulfato de heparina, heparano, sulfato de he- parano, sulfato de dermatano, sulfato de queratano, carrageninas, quitosano, amido, amilose, amilopectina, poli-N-glucosamina, ácido polimanurônico, áci- E do poliglucônico, e derivados; polinucleotíideos como, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos, e outros como, poli(N-isopropil acrilamida), po- lifoxialquileno), copolímeros de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), poli(álcool vinílico), poliacrilato, glicerol monoestearila cossuccinato/polietileno glicol (MGSA/PEG) e copolímeros e combinações dos mesmos.

Na definição dos materiais de celulose aqui descritos, o termo "“alquila" refere-se a uma cadeia de hidrocarbonetos que pode ser uma ca- deia reta ou ramificada contendo cerca de 1 a cerca de 7 átomos de carbo- no, exceto quando indicado de outra forma para uma modalidade particular, por exemplo metil, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc-butila, penti- la, isopentila, neopentila, hexil, 2,3-dimetilbutil, neo-hexil, ou heptila, hepari- na, sulfato de heparina, heparano, sulfato de heparano, sulfato de dermata- no, sulfato de queratano, carrageninas, quitosano, amido, amilose, amilopec- tina, poli-N-glucosamina, ácido polimanurônico, ácido poliglucônico, e deri- vados; polinucleotídeos como, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucle- icos, e outros como , poli(N-isopropil acrilamida), poli(oxialquileno), copoli- meros de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), poli(álcoo! vinílico), poliacrilato, — glicerol monoestearila cossuccinato/polietileno glico! (MG-

SA/PEG) e copolímeros e combinações dos mesmos.

Em uma modalidade, o material gelificante compreende polissa- carídeos. Em outra modaliade, o material gelificante compreende carbóxi metil celulose de sódio. O gel ou líquido injetável ou aspersível pode ser preparado pela dissolução de uma quantidade efetiva de material gelificante em uma solu- - ção salinaaquosa para formar um gel inicial.

Uma "quantidade eficaz" de material gelificante é definida como a quantidade de material gelificante suficientemente necessária para permitir que o gel ou líquido injetável ou aspersível seja injetado ou aspergido sobre aárea afetada e permanecer substancialmente no local após a aplicação. Embora a quantidade efetiva de material gelificante varie dependendo de, - por exemplo, o material gelificante selecionado, a quantidade de CRP dese- jada, e similares, o versado na técnica pode determinar facilmente uma quantidade efetiva de material gelificante sem demasiada experimentação. Em uma modalidade, em que o material gelificante é carbóxi metil celulose, o material gelificante pode estar presente em uma quantidade, com base no peso total da solução, em uma faixa de cerca de 0,1 por cento a cerca de 5 por cento, ou em uma faixa de cerca de 0,5 por cento a cerca de 3 por cento. O componente CRP-hemostato pode então ser combinado com ogelinicial por quaisquer técnicas de mistura convencionais conhecidas na técnica incluindo, mas não se limitando a, mistura manual com uma espátu- la, agitação magnética, ou mistura mecânica usando um motor a e uma pá ou lâmina rotativa. Para minimizar possíveis efeitos deletérios ao CRP, a temperatura de mistura não deve exceder a cerca de 50ºC. O CRP- hemostato está presente no gel resultante em uma quantidade efetiva para induzir a hemostase quando aplicado ao local da hemorragia, e está tipica- mente em uma faixa de, com base no peso total do gel final, cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 10 mg/mL, ou em uma faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cer- ca de 1 mg/mL, ou cerca de 0,3 mg/ml. Em uma modalidade, o gel ou líqui- do injetável ou aspersível pode estar na forma de gel antes da injeção, em- bora em uma modalidade alternativa, o gel ou líquido injetável ou aspersível pode estar na forma líquida antes da injeção, mas em uma forma de gel e

Í capaz de permanecer substancialmente no lugar no momento da administra- ção no local desejado.

Nas modalidades em que o componente CRP-hemostato está na forma de pó, o CRP pode estar combinado com qualquer veículo de pó ade- í 5 quado conhecido na técnica.

Em uma modalidade, o veículo pode ser um - líquido pulverizador revestindo partículas de pó usando métodos apresenta- dos em, por exemplo, Maa YF, et al., SJ Curr Pharm Biotechnol., 2000 (Nov.), 1(3), 283-302. O componente CRP-hemostato pode estar presente em uma quantidade, com base no peso total do pó, em uma faixa de cerca de0,5 porcento a cerca de 100 por cento, ou em uma faixa de cerca de 2 por cento a cerca de 10 por cento. - Exemplos de veículos de pó adequados incluem, mas não se limitam, polissacarídeos, como amido, pectina, celulose, alquila celulose (por f exemplo metilcelulose), alquila hidróxi alquila celulose (por exemplo, etila hidróxi etila celulose), hidróxi alquila celulose (por exemplo, hidróxi etil celu- lose), sulfato de celulose, sais de carbóxi metil celulose, carbóxi metil celulo- se, carbóxi etil celulose, quitina, carbóxi metil quitina, ácido hialurônico, sais de ácido hialurônico, alginato, ácido algínico alginato de ligação cruzada, alginato de propileno glicol, glicogênio, dextrana, sulfato de dextrana, curdla- na, pectina, pululana, xantana, condroitina, sulfatos de condroitina, carbóxi metil dextrana, carbóxi metil quitosana, quitosana, heparina, sulfato de hepa- rina, heparana, sulfato de heparana, sulfato de dermatana, sulfato de quera- tana, carragenas, quitosana, amido, amilose, amilopectina, poli-N- glucosamina, ácido polimanurônico, ácido poliglucurônico, manitol, lava po- rosa, poliésteres, e copolímeros e misturas dos mesmos.

Síntese Geral de CRP Os CRPs da presente invenção podem ser feitos por uma varie- dade de técnicas em solução ou em fase sólida Por exemplo, embora os CRPs possam ser preparados por outros métodos (por exemplo, métodos de solução) e então anexados a um material de suporte para acoplamento sub- sequente, é preferível que sejam usadas técnicas padrão de síntese orgâni- ca em fase sólida, como técnicas de síntese de polipeptídeos em fase sólida

(SPPS). Isto é, um CRP da presente invenção pode ser sintetizado, subse- quentemente anexado a um material de suporte, acoplado com vários rea- gentes, e então removido do suporte material usando uma variedade de téc- , nicas. De preferência, entretando, o CRP é sintetizado sobre um material de suporte, acoplado com reagentes, e então removido de um material de su- - porte usando uma variedade de técnicas.

Para a preparação de CRPs (oligopeptídeos, polipeptídeos, ou proteínas), a síntese de peptídeo em fase sólida envolve uma etapa de liga- ção covalente (isto é, ancoragem) que liga a cadeia de CRP nascente ao material de suporte (tipicamente, um suporte polimérico insolúvel) contendo grupos funcionais apropriados para anexação. Subsequentemente, o CRP - ancorado é estendido por uma série de ciclos de adição (desprote- ; ção/acoplamento) que envolvem a adição gradual de áminoácidos N- protegidos e protetores de cadeia lateral na direção C a N. Uma vez que a montagem da cadeia tenha sido realizada, os grupos protetores são removi- dos e o CRP é clivado a partir do suporte. Em alguns casos, outros grupos são adicionados ao CRP antes dos grupos protetores serem removidos.

Tipicamente, o SPPS começa pelo uso de um cabo para anexar um resíduo de aminoácido inicial a um material de suporte funcionalizado.

Um cabo (isto é, conector) é um espaçador bifuncional que, em uma extre- midade, incorpora características de um grupo protetor uniformemente cliva- do, e na outra extremidade, um grupo funcional, geralmente um grupo car- boxila, que pode ser ativado para permitir o acoplamento ao material de su- porte funcionalizado. Cabos conhecidos incluem os cabos de ácido lábil p- —alcoxibenzila (PAB), cabos de ésteres de o-nitrobenzila fotolábeis, e cabos como aqueles descritos por Albericio et al., J. Org. Chem., 55, 3730-3743 (1990) e referências citadas nesse, e nas Patentes US nºs 5.117.009 (Ba- rany) e 5.196.566 (Barany et al.).

Por exemplo, se o material de suporte é preparado com monô- meros amino-funcionais, tipicamente, os cabos apropriados são acoplados quantitativamente em uma etapa única nos suportes amino-funcionalizados para fornecer um ponto de partida geral de estruturas bem definidas para a f montagem da cadeia de polipeptídeos. O grupo protetor do cabo é removido e o resíduo C-terminal do primeiro aminoácido N'-protegido é acoplado quantitativamente ao cabo. Uma vez que o cabo estiver acoplado ao material de suporte e o aminoácido inicial estiver anexado ao cabo, o ciclo de síntese E 5 geral prossegue. O ciclo da síntese geralmente consiste na desproteção do Y grupo amino N-protegido do aminoácido no material de suporte, lavagem e, se necessário, uma etapa de neutralização, seguida por reação com uma forma carboxil ativada do próximo aminoácido N-protegido. O ciclo é repetido para formar o CRP de interesse. Os métodos de síntese de peptídeo em fa- se sólida usando materiais de suporte insolúveis funcionalizados são bem conhecidos. Quando as técnicas de SPPS são usadas para sintetizar CRPs sobre o material de suporte, metodologias Fmoc envolvem o uso de técnicas E ortogonais moderadas com o uso do grupo protetor de base lábil 9- fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc). Aminoácidos Fmoc podem ser preparados com o uso de carbonato de fluorenilmetil succinimidila (Fmoc-OSu), cloreto de Fmoc, ou sulfato de [4-(9-fluorenil metitóxi carbonilóxi)fenilJdimetilsulfônio metil (Fmoc-ODSP). O grupo Fmoc pode ser removido com o uso de piperi- dina em dimetilformamida (DMF) ou N-metilpirrolidona, ou com o uso de 1,8- diazabiciclo[5.4.0Jundec-7-eno (DBU) em DMF. Após a remoção de Fmoc, a N'-amina liberada da resina suportada está livre e pronta para anexação i- mediata do lipídeo sem uma etapa de neutralização interveniente. O análogo hidrofóbico imobilizado do CRP desejado pode ser então removido, por e- xemplo, com o uso de ácido trifluoroacético (TFA) à temperatura ambiente. Taismetodologias de síntese de polipeptídeo em fase sólida Fmoc são bem conhecidas aos elementos versados na técnica.

Uma variedade de materiais de suporte para a preparação dos complexos da presente invenção pode ser usada. Eles podem ser de mate- riais inorgânicos ou orgânicos e podem estar em uma variedade de formas (como membranas, partículas, cápsulas esféricas, fibras, géis, vidros, etc). Exemplos incluem, vidro poroso, sílica, poliestireno, polietileno tereftalato, polidimetilacrilamidas, algodão, papel, e similares. Poliestirenos funcionali-

zados, como resinas de poliestireno aminofuncionalizado, poliestireno ami- nometila, poliestireno aminoacila, poliestireno p-metilbenzidrilamina ou polie- tileno glicol-poliestireno também podem ser usadas para esse propósito.

Síntese Específica de CRP É 5 Acredita-se que aquele versado na técnica poderá, com base na - descrição aqui, utilizar a presente invenção em sua mais completa extensão.

As seguintes modalidades específicas devem ser construídas como mera- mente ilustrativas e não como limitativas do restante da descrição em qual- quer maneira que seja.

Materiais e Métodos: aminoácidos Fmoc, HBTU/HOBT, DIEA, NMP e DCM foram adquiridos junto a Applied Biosystems, Inc.

A piperidina - foi adquirida junto a Sigma-Aldrich.

A resina Fmoc-Gly-Wang foi adquirida junto a Bachem e a resina Fmoc-Phe-Wang junto a Novabiochem.

A espec- Ê tometria de massa MALDI-TOF foi realizada na M-Scan Inc. com o uso de uma estação de trabalho de Biospectometria Voyager-DE PRO de Applied Biosystems acoplada com um espectômetro de massa com dessorção a la- ser de Extração Atrasada com ácido a-ciano-4-hidróxi cinâmico como matriz.

A análise de aminoácido foi realizada na Molecular Structural Facility de U.C.

Davis com o uso de uma analisador de aminoácido Beckman 6300 Li- baseado.

Os CRPs obtidos eram de pureza maior de 90% e o contéudo do polipeptídeo foi considerado para preparar as soluções para cada experi- mento.

Adicionalmente, a concentração do CRP foi confirmada medindo a absorção em 214 (e = 6,0 x 10º M'cm” em PBS) ou 215 nm (e = 6,5 x 10º M cm” em água). Todas as filtrações de polipeptídeos para experimentos de microscopia eletrônica foram realizadas com o uso de filtro Nuclepore (0,4-um; membrana de policarbonato) de Whatman, o resto das filtrações foi feito com o uso de filtros de seringa Acrodisc (0,45-um; membrana de polite- trafluoroetileno) de Pall.

A menos que seja definido de outro modo, todos os termos téc- nicose científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme compre- endido pelo versado na técnica à qual a invenção pertence.

Abreviações u- sadas na especificação instantânea são as seguintes:

Abreviação Significado DCM diclorometano Ac acetila DIEA N,N-di-isopropiletilamina : DBU 1,8-diazabiciclo[5.4.0]Jundec-7-eno - DMF dimetilformamida Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonila Fmoc-Osu carbonato de fluorenilmetil succinimidila Fmoc-ODSP sulfato metil [4-(9-fluorenil-metilóxicarbonilóxi)fenil]- dimetilsulfônio HBTU hexafluorofosfato de 2-[(1H-benzotriazol-1-i1)-1,1,3,3- q tetrametilurônio E HOBT hidroxibenzotriazo! NMP N-metil-pirrolidona PBS solução salina tamponada de fosfato TFA ácido trifluoroacético Tm temperatura de fusão Exemplo 1 SEQ ID 25: (Fs)-Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe Comparador SEQ ID 29: Ac-(Gly-Pro-Hyp) 10-Gly Comparador SEQ ID 35: FsPhe-(Gly-Pro-Hyp)5-Phe O CRP tendo SEQ ID 25 e polipeptídeos comparadores com SEQ ID 29 e SEQ ID 35 foram sintetizados por química FastMoc padrão, purificados por HPLC de fase reversa e caracterizados.

O CRP tendo SEQ ID 25 foi sintetizado em um sintetizador ABI 431 usando química FastMoc (escala de 0,1 mmol) e resina de Fmoc-Phe- Wang (0,74 mmol/g, rede de 100-200). O CRP foi clivado a partir da resina com TFAvtri-isopropilsilano/água (95:2,5:2,5) por 2 horas.

A purificação por HPLC foi realizada em um purificador de coluna de fase reversa Phenome- nex C-18 (25x 5 cm), com o uso de um gradiente linear de 10-95% B (A: 0,2% TFA/H2O; B: 0,16% TFA/MeCN) em torno de 60 minutos em uma taxa de fluxode 50mL/min.

O CRP foi obtido como um pó branco em 32% de

: rendimento total. Para a SEQ ID 25: (Fs)-Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe: MALDI- TOF-MS (M+Na)* calculado para CiasHissFsN32O43, 3096,3; encontrado, 3096,8. O polipeptíideo comparador tendo SEQ ID 35: FsPhe-(Gly-Pro- Hyp)5-Phe foi sintetizado de modo similar ao CRP tendo SEQ ID 25: (F5)- Phe(Gly-Pro-Hyp)10-Phe.

- O polipeptideo comparador tendo SEQ ID 29: Ac-(Gly-Pro- Hyp) 10-Gly foi sintetizado em um sintetizador ABI 433A com o uso de quími- ca FastMoc (escala de 0,1 mmol) e Fmoc-Gly-Wang (0,7 mmol/g, rede de 100-200). O polipeptídeo comparador foi clivado a partir da resina com 95% TFA por 2 horas. A purificação por HPLC foi realizada em duas colunas de fase reversa C-18 (25 x 2,5 cm), com o uso de um gradiente de etapa de 0- - 100% B em torno de 90 minutos (A: 0,1% TFA/HzO; B: 80% MeCN/H2O con- tendo TFA a 0,1%) em uma taxa de fluxo de 6 mL/min. O polipeptídeo com- parador foi obtido como um pó branco em 34% de rendimento total. Para a SEQ ID 29: Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly: MALDI-TOF-MS (M+Na)* calculado para C124H177N31O43, 2811,3; encontrado, 2812,2. Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) As soluções de CRP tendo SEQ ID 25, e polipeptídeos compa- radores tendo SEQ ID 29 e SEQ ID 35 (0,25 mM e 0,013 mM em água) fo- ram armazenados a 4ºC por 24 horas e monitorados para a formação de trímero. O espectro CD foi medido a 25ºC em um instrumento Jasco J-710 com o uso de células de comprimento de trajetória de 0,1 cm por sinal em uma média de 10 or 20 varreduras a uma velocidade de varredura de 100 nm/min. Verificou-se que o CRP tendo SEQ ID 25 e polipeptídeo compara- dortendo SEQ ID 29 adotam estruturas tripo-helicoidais por espectroscopia CD (max = 225 nm). As curvas de fusão CD foram obtidas em um espec- tômetro Aviv 215 equipado com um sistema de controle de temperatura. A elipticidade a 225 nm foi monitorada partir de 20 a 100ºC, a uma taxa de 1ºC/min, com incrementos de 3ºC, tempo de equilíbrio de 5 minutos e com- primento de trajetória de 0,1-cm. Verificou-se que homotrímero de CRP tendo SEQ ID 25 tinha Tm de cerca de 57ºC. O resultado para o trimero CRP de SEQ ID 25 foi con-

firmado por um estudo HNMR dependente de temperatura, no qual a des- proteção acentuada característica para a 5-H de prolina (originalmente 5 3,0- 3,5 ppm) ocorreu de cerca de 55ºC a cerca de 65ºC (com equilíbrio). Por- tando, o trímero de CRP tendo SEQ ID 25 era estável à temperatura ambien- Í 5 te Comparativamente, a estabilidade térmica para o trimero de CRP tendo - SEQ ID 25 foi levemente mais alta do que aquela para um composto miméti- co de colágeno recentemente descrito (Tr, = 47ºC) com três cadeias de pep- tídeos ligadas covalentemente por um par de ligações dissulfeto. (Kotch F e Raines RT, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2006, 103, 3028-3033). A temperatura defusãomais baixa para o trímero de CRP tendo SEQ ID 25 comparado ao trimero de polipeptídeo de referência tendo SEQ ID 29 (Tm 70ºC) pode ser - atribuível a algumas rachaduras estruturais ("desgaste") nas extremidades do trímero de CRP tendo SEQ ID 25 pelos grupos fenil e pentafluorofenil.

Í Dispersão Dinâmica de Luz (DLS) As medidas de DLS foram feitas em um instrumento Malvern Zetasizer Zen 1600 equipado com um laser de 633-nm (He-Ne, 4,0 MW) e detecção de retroespalhamento a 173º. Soluções de CRP tendo SEQ ID 25 e o polipeptídeo de referência tendo SEQ ID 29 (0,5 mg/mL em água) foram aquecidas a 70ºC por 10 minutos, filtradas quentes através de um filtro d 0,45-um e medidas em cadinhos plásticos (1,0 cm) quando as soluções al- cançavam a temperatura ambiente (no tempo = 0) e após 24 horas.

As medidas DLS foram tomadas para determinar o tamanho dos compósitos supramoleculares formados pelo CRP tendo SEQ ID 25 e poli- peptídeo comparador tendo SEQ ID 29 em água a 25ºC. Uma solução fresca deCRP tendo SEQ ID 25 continha duas espécies, dimensionadas em 3 nm e 190 nm, as quais após 24 horas, convergiram em um material agregado com um tamanho aproximado de 1000 nm. Em contraste, o polipeptídeo comparador tendo SEQ ID 29 mostrou duas espécies com tamanhos de cer- ca de 4 e 100 nm, que não aumentaram durante o mesmo período de tempo.

Esses resultados sugerem que o mecanismo de empilhamento fenil- pentafluorofenila aromática hipotetizado estava facilitando a formação do CRP tendo SEQ ID 25 em um compósito supramolecular.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) O tamanho e morfologia do compósito supramolecular do CRP tendo SEQ ID 25 também foram avaliados por Timagens EM tomadas com um TEM Philips EM 300. Soluções aquosas de CRP tendo SEQ ID 25 À 5 (0,05mg/mL) foram filtradas através de filtros de 0,4-um e depositadas so- - bre grades de cobre revestidas com filmes de carbono.

As soluções foram submetidas a secagem a 40ºC e imagens foram registradas a 80 kV.

Artérias de ratos foram tingidas com glutaraldeído a 2% e colocadas dentro de blocos de epóxi para TEM.

Seções finas das artérias dentro de blocos de epóxi (cerca de 200-500 nm de tamanho) foram cortadas com o uso de uma fer- ramenta de seção de diamante.

As seções foram montadas sobre grades de La cobre e imagens registradas a 60 kV.

Em cada experimento, filbrilas de : compósito de um, (diâmetro médio: 0,26 um), lembrando fibrilas de colágeno encontradas no tecido aórtico de ratos (diâmetro médio: 0,05 um) foram ob- servadas.

As dimensões de fibrilas tendo SEQ ID 25 exigiram uma monta- gem ponta a ponta (linear) e lado a lado (lateral) de pelo menos 100 CRP trímeros tendo SEQ ID 25 em cada direção.

Espectroscopia RMN de Prótons O espectro RMN de prótons de CRP tendo SEQ ID 25 (1 mM em D2O incubados a 4ºC por 24 horas) foi coletado em um espectrômetro DMX- 600 RMN (Bruker Biospin, Inc., Billerica, MA 01821-3991) equipado com uma ressonância tripla ('H, ºC, **N), eixo triplo, ponta de prova de gradien- te.

Um NOESY unidimensional, com pré-saturação durante o tempo de repe- tição e tempo de misturação, foi usado para coletar os dados.

A temperatura foielevada em incrementos de 10ºC e o espectro foi medido após equilíbrio de 15 min.

Exemplo 2 SEQ ID 25: FsPhe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe SEQ ID 26: Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe SEQ ID 27: Leu-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe SEQ ID 28: GIy-(Gly-Pro-Hyp)10-GIy.

Os CRPs tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26, e SEQ ID 27 e o poli-

peptídeo comparador tendo SEQ ID 28 foram sintetizados por química FastMoc padrão, purificados em HPLC de fase reversa, e caracterizados.

Síntese de Peptídeo Os CRPs tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 e o polipep- tídeo comparador tendo SEQ ID 28 foram sintetizados em um sintetizador - ABI 431 com o uso de química FastMoc (escale de 0,1 mmol) e resina Fmoc-Phe-Wang (0,74 mmol/g, rede de 100-200) ou resina Fmoc-Gly-Wang (0,66 mmol/g, rede de 100-200). Os CRPs e o polipeptídeo foram clivados a partir da resina com TFAv/tri-isopropilsilano/água (95:2,5:2,5) por 2 horas.

À purificação foi realizada por RP-HPLC (Zorbax 300 SB-C18, 21,2 x 150 mm, a 60ºC) com o uso de um gradiente linear de 5-95% B (A:TFA/água a 0,05%; - B: TFA/MeCN a 0,05%) durante 15 minutos a uma taxa de fluxo de 20 ; mL/min.

As frações foram analisadas por LC/MS em um Agilent 1100 aco- plado com detector Finnigan LCQ com o uso de uma coluna Zorbax 300 SB- C18(3,5 um 4,6 x 150 mm) a 60ºC e um gradiente linear de 5-95% B (A: ácido fórmico a 0,02%/água; B: fórmico/MeCN a 0,02%) durante 20 minutos a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.

Conforme mostrado na Tabela 1, as frações contendo material (>90%) puro foram combinadas e liofilizadas para render os peptídeos como pós brancos.

O conteúdo do peptídeo foi determinado pela medida da absor- ção a 215 nm e usando o coeficiente de extração de (e = 6,5 x 10º M* cm”) determinado para o peptídeo de referência de SEQ ID 34: (Pro-Hyp-Gly)1o (fornecedor: Peptides International). Calculados e Encontrados, os valores MS foram determinados com o uso de MALDI-TOF-MS (M+Na)*. Tabela SEQ MS Cal- MS Encon- PaaNENNNATE Conteúdo ID Fórmula culado trado monto do Pepti- deo 25 CissHissFsN32O043 3096,3 3096,7 31 95 26 CissHiooN320:3 — 30064 — 3007,0 26 95 27 CisstHioaN32O0as3g — 29724 2973,0 35 96 28 CicaHizoN320a3g — 2826,3 2826,9 32 90

Análise de CRP Espectroscopia de CD: Soluções de CRP tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 e o peptídeo comparador tendo SEQ ID 28 (0,25 mM e 0,013 mM em água) foram armazenadas a 4ºC por 24 horas e monitoradas — paraformação de tripla hélice.

O espectro CD foi medido a 25ºC em um ins- - trumento Jasco J-710 com o uso de células de comprimento de trajetória de 0,1 cm por sinal em uma média de 10 ou 20 varreduras a uma velocidade de varredura de 100 nm/min.

As curvas de fusão CD foram obtidas em um es- pectômetro Aviv 215 equipado com um sistema de controle de temperatura.

A elipticidade a 225 nm foi monitorada de 20 a 100ºC, a uma taxa de 1ºC/min, com incrementos de 3ºC, tempo de equilíbrio de 5 minutos e com- - primento de trajetória de 0,1-cm. : O espectro de CD de três CRPs (0,25 mM em água) a 25ºC mostrou uma banda de 225 nm (6ma, Característica de uma tripla hélice de colágeno.

A estabilidade térmica das triplas hélices formadas pelos CRPs tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 também foram estudadas compa- rativamente pelo monitoramento da elipticidade a 225 nm a partir de 20- 100ºC, com incrementos de 3ºC e tempo de equilíbrio de 5 minutos.

As tem- peraturas de fusão dos três CRPs foram muito similares (na faixa de 56- 59ºC) indicando que, independentemente das diferenças estruturais em seus N-terminus, todos eles formaram trímeros estáveis.

Exemplo 3 SEQ ID 31: FsPhe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe SEQ ID 32: Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe SEQ ID 33: Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe Conforme será descrito a seguir com mais detalhe, a estrutura do modelo de um trimero de CRP da presente invenção foi interpretada a partir da estrutura de raio X do trímero de polipeptídeo semelhante ao colá- geno tendo SEQ ID 30: (Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-Hyp-Ala)-(Pro-Hyp-Gly)s (Bella . 30 dJ,EatonM, Brodsky Be Berman HM, Science 1994, 266, 75-81). O trímero de polipeptídeo semelhante ao colágeno tendo SEQ ID 30 foi mutado para incorporar FsPhe no N-terminal (posição-Pro) e Phe no C-término (posição-

Gly) para fornecer um CRP tendo SEQ ID 31 (similar à SEQ ID 25, mas sem repetição de GPO). Os polipeptídeos tendo SEQ ID 32 e SEQ ID 33 foram preparados de modo similar com o uso de Phe e Leu, respectivamente. Química Computacional É 5 A estrutura de cristal do polipeptideo semelhante ao colágeno - tendo SEQ ID 30 foi usada como ponto de partida para a modelagem. Visto que essa estrutura continha um resíduo de alanina central, o resíduo foi pri- meiramente mutado para glicina. Uma de cada das unidades B e X do CRP de Fórmula (1) foi então adicionada ao N-término e C-término de cada cadeia datripla hélice tendo SEQ ID 30. No C-terminus, o resíduo de Gly da SEQ ID 30 foi substituído por Phe (para SEQ ID 31, SEQ ID 32 e SEQ ID 33). No N- término, os segmentos Pro-Hyp foram substituídos com um único FsPhe : (SEQ ID 31), Phe (SEQ ID 32) e Leu (SEQ ID 33). Devido à natureza da sequência, cada um dos CRPs tendo SEQ 1D31, SEQID32 e SEQ ID 33 continha uma repetição de motivo GPO a menos (comparado à SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27), mas foram ade- quados para a modelagem molecular de SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID

27. Cada trímero de CRP foi minimizado com o uso de uma cadeia principal constrita, campo de força OPLS-AA (Jorgensen WL e Tirado-Rives J, J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 1657-1666), GB/água SA (Qui D, Shenkin PS, Hol- linger FP e Still CW, J. Phys. Chem. A., 1997, 101, 3005-3014) com o uso de Macromodel 9.0 (MacroModel 9.0, 2005, Schrôdinger, Inc., 1500 SW First Ave., Suite 1180, Portland, or 97201) para relaxar qualquer tensão causada pelas modificações. Cada tríimero de CRP foi então emparelhado com um trimero CRP de mesma sequência por alinhamento de duas das unidades de trímeros ao longo do eixo centra! do trimero. Nessa etapa, tomou-se cuidado para fornecer um alinhamento robusto das unidades hidrofóbicas de reco- nhecimento. Cada um dos pares de trimero CRP alinhados tendo SEQ ID 31, SEQID320ouSEQID 33 foram avaliados para automontagem e propagação fibrilar com o uso de campo de força XED em que cada par de trímero ali- nhado foi minimizado a <0,01 rms (gradiente conjugado sem constrições;

Hunter CA, Sanders JKM, J.

Am.

Chem.

Soc., 1990, 112, 5525-5534; Vinter JG, J.

Comp.-Aid.

Mol.

Design, 1994, 8, 653-668; Vinter JG, J.

Comp.-Aid.

Mol.

Design, 1996, 10, 417-426; e Chessari G, Hunter CA, Low CMR, Packer MJ, Vinter JG e Zonta C, Chem.

Eur.

J., 2002, 8, 2860-2867). Todos os íons Ê 5 de amônioe carboxilados foram carregados a 1/8 da carga total para res- - ponder aos efeitos de solvatação parcial.

Após a minimização, a energia de interação (IE) entre as duas unidades de tripla hélice foi calculada e consistiu nos componentes de Coulomb e de van der Waals.

Essa energia incluiu ter- mos intermoleculares entre cada unidade de tripla hélice.

Os termos e ener- gias intramoleculares entre as cadeias no mesmo feixe de tripla hélice não foram incluídos.

Os resultados de várias combinações de elementos de re- . conhecimento estão resumidos na Tabela 2. ; A energia de interface modelada para o par de trímero de CRP alinhado tendo SEQ ID 31 é mostrada na (Tabela 2, entrada 1). Três pares de anéis aromáticos adotaram orientações face a face e uma ponte de hi- drogênio foi observada na interface.

A estrutura foi testada para reorientar os aromáticos em uma disposição borda-a-borda e então reminimização (Tabe- la 2, entrada 2). A estrutura da interface resultante reverteu as interações face a face com energia de interface similar.

A interface do par de trimero de CRP tendo SEQ ID 32 exibiu interações borda-a-face (Tabela 2, entrada 3) ou face a face com ângulo deslocado.

As energias totais de interface do par de trimero de CRP tendo SEQ ID 33 foram mais baixas (Tabela 2, entrada 4). Tabela 2 Energias de Interação Calculadas para Pares de Trímero (kcal/mol) Entrada SEQ ID El Total Coulomb van der Waals 7 sEeQID3T -552 150 402 2 ?SEQ ID 31 -56,4 -15,2 41,2 3 ?SEQ ID 32 49,2 -7,0 42,2 4 SEQ ID 33 -32,5 -5,6 -36,9 1 Modelo Phe-pentafluorofenilalanina (iniciando com orientação face a face) de SEQ ID 31; 2 Modelo phe-pentafluorofenilalanina (iniciando com orientação em forma de T) de SEQ ID 31, Minimiza para trás de orientações face a fa- ce; 3 Minimiza em direção a orientações borda-a-face.

Conforme mostrado na Tabela 2, os polipeptídeos tendo SEQ ID i 5 31,SEQID32eSEQID 33 têm as exigências estruturais para montagem - ponta a ponta em graus variados.

Analogamente, os polipeptídeos tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 também teriam exigências estruturais para montagem ponta a ponta de modo similar.

Exemplo 4 Estudos de Agregação Plaquetária A capacidade do CRP tendo SEQ ID 25 para mimetizar a função . biológica do colágeno foi avaliada em um ensaio de agregação de plaquetas D humanas.

Um concentrado de plasma rico em plaquetas (PRP) humanas de voluntários saudáveis foi adquirido junto a Biological Specialties, Inc. (Col- mar, PA). O PRP não tinha mais que 5 horas, visto que o PRP que tem mais de 24 horas produz respostas consideravelmente atenuadas para o coláge- no e para CRP de SEQ ID 25. O PRP foi centrifugado em 730 g durante 15 minutos.

O pélete plaquetário resultante foi lavado duas vezes em tampão CGS (13 mM de citrato de sódio, 30 mM de glicose, 120 mM de NaCl, pH 6,5) contendo 1 U/mL de apirase (grau V, Sigma-Aldrich) e ressuspenso em tampão de Tyrode (140 mM de NaCl, 2,7 MM de KCI, 12 mM de NaHCO;, 0,76 mM Na2HPO;,, 5,5 mM de dextrose, 5,0 mM de Hepes, 0, 2% de BSA, pH 7,4). As plaquetas "lavadas" foram diluídas 3 x 10º plaquetas/mL e man- tidas >45 minutos a 37ºC antes do uso.

Para o ensaio, 105 ul. de plaquetas lavadas, 2 mM de CaCkb e 2,5 mM de fibrinogênio foram adicionados a uma placa de microtitulação com 96 poços.

A agregação plaquetária foi iniciada pela adição de concen- trações seriais de fibrilas de colágeno nativas (tipo | equino; 92% de identi- dade com a sequência de colágeno humana; Chrono-log Corp., Havertown, PA) ou peptídeos teste.

O tampão foi adicionado a um conjunto de poços para controle.

A placa do ensaio foi agitada constantemente e colocada de forma intermitente em um leitor de microplaca (Softmax, Molecular Devices,

Menlo Park, CA, EUA) para ler a densidade ótica (650 nm) no tempo 0 e 5 minutos após a adição das soluções do composto.

A agregação foi calculada como a diminuição na densidade ótica entre as medições no tempo-0 e 5- minutos e expressas como percentagem da agregação. ' 5 As condições para a preparação do peptídeo para estudos de - agregação plaquetária são mostradas na Tabela 3. Os peptídeos foram dis- solvidos em PBS (pH 7) ou água (pH final 5) em uma concentração de 2 mg/mL.

Algumas amostras foram aquecidas em banho-maria (70ºC) por 10 minutos, filtradas através de um filtro de 0,45-um e incubadas por 24 horas ou7diasa4C.

Medições de UV a 215 nm antes e após a filtração não indi- caram perda de peptídeos.

Algumas soluções de teste de CRP com SEQ ID -. 25 em PBS (pH 7) ou água foram incubadas por 24 horas ou 7 dias (4ºC), e : outras amostras foram desnaturadas (H+F) e reaneladas a 4ºC.

Tabela 3 Condições para Preparação de Peptídeo e Resultados para Estudos de A- gregação Plaquetária Peptídeo Solvente — Condições" pH Tempo deECso + SEM Incubação — ug/mL) Colágeno — -— — -— 0,25 + 0,02 SEQID25 PBS -— 7 7 dias 0,37 + 0,06 SEQ ID 25 PBS H+F 7 7 dias 2,7 +0,20 SEQID25 PBS H+F 7 24h 9,2 + 0,82 SEQ ID 25 Água -— 5 24h 1,4 + 0,27 SEQ ID 34 PBS H+F 7 24h Não Ativo * H+F representa aquecido a 70ºC por 10 minutos e filtrado através de um filtro de 0,45-um As soluções diferentes de CRP tendo SEQ ID 25 induziram a agregação plaquetária, mas incubações mais curtas e amostras "H+F" mos- traram uma potência diminuída.

O CRP tendo SEQ ID 25 (não tratada, enve- lhecida 7 dias em PBS; ECso = 0,37 ug/mL) foi aproximadamente equipoten- te ao colágeno Tipo | equino (ECso = 0,25 ug/mL), considerando que o poli- peptídeo de referência 30-mer tendo SEQ ID 34 (Pro-Hyp-Gly)1o deixou de agregar plaquetas.

O peptídeo de SEQ ID 34 (Pro-Hyp-Gly)1o foi adquirido junto a Peptides International, Inc.

Esses resultados indicam que o trimero de CRP que tem SEQ ID 25 pode automontar-se ao longo do tempo em agregados de comprimento e conformação apropriados para satisfazer as exigências estruturais para o á 5 reconhecimento de plaquetas (presumivelmente em receptores de colágeno - plaquetário). Além disso, foi observada a automontagem de um CRP curto (8-nm) tendo SEQ ID 25 por meios não-covalentes em trímeros de CRP e então em fibrilas semelhantes a colágeno com propriedades de mimetizar o colágeno.

De modo notável, fibrilas de compósito, com comprimento de mi- crômetros, e contendo tripla hélice foram formados, conforme determinado por dados de CD, DLS, e TEM.

Também, o trímero de CRP tendo SEQ ID 25 - agiu como um material funcional semelhante a proteina, com capacidade : para induzir a agregação plaquetária de modo análogo ao colágeno.

Os mo- tivos de reconhecimento aromático-aromático e hidrofóbico-hidrofóbico para um CRP de Fórmula (1) oferecem uma abordagem objetiva para automonta- gem de peptídeos que mimetizam o colágeno e fornecem trímeros de CRP capazes de montagem em estruturas fibrilares biologicamente funcionais.

Exemplo 5 A inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno ou trimero de CRP que tem SEQ ID 25 foi obtida com o uso do antagonista GPIlb/llla integrina elarofiban (Hoekstra WJ, et al. . Med.

Chem. 1999, 42, 5254-5265). A agregação plaquetária induzida por trimero CRP tendo SEQ ID 25 e colágeno foi inibida pelo elarofiban, um inibidor de GPIIb/llla.

Plaquetas lavadas foram incubadas com várias doses de elarofi- ban(10,100e 1000 nM) por 5 minutos antes da adição do trímero de CRP tendo SEQ ID 25 e colágeno.

A inibição dose-dependente de agregação pla- quetária foi observada.

Esses dados sugerem que o colágeno bem como o trimero de CRP tendo SEQ ID 25 ativaram a agregação plaquetária ao enga- tilhar a sinalização de GPIlb/llla.

Exemplo6 A inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno ou trímero de CRP tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26, SEQ ID 27, SEQ ID 28 e SEQ

ID 34 foi realizada pelos métodos descritos no Exemplo 4. De acordo com as modalidades da presente invenção, a Figura 1 mostra que os trimeros de CRP tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 estimularam a agregação plaquetário em graus variados, com o trímero de CRP tendo SEQ ID 25e o Á 5 trimero CRP tendo SEQ ID 26 sendo mais potentes.

Polipetídeos de refe- - rência tendo SEQ ID 28, SEQ ID 34 e SEQ ID 35 não foram efetivos na es- timulação da agregação plaquetária.

A Figura 1 com ECrsovalores (+ SEM) . Ug/mL) obtidos para o colágeno e o trímero de CRP tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 são mostrados na Tabela 4. Tabela4 EC, valores (+ SEM) ua/mL) : Peptídeo ECs5o ! Colágeno 0,56 + 0,09 SEQ ID 25 2,44 + 0,20 SEQ ID 26 13,06 + 1,28 SEQ |D 27 >30 Exemplo 7 CRP Revestido e Espuma PCL/PGA Revestida de Controle PBS em Modelo de Ferimento de Baço Etapa A.

Suspensão de CRP Uma suspensão teste foi preparada pela dissolução do CRP tendo SEQ ID 25 em solução salina tamponada com fosfato ("PBS") tendo pH 7,4 a uma concentração de 0,33 mg de CRP/mL de PBS, e então pela incubação da suspensão por 7 dias a 4ºC.

EtapaB.

Preparação de Espuma de Substrato PCL/PGA Um polifépsilon-caprolactona-co-glicolideo) ("espuma P- CL/PGA") de 3 mm de espessura foi preparado pela liofiização de 50 gramas de uma solução com 3 por cento em peso de PCL/PGA 35/65 (mol/mol) em 1,4-dioxano em um molde de alumínio de 4,5" x 4,5" sob con- diçõesde temperatura de cerca 5 a cerca de -5ºC por cerca de 3 horas em um secador de baixa temperatura (FTS Systems, Model TD3B2T5100). À espuma PCL/PGA resultante foi removida do molde, e então cortada em vá-

rios quadrados de 2" x 2". Etapa C. Preparação de Espuma Revestida de Polipeptíideo Um quadrado de espuma PCL/PGA preparado de acordo com o procedimento apresentado na Etapa B acima foi colocado em um molde de É 5 alumínio2"x2" Após a mistura da suspensão de CRP preparada de acordo . com procedimento apresentado na Etapa A acima até parecer homogênea, 7 mLs da suspensão foram então derramados dentro do molde para cobrir substancialmente a superfície superior da espuma. O molde foi então colo- cado dentro de um secador de baixa temperatura (FTS Systems, Model TD3B2T5100), pré-resfriado a -50ºC, e liofilizado a -25ºC por cerca de 44 horas. . Etapa D. Preparação de Espuma de Controle Revestida de PBS , Espumas revestidas de polipetídeo foram preparadas pela adi- ção de 7 mL de PBS a um molde 2" x 2" contendo uma espuma PCL/PGA com espessura de 3 mm de acordo com o procedimento apresentado na Etapa B acima para cobrir substancialmente a superfície superior da espu- ma. O molde foi colocado dentro de um secador de baixa temperatura (FTS Systems, Model TD3B2T5100), pré-resfriado a -50ºC, e liofiizado a -25ºC por cerca de 44 horas.

A espuma revestida de CRP e o controle revestido de PBS fo- ram então cortados em vários pedaços de 2 cm X 3 cm para testagem sub- sequente.

Modelo de Lesão de Baço Duas lacerações lineares (cada uma das quais tinha 1 cm de extensãoe 0,3 cm de profundidade) foram feitas em um baço de suíno. Após o término da sangria dos ferimentos por cerca de 3 a 5 segundos, um peda- ço de espuma revestido por CRP produzido de acordo com a Etapa C foi aplicado a mão à superfície de um ferimento (Grupo Teste 1), e um pedaço de espuma revestido de PBS preparado de acordo com a Etapa D foi aplica- doamão à superfície do outro ferimento (Grupo Teste 2). Uma pressão simi- lar para baixo foi então aplicada aos locais do teste por 30 segundos. Após a remoção do pedaço de espuma revestido, cada respectivo ferimento foi ava-

liado visualmente para determinar se a hemostase foi alcançada. Se neces- sário, foi reaplicada pressão sobre cada ferimento, respectivamente, com um pedaço de espuma revestido e limpo de um tipo similar em intervalos de 30 segundos. O tempo para alcançar a hemostase, a parada do sangramento, : 5 paracada ferimento é mostrado abaixo na Tabela 5. - Tabela 5 Tempo para a Hemostase (segundos) Grupo de Teste 1 Grupo de Teste 2 Pedaços Aplicados 2 2 Tempo 95 +/- 65 170 +/-70 Os resultados indicam que a espuma revestida de CRP foi útil no . alcance da hemostase em menos tempo que a espuma controle.

210 Enquanto ao relatório supracitado ensina os princípios da pre- sente invenção, com exemplos fornecidos a propósito de ilustração, será entendido que a prática da invenção abrange todas as variações, adapta- ções e/ou modificações usuais, conforme ocorre dentro do escopo das se- guintes reivindicações e suas equivalentes. Igualmente, todas as publica- ções, pedidos de patente, patentes, e outras referências apresentadas no relatório acima estão aqui incorporadas inteiramente por referência e para todos os propósitos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada por ser formada por um peptídieo relacionado a colágeno, de Fórmula (1): B-(Z)M-X É 5 emque . Z é selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro; J é selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14ou 15; e - B e X são independentemente selecionados do grupo consistin- ' do em Fs5-Phe, Phe (opcionalmente, mono- ou dissubstituído em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou CF3), Tirosina, 3,4-(OH)>-Fenilanina, MeO-Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, leu, lle e Val, sendo que a composição está sob a forma de uma espuma, um pó, uma fibra, ou um filme.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada porcompreender, adicionalmente, uma pluralidade dos ditos peptídeos rela- cionados a colágeno, sendo que os peptídeos relacionados a colágeno estão presentes na forma de trímeros de peptídeo relacionados a colágeno.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os trimeros de peptídeo relacionado a colágeno são homo- trímeros.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os trímeros de peptídeo relacionados a colágeno são hete- rotrímeros.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de estar sob a forma de uma espuma e de compreender, adicio- nalmente, com base no peso a seco total da espuma, de cerca de 0,1 por cento a cerca de 15 por cento de um plastificante.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o plastificante é selecionado do grupo que consiste em gli- cerol, polietileno-glicol, glicerina, propileno-glicol, monoacetato de glicerol, diacetato de glicerol, triacetato de glicerol e misturas dos mesmos.

É 5 7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada - pelo fato de estar sob a forma de uma espuma que tem uma espessura de cerca de 0,5 mm a cerca de 10 mm.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de estar sob a forma de uma espuma que tem um tamanho de po- rosde cerca de 1 miícron a cerca de 500 mícrons.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada - pelo fato de estar sob a forma de um filme que tem uma espessura de cerca b de 50 mícrons a cerca de 150 mícrons.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de estar sob a forma de um pó cujas partículas têm tamanho de cerca de 1 mícron a cerca de 2.000 mícrons.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- da pelo fato de compreender, adicionalmente, um veículo selecionado a par- tir de polissacarídeos, manitol, lava porosa, poliésteres e copolímeros e mis- turasdosmesmos.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- da pelo fato de que o polissacaríideo é selecionado do grupo que consiste em amido, pectina, celulose, alquila celulose cujo grupo alquila tem de cerca de 1 a cerca de 7 átomos de carbono, celulose de alquilhidroxialquila cujo grupo alquila tem de cerca de 1 a cerca de 7 átomos de carbono, hidróxi al- quila celulose cujo grupo alquila tem de cerca de 1 a cerca de 7 átomos de carbono, sulfato de celulose, sais de celulose de carbóxi metil, celulose de carbóxi metil, celulose de carbóxi etila, quitina, quitina de carbóxi metila, áci- do hialurônico, sais de ácido hialurônico, alginato, alginato reticulado, ácido —algínico, alginato de propileno glicol, glicogênio, dextrano, sulfato de dextra- no, curdlan, pectina, pululano, xantana, condroitina, sulfatos de condroitina, carbóxi metil dextrano, carbóxi metil quitosano, quitosano, heparina, sulfato de heparina, heparina, sulfato de heparan, sulfato de dermatano, sulfato de queratano, carragenina, quitosano, amido, amilose, amilopectina, poli-N- glicosamina, ácido polimanurônico, ácido polglucurônico, e copolimeros e misturas dos mesmos. É 5

13. Método de intensificação da hemostase em um indivíduo que - dela necessita, caracterizado pelo fato de compreender a aplicação da com- posição conforme definida na reivindicação 1, a pelo menos um local de sangramento do indivíduo.

14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um peptídeo relacionado a colágeno de fórmula (1): B-()M-X - em que : Z é selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro; J é selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14o0u 15;e B e X são selecionados, independentemente, do grupo que con- siste em Fs-Phe, Phe (opcionalmente mono- ou dissubstituído em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)z-Phe, MeO-Tyr, fe- nilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, leu, Ile e Val; e (b) um substrato.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelofatode que compreende, adicionalmente, uma pluralidade dos ditos peptídeos relacionados a colágeno, sendo que tais peptídeos relacionados a colágeno estão presentes sob a forma de uma pluralidade de trímeros de peptídeos relacionados a colágeno.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- da pelofatode que os trímeros de peptídeo relacionado a colágeno são ho- motrímeros.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-

da pelo fato de que os trímeros de peptídeo relacionado a colágeno são he- terotrímeros.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o substrato é adequado para implantação em um corpo É 5 humano.

- 19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracteriza- da pelo fato de que o substrato é uma âncora de sutura, uma sutura, um grampo, um aderente cirúrgico, um clipe, uma placa, uma rosca, um filme, uma plataforma de engenharia de tecido, uma espuma ou um pó.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o substrato é formado por um polímero selecionado do - grupo consistindo em poliésteres alifáticos, politaminoácidos), copóli(éter- b esteres), polialquilenos oxalatos cujo grupo alquila tem cerca de 1 a cerca de 10 átomos de carbono, poliamidas, policarbonatos derivados de tirosina, po- lifiminocarbonatos), poliortoésteres, polioxaésteres, poliamidoésteres, polio- xiésteres que contém grupos de amina, poli(anidridos), polifosfazenos, colá- geno, elastina, gelatina, polissacarídeos, e copoliímeros e misturas dos mesmos.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o substrato é formado por um material selecionado do grupo consistindo em algodão, linho, seda, náilon, poliésteres, fluoropolime- ros, poliolefinas, poliuretanos e copolímeros e combinações dos mesmos.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o substrato é um substrato que não deve ser implantado emum corpo humano.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- da pelo fato de que o substrato é uma bandagem, uma bandagem adesiva ou uma bandagem para ferimentos.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o peptídeo relacionado ao colágeno está presente na composição em uma quantidade, com base na área superfícial total do subs- trato, de cerca de 0,01 mg /cm? a cerca de 1 mg /cm?,

25. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o peptídeo relacionado ao colágeno está presente na composição em uma quantidade, com base na área superficial total do subs- trato, de cerca de 0,1 mg /cm? a cerca de 0,5 mg /cm?. Í 5

26. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- -. da pelo fato de que o substrato é uma espuma que compreende um copoli- mero de épsilon-caprolactona e glicolídio.

27. Método de intensificação da hemostase em um indivíduo com necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende aplicar uma composição conforme definida na reivindicação 14, a um local de sangramento no indivíduo. -

28. Método de instensificação de hemostáse em um indivíduo U com necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de uma composição conforme definida na reivindicação 26, em um local de sangramento do indivíduo.

29. Gel, caracterizado pelo fato de que compreende: a) um peptídeo relacionado ao colágeno da fórmula (1): B-()Mm-X em que Z é selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro; J é selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13,14o0u15e B e X são independentemente selecionados do grupo consiste em Fs5-Fe, Fe (opcionalmente mono ou dissubstituído em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)>-PheTyr, MeO-Tyr, fenilgli- cina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Val; e b) um agente gelificante, sendo que o peptídeo relacionado ao colágeno está presente no gel em uma quantidade, com base no peso total do gel, de cerca de 0,1 mg /ml a cerca de 10 mg/ml.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 29, caracteriza- da pelo fato de que compreende adicionalmente uma pluralidade dos ditos peptídeos relacionados a colágeno, sendo que os peptídeos relacionados a colágeno estão presentes sob a forma de uma pluralidade de trímeros de i 5 peptídeos relacionados a colágeno.

e 31. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- da pelo fato de que os trímeros do peptídeo relacionado a colágeno são ho- motrímeros.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- da pelofatode que os trímeros do peptídeo relacionado a colágeno são he- terotrímeros. :

33. Método de intensificação de hemostáse em um indivíduo que . necessita da mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação do gel como definida na reivindicação 29, a um local de sangramento no in- divíduo.

34. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um peptídeo relacionado ao colágeno da fórmula (1): B-(Z)m-X em que Z é selecionado do grupo que consiste em Giy-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro; J é selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13/140uí5;e B e X são independentemente selecionados do grupo consiste em Fs5-Fe, Fe (opcionalmente mono ou dissubstituído em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)>-PheTyr, MeO-Tyr, fenilgli- cina, 2-naftil-Ala, 1-nafti-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Val e b) pelo menos um excipiente.

35. Dispositivo médico caracterizado pelo fato de que compre- ende a composição como definida na reivindicação 1.

. My 7

36. Dispositivo médico caracterizado pelo fato de que compre- ende a composição como definida na reivindicação 14.

37. Dispositivo médico caracterizado pelo fato de que compre- ende a composição como definida na reivindicação 29. i 5

38. Dispositivo médico caracterizado pelo fato de que compre- . ende a composição como definida na reivindicação 34.

39. Método de tratamento de distúrbios de sangramento em um indivíduo que necessita do mesmo, caracterizado pelo fato de que compre- ende o uso de um peptídeo relacionado a colágeno de fórmula (1): B-(Z)M-X em que - Z é selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly Y e J-Gly-Pro; J é selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14ouÍ15; e B e X são independentemente selecionados do grupo que con- siste em Fs-Phe, Phe (opcionalmente mono ou dissubstituído em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)>-Fe, MeO-Tyr, fe- nilglicina, 2-naftil-Ala, 1-nafiti-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, leu, Ile e Val; em uma quantidade eficaz para iniciar agregação de plaquetas em um local desejado do dito indivíduo.

40. Método de diagnóstico de distúrbios de sangramento em um indivíduo que necessita do mesmo caracterizado pelo fato de que compre- ende: (a) combinar um peptídeo relacionado a colágeno da Fórmula (I): B-(Z)M-X em que Z é selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro; J é selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e t 8 Pro; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 140u 15; e B e X são independentemente selecionados do grupo que con- : 5 siste em Fs-Phe, Phe (opcionalmente mono- ou dissubstituído em fenila com - fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Fe, MeO-Tyr, fe- nilglicina, 2-naftil-Ala, 1-nafitil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, leu, Ile e Val; com sangue ou plasma que contém plaquetas do dito indivíduo para formar uma mistura; então: (b) adicionar a mistura a um agregômetro de plaquetas para ava- liar a agregação de plaquetas na dita mistura. "

41. Composição caracterizada pelo fato de que compreende: : (a) um peptídeo relacionado a colágeno de fórmula (1): B-(Z)M-X emque Z é selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro; J é selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 140u 15; e B e X são independentemente selecionados do grupo consistin- do em Fs5-Fe, Fe (opcionalmente mono ou dissubstituído em fenila com fluo- ro, cloro, bromo, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4-(OH);-Fe, MeO-Tyr, fenilgli- cina,2-naftil-Ala, 1-nafti-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Val; e (b) um agente farmaceuticamente ativo.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- da pelo fato de que o agente farmaceuticamente ativo é selecionado do gru- po que consiste em agentes hemostáticos, anti-infecciosos, analgésicos, anti-inflamatórios e combinações dos mesmos.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- da pelo fato de que os hemostáticos são selecionados a partir do grupo con-

f 9 sistindo em trombina, fibrinogênio, ADP, ATP, cálcio, magnésio, TXA,, sero- tonina, epinefrina, fator de plaqueta 4, fator V, fator El, PAI-1, trombospondi- na e combinações dos mesmos.

44. Composição, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- i 5 da pelo fatode que os anti-infecciosos são selecionados a partir do grupo -: consistindo em anticorpos, antígenos, antibióticos, agentes antivirais e com- binações dos mesmos.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- da pelo fato de que o agente anti-inflamatório é um anti-histamínico.

46. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma matriz de polímero tridimensional quimicamente definida suplementada . por um peptídeo relacionado a colágeno da Fórmula (|): : B-(Z)m-X em que Z é selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro; J é selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro, mPro e Pro; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13,140uí5;e B e X são independentemente selecionados do grupo que con- siste em Fs-Phe, Phe (opcionalmente mono ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4-(OH);-Phe, MeO-Tyr, fe- nilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Val.